1. Stand der Technik Siliciumverbindungen wie Silicate und Silicone (Siloxane) sind vielbenutzte Materialien in Industrie und Medizin und auch in wirtschaftlicher Hinsicht bedeutsam. Viele Hochtechnolo- gie-Produkte wie optische und mikroelelctronische Instrumente sowie Katalysatoren enthalten oder bestehen aus Silicaten oder Silicon-Verbindungen.

Das tetraedrisch gebaute Silicat-Anion ( [Si041 4- ; Monomer) neigt zur Polymerisation durch Verknüpfung von Si04-Einheiten, wobei jeweils zwei Si-Atome über ein O-Atom miteinan- der verbunden werden. Durch Wasserabspaltung (Kondensation) entsteht dabei aus der Or- thokieselsäure zunächst die Orthodikieselsäure (Pyrokieselsäure ; H6Si207). Die weitere Kon- densation führt über die Polykieselsäuren zu den Metakieselsäuren [ (H2Si03)"]. Bei kleinerer Zahl der Si04-Einheiten (n = 3,4 oder 6) können sich dabei auch ringförmige Moleküle bil- den. Bei weiterem Fortschreiten der Kondensation entstehen aus den zunächst erhaltenen Ket- ten oder Netzen dreidimensionale Strukturen, welche der Zusammensetzung Si02 entsprechen (CD Römpp Chemie Lexikon-Version 1.0, Stuttgart/New York : Georg Thieme Verlag 1995).

Das (polymere) Siliciumdioxid (Si02) kommt sowohl in kristalliner als auch in amorpher Form vor. Zu den verschiedenen Formen des kristallinen Si02 gehören u. a. Quarz, Tridymit und Cristobalit. Amorphe Siliciumdioxid-Mineralien sind u. a. Achat, Opal und Feuerstein.

Aus amorphem Si02 (auch Silica genannt) bestehen auch viele, durch Biomineralisation ent- standene Skelettstrukturen, wie die Schalen von Kieselalgen (Diatomeen) und die Nadeln (Spiculae) von Kieselschwämmen. In allen diesen SiO2-Formen besitzt Silicium die Koordi- nationszahl 4 und ist tetraedrisch von vier Sauerstoff-Atomen umgeben.

Durch teilweises Ersetzen der OH-Gruppen der Kieselsäure durch einbindige Organylreste, die sich nicht am Kondensationsvorgang beteiligen, entstehen verschiedene Silicone (Siloxa- ne). Sie werden eingeteilt in lineare, verzweigte und cyclische Polysiloxane sowie vernetzte Polymere (Verknüpfung von ketten-oder ringförmige Molekülen zu zwei-oder dreidimen- sionalen Netzwerken).

Die Viskosität der kettenförmig aufgebauten Silicone (Siliconöle) nimmt mit wachsender Ket- tenlänge zu. Silicone, die in geringem Maß vernetzt sind, zeigen Kautschuk-Elastizität (Sili- conkautschuk), stark vernetzte Ketten sind harzartig (Siliconharze).

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von rekombinantem oder aus natürlichen Quellen isoliertem Silicatein-ß sowie von Silicatein-ß-Fusionsproteinen zur Synthese und zum Abbau von amorphem oder kristallinem Siliciumdioxid (Kieselsäuren und Silicate), Si- loxanen sowie Modifikationen dieser Verbindungen und deren technische Verwendung.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung von rekombinantem oder aus natür- lichen Quellen isoliertem Silicatein-ß sowie von Silicatein-ß-Fusionsproteinen zum Auffin- dung von Aktivatoren oder Inhibitoren dieser, durch das Enzym katalysierten Prozesse.

1. 1 Biomineralisation (Bildung von biogenem Siliciumdioxid) in Kieselschwämmen Die technische Synthese der Silicate erfordert drastische Bedingungen wie hoher Druck und hohe Temperatur. Kieselschwämme sind dagegen-ebenso wie Kieselalgen-befähigt, mit Hilfe spezifischer Enzyme Silicatgerüste unter milden Bedingungen, d. h. bei relativ niedriger Temperatur und niedrigem Druck, zu bilden.

Die Hauptelemente des Skeletts der Kieselschwämme sind die nadelförmigen Spiculae, die bei der Gruppe der Demospongien (Hornschwämme) und Hexactinellida (Glasschwämme) aus amorphem nichtkristallinem Siliciumdioxid bestehen.

Der Stand des Wissens über die Morphologie und Biogenes der Spiculae ist dargestellt in : Uriz et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33 : 163-193 ; Müller et al. (2003) Progr Molec Subcell Biol 33 : 195-221. Das opale Siliciumdioxid in Schwamm-Spiculae enthält 6-13% Wasser, was die ungefähre Formel (Si02) 2sH20 ergibt (Schwab & Shore (1971) Nature 232 : 501-502). In Demospongien beginnt die Spiculaebildung um ein axiales Filament, um das Silica enzymatisch abgelagert wird.

Zwei Enzyme, die bei silicatbildenden Organismen an der Synthese und/oder dem Abbau des SiO2-Skeletts beteiligt sind, und ihre technische Verwendung wurden beschrieben.

Bei dem einen Enzym handelt es sich um Silicatein-a (auch lediglich Silicatein genannt), bei dem es sich um das Protein handelt, welches das den Axialkanal der Schwamm-Spiculae (Na- deln) ausfüllende Axialfilament aufbaut (PCT/US99/30601. Methods, compositions, and biomimetic catalysts, such as silicateins and block copolypeptides, used to catalyze and spa- tially direct the polycondensation of silicon alkoxides, metal alkoxides, and their organic con- jugates to make silica, polysiloxanes, polymetallo-oxanes, and mixed poly (silicon/ met- allo) oxane materials under environmentally benign conditions. Inventors/Applicants : Morse DE, Stucky GD, Deming, TD, Cha J, Shimizu K, Zhou Y ; DE 10037270 Al. Silicatein- vermittelte Synthese von amorphen Silicaten und Siloxanen und ihre Verwendung. Deutsches Patentamt 2000. Anmelder und Erfinder : Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC ; PCT/EP01/08423. Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicates and siloxanes and use thereof. Inventors/Applicants : Müller WEG, Lorenz B, Krasko A, Schröder HC). Dieses En- zym wurde aus dem marinen Kieselschwamm Suberites domuncula kloniert (Krasko A, Batel R, Schröder HC, Müller IM, Müller WEG (2000) Expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge S. domuncula is controlled by silicate and myotrophin. Europ J Biochem 267 : 4878-4887). Silicatein ist in der Lage, aus organischen Siliciumverbindungen (Alkoxysi- lanen) amorphes Siliciumdioxid (Polykieselsäuren und Polysilicate) zu synthetisieren (Cha JN, Shimizu K, Zhou Y, Christianssen SC, Chmelka BF, Stucky GD, Morse DE (1999) Sili- catein filaments and subunits from a marine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 96 : 361-365).

Das zweite Enzym ist die Silicase, die zur Gruppe der Carboanhydrasen gehört (DE 102 46 186.4. Abbau und Modifizierung von Silicaten und Siliconen durch Silicase und Verwendung des reversiblen Enzyms. Deutsches Patentamt 2002. Anmelder und Erfinder : Müller WEG, Krasko A, Schröder HC). Dieses Enzym, das zuerst im Meeresschwamm S. domuncula ent- deckt wurde, ist primär am Abbau von biogenem Silica beteiligt (Schröder HC, Krasko A, Le Pennec G, Adell T, Wiens M, Hassanein H, Müller IM, Müller WEG (2003) Silicase, an en- zyme which degrades biogenous amorphous silica : Contribution to the metabolism of silica deposition in the demosponge Suberites domuncula. Progr Molec Subcell Biol, 33, 250-268), aber auch in der reversiblen Reaktion zu deren Synthese in der Lage.

2. Gegenstand der Erfindung Überraschenderweise wurde von den Erfindern-zunächst im Meeresschwamm S. domuncula - entdeckt, daß in Zellen von Silica-bildenden Organismen nicht nur ein Silica- synthetisierendes Enzym (Silicatein-a), sondern weitere Silica-bildende Enzyme vorkommen.

Das hier beschriebene Silicatein-ß zeichnet sich hierbei durch besonders vorteilhafte Eigen- schaften im Hinblick auf seine katalytischen Fähigkeiten und deren technische/medizinische Anwendbarkeit aus, die nicht aus dem Stand der Technik und Analogiefolgerungen für den Fachmann zu erkennen sind.

Diese vorteilhaften Eigenschaften beruhen auf : a) unterschiedlicher Substratspezfität b) unterschiedlicher Kinetik c) unterschiedlichen Bindekonstanten d) unterschiedlicher Stabilität.

Die für das Silicatein-ß-Polypeptid codierende cDNA wurde mit Hilfe der PCR-Methode aus S. domuncula isoliert (siehe unten). Verwandte cDNAs können auch aus weiteren Schwäm- men, wie z. B. Geodia cydonium, isoliert werden.

Neu an der vorliegenden Erfindung ist außerdem, daß das Silicatein-ß-Gen in Tieren (Schwämmen) oder daraus gewonnenen Zellen/Zellaggregaten durch Erhöhung der Silicium- Konzentrationen im Medium (gewöhnlicherweise auf 60 uM Silicat oder eine andere Silici- umverbindung, bei deren Hydrolyse eine ebenso große Konzentration an Silicat erreicht wird) induziert werden kann. Besonders vorteilhaft ist (eine noch stärkere Induktion wird erreicht), wenn neben Silicium auch eine erhöhte Eisenkonzentrationen (Eisenionen bzw. Eisensalze oder Komplexe wie Fe (+++) Citrat) im Medium vorliegt.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird allgemein ein Verfahren zur in vitro oder in vivo Synthese von Siliciumdioxid (Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Siliconen und anderen Silicium (IV)- oder Metall (IV)-Verbindungen sowie von Mischpolymeren dieser Verbindungen zur Verfügung gestellt, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zum Abbau eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Hydrolase (Silicatein-ß)- Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit (siehe Abbildungen 1) zu den in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist. Bisher war nicht bekannt und nicht aus dem Stand der Technik zu erkennen, daß neben Silicatein-oc weitere Enzyme, wie das hier beschriebene Silcatein-ß, in der Lage sind, Silicate oder Silicone aufzubauen. Aufgrund der Reversibilität dieses Prozesses betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Abbau von amorphem Siliciumdioxid (Kondensationsprodukte der Kieselsäure, Silicate), Si- liconen und anderen Silicium (IV)- oder Metall (IV)-Verbindungen sowie von Mischpolyme- ren dieser Verbindungen, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Synthese eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakteri- elle, pflanzliche oder Pilz Hydrolase (Silicatein oder Cathepsin) -Domäne umfaßt, die minde- stens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist.

Es wird ein erfindungsgemäßes Verfahren eingesetzt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß zur Synthese Verbindungen wie Kieselsäuren, Monoalkoxysilantriole, Monoalkoxysilandiole, Monoalkoxysilanole, Dialkoxysilandiole, Dialkoxysilanole, Trialkoxysilanole, Tetraalkoxysi- lane, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Silantriole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Silandiole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Silanole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Monoalkoxysilandiole, Alkyl-, Aryl- oder Metallo-Monoalkoxysilanole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Dialkoxysilanole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Trialkoxysilane oder andere Metall (IV) -Verbindungen als Reaktanten (Substrate) eingesetzt werden. Durch Verwendung definierter Mischungen der Verbindungen, wobei das Verhältnis der Substrate frei gewählt werden kann, können Mischpolymere defi- nierter Zusammensetzung hergestellt werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann durch das Polypeptid oder ein Metallkomplex des Polypeptids oder die Bindung des Polypeptids oder eines Metallkom- plex des Polypeptids an andere Moleküle oder die Oberflächen von Glas, Metallen, Metall- oxiden, Kunststoffen, Biopolymeren oder anderen Materialien als Template die Ausbildung definierter zwei-und dreidimensionaler Strukturen erfolgen.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Modifia- <BR> <BR> tion einer Kieselsäure oder Silicium (IV)- oder Metall (IV) -Verbindung enthaltenden Struktur oder Oberfläche zur Verfügung gestellt, wobei ein Polypeptid oder ein Metallkomplex eines Polypeptids zur Modifikation eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine tierische, bakterielle, pflanzliche oder Pilz Hydrolase (Silicatein oder Cathepsin)- Domäne umfaßt, die mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz aufweist. Bevorzugterweise liegt die Kieselsäure enthaltende Struktur oder Oberflä- che in Form eines Edelsteins oder Halbedelsteins vor.

Es wird ein erfindungsgemäßes Verfahren eingesetzt, wobei die Modifikation vergleichbar einer Glättung, eines Anätzens oder ein Herstellen von Ausbohrungen bzw. Aussparungen der <BR> <BR> Kieselsäure oder Silicium (IV)- oder Metall (IV) -Verbindung enthaltenden Struktur oder Ober- fläche durch das Polypeptid oder einen Metallkomplex des Polypeptids umfaßt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine chemische Verbindung oder Kieselsäure-enthaltende Struktur oder Oberfläche, die mit einem erfindungsgemäßen Verfah- ren erhalten wurde, insbesondere in Form eines Edelsteins oder Halbedelsteins.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch ein Polypeptid einer Hydrolase (Silicatein-ß) aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Poly- <BR> <BR> peptid, das in der Aminosäuresequenz der Hydrolase (Silicatein-ß) -Domäne mindestens 25 % Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, ein Metallkomplex des Polypeptids, oder Teile davon.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch eine Nukleinsäure, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen für ein Polypeptid der Erfindung kodiert. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann in Form einer DNA, cDNA, RNA oder Gemischs davon vorliegen und dadurch gekennzeichnet sein, daß die Sequenz der Nukleinsäure mindestens ein Intron und/oder eine polyA-Sequenz aufweist. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die erfindungsgemäße Nukleinsäure in Form ihrer komplementären"antisense"-Sequenz.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft auch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Form eines (a) Fusionsprotein- (chimäres Protein) Konstrukts, (b) Konstrukts mit getrennter Protein-Expression (Protease-Spaltstelle) oder (c) Konstrukts mit getrennter Protein-Expression (Kassetten-Expression). Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann syn- thetisch hergestellt worden sein. Verfahren dazu sind im Stand der Technik gut bekannt.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen Vektor, vorzugsweise in Form eines Plas- mids, shuttle Vektors, Phagemids, Cosmids, Expressionsvektors, retroviralen Vektors, adeno- viralen Vektors oder Partikels, Nanopartikeln oder Liposomen, wobei der Vektor eine erfin- dungsgemäße Nukleinsäure enthält. Weiterhin können Vektoren zum Transfer von Proteinen vorgesehen werden, vorzugsweise in Form eines Nanopartikels oder Liposoms, die ein Poly- peptid der Erfindung umfassen.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Wirtszelle, transfiziert mit einem Vektor oder infiziert oder transduziert mit einem Partikel gemäß der Erfindung, zur Verfügung gestellt. Diese Wirtszelle nach kann dadurch gekennzeichnet sein, daß sie ein Po- lypeptid nach Anspruch 1, einen Metallkomplex des Polypeptids oder Teile davon exprimiert.

Als Wirtszellen eignen sich alle bekannten Wirtszell-Organismen, so u. a. Hefen, Pilze, Schwämme, Bakterien, CHO-Zellen oder Insektenzellen.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann, neben der natürlichen Form, ferner dadurch gekenn- zeichnet sein, daß es synthetisch hergestellt worden ist oder daß das Polypeptid oder der Me- tallkomplex des Polypeptids in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Zellextrakt oder- lysat vorliegt. Der Zellextrakt oder das Lysat kann aus einer Zelle ex vivo oder ex vitro ge- wonnen werden, zum Beispiel einer rekombinanten bakteriellen Zelle oder einem Meeres- schwamm.

Das erfindungsgemäße Polypeptid kann nach herkömmlichen im Stand der Technik bekann- ten Verfahren gereinigt werden und somit im wesentlichen frei von anderen Proteinen vorlie- gen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft dann ein Verfahren zur Auffindung von Inhibitoren oder Aktivatoren eines Polypeptids einer Hydrolase (Silicatein-ß) aus Suberi- tes domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder einem dazu homologen Polypeptid, das in der Ami- nosäuresequenz der Hydrolase (Silicätein-ß)-Domäne mindestens 25% Sequenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt, wobei a) ein Polypeptid einer Hydrolase (Sili- catein-ß) aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Hydrolase (Silicatein-ß)-Domäne mindestens 25% Se- quenzähnlichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt zur Verfügung gestellt wird, b) das Polypeptid aus Schritt a) mit einem potentiellen Inhibitor oder Aktivator in Kon- takt gebracht wird, und c) die Fähigkeit des Polypeptids gemessen wird, Silicate oder Silicone zu synthetisieren oder abzubauen. Mit diesem Verfahren lassen sich wertvolle Substanzen aufspühren, die sich unter Umständen als Therapeutika eignen (dazu siehe im folgenden).

Verfahren zur Auffindung solcher Substanzen sind dem Fachmann bekannt und schließen z. B. die Verwendung von radioaktiv markierten oder enzymatisch markierten Kandidaten- Verbindungen ein. Verfahren zur Messung der Aktivität der Hydrolase (Silicatein-ß) sind im folgenden beschrieben und können leicht durch den Fachmann auf ein Testformat hin ange- paßt werden. Ein Inhibitor verringert dabei die Aktivität des Enzyms im wesentlichen voll- ständig, ein Aktivator induziert eine Aktivität oder verstärkt diese über den Ausgangsspiegel.

Gemäß einer Alternative des Verfahrens kann das Polypeptid einer Hydrolase (Silicatein-ß) aus Suberites domuncula gemäß SEQ ID Nr. 1 oder ein dazu homologes Polypeptid, das in der Aminosäuresequenz der Hydrolase (Silicatein-ß) -Domäne mindestens 25% Sequenzähn- lichkeit zu der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz besitzt in vivo, in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Zellextrakt oder-lysat oder in gereinigter Form für den Test zur Verfü- gung gestellt wird.

Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharma- zeutischen Zusammensetzung, umfassend a) Auffinden eines Inhibitors oder Aktivators nach Anspruch 24 oder 25 und b) Mischen des wie oben angegeben aufgefundenen Inhibitors oder Aktivators mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Hilfsstoff. Mittels dieser Zu- sammensetzung werden wertvolle Pharmazeutika zur Verfügung gestellt, die, wie das Poly- peptid oder eine Nukleinsäure der Erfindung zur Prävention oder Therapie der Silikose ver- wendet werden können. Weiterhin kann die Verwendung eines Polypeptids oder einer Nu- kleinsäure oder pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Resorption oder zur Modulation der Resorbierbarkeit von Siliconen und Silicon-Implantaten erfolgen.

Schließlich läßt sich die vorliegende Erfindung auch zur Transfektion von Zellen mit erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren zur Resorption oder zur Modulation der Resorbierbarkeit von Siliconen und Silicon-Implantaten verwenden. Die oben genannten Verwendungen und die Verfahren dazu sind dem Fachmann bekannt und können leicht auf die hier vorhandenen Be- dürfnisse und Anforderungen angepaßt werden.

Die Erfindung soll nun in den folgenden Beispielen weiter verdeutlicht werden, ohne darauf beschränkt zu werden. In den beigefügten Figuren und dem Sequenzprotokoll zeigen : Im nachfolgenden sind die erläuternden Legenden zu den beigefügten Abbildungen und den Sequenzprotokollen aufgeführt. Es zeigen : SEQ ID Nr. 1 : Die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Silica-metabolen Silicatein- ß-Polypeptids aus S. domuncula (rSILICAß_SUBDO), SEQ ID Nr. 2 : Die Nukleinsäuresequenz der cDNA des erfindungsgemäßen Silica-metabolen Silicatein-ß-Polypeptids aus S. domuncula.

Figur 1 : Die Nukleinsäuresequenz der cDNA des erfindungsgemäßen Silica-metabolen Silicatein-ß- Polypeptids aus S. donzuncula. Die aus der Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens abge- leitete Aminosäuresequenz ist unterhalb der Nukleotidsequenz angegeben.

Figur 2 : Gezeigt ist ein Vergleich ("Alignment") der Schwamm-Silicatein-Sequenzen, Silicatein-a und Silicatein-ß, von S. domuncula (SILICAaSUBDO [Datenbank-Eintragungsnummer <BR> <BR> CAC03737.1] und SILICAbSUBDO [AJ519940] ) und T. aurantium (SILICAaTETHYA [AAC23951. 1] ; SILICAbTETHYA [AF098670]). Konservierte Reste (ähnlich oder verwandt imHinblick auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften) in den Sequenzen werden in weiß auf schwarz gezeigt und solche in mindestens zwei Sequenzen in schwarz auf grau. Die charakteristischen Stellen innerhalb der Silicatein-Sequenzen sind angegeben : Ser (e), His (a) und Asn (n), die Prozessierungsstelle für die Umwandlung des Proenzyms zum reifen Enzym ist markiert (} {), ebenso das Serin-Cluster ( [Ser]).

Figur 3 : Phylogenetische Beziehungen des Schwamm-Silicateins mit den Cathepsin L-Sequenzen von Protostomiern (D. melanogaster [DROSOPHILA] BAA06738 ; Caenorhabditis elegans [CAENORHABDITIS] NP507199 ; Artemia franciscana [ARTEMIA] AAD39513) und Deuterostomiern (Danio rerio [DANIO] AAN32912. 1 ; Homo sapiens [HUMAN] X12451) zusammen mit den Schwammsequenzen von S. domuncula ( [SUBERITES] ; AJ272013) und G. cydonium ( [GEODIA] ; Y10527). Der Baum blieb"ungerooteter" [ohne Außengruppe "root"], um das Clustering der Cathepsine und Silicateine zu zeigen. Die Zahlen an den Ver- zweigungen geben die statistische Signifikanz der Verzweigungen an (1000 entspricht 100% Signifikanz). Die Skala gibt die sogenannte"evolutionäre Distanz"wieder, wobei die Länge der Skala einer Distanz von 0.1 Aminosäure-Substitutionen pro Position innerhalb der Se- quenz entspricht.

Figur 4 : Höhe der Expression von silicatein in Gewebe von S. domuncula nach Überführung in Sili- cat/Fe (+++)-supplementiertes künstliches Seewasser. Die RNA wurde entweder sofort nach der Zugabe von Silicat/Fe (+++) (Tag Null) oder zwei und sechs Tage später extrahiert. Nor- them-Blot-Analyse.

Figur 5 : Nachweis von silicatein-positiven Zellen in Schwammgewebe. (A) Cryoschnitte wurden von einem Schwamm hergestellt, der in Silicat/Fe (+++)-freiem Seewasser gehalten wurde, und mit DIG-markierter SDSILICAß-antisense DNA hybridisiert. Anschließend wurden die Pro- ben mit Anti-Digoxigenin/alkalischer Phosphatase inkubiert und die Signale mit NBT/X- Phosphat detektiert. Analyse der Schnitte von Tieren, die für 2 (B), 4 (C) oder 6 Tage (D) in Silicat/Fe (+++) -supplementiertem Seewasser gehalten wurden. Die Kanäle (c) des wasserhal- tigen Systems innerhalb des Mesohyl (m) sind gezeigt. Die Kanäle werden von einer epithe- lialen Schicht begrenzt, die von Pinacocyten gebildet wird. Vergrößerung : x 50.

Klonierung des das Silicatein-ß kodierenden Gens Eine cDNA, die für das Silicatein-ß von S. domuncula kodiert, wurde aus einer cDNA- Bibliothek isoliert (Abbildung 1). Bei Silicatein-ß war bisher lediglich bekannt, daß es als Proteinkomponente des axialen Filaments der Spiculae (Schwamm-Nadeln) vorkommt, nicht jedoch eine Beteiligung an der enzymatischen Bildung von Siliciumdioxid-Spiculae.

Die Isolierung der cDNA für Silicatein-ß z. B. aus S. domuncula wird folgendermaßen durch- geführt. Zum Homologie-Screening wird eine Digoxigenin-11-dUTP-markierte DNA-Sonde ("DIG random primed DNA labelling kit" ; Fa. Roche) von Silicatein-a aus S. domuncula be- nutzt ; die Sequenz dieser cDNA ist beschrieben (Datenbank-Eintragungsnummer AJ272013 ; Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267 : 4878-4887). Das Screening der S. domuncula- cDNA-Bibliothek wird unter"low stringency"-Hybridisierungs-Bedingungen der"plaque lifts"wie beschrieben (Kruse et al. (1997) Mol Biol Evol 14 : 1326-1334) durchgeführt. Positi- ve Klone werden mit einem alkalische Phosphatase-konjugiertem Anti-Digoxigenin- Antikörper unter Benutzung von BCIP/NBT als Substrat identifiziert (Blake et al. (1984) Anal Biochem 136 : 75-179). Durch Northern-Blotting kann bestimmt werden, ob die komplet- te Sequenz SDSILICAß erhalten wurde. Die DNA-Sequenzierung kann mit einem automati- schen DNA-Sequencer durchgeführt (Li-Cor 4000S) werden.

Die für das Silicatein-ß-Polypeptid aus dem Meeresschwamm S. domuncula codierende cDNA sowie das aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Polypeptid besitzen folgende Eigen- schaften. Die Nucleotidsequenz umfaßt 1372 Reste mit einem offenen Leserahmen von ntl22- 124 bis nti27i-i273 (Stoppcodon) (Abbildung 1). Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Silicat- ein-ß stellt mit 383 Resten ein 42,068 Da großes Polypeptid dar (Abbildung 1 und Abbildung 2).

Die Schwamm-Silicatein-ß-Polypeptid ist ein neues Mitglied der Cathepsin L Unterfamilie (Shimizu et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95 : 6234-6238 ; Cha et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96 : 361-365 ; Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267 : 4878-4887). Das S. domuncula-Silicatein-ß-Polypeptid besitzt die größte Ähnlichkeit zu Silicatein-a von Tethya <BR> <BR> aurantium (Datenbank-Eintragungsnummer AAC23951.1 ; "Expect value" [E ; Blast-NCBI ; (Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons, Chichester)] = 7e~58), zu Silicatein-ß von T. aurantium (AF098670 ; E = 4e-57) und zu Silicatein-a von S. domuncula (CAC03737. 1 ; E = 2e~56) ; etwas entfernter verwandt ist das S. domuncula Silicat- ein-ß zu Cathepsin L von Rhodnius prolixus (AF320565 ; E = 3e~55). Alle vier Silicateinse- quenzen zeigen die charakteristischen drei Aminosäuren Ser (anstelle von Cys, das in den Cathepsinen vorhanden ist), His und Asn, welche die katalytische Triade der Cystein- Proteasen bilden (Shimizu et al. (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95 : 6234-6238 ; Cha et al.

(1999) Proc Natl Acad Sei USA 96 : 361-365 ; Krasko et al. (2000) Europ J Biochem 267 : 4878-4887) ; Abbildung 2. Die Pozessierungsstelle, die für die Bildung der aktiven En- zyme erforderlich ist, entweder als Ergebnis einer Autolyse oder durch eine zweite Protease, kann nach : Nishimura et al. ( (1988) Arch Biochem Biophys 261 : 64-71) vorhergesagt werden.

Auf Grund von Vergleichen mit den Cathepsinen kann die Spaltstelle in dem Schwamm- Silicatein-ß bei aai39 lokalisiert werden (Abbildung 2) ; daher wird das Proenzym mit Mr 42,068 Da zu einem aktiven Enzym mit einem vorhergesagten Mr von 26,205 Da reifen. Die drei mutmaßlichen Disulfidbindungen sind in dem Schwamm-Silicatein-ß ebenso wie in den anderen Cystein-Proteasen vorhanden.

Phylogenetische Analyse des Silicatein-ß-Polypeptids Für die phylogenetische Analyse (Abbildung 3) wurde ein Vergleich ("Alignment") der Schwamm-Silicateine von S. domuncula (Silicatein-a und Silicatein-ß) und T. aurantium (Si- licatein-a und Silicatein-ß) mit den Cathepsin L-Sequenzen von Protostomiern (Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans und Artemiafranciscana) und Deuterostomiern (Homo sapiens und Danio rerio) zusammen mit den Cathepsin-Sequenzen von S domuncula und G. cydonium durchgeführt. Der"ungerootete" [ohne Außengruppe"root"] Baum zeigt, daß die Cathepsin L-Sequenzen von den vier Silicateinen klar getrennt sind.

Hochregulation des Silicatein-ß-Polypeptids Die Expression des silicatein-ß-Gens läßt sich durch Zusatz von Silicat und Fe (+++) im Me- dium hochregulieren. Dies läßt sich sowohl beispielsweise durch Northern-Blotting oder We- stern-Blotting an ganzen Tieren, Geweben, Zellen oder Zellaggregaten (wie Schwamm- Primmorphen) zeigen.

Die letztgenannten Primmorphe sind Aggregate, die aus proliferierenden und differenzieren- den Zellen bestehen und aus Schwamm-Einzelzellen gebildet werden. Das Primmorphe- System wurde zum Patent angemeldet (DE 19824384. Herstellung von Primmorphe aus dis- soziierten Zellen von Schwämmen, Korallen und weiteren Invertebraten : Verfahren zur Kulti- vierung von Zellen von Schwämmen und weiteren Invertebraten zur Produktion und Detekti- on von bioaktiven Substanzen, zur Detektion von Umweltgiften und zur Kultivierung dieser Tiere in Aquarien und im Freiland. Erfinder und Anmelder : Müller WEG, Brümmer F).

In dem in Abbildung 4 gezeigten Experiment wurde die Höhe der Expression des silicatein-ß- Gens bestimmt, die als Antwort auf Silicat und Fe (+++) im Medium stark hochreguliert wird.

Zur Bestimmung des Effektes von Silicium und Eisen auf die Genexpression wurden die Tie- re für zwei Wochen in künstlichem Seewasser kultiviert, das zusammengesetzt ist aus Chlorid (19.0 g/kg), Natrium (11.0), Magnesium (1.3), Sulfat (2.7), Calcium (0.4), Kalium (0.4) und Bicarbonat (0. 15). Dann wurden die Tiere in künstliches Seewasser, ergänzt mit 60 FM Silicat (als Na-Silicat) und 30, uM Fe (+++), überführt.

Northern-Blotting Die RNA wird aus in flüssigem Stickstoff pulverisierten Tieren, Geweben, Zellen oder Zell- aggregaten mit TRIzol-Reagens extrahiert (Fa. GibcoBRL). Dann wird eine Menge von 5 ig Gesamt-RNA elektrophoretisch an einem 1% igen Formaldehyd/Agarose-Gel aufgetrennt und auf eine Hybond-N+-Nylon-Membran geblottet entsprechend den Instruktionen des Herstel- lers (Fa. Amersham). Die Hybridisierung wird mit der cDNA SDSILICAß durchgeführt. Ver- wendet werden kann beispielsweise eine silicatein-ß-Sonde, die von nt676 bis neues reicht und somit die charakteristische Region in dem abgeleiteten Polypeptid, nämlich das Serin-reiche Cluster, überspannt. Dieses Cluster wird im S. domuncula Silicatein-ß-Polypeptid zwischen aa309 bis aa329 gefunden ; diese Region zeigt auch Unterschiede zu dem Silicatein-a- Polypeptid. Als interner Standard kann beispielsweise die S domuncula ß-Tubulin cDNA, SDTUB (Datenbank-Eintragungsnummer AJ550806) benutzt werden. Die Sonden werden mit dem PCR-DIG-Probe-Synthesis Kit entsprechend dem"Instruction Manual" (Fa. Roche) markiert. Nach dem Waschen wird die DIG-markierte Nucleinsäure mit den Anti-DIG Fab- Fragmenten [konjugiert an alkalische Phosphatase ; Verdünnung 1 : 10,000] detektiert und durch Chemolumineszenztechnik unter Benutzung von CDP entsprechend den Instruktionen des Herstellers (Fa. Roche) sichtbar gemacht. Die Screens können danach zur Auswertung z.

B. mit einem GS-525 Molecular Imager (Fa. Bio-Rad) gescannt werden.

Die Northern-Blot-Untersuchungen ergaben, daß die Mengen an Transkripten nach Überfüh- rung der Tiere von Silicate (+++) -freiem in Silicate (+++)-enthaltendes Seewasser stark ansteigt (Abbildung 4). Parallele Hybridisierungsstudien mit dem SDTUB (ß-Tubulin) Gen zeigten, daß dieselbe an RNA auf die Gele geladen wurde.

Aufgrund dieser Ergebnisse kann geschlossen werden, daß in intakten Tieren nach Inkubation der Tiere mit Silicat/Fe (+++) silicatein-ß-positive Zellen gebildet werden.

In situ-Lokalisierungsstudien Die Expression des Silicatein-ß-Gens kann auch mittels in situ-Hybridisierung verfolgt wer- den. Hierzu wird Gewebe von Tieren z. B. nach 6-tägiger Inkubation in einem Sili- cat/Fe (+++)-Medium für 30 min in Seewasser, ergänzt mit 30 mM Ethylendiamintetraessig- säure (EDTA), bei Raumtemperatur behandelt. Die Spiculae werden dann durch Sedimentati- on erhalten und für die in situ-Hybridisierung weiter verarbeitet.

Im folgenden wird eine Methode angewandt, die auf der von Polak & McGee (In situ Hybri- dization. Oxford University Press, Oxford, 1998) beschriebenen Prozedur mit Modifikationen (Le Pennec et al. (2003) J Biotechnol 100 : 93-108) basiert. 8-um dicke gefrorene Schnitte werden bei-30°C mit Hilfe eines Cryostats erhalten. Die Cryoschnitte werden mit Parafor- maldehyd fixiert und dann 2-mal mit lxPBS bei Raumtemperatur gewaschen. Die Schnitte werden mit Proteinase K inkubiert und anschließend wieder mit Paraformaldehyd fixiert. Um die Schwammfarbe zu entfernen, werden die Schnitte mit Ethanol und letzendlich mit Isopro- panol inkubiert. Nach der Rehydrierung mit lxPBS werden die Digoxigenin (DIG)-markierten DNA-Sonden zu der Hybridisierungslösung hinzugefügt. Die Hybridisierung wird über Nacht in einem Glasbehälter bei 45°C durchgeführt ; die anschließenden Waschschritte werden bei 50°C wie beschrieben durchgeführt (Perovic et al. (2003) Evo & Devo 5 : 240-250). Nach dem Blocking werden die Schnitte z. B. mit einem Anti-Digoxigenin-Antikörper, der mit alkali- scher Phosphatase konjugiert ist, inkubiert. Zur Sichtbarmachung der Signale kann das Farb- reagens NBT/X-Phosphat benutzt werden.

Herstellung von DNA-Sonden für in situ-Lokalisierungsstudien Die In-situ-Hybridisierung kann zum Beispiel mit einer Digoxigenin-markierten ssDNA- Sonde durchgeführt werden. Die Sonde wird z. B. mit dem"PCR DIG Probe synthesis Kit" (Fa. Roche) markiert. Die DNA-Sonde wird basierend auf der S. domuncula cDNA-Sequenz konstruiert. Sowohl antisense-als auch sense-Sonden werden durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Benutzung der linearisierten cDNA hergestellt. Die antisense-Sonde wird durch Anwendung eines"forward primer"in 5'nach 3'sense-Richtung erhalten ; die komplementäre sense-Sonde wird durch Benutzung eines reverse Primer in 3'nach 5'Orientierung erhalten.

Die SDSILICAß-Sonde überspannt ein Segment innerhalb des offenen Leserasters mit einer Länge von 520 bp (nt676 bis ntlls8). Die PCR wird zum Beispiel mit Hilfe eines GeneAmp 9600 thermal cycler (Perkin Elmer) durchgeführt. Folgende Reaktionsbedingungen haben sich bei der PCR als geeignet erwiesen : initiale Denaturierung bei 95°C für 3 min, dann 35 Ampli- fikationszyklen jeweils bei 95°C für 30 s, 58°C-30 s, 74°C-4 min und ein finaler Extensi- onsschritt bei 72°C für 20 min. Die Markierung kann zum Beispiel mit Hilfe des"DIG Oligo- nucleotide Labeling Kit" (Fa. Roche) erfolgten.

Silicatein-positive Zellen In dem in Abbildung 5 wiedergegebenen Experiment wurde mit Hilfe der In-situ- Hybridisierungsstudien gezeigt, daß keine Silicatein-positiven Zellen in Gewebe von <BR> <BR> Schwämmen, die in Silicat/Fe (+++) -freiem Seewasser gehalten wurden, vorhanden sind. In- teressanterweise erscheinen die silicatein-positiven Zellen zunächst in der Epithelschicht (Pi- nacoderm), und erst später, vier Tage nach der Silicat/Fe (+++)-Exposition, werden auch Zel- len im Mesohyl mit der silicatein-Sonde positiv (B-D).

3. Herstellung des Silicatein-, ß-Polypeptids Das Silicatein-ß-Polypeptid kann aus Geweben oder Zellen gereinigt oder rekombinant herge- stellt werden.

3. 1. Reinigung des Silicatein-ß-Polypeptids aus natürlichen Quellen Die Reinigung des Silicatein-ß kann vorteilhaft aus isolierten Spiculae von Schwämmen durchgeführt werden. Mit Hilfe dieser Prozedur kann das Silicatein-ß-Polypeptid unter ande- rem aus dem Schwamm S. domuncula gereinigt werden.

Hierzu werden aus dem Schwamm, z. B. Suberites domuncula, die Spiculae (bestehend aus amorphem Silicat) durch Dissoziation des Gewebes in Ca-un Mg-freiem Seewasser und Sedimentation gewonnen. Das amorphe Silicat der Spiculae wird im alkalischen Milieu, z. B. in verdünnter Natronlauge, entfernt. Die organischen Fibrillen der Spiculae, die Silicatein-ß enthalten, werden durch Abzentrifugation (z. B. 20,000 x g ; 1 Stunde ; 4°C) gewonnen. Das Protein wird durch hohe Salzkonzentration, wie z. B. 1 M NaCl, aber auch durch den"Protein Refolding-Kit"in Lösung gebracht.

Anschließend wird das Silicatein-ß an einer Affinitätsmatrix gereinigt. Die Affinititätsmatrix wird hergestellt, indem ein Silicatein-ß-spezifischer Antikörper an eine feste Phase (CNBr- aktivierte Sepharose oder andere geeignete Träger) immobilisiert wird, gereinigt. Als Anti- körper werden monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das Silicatein-ß eingesetzt, die nach Standard-Methoden hergestellt werden (Osterman, L. A. Methods of Protein and Nu- cleic Acid Research Vol. 2 ; Springer-Verlag [Berlin] 1984). Die Kopplung des Antikörpers an die Säulenmatrix wird nach den Angaben des Herstellers (Fa. Pharmacia) durchgeführt. Die Elution des reinen Silicatein-ß erfolgt mittels pH-Änderung oder Änderung der Ionenstärke.

3. 2. Herstellung von rekombinantem Silicatein-ß-Polypeptid 3.2. 1. Klonierung der cDNA aus marinen Schwämmen Die Clonierung der Silicatein-ß-cDNA aus dem Meeresschwamm S. domuncula wurde oben beschieben.

Das Silicatein-ß-Gen kann auch aus cDNA-Bibliotheken, z. B. in ZapExpress und in Escheri- chia coli XL1-Blue MRF', mit geeigneten degenerierten Primern mittels der PCR-Technik identifiziert werden ; hierzu werden entsprechende vektorspezifische Primer eingesetzt. Die erhaltenen Syntheseprodukte werden zum Screenen in den betreffenden cDNA-Bibliotheken benutzt. Danach werden die identifizierten Clone in einen Vektor (beispielsweise pGem-T) subcloniert und anschließend sequenziert.

3.2. 2. Expression und Isolierung des rekombinanten Silicatein-ß-Polypeptids Die Herstellung von rekombinantem Silicatein-ß-Polypeptid erfolgt bevorzugt in E. coli. Aber auch die Herstellung in Hefen und Säugerzellen ist möglich und wurde erfolgreich durchge- führt. Hierzu wird die cDNA in einen entsprechenden Vektor, z. B. pQE-30, eincloniert. Nach Transformation von E. coli wird die Expression des Silicatein-ß-Polypeptids durch Induktion mit IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) (Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, New York) durchgeführt. Die Expression des Sili- catein-ß-Polypeptids sowie die Aufreinigung des rekombinanten Proteins über z. B. das Histi- din-Tag, das an dem rekombinanten Protein vorliegt, kann an entsprechenden Affinitätssäu- len, z. B. einer Ni-NTA-Matrix durchgeführt werden (Skorokhod et al. (1997) Cell. Mol. Bi- ol. 43 : 509-519).

Im Folgenden ist als Beispiel die Expression des Silicatein-ß-Gens von S domuncula in E. coli unter Benutzung des"GST (Glutathion-S-Transferase) Fusions"-Systems (Fa. Amers- ham) beschrieben. In dem Beispiel wird ein Insert benutzt, das lediglich die Aminosäuren aa48 bis aa383 (kurze Form) umfaßt ; ebenso kann auch ein Insert benutzt werden, welches das ge- samte abgeleitete Protein umfaßt. Der entsprechende Klon wird in einen Vektor eincloniert, z.

B. in das Plasmid pGEX-4T-2, welches das GST-Gen von Schistosoma japonicum enthält.

Auch andere Expressionsvektoren haben sich als geeignet erwiesen. Nach Transformation von E. coli wird die Expression des Silicatein-ß-Polypeptids üblicherweise durch IPTG indu- ziert und für 4 oder 6 Stunden bei 37°C durchgeführt (Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Smith JA, Seidmann JG, Struhl K (1995) Current Protocols in Molecular Biolo- gy. John Wiley and Sons, New York). Das erhaltenen GST-Fusionsprotein wird z. B. durch Affinitätschromatographie an Glutathion-Sepharose 4B gereinigt. Zur Abtrennung der Glu- tathion-S-transferase von dem rekombinanten Schwamm-Silicatein-ß-Polypeptid wird das Fusionsprotein mit Thrombin (10 Units/mg) gespalten. Das Protein wird dann der Gelelek- trophorese in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol unterworfen. Die Gelelektrophorese kann in 10% igen Polyacrylamidgelen mit 0,1% NaDodS04 (Polyacrylamidgel-Elektrophorese ; PAGE) durchgeführt werden. Das Gel wird mit Coomassie Brillant Blau gefärbt. Nach der Spaltung, Reinigung und anschließender PAGE wird die kurze Form des rekombinanten Pro- teins erhalten.

3.2. 3. Expression und Isolierung des rekombinanten Silicatein-, 6-Polypeptids aus weiteren Organismen Entsprechend der oben beschriebenen Vorgehensweise kann die Isolierung, Clonierung und Expression der Silicatein-ß-cDNA auch aus anderen Organismen durchgeführt werden, bei- spielsweise aus (Siliciumdioxid-produzierenden) Hexactinelliden (z. B. Rhabdocalyptus daw- soni).

3. 3. Isolierung und Reinigung des Silicatein-ß-Polypeptids mittels Antikörper Nach Extraktion oder partieller Renigung nach einem der oben geschilderten Verfahren wird das Silicatein-ß an einer Antikörper-Affinitätsmatrix gereinigt. Die Vorgehensweise entspricht derjenigen, die in Abschnitt 3.1 ("Reinigung des Silicatein-ß-Polypeptids aus natür- lichen Quellen") beschrieben wurde.

Auch andere Affinitätsmatrizes wie polymere Silicate oder copolymere Silicate/Germanate wurden mit Erfolg eingesetzt.

4. Nachweis der Silicatein-ß-Aktivität und Synthese von Silicium-Alkoxv-Verbinduren Im Folgenden werden lediglich die Aktivitäten, die für die kurze Form der rekombinanten Schwamm-Silicatein-ß-Polypeptids gefunden werden, angegeben.

4. 1. Silicatein-ß-Aktivität 4. 1. 1. Polymer (z. B. Silica)-bildende Aktivität Zur Bestimmung der Enzymaktivität des rekombinaten Silicatein-ß kann ein Assay ange- wandt werden, der auf der Messung von polymerisiertem und präzipitiertem Silicat nach Hy- drolyse und nachfolgender Polymerisation von Tetraethoxysilan (TEOS) basiert.

Die Messung der enzymatischen Synthese-Aktivität des rekombinanten Silicatein-ß wird üblicherweise wie folgt durchgeführt. Das rekombinante Silicatein-ß wird über Nacht gegen einen für die Reaktion geeigneten Puffer, wie 50 mM MOPS, pH 6,8 dialysiert [andere Puffer innerhalb eines pH-Bereiches von 4,5 bis 10,5 sind ebenfalls geeignet].

1-50 ug rekombinantes Silicatein-ß werden in 1 ml eines geeigneten Puffers, wie 50 mM MOPS (pH 6,8) gelöst und mit 1 ml einer 1-4, 5 mM Tetraethoxysilan-Lösung versetzt. Die enzymatische Reaktion kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Bei einer Inkubati- onszeit von 60 min werden üblicherweise 200 nmol amorphes Silicat (als Molybdat-reaktives, lösliches Silicat) pro 100 pg Silicatein-ß synthetisiert. Zum Nachweis der Silicat-Produkte wird das Material in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert (12 000 x g ; 15 min ; +4°C), mit Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Anschließend wird das Sediment mit 1 M NaOH hy- drolysiert. In der entstandenen Lösung wird unter Anwendung eines Molybdat-gestützten Nachweisverfahrens, wie z. B. dem Silicon-Assays (Merck), Silicat quantitativ gemessen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Silicatein-ß neben dem Substrat Tetraethoxysilan auch noch weitere Silan-Alkoxide polymerisiert.

Folgende Verbindungen können als Reaktanten (Substrate) zur Carboxypeptidase- vermittelten Synthese verwendet werden : Tetraalkoxysilane, Trialkoxysilanole, Dialkoxysi- landiole, Monoalkoxysilantriole, Dialkoxysilanole, Monoalkoxysilandiole, Monoalkoxysila- nole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Trialkoxysilane, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Silanole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Silandiole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Silantriole, Alkyl-, Aryl-oder Me- tallo-Monoalkoxysilandiole, Alkyl-, Aryl-oder Metallo-Dialkoxysilanole, oder andere Me- tall (IV)-Verbindungen (Alkoxyverbindungen von Gallium (IV), Zinn (IV) oder Blei (IV).

Auch Mischungen dieser Substrate werden durch das Enzym erkannt und polymerisiert. So- mit können auch Mischpolymere hergestellt werden.

Die Substrate, wie Tetraethoxysilan, werden in Dimethylsulfoxid in einer Stammlösung von üblicherweise 500 mM gelöst und anschließend in die gewünschte Endkonzentration herunter verdünnt.

Die Silicatein-Reaktion läßt sich auch mit anderen, aus der Silicium-Chemie her bekannten Reaktionen kombinieren, wie der Müller-Rochow-Synthese von Chlormethylsilanen, der Syn- these längerkettiger Silane (z. B. Si8-Silane) und Silicium-Stickstoff-Verbindungen (z. B. Sili- ciumnitrit, Si3N4). Die letztgenannte Verbindung entsteht bei der Verbrennung von Silanen durch Stickstoff oder Luft (Luft-Stickstoff). Längerkettige Silane entstehen pyrolytisch, z. B. in Gegenwart von Kupfer bei 500°C. Über das Müller-Rochow-Verfahren (Katalysator : Kup- fer ; Temperaturen zwischen 250-300°C) erfolgt auch überwiegend die großtechnische Syn- these von Methylsiliconen. Diese Verfahren sind Stand der Technik. Niedere Silane sind sehr unbeständig und entzünden sich leicht-unter heftigen Explosionen-an Luft oder bei Kontakt mit Wasser, während höhere (längerkettige) Silane, die nicht mehr selbstentzündlich sind (ab n-Heptasilan), vielverspechende Energieträger (Brennstoffe oder Treibstoffe) darstellen.

Verbrennungsprodukt dieser Silane ist-ungiftiges-Siliziumnitrit (Si3N4). Da die durch Sili- catein katalysierte enzymatische Reaktion Vorstufe zu diesen Silanen liefert, ergibt sich eine deutliche Erleichterung und Erhöhung der Effizienz und Spezifität von deren Synthese.

Als ein Beispiel, das den Umfang der Patentansprüche nicht einschränkt, wird folgendes Re- aktionsschema gegeben : Dabei werden kurzkettige Silicate mit einer Kettenlänge von Sin mit n > 8 durch den Biokatalysator Silicatein hergestellt. Die Hydroxylgruppen in diese kurzketti- gen Silicaten werden in einer elektrisch induzierten Hydrolyse mit Wasserstoff, einem Reduk- tionmittel, welches Wasserstoff freisetzt, oder durch Lewis-Säuren katalysierte Hydrierungen ersetzt. Das frei werdende Wasser wird aus dem Reaktionsgemisch durch geeignete Verfah- ren, entsprechend dem Stand der Technik für Reduktions-und Trocknungsverfahren, oder durch Destillationsverfahren entfernt. Die Reaktionskette kann formal wie folgt dargestellt werden : (1) n>8 Si (OH) 4 + Silicatein Si">8- (OH) 2, >8- (OH) 2 + n>8 H20 (bei Raumtemperatur-neutral pH) (2) Sin>8-(OH) 2n>g-(OH) 2 + 2n>8+2 H2çaktiViert (nascendi) + Sin>gH2n>g+2 (unter Wasserentzug und Elektroaktivierung) Erfindungsgemäß kann ein Zwei-Stufen-Prozeß aufgebaut werden. Elektrochemisch kann Wasserstoff aus Wasser hergestellt werden. Dazu sind eine Vielzahl von Verfahren bekannt.

Parallel dazu, in einer Apparatur aber räumlich getrennt, werden erfindungsgemäß durch die katalytischen Polypeptide Silicatein a und ß Oligosilicate mit Sin (OH) 2n+2 mit n > 7 unter-im Gegensatz zum Stand der Technik-extrem milden Bedingungen aufgebaut. Nach Entfernung der Reaktionslösung können in einer anschließenden Reaktion mit aktivierten Wasserstoff"",- cendi die Oligosilicate zu Oligosilanen entsprechend der Formel Sin (H) 2n+2 mit n 7 durch Hy- drierung überführt werden. Diese Reaktionsführung ist möglich, da Silane ab n=7 entspre- chend der Formel Sin (OH) 2n+2 nicht mehr spontan mit Luftsauerstoff oder Wasser reagieren, da ihr Aktivierungsenergiepotential mit zunehmender Zahl n steigt. Bei den niederen Silanen findet dagegen aufgrund des niedrigen Aktivierungsenergiepotentials eine spontane Reaktion statt.

Die vorliegende Erfindung trägt damit auch zur Einführung energiesparender und umwelt- freundlicher Verfahren bei, da unter anderem auf die derzeit verwendeten chlorierten Silicat- verbindungen verzichtet werden kann. Ferner kann die gesamte Reaktionsführung unter ex- trem milden Reaktionsbedingungen durchgeführt werden. Durch die vorliegende Erfindung können Oligosilicate als Wasserstoffspeicher genutzt werden, der universell, unter geringen Gefahren und mit einfachem technischen Aufwand transportierbar und lagerbar ist.

Erfindungsgemäß können mit Silicatein a und ß, als katalytische Polypetide, wie zuvor dage- stellt, kurzkettige Oligosilicate mit n > 2 hergestellt werden. Im Gegensatz zum Stand der Technik, bei dem Temperaturen von >200°C und Drücke über Normaldruck verwendet wer- den, reichen hier Temperaturen unter 50°C und Normaldruck aus. Ferner kann die Reaktion im wäßrigen Medium durchgeführt werden, was nach dem Stand der Technik nicht möglich ist. Dies bedeutet eine erhebliche Verbesserung der Umweltverträglichkeit, der Sicherheit und auch eine Einsparung von Kosten. Die Oligosilicate sind in nachfolgenden Reaktionsführun- gen Grundlage für eine Vielzahl von derzeit verwendeten Produkten, wie Silanen, Siliconen und anderen organischen Siliciumverbindungen.

Die Silicatein-Reaktion erlaubt aufgrund ihrer Reversibilität auch eine Mischether- Herstellung (Bildung von Si-O-C Bindungen), wie oben dargelegt. Aus diesen Verbindungen lassen sich-nach dem Stand der Technik-mit Hilfe anderer Katalysatoren Halogenverbin- dungen (z. B. mit Chlor) bilden, aus denen unter Wasserstoff-Atmosphäre unterschiedliche Silanverbindungen gewonnen werden können.

Silicatein ist insbesondere auch in der Lage, Germanium und Titan-Verbindungen zu synthe- tisieren und abzubauen, und eignet sich auch zur Herstellung von Si-Ti, Si-Ge oder Si-Ge-Ti Mischstrukturen, die für die Chip-Produktion von Bedeutung sind.

4. 1. 2. Polymer (z. B. Silica)-abbauende Aktivität (Silica-auflösende Aktivität) Silicatein-ß ist auch in der Lage, Silica aufzulösen, insbesondere wenn die Reaktion in Anwe- senheit von Ascorbinsäure oder einer anderen, Catechol oder 1,2-Diphenol-enthaltenden Ver- bindung stattfindet. Als Substrat für Silicatein-ß können beispielsweise Spiculae (amorphes Siliciumdioxid) von S. domuncula dienen. Die Spiculae können aus Schwammgewebe durch 12-stündige Inkubation in Gegenwart von Ethylendiamintetraessigsäure (20 mM, in PBS ; PBS = Phosphatpuffer-Salz-Lösung, beste- hend aus 1,15 mM KH2P04, 8,1 mM Na2HPO4, 137 mM NaC1 und 2,7 mM KCl) erhalten werden. Nach Waschen mit destilliertem Wasser und mit Ethanol (zweimal) werden die Spi- culae getrocknet (56°C) und dann in einem Mörser zu einem Pulver zerrieben.

Die Silica-auflösende Aktivität kann dann wie folgt bestimmt werden. Üblicherweise werden 100 u. g der getrockneten Spiculae (Pulver) zu einem geeigneten Puffer wie 50 mM Tris-HCl- Puffer (pH 7,2 ; 10 mM DL-Dithiothreitol, 100 mM NaCl) und 0,5 mM ZnS04 in 2 ml Eppen- dorf-Gefäßen hinzugegeben. Dann werden üblicherweise 50 p1 des rekombinanten Silicatein- ß-Polypeptids hinzugefügt und bei 25°C inkubiert (die Inkubation ist auch bei anderen Tem- peraturen zwischen 5°C und etwa 65°C möglich). Die durchschnittliche Inkubationszeit be- trägt 60 Minuten. Zur quantitativen Bestimmung der Menge an gelöstem Siliciumdioxid wer- den die nichtgelösten Spiculae abzentrifugiert (14000 x g ; 15 Minuten ; 4°C). Die freigesetzte, lösliche Kieselsäure kann z. B. mit Hilfe eines Molybdat-gestützten Nachweisverfahrens, wie z. B. dem kolorimetrischen"Silicon Test" (Merck ; 1.14794), quantitativ bestimmt werden.

Die Menge an Kieselsäure wird in diesem Fall anhand einer Kalibrierungskurve mit einem Siliciumstandard (Merck 1.09947) aus den Extinktionswerten bei 810 nm berechnet.

4. 1. 3. Silicium (IT)-Verbindung-synthetiserende Aktivität Die Reversibiltät der Alkoxysilan-hydrolysierenden Aktivität des Silicatein-ß (aber auch wei- terer Silicateine wie Silicatein-a) kann auch zur Synthese anderer Silicium (IV)- Verbindungen oder anderer Metall (IV) -Verbindungen benutzt werden, und zwar dadurch, daß die einzuführende, vorteilhaft nucleophile Gruppe der das Alkoxysilan (Alkoxy-Metall (IV)- Verbindung) und das Enzym enthaltenden Reaktionsmischung hinzugesetzt wird. Neben Te- traalkoxysilanen wie z. B. Tetraethoxysilan (TEOS) können auch Trialkoxysilane, Dialkoxysi- lane und Monoalkoxysilane sowie Trialkoxysilanole, Dialkoxysilandiole, Dialkoxysilanole, Monoalkoxysilantriole, Monoalkoxysilandiole, Monoalkoxysilanole sowie Alkyl-, Aryl-oder Halogen-substituierte Alkoxyverbindungen des Silicium (IV) eingesetzt werden.

Die Silicium (IV)-Verbindung-synthetiserende Aktivität des Silicatein-ß kann auch mit der Polymerisation dieser Substrate oder Mischungen dieser Substrate oder der aus ihnen entste- henden Produkte verknüpft werden, wobei eine Durchführung der Reaktionen simultan im gleichen Ansatz möglich ist. Somit können auch unterschiedliche Polymere oder Mischpoly- mere hergestellt werden.

4. 1. 4. Gekoppelter optischer Test zur Bestimmung der Silicatein-Reaktion Ein einfacher Test zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität des Silicateins wird angegeben. Hierbei handelt es sich um einen gekoppelten optischen Test zur Bestimmung des bei der durch Silicatein vermittelten Enzymreaktion aus Substraten (Alkoxy-Silanen und Derivaten) freigesetzten Alkohols. Benötigt wird hierzu ein Photometer (z. B. Eppendorff Photometer 1101 M). Als Pufferlösungen werden verwendet : Lösung 1 2 mmol/1 ABTS (Azino-bis (3-Ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) in Puffer, hergestellt wie folgt : Schritt a : 0,1 M Kaliumphosphat Puffer (pH 7,5), hergestellt aus Lösung A (8,16 g KH2PO4 in Aqua Bidest lösen, auf 600 ml auffüllen) und Lösung B (68,4 g K2HPO4 in Aqua Bidest lö- sen, auf 300 ml auffüllen ; =10x Ansatz), und zwar werden 300 ml Lösung A mit Lösung B auf pH 7,5 gebracht.

Schritt b : 320 ml der in Schritt a hergestellten Lösung werden 30 min mit 02 gesättigt ; dann werden darin 352 mg ABTS gelöst. (Bemerkung : ABTS ist licht-und luftempfindlich, Puffer nicht länge als 1 h benutzen).

Lösung 2 POD (Peroxidase, Fa. Roche) ; 10 mg Protein/ml, spezifische Aktivität ca. 5 U/mg.

Lösung 3 Alkoholoxidase (Fa. Sigma) -Lösung, hergestellt wie folgt : Schritt a : 100 mg BSA werden in 0,1 M Kaliumphosphat Puffer (pH 7,5) gelöst.

Schritt b : 10 mg Alkoholoxidase-Lyophilisat werden in 1 ml des in Schritt a hergestellten BSA-0, 1 M Kaliumphosphat-Puffers (kalt) gelöst.

Schritt c : 135 pl der in Schritt b hergestellten Alkoholoxidase-Lösung werden mit 10 ml des in Schritt a hergestellten BSA-0, 1 M Kaliumphosphat-Puffers (kalt) verdünnt.

11202 5 RI (Fa. Merck) werden mit Aqua Bidest auf 50 ml verdünnt.

Als Substratlösung kann beispielweise 4,5 mM Tetraethoxysilan (TEOS) in MOPS-Puffer (100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,1 mM ZnS04, pH 6,8) benutzt werden.

Die Testdurchführung ist wie folgt : In Küvette pipettieren : 2,8 ml Puffer/ABTS 10, ul POD 50, ul AO Dann mischen, und danach Zugabe von 10 111 H202 Erneut mischen, Nullabgleich des Photometers (auf 0,1 einstellen), dann Zugabe von 100 jil Substratlösung bzw. Enzym (Silicatein) in Substratlösung, mischen, Extinktion über mindestens 2 min verfolgen (Filter 405 nm).

Als Positiv-Kontrolle und für die Eichgerade dienen verschiedene Alkohol (z. B. Ethanol)- Konzentrationen.

5. Ligation der cDNA für Silicatein-ß mit einer oder mehreren cDNA (s) für anderer Proteine 5. 1. Herstellung von Silicatein-ß-Fusionsproteinen Zur Herstellung von Fusionsproteinen mit dem Silicatein-ß-Polypeptid wird ein geeigneter Expressionsvektor (beispielsweise pQE-30-Vektor ; Qiagen) eingesetzt. Die Silicatein-ß- cDNA-mit z. B. einer BamHI-Restriktionsstelle am 5'-Terminus und z. B. einer SalI- Restriktionsstelle am 3'-Terminus-wird hergestellt. Das Stopp-Codon in der Silicatein-ß- cDNA wird entfernt. Hierzu wird die PCR-Technik eingesetzt und zum Amplifizieren Primer, welche die betreffenden Restriktionsstellen besitzen, benutzt. Die cDNA für das zweite Prote- in wird entsprechend gewonnen, wobei am 5'-Terminus die gleiche Schnittstelle wie am 3'- Terminus der Silicatein-ß-cDNA (im Beispiel SalI) und am 3'-Terminus eine von den anderen verschiedene (z. B. eine HindIII-Stelle) vorliegt. Falls sich in den betreffenden cDNAs interne Restriktionsstellen befinden, können alternative Restriktionsenzyme eingesetzt werden. Dar- über hinaus können auch Linker zwischen die beiden cDNAs eingesetzt werden.

Die beiden cDNAs werden nach den üblichen Verfahren ligiert, gereinigt und in denpQE-30- Vektor einligiert. Die Ligation erfolgt im Anschluß an das Histidin-Tag (etwa 6 Histidin- Codons). Die Expression und Reinigung des Fusionsproteins über z. B. das Histidin-Tag, das an dem rekombinanten Protein vorliegt, kann an entsprechenden Affinitätssäulen, z. B. einer Ni-NTA-Matrix, durchgeführt werden (Skorokhod A, Schäcke H, Diehl-Seifert B, Steffen R, Hofmeister A, Müller WEG (1997) Cell Mol Biol 43 : 509-519).

5. 2. Getrennte Expression I (Protease-Spaltstelle) Alternativ zu dem Verfahren unter 5.1. kann zwischen der cDNA für das Silicatein-ß- Polypeptid und der cDNA für ein weiteres Protein eine Protease-Spaltstelle (wie z. B. eine Enterokinase-Stelle) einkloniert werden. In diesem Falle kann ein Codon für ein neues Start- Methionin vor den codierenden Bereich des Gens für das weitere Protein insertiert werden.

Nach Expression und Reinigung wird das Fusionsprotein proteolytisch gespalten. Jetzt liegen beide Proteine separat vor.

5. 3. Getrennte Expression II (Kassetten-Expression) Alternativ können beide Proteine auf einem Konstrukt separat exprimiert werden. Hierzu wird in einem Expressions-Vektor das Silicatein-ß-Gen dem His-Tag nachgeschaltet. Am Ende der Silicatein-ß-cDNA wir ein Stopp-Codon insertiert. Zwischen der cDNA für das Silicatein-ß- Polypeptid und der cDNA für das weitere Protein wird eine Ribosomen-Bindungsstelle mit Codon für ein Start-Methionin eincloniert. Wiederum wird ein His-Tag der cDNA für das weitere Protein vorgeschaltet. Ebenfalls erhält dieses Gen ein Stopp-Codon.

Die His-Tags können deletiert werden, wenn die Proteine zur Funktionsanalyse in den betref- fenden Wirtszellen benutzt werden.

5. 4. Erweiterungen Für die unter 5.1 bis 5.3 beschriebene Expression können sowohl bakterielle als auch euka- ryotische Zellen benutzt werden.

Die unter 5.1 bis 5.3 beschriebene Expression kann auch für drei und mehr offene Leserah- men eingesetzt werden.

6. Verwendungen der Silicatein-ß-Polypeptids und der Silicatein-ß-Fusionsproteine Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind die nachstehend genannten Verwendungen des re- kombinanten Silicatein-ß-Polypeptids, des aus verschiedenen Quellen gereinigten Silicatein-ß und der Silicatein-ß-Fusionsproteine. Die diesen Verwendungen zugrundeliegenden Verfah- ren sind für den Fachmann aus der hier und oben bereits angegebenen Beschreibung, der Fachliteratur und mittels des allgemeinen Fachwissens ohne weiteres herzuleiten.

1.) Verwendung zur Oberflächenmodifikation von Biomaterialien (Verbesserung der Bio- kompatibilität). Oberflächen-modifizierte Biomaterialien finden u. a. Verwendung zur Beein- flussung von Zelladhäsion und Wachstum, zur Modifizierung der Blut-Kompatibilität oder zur Kontrolle der Protein-Adsorption (z. B. Herabsetzung der Adsorption von Kontaktlinsen).

Eine Literatur-Übersicht findet sich in : Ratner BD et al (Hrsg) Biomaterials Science-An In- troduction to Materials in Medicine. Academic Press, San Diego, 1996. Ein Problem besteht darin, daß die zur Herstellung dieser Modifikationen angewandten Bedingungen oft einen schädlichen (destruierenden) Effekt auf die benutzten Biomaterialien haben. Eine im Ver- gleich zu den benutzten physikalisch/chemischen Verfahren"milde", Biomaterialien scho- nenden Methode stellt eine Modifikation der Oberflächen dar, die allein auf bioche- misch/enzymatischen Reaktionen beruht, was mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht wird (Silicatein-ß-vermittelte enzymatische Synthese und-als reversible Reaktion - enzymatischer Abbau von Si02-oder Siloxan-enhaltenden Oberflächen mit Hilfe des re- kombinanten/gereinigten Silicatein-ß-Polypeptids). Insbesondere ergibt sich auch eine Ver- wendung des rekombinanten oder aus natürlichen Quellen gereinigten Silicatein-ß bei der Herstellung von Oberflächen-Modifikationen (beim Coating) von Silicon-Materialien, wie Silicon-Brust-Implantaten, Endoprothesen oder Metall-Implantaten (Verbesserung der Ver- bindung zwischen Knochen und Metall-Implantat, Biologisierung der Metall-Implantate) so- wie Kontakt/Plastiklinsen. Weitere Verwendungen betreffen das Coating von Collagen, das als Knochenersatzmaterial dient, und von Collagen-Vliesen, die z. B. für das"Tissue Enginee- ring"benutzt werden. Das Ziel ist hierbei die Erhöhung der Stabilität und der Porosität sowie die Verbesserung der Resorbierbarkeit.

2. ) Verwendung zur Herstellung neuer Biomaterialien wie Knochenersatzmaterialien oder Zahnersatzmaterialien durch Co-Synthese von Polysilicaten, Siliconen oder Mischpolymeren.

3. ) Verwendung zur Oberflächen-Modifikation (Kontaktzonen-Behandlung) von (Silicium)- Halbleitern oder Silicium-Chips.

4. ) Verwendung zur Modifikation oder zur Synthese von Nano-Strukturen aus amorphem Siliciumdioxid. Mittels des rekombinanten Silicatein-ß, der rekombinanten Silicatein-ß- Fusionsproteine oder des gereinigten Silicatein-ß ist es möglich, spezifische zwei-und drei- dimensionale Strukturen aus amorphem Siliciumdioxid im Nano-Maßstab zu modifizieren oder zu synthetisieren. Die gebildeten Strukturen können in der Nanotechnologie angewandt werden. <BR> <BR> <P>5. ) Verwendung zur Oberflächenmodifikation von Silicium-haltigen Edelsteinen und Halb- edelsteinen. Zu den amorphen bzw. feinkristallinen Modifikationen des Si02 zählen u. a.

Achat, Jaspis und Onyx. Aufgrund der Möglichkeit, mit Hilfe des Silicatein-ß unter kontrol- lierten Bedingungen die Oberfläche dieser Minerale zu modifizieren, ergibt sich die Verwen- dung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Herstellung oder Bearbeitung dieser Edel- steine/Halbedelsteine. Hierbei ergibt sich auch die Möglichkeit, gezielt Fremdmoleküle/atome einzufügen. <BR> <BR> <P>6. ) Verwendung zur Herstellung von Überzügen für Metalle, Metalloxide, Kunststoffe und andere Materialien ; insbesondere zur Herstellung von monomolekularen Schichten auf diesen Materialien. <BR> <BR> <P>7. ) Verwendung zur Herstellung von Überzügen für technische Fasermaterialien, z. B. Car- bonfasern, zum Feuerschutz, zum Zwecke einer besseren Verarbeitung oder weiteren Verän- derungen der Eigenschaften dieser Materialien.

Carbonfasern (Kohlenstoffasern) besitzen eine große technische Bedeutung, da durch ihren Einsatz im Vergleich zu Metallen wesentlich leichtere, aber trotzdem festere und steifere Bau- teile herstellbar sind (wichtig insbesondere in der Luft-und Raumfahrt).

8. ) Verwendung zur Herstellung von Überzügen für Wolle oder Baumwolle zur Erzielung neuer Eigenschaften, insbesondere antiallergischer Eigenschaften, einer Verbesserung der Reinigung oder weiteren Veränderungen der Eigenschaften dieser Materialien. Gerade hier zeigt sich der Vorteil eines enzymatischen Verfahrens, da diese Materialien empfindlich ge- genüber den bei den heutigen Verfahren notwendigen drastischen Bedingungen sind. Mit Hil- fe der Silica-Beschichtung kann verhindert werden, daß bei der Reinigung Bestandteile der hierbei verwendeten Lösungen an den Materialien hängen bleiben. <BR> <BR> <P>9. ) Verwendung zur Herstellung von Überzügen/Beschichtungen zur Herabsetzung allergi- scher Reaktionen bei Zusatzstoffen (z. B. Stärke) zu Medikamenten (Tabletten).

10. ) Verwendung zur Herstellung von Silicium-Stickstoff-Verbindungen.<BR> <P>11. ) Verwendung zur Synthese von Silicium-organischen Verbindungen.<BR> <P>12. ) Verwendung zur Herstellung von Silica-Komplexen mit Polyphosphaten, die auch über divalente Kationen verbunden sein können. <BR> <BR> <P>13. ) Verwendung zur Herstellung von thixotropen Materialien. Silicatein läßt sich auch zur (enzymatischen oder teilenzymatischen) Herstellung thixotroper Materialien verwenden. Die- se Materialien besitzen die Eigenschaft, daß ihre Viskosität beim Schütteln oder Rühren-mit einer gewissen zeitlichen Verzögerung-abnimmt (oder auch zunimmt). Hierbei spielt die Bildung und das Aufbrechen von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen hydrophilen OH- Gruppen an den Oberflächen von Silikat (Kieselsäure) -Nanopartikeln eine Rolle. Durch ge- eignete Wahl der Reaktionsbedingungen lassen sich mit Hilfe von Silicatein hochdisperse Kieselsäuren (Silikate) herstellen. Es ist Stand der Technik, daß hochdisperse Kieselsäuren ein effizientes Thixotropierungsmittel darstellen. Thixotrope Flüssigkeiten und Materialien sind von großer technischer Bedeutung (z. B. für Anstreicher-Farben).

14. ) Erleichterung der Membrangängigkeit von Medikamenten oder RNAs und DNAs durch Silicatein-vermittelte Überschichtung oder Einkapselung in Silica.