Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Oxidation von Terpenkohlen- wasserstoffen und dafür einsetzbare Polypeptide.

Während Terpenkohlenwasserstoffe häufig als unerwünschte Überschusskom- ponenten aus etherischen Ölen entfernt werden, finden synthetische oxyfunktionalisierte Derivate breite Verwendung als Aroma- und Duftstoffe. Dieses Missverhältnis im Verein mit den Spurenvorkommen der wirtschaftlich interessanten Terpenoide in pflanzlichen Quellen hat der mikrobiellen Terpen- biotransformation eine inzwischen fünfzigjährige Geschichte beschert (Schra- der und Berger 2001). (+)-Nootkaton besitzt einen an Citrus und Grapefruit erinnernden Geruch, einen leicht bitteren Geschmack und einen extrem niedrigen sensorischen Schwellenwert von etwa einem pg L ^"1 Wasser (Ohloff 1994). Diese Eigenschaftskombination hat Nootkaton weltweit zu einem vielgesuchten Bioprodukt werden lassen . Die erste in der Literatur erwähnte Biotransformation von Valencen stammt aus dem Jahr 1973 (Dhavlikar und Albroscheit 1973). Valencen wurde mit zwei isolierten Enterobacter- Arten mit einer maximalen Ausbeute von 12% (w/w) zu ( + )- Nootkaton transformiert. Die Biotransformation von Valencen mit Zellkulturen von Grapefruit (Citrus paradisi) führte nach sechs Stunden Inkubationsdauer zu Nootkatongehalten von ca. 1 mg L ^"1 (Drawert et al. 1984). Del Rio et al. verwendeten verschiedene C/trus-Arten zur Biosynthese von Nootkaton und erzielten die höchsten Nootkatonausbeuten mit neun Monate alten Kalluskulturen von Citrus paradisi (1,6 pg g ^"1 Biofeuchtmasse). 1994 wurde die Biosynthese von Nootkaton durch einen Rhodococcus- Stamm (KSM-5706) beschrieben (Okuda et al. 1994), jedoch waren die Ausbeuten ebenfalls gering.

Unter den neuartigen Lösungsansätzen der jüngsten Zeit sind Experimente mit rekombinanten Mikroorganismen und mit Pflanzenzellkulturen beziehungsweise pflanzlichen Präparationen zu nennen . Mikrosomale Präparationen aus der Wurzel von Chicoree (Cichorium intybus L.) zeichneten sich durch eine ver- nachlässigbare Bildung von Nebenprodukten aus (Bouwmeester et al. 2007; de Kraker et al. 2003), jedoch führt auf absehbare Zeit kein gangbarer Weg zu ausreichenden Mengen dieses Biokatalysators. Die Oxyfunktionalisierung von ( + )-Valencen mit rekombinanten P450 _ca m- Enzymen aus Pseudomonas putida mit einer maximalen Ausbeute von 9% (w/w) wurde 2005 publiziert (Sowden et al. 2005). Die Umsetzung mit rekombinanten P450 _B M-3-Enzymen wurde ebenfalls beschrieben, führte neben (+)-Nootkaton jedoch zu einer Reihe weiterer Produkte.

Auch Submerskulturen des Ascomyceten Chaetomium globosum wurden zur Darstellung von (+)-Nootkaton aus (+)-Valencen eingesetzt (Kaspera et al. 2005). Nach dreitägiger Transformation wurden 8 mg L ^"1 ( + )-Nootkaton erzielt, wobei wiederum zahlreiche flüchtige und nicht flüchtige Nebenprodukte gebildet wurden. Außerdem sind Pflanzenzellkulturen von Gynostemma pentaphyllum, Caragana chamlagu und Hibiscus cannabinus zur Nootkatonsynthese aus (+)-Valencen befähigt (Sakamaki et al. 2005). Maximale Ausbeuten an ( + )-Nootkaton wurden mit Gynostemma pentaphyllum (Cucurbitaceae) jedoch erst nach 20-tägiger Transformation erzielt (600 mg L ^"1 ). Lange Inkubationszeiten waren auch bei Submerskulturen von Mucor sp. und Chlorella pyrenoidosa erforderlich (Hashimoto et al. 2003b, Hashimoto et al. 2003a; Furusawa et al. 2005).

Zur Umgehung der mit der Verwendung von intakten Zellen assoziierten Probleme ist der Einsatz isolierter Enzyme vorgeschlagen worden. Ein Schweizer Aromaproduzent beschreibt die Zugabe von Lipoxygenase und ungesättigten Fettsäuren zu Valencen (Muller et al. 1998). Laccasen benötigten synthetische Cosubstrate (Hitchman et al. 2005) oder einen zweiten Reaktionsschritt (Erhitzen/Schwermetallkatalyse) (Huang et al. 2001). Mit Lyophilisaten aus Basidiomycten wurden gute Raum-Zeitausbeuten erzielt, ohne dass die einschlägige Patentanmeldung ein konkretes Verfahrensbeispiel beschreibt (Müller et al. 2005). Es besteht daher weiterhin ein Bedarf nach Verfahren, die es erlauben, Ter- penkohlenwasserstoffe mit hoher Effizienz umzusetzen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein solches Verfahren bereitzustellen. Gelöst wird die Aufgabe durch die Bereitstellung eines Polypeptides, das zur Oxidation von Terpenkohlenwasserstoffen geeignet ist, sowie der nötigen Angaben, um das Enzym rekombinant herstellen zu können.

Gegenstand ist daher zum einen ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 3 oder eine Variante, bei der bis zu 10% der Aminosäuren durch Insertionen, Deletionen oder Substitution verändert sind . Bevorzugt wird eine Sequenz eingesetzt, die genau SEQ ID. NO 1 oder No. 3 aufweist.

Insertion bedeutet die Einfügung genau einer Aminosäure; Deletion die Entfernung genau einer Aminosäure. Bei einer Substitution wird eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzt. Erfindungsgemäß umfasst sind auch Peptide und Proteine, die die Sequenz gemäß SEQ ID 1 oder eine Variante, bei der bis zu 10% der Aminosäuren durch Insertionen, Deletionen oder Substitution verändert sind, enthalten, aber zusätzlich N- oder C-terminal verlängert sind sowie Peptide und Proteine, die die Sequenz gemäß SEQ ID 3 oder eine Variante, bei der bis zu 10% der Aminosäuren durch Insertionen, Deletionen oder Substitution verändert sind, enthalten, aber zusätzlich N- oder C-terminal verlängert sind.

Aminosäuren sind neben den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren auch Aminosäurederivate, wie z. B. Hydroxyprolin, Derivate, die durch Veresterung von Carbonsäuren oder durch Amidbildung oder ähnliches erhalten werden können. Neben den natürlichen L-Aminosäuren können auch D-Aminosäuren zum Einsatz kommen. Bevorzugt kommt ein Peptid zum Einsatz, bei dem weniger als 10% der Aminosäuren durch Insertionen, Deletionen oder Substitution verändert sind, insbesondere maximal 8%, maximal 5%, maximal 3% und besonders bevorzugt maximal 1%. In einer Ausführungsform weisen die Peptide C-terminale und/oder N- terminale Trunkierungen auf.

Eine bevorzugte Ausführungsform des Proteins ist ein Protein, dass durch SEQ. ID. No. 2 oder SEQ. ID. No. 4 oder eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit diesen hybridisiert, kodiert wird. Das erfindungsgemäße Peptid zeigt die Eigenschaften eines Enzyms, nämlich einer Oxygenase.

Das Enzym ist biochemisch und molekularbiologisch charakterisiert und zeigt nur geringe Sequenzhomologien zu bislang bekannten Oxygenasen, sei es aus Pilzen oder aus anderen Mikroorganismen. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin eine Nukleinsäure, die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert und eine besonders bevorzugte Ausführungsform hiervon ist die Sequenz gemäß Seq. ID Nr. 2 oder Seq . ID Nr. 4 oder mit dieser unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, der die erfindungsgemä- ße Nukleinsäure enthält, sowie ein transformierter Organismus, der den erfindungsgemäßen Vektor enthält.

Gegenstand des Verfahrens ist weiterhin ein Verfahren zur Oxidation von Ter- penkohlenwasserstoffen umfassend den Schritt des

- Inkontaktbringens von Terpenkohlenwasserstoffen mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder einer Enzympräparation enthaltend das Polypeptid gemäß Anspruch 1. Eingesetzt werden kann also ein aufgereinigtes Enzym aus natürlichen Quellen oder rekombinanter Herstellung oder eine Enzympräparation. Solche können aus dem Mycel eines Basidiomyceten erhalten werden, wenn dies physikalisch, chemisch oder enzymatisch aufgeschlossen wird. In einer Ausführungsform erfolgt der Aufschluss chemisch. In einer anderen Ausführungsform erfolgt der Aufschluss physikalisch. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt der Aufschluss enzymatisch.

Bevorzugt wird mindestens ein Schritt ausgewählt aus chromatographischer Trennung, Fällung, Adsorption, Kristallisation, Extraktion und Filtration, insbe- sondere an einer Membran mit einem Ausschlussvolumen von 100 kDa oder mehr, durchgeführt.

Bevorzugt erfolgt ein solcher Aufschluss durch Dispergieren, Kugelmahlen oder Hochdruckhomogenisieren.

Eine Gefriertrocknung oder Lyophilisierung ist kein Aufschluss; das alleinige Lyophilisieren führt daher nicht zum gewünschten Ergebnis. Ausgeschlossen ist daher die alleinige Lyophilisierung ohne weitere Homogenisierungsschritte.

Als Basidiomyceten eignen sich insbesondere Basidiomyceten aus der Familie der Pleurotaceae, insbesondere Pleurotus sapidus, PI. Ostreatus und P.eryngii.

Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren einsetzbar, um aus Valencen Nootkaton zu erhalten. Es sind aber auch beliebige weitere Terpen- kohlenwasserstoffe einsetzbar.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.

Figur 1 zeigt die Produktausbeuten nach Transformation von ( + )-Valencen mit aufgeschlossener Biofeuchtmasse; Transformation von 2 μΙ_ ( + )-Valencen mit Biofeuchtmasse (BFM, aufgeschl.) in 1,5 ml_ 50 mM TRIS-HCI, pH 7,5 für 16 Stunden. Figur 2 zeigt die Produktausbeuten nach Fed-Batch Transformation von (+)- Valencen mit aufgeschlossener Biofeuchtmasse in 100 mL 50 mM TRIS-HCI, pH 7,5 für 50 Stunden.

Figur 3 zeigt ein FPLC-Chromatogrammausschnitt der dritten Stufe der 3- Stufenreinigung von separiertem Überstand an einer Superdex-200-Säule; Laufpuffer: 200 mM TRIS-HCI, pH 7,5, Flussrate : 0,5 mL min ^"1 , Probenvolumen : 200 pL, Fraktionsgröße: 1,0 mL.

Figur 4 zeigt die Produktausbeuten nach Transformation mit FPLC-Fraktionen der 3. Reinigungsstufe; Transformation von 1 pL ( + )-Valencen in einem Volu- men von 1,5 mL für 20 Stunden; Puffer: 20 mM TRIS-HCI, pH 7,5.

Figur 5 zeigt ein Gel (12%ig) der SDS-PAGE nach 3-stufiger Proteinreinigung mittels FPLC mit anschließender Silberfärbung; MW = Molekulargewicht, Std . = Standard (1 pL).

Figur 6A zeigt ein Gel Gel (12%ig) der SDS-PAGE nach 3-stufiger Proteinreini- gung mittels FPLC mit spezifischer Färbung für Häm-/Metallenzyme (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin); MW = Molekulargewicht des Standards, Std . = Standard (4 pL), MPO = Meerrettich-Peroxidase (15 pL, 345 mU), Über. = separierter Überstand (15 pL), GF = vereinte aktive Fraktionen aus der 3. Reinigungsstufe (Gelfiltration, 15 pL), XXX = entsprechende Probe vor SDS-PAGE 5 min auf 95°C erhitzt.

Figur 6B zeigt ein Gel (12%ig) der SDS-PAGE mit anschließender Färbung für Häm-/Metallenzyme; SLOX = Lipoxygenase aus Sojabohnen (20 pL, 85 mU).

Figur 7 zeigt ein Alignment der Peptidsequenzen 66-1 und 66-3 aus P. sapidus mit der Sequenz einer Lipoxygenase aus A. fumigatus (XP_746844.1) mittels ClustalW (Thompson et al. 1994). Figur 8 zeigt die cDNA- und Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptides gemäß SEQ ID. No. 1 bzw. 2 aus P. sapidus.

Figur 9 zeigt die cDNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Polypeptides gemäß SEQ ID. No. 4 aus P. sapidus. Figur 10 zeigt die Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Polypeptides gemäß SEQ ID. No. 3 aus P. sapidus.

Beispiele Beispiel 1 : Mikroorganismus und Kultivierung

Pleurotus sapidus (DSMZ 8266) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig bezogen. a) Nährlösungen

Die einzelnen Bestandteile (Tabelle 1) wurden in destilliertem Wasser gelöst und mit 0,5 M Natronlauge auf pH 6,0 eingestellt.

Tabelle 1 : Zusammensetzung der Nährlösungen; Glc = D-(+)-Glucose-Monohydrat, Asn = L-Asparagin-Monohydrat, SE-Lsg = Spurenelementlösung (Tabelle 2) = Konzentration, * = modifiziert nach Sprecher 1959

Tabelle 2 : Zusammensetzung der Spurenelementlösung

Substanz Konzentration [g L ^" ']

FeCI ₃ · 6 H ₂ 0 0,080

ZnS0 ₄ · 7 H ₂ 0 0,090

MnS0 ₄ - H ₂ 0 0,030

CuS0 ₄ · 5 H ₂ 0 0,005

EDTA 0,400 b) Stammkultivieruna

Von Pleurotus sapidus wurden Stammkulturen auf Agarplatten mit SNL-H- Agar-Medium angelegt. Dazu wurde je eine Agarplatte mit einem ca. 1 cm ² großen, mit Myzel bewachsenen Agarstück beimpft, mit Parafilm ^® verschlossen und im Brutschrank bei 24°C kultiviert (Taubert et al. 2000). Nachdem die Platten zur Hälfte mit Myzel bewachsen waren, wurde die Kultur bei 4°C gelagert. Diese Stammkulturen wurden mindestens alle 6 Monate nach dem gleichen Verfahren überimpft.

c) Vorkulturen

Ein myzelbewachsenes Agarstück (ca. 1 cm ² ) der Stammkultur wurde mit Hilfe eines sterilen Spatels in einen Erlenmeyerkolben (500 mL) mit 200 ml_ SNL-H- Medium überführt, homogenisiert (Ultra-Turrax-Homogenisator, TP 18/10, IKA, Staufen, ca. 20 s bei niedriger Drehgeschwindigkeit) und 4 Tage bei 24°C und 150 U min ^"1 inkubiert.

d) Anzucht von Biomasse

Im Rührkesselreaktor wurden 2,3 L NLMA-Medium mit 230 mL homogenisierter Vorkultur inokuliert. Nach 4 Tagen wurde der Rührkesselreaktorinhalt geerntet. Dazu wurde dieser durch ein Baumwolltuch filtriert. Das erhaltene Pilzmyzel wurde zweimal mit je 400 mL destilliertem Wasser (m/v) gewaschen und für weitere Experimente verwendet. Die Arbeiten erfolgten unter einer Sterilwerkbank und die eingesetzten Geräte und Lösungen wurden zuvor 20 min bei 121°C autoklaviert.

Beispiel 2 : Zellaufschluss

a) Homogenisierung von Biofeuchtmasse

3 g Biofeuchtmasse wurden mit 7 mL 50 mM TRIS-HCI, pH 7,5 versetzt und anschließend bei 15.600 U min ^"1 für 5 min auf Eis mit einem Ultra-Turrax- Homogenisator (TP 18/10, IKA) behandelt. Anschließend wurde das aufgeschlossene Pilzmyzel auf 16,7% (v/v) mit dem selben Puffer verdünnt und zur Transformation von (+)-Valencen verwendet. b) Homogenisierung von Biofeuchtmasse- Upscaling

50 g Biofeuchtmasse wurden mit 50 mL 50 mM TRIS-HCI, pH 7,5 versetzt und anschließend bei 20.000 U min ^"1 für 15 min auf Eis mit einem Ultra-Turrax- Homogenisator (TP 18/10, IKA) behandelt. Anschließend wurde das aufge- schlossene Pilzmyzel auf 25% (v/v) mit dem selben Puffer verdünnt und zur Transformation von (+)-Valencen verwendet.

c) Homogenisierung von Biofeuchtmasse mit Hochdruck

Pilzmyzel-Suspensionen in VE-Wasser wurden mittels Hochdruck- Homogenisation (LAB 60/60 TBS, Gaulin APV, Schweiz ) aufgeschlossen. Ge- kühltes Mycel wurde mit 1 bis 3 Passagen (150/30 bar und 300/60 bar) aufgeschlossen und direkt für die Biotransformationsreaktion eingesetzt. Alternativ wurde Valencen direkt während des Zellaufschlusses einhomogenisiert.

d) Herstellung von Lyophilisaten

Bis zu 100 g Biofeuchtmasse wurde in eine Glaspetrischale eingewogen, mit Aluminiumfolie abgedeckt und bei -20°C tiefgefroren . Die Lyophilisierung erfolgte für 3 bis 7 Tage (VaCo 2, Zirbus Technology, Bad Grund). Die Stellflächentemperatur betrug -20°C, die Temperatur der Kühlspirale -45°C. Das erhaltene Lyophillisat wurde ausgewogen, mit einem Glasstab zerkleinert, in sterile Falcon™-Tubes überführt und bis zur Verwendung bei -70°C gelagert. Beispiel 3 : Biotransformation von Valencen

a) Transformation mit aufgeschlossener Biomasse

Die Transformation wurde in Schraubdeckelgläschen (4 mL) in horizontaler Lage bei 300 U min ^"1 und 24°C durchgeführt. Biofeuchtmasse von Pleurotus sapidus (1,5 mL) wurde mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator behandelt und zur Transformation von 2 pL (+)-Valencen (Döhler, 70%) verwendet. Nach dem Ende der Transformation wurde extrahiert. Der ermittelte Gehalt an ( + )- Nootkaton betrug 221 mg L ^"1 (Figur 1). b) Fed-Batch Transformation von Valencen

Die Transformation wurde in Glasflaschen (500 mL) auf einem Magnetrührer (Variomag Poly 15, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bei 900 U min ^"1 und Raumtemperatur durchgeführt. Die Transformation wurde durch Zugabe von 333 pL (+)-Valencen (Döhler, > 70%) zu 100 mL Zellsuspension (homogenisiert) gestartet. Nach 6, 12, 18, 24, 30, 36 und 42 h wurde jeweils 156 pL (+)-Valencen zudosiert. Nach 6, 23, 46 und 50 h wurden jeweils 2x 1,5 mL Probe entnommen und extrahiert. Nach 50 h Transformationsdauer betrug der Gehalt an (+)-Nootkaton 603 mg L ^"1 (Figur 2). In Summe wurden 893 mg L ^"1 oc-, 3-Nootkatol und (+)-Nootkaton gebildet. c) Transformation mit gereinigter Enzymlösuna

0,5 mL gereinigter Proteinfraktion (Fraktionen 08, 09 und 12 bis 22) wurden mit 1,0 mL 20 mM TRIS-HCI, pH 7,5 gemischt. Anschließend wurde die Transformation durch Zugabe von 1 pL (+)-Valencen (Fluka, > 90%) gestartet. Die Transformation wurde in Schraubdeckelgläschen (4 mL) in horizontaler Lage bei 150 U min ^"1 und 24°C durchgeführt. Nach dem Ende der Transformation wurde extrahiert. Signifikante Gehalte an den Transformationsprodukten oc-, ß- Nootkatol und (+)-Nootkaton wurden nach Umsetzung mit den Fraktionen 15 und 16 nachgewiesen (Figur 4).

d) Kapillargaschromatographie (GC) - Mikroextraktion nach Transformation

Die Mikroextraktion erfolgte direkt in dem für die Transformation verwendeten Schraubdeckelgläschen. Der Ansatz wurde mit internem Standard (67 mg L ^"1 bzw. 200 mg L ^"1 Thymol) und 2 mL Pentan versetzt, 10 s gevortext, 10 min bei 150 U min ^"1 horizontal geschüttelt. Nach Zentrifugation (10 min, 3.313 x g, 4°C) wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und gaschromatographisch untersucht.

e) Kapillargaschromatographie (HRGC)

Die Quantifizierung von oc-, ß-Nootkatol und (+)-Nootkaton mittels FID erfolgte mit einem Kaltaufgabesystem und polarer Trennsäule. Tabelle 3 : GC-FID (KAS) mit polarer Trennsäule

Beispiel 4: Enzymreinigung

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC)

Zur Abtrennung von Verunreinigungen wurde die Probe zentrifugiert (10 min, 13.000 U min ^"1 , 16.060 x g, 4 C) und der Überstand in die FPLC (Tabelle 4) injiziert. Wenn nötig, wurde die Probe zusätzlich membranfiltriert (0,45 pm Porengröße, 25 mm, PET, Carl Roth GmbH). a) Dreistufenreiniaung mittels FPLC

Viermal 5 mL separierter Überstand von Pleurotus sapidus wurde jeweils in die FPLC injiziert und mit Hilfe des schwachen Anionenaustauschers DEAE FF ge- trennt,(siehe Tabelle 5). Die Fraktionen 09 bis 24 der vier FPLC-Läufe wurden vereint (Reinigungsstufe 1, DEAE-Pool), mit 20 mM Na-Citrat, pH 3,0 umgepuffert (Centricon Plus-70, Ausschlussgröße 10 kDa) und auf 2,5 mL konzentriert. Ausgefallene Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. 2,0 mL des umgepufferten DEAE-Pools wurden erneut in die FPLC injiziert und mittels des starken Kationenaustauschers SP Sepharose FF getrennt, Tabelle 6). Die Fraktionen 07 bis 11 wurden vereint (Reinigungsstufe 2, SP-FF-Pool), mit 200 mM TRIS-HCI, pH 7,5 umgepuffert (Amicon Ultra-15, Ausschlussgröße 10 kDa) und auf 300 pL konzentriert. 200 pL des umgepufferten SP-FF-Pools wurden in die FPLC injiziert und durch Gelfiltration an einer Superdex-200- Säule (Tabelle 7) getrennt (Reinigungsstufe 3). Nach Kalibrierung der verwendeten Trennsäule entsprach das Peakmaximum (30 min, Figur 3) einer Molmasse von 54 kDa.

Für die SDS-Analysen wurden die Fraktionen 12 bis 19 mit E-Pure-Wasser umgepuffert und auf 80 μΙ_ konzentriert (Figur 5). Diese Konzentrate wurden zur denaturierenden SDS-PAGE mit anschließender Silberfärbung, zur nicht- denaturierenden SDS-PAGE mit anschließender spezifischer Färbung für Häm- /Metallenzyme (Figur 6) und für die Sequenzierung ausgewählter Proteinbanden nach denaturierenden SDS-PAGE und anschließender Färbung mittels Coomassie eingesetzt.

Tabelle 4: FPLC mit UV-Detektor

FPLC-System Biologie Duo Flow Chromatography System (Bio-Rad) mit Biologie Fraktions ^¬ sammler Modell 2128 (Bio-Rad)

Datenaufnahme Biologie Duo Flow Workstation (Bio-Rad),

Version 3.00

Detektionswellenlänge 280 nm

Ionenaustauschchromatoqraphie (IEX)

Tabelle 5: Enzymreiniqunq mittels DEAE, Stufenqradient

Säule HiPrep 16/10 DEAE FF

(Amersham Pharmacia Biotech)

Säulenvolumen (CV) 20 ml_

Startpuffer (A) 20 mM TRIS-HCI, pH 7,5

Elutionspuffer (B) 20 mM TRIS-HCI + 0,2 M NaCI, pH 7,5

Spülpuffer (C) 20 mM TRIS-HCI + 2,0 M NaCI, pH 7,5

Probenschleife 5,0 ml_

Flussrate 5,0 ml_ min ¹

Elutionsprogramm 2 CV 100% Puffer A

Probeninjektion: 2 x Probenvolumen (Puffer A)

7 CV100% Puffer A

6 CV35% Puffer B

5 CV100% Puffer B

4 CV100% Puffer C

5 CV100% Puffer A

Fraktionsvolumen 2,0 ml_

Fraktionsvolumen 2,0 mL

Tabelle 7: Enzymreinigung mittels Superdex 200

Säule Superdex 200 10/300 GL

(Amersham Pharmacia Biotech)

Bettvolumen ca. 24 mL

Trennbereich 10 - 600 kDa

Probenschleife 200 nL

Flussrate 0,5 mL min ¹

Laufpuffer 200 mM TRIS-HCI, pH 7,5

Elutionsprogramm Probeninjektion : 2 x Probenvolumen

(Laufpuffer)

30 mL 100% Laufpuffer

Fraktionsgröße 1,0 mL

Die Kalibration der Gelfiltrationssäule wurde mit Hilfe von Standardproteinen zweier Gelfiltration-Kalibrationskits (High Molecular Weight und Low Molecular Weight, Amersham Pharmacia Biotech) nach Herstellerangaben durchgeführt. b) SDS-PAGE unter denaturierenden Bedingungen

Die Proteine wurden in 12%igen Trenngelen getrennt (modifiziert nach Laemmmli, 1970) und mittels Coomassiefärbung oder Silberfärbung (Blum et al., 1987) visualisiert. Beide Methoden sind fachkundigen Personen bekannt. c) SDS-PAGE unter nicht-denaturierenden Bedingungen

Die SDS-PAGE unter nicht denaturierenden Bedingungen erfolgte analog Punkt 4b, jedoch wurde die Zusammensetzung des Auftragspuffers (Tabelle 8) modifziert.

Tabelle 8: Zusammensetzun des Auftra uffers

d) Färbung für Häm- und Metallenzyme (Hämfärbung)

Die Hämfärbung (modifiziert nach Thomas et al. 1976 und Henne et al. 2001) wurde nur nach SDS-PAGE unter nicht-denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Für die Hämfärbung wurden folgende Lösungen verwendet (Tabelle 9) :

Tabelle 9: Zusammensetzun der Lösun en für die Hämfärbun

Lösung I und III wurden jeweils kurz vor der Verwendung hergestellt.

SDS-Gele wurden für 45 min - 1 h in Lösung III im Dunkeln inkubiert, anschließend H ₂ 0 ₂ (30%ig) bis zur Endkonzentration von 30 mM zugeben und für 1 min inkubiert. Die Gele wurden dreimal je 20 s in E- Pure- Wasser gewaschen. Verglichen wurde separiertes Lyophilisat von Pleurotus sapidus mit der über drei chromatographische Stufen gereinigten Enzymprobe (siehe Beispiel 3, Reinigung über drei chromatographische Stufen (IEX, IEX, GF)). Als Positivkontrollen dienten das hämhaltige Enzym Meerrettich-Peroxidase und eine Lipoxygenase aus Sojabohnen (Figur 6B). Anhand der spezifischen Färbung wurden zwei Proteine als Metallenzyme identifiziert, die ebenfalls nach der chromatographischen Reinigung über drei Stufen nachgewiesen werden konnten . Ein Erhitzen der Proben vor der Applikation führte jeweils zum Verlust der Aktivität. Beispiel 5 : Peptidsequenzen

Analog zu Beispiel 4a wurde eine dreistufige chromatographische Reinigung des separierten Überstandes von Pleurotus sapidus durchgeführt. Nach der Proteinreinigung wurde durch Inkubation von (+)-Valencen mittels Gaschro- matographie überprüft, ob die gereinigten Fraktionen Aktivität aufwiesen . Die aktiven Fraktionen 15 und 16 der abschließenden Gelfiltration wurden auf einem SDS-Gel unter denaturierenden Bedingungen getrennt und mit Coomassie ^® R gefärbt (vergleiche analoge SDS-PAGE mit Silberfärbung in Figur 5). Die für die gesuchte Transformationsaktivität verantwortliche Bande, mit geschätzter Molmasse von 75 kDa, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und nach Trypsinverdau einer de novo Sequenzierung mittels "Electrospray- tandem-Massenspektrometrie" (ESI-MS-MS) zugeführt (Tabelle 10).

Tabelle 10 : Ermittelte Peptidsequenzen (Einbuchstabencode) nach ESI-MS- MS-Analyse der über 3 Stufen gereinigten Enzyme; MW = Molekulargewicht nach SDS-PAGE, fettgedruckt = sichere Identifizierung

Homologievergleiche wurden durch Datenbankrecherche mit NCBI Blast mittels blastp (Schäffer et al. 2001) durchgeführt und Treffer auf verschiedene Lipoxygenasen aus Ascomyceten gefunden . Ausgehend von einem Vergleich der Peptidsequenzen 66-1 und 66-3 mit der Sequenz einer Lipoxygenase aus Aspergillus fumigatus (XP_746844.1; Figur 7) wurden degenerierte Primer abgeleitet und im PCR-Screening eingesetzt (Beispiel 6, Molekulare Charakterisierung, cDNA-Synthese und PCR-Screening). Beispiel 6: Molekulare Charakterisierung

a) cDNA-Svnthese und PCR-Screening

Für die Klonierung der Oxygenase-kodierenden cDNA-Sequenzen wurde cDNA aus P. sapidus synthetisiert und mittels Polymerase-Kettenreaktion gescreent. Das Myzel von P. sapidus wurde am 4. Kulturtag geerntet. Zur Isolierung der Gesamt-RNA wurde das RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben verwendet. Die Qualität der isolierten RNA wurde mittels denaturierender Formaldehyd-Agarose-Gel-Elektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid überprüft. Für die Synthese der cDNA wurde der SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech-Takara Bio Europe, Saint- Germain-en-Laye, Frankreich) nach Herstellerangaben eingesetzt. Der Erststrang wurde mittels SuperScript™ II RNase H ^" (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) synthetisiert. PCR Primer wurden von Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) produziert. Für die PCR wurden ca. 20 ng cDNA als Template in 50 pL-Ansätzen mit lx CoralLoad Puffer (Qiagen), 0,2 mM dNTPs, 0,4 μΜ Primer und 1,25 U HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen) verwendet. Die Amplifizierung wurde mit einem PCR Mastercycler personal (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Die folgenden Primer wurden für die Gesamtsequenz der cDNA verwendet: forward (5'>AAA CCT GAT GAG GAG CTG TTT<3'); reverse (5'>ACA GGA TAC GGT GAT GAA TG<3').

b) Klonierung und Sequenzierung von PCR-Produkten

Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe des TA Cloning Kits (Invitrogen) in den Vektor pCR ^® 2.1 kloniert. Die Sequenzierung erfolgte mit M13 reverse und forward Primern und wurde von MWG Operon durchgeführt. Die erwartete Fragmentgröße im PCR-Screening bei Verwendung der degenerierten Primer gegeneinander betrug ca. 429 bp (entspricht 143 Aminosäuren). Die entsprechende Bande wurde aus dem Agarosegel isoliert, in den Vektor pCR2.1-TOPO zwischenkioniert und anschließend sequenziert. Die erhaltene Sequenz wurde erneut Homologievergleichen unterzogen und als Fragment einer Oxygenase identifiziert. Durch Primer Walking wurde die kodierende Sequenz der cDNA mit einer Länge von 1191 bp beziehungsweise 396 Aminosäuren ermittelt (Figur 8). Die übersetzte Proteinsequenz zeigte eine Homologie von ~ 50% zu einer Oxygenase aus dem Basidiomyceten Laccaria bicolor (ermittelt mit blastp, Schäffer et at. 2001).

Eine hochhomologe, aber wesentlich längere kodierende cDNA-Sequenz mit 1944 Basen (plus Stopcodon) entsprechend 648 Aminosäuren wurde ebenfalls auf diesem Weg ermittelt (Figur 9). Diesem Protein kommt eine berechnete Molmasse von ca 75 kDa zu, was gut mit den in Beispiel 5 beschriebenen gel- elektrophoretischen Befunden übereinstimmt.

Literaturverzeichnis

Blum, H.; Beier, H.; Gross, H. J. (1987) Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in Polyacrylamide gels, Electrophoresis 8, 93-99.

Bouwmeester, H. J.; Kraker, J.-W. de; Schurink, M.; Bino, R. J.; Groot, A. de; Franssen, M. C. R. (2007) Plant Enzymes for Bioconversion, Patent US 7,214,507 B2.

Dhavlikar, R. S.; Albroscheit, G. (1973) Mikrobiologische Umsetzung von Terpenen: Valencen, Dragoco Rep 12, 251-258.

Drawert, F.; Berger, R. G.; Godelmann, R. (1984) Regioselective biotransformation of valencene in cell Suspension cultures of Citrus sp., Plant Cell Rep 3, 37-40.

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