Die vorliegende Erfindung betrifft die Gebiete Biologie, Biochemie, Chemie, Phar¬ mazie sowie Human- und Veterinärmedizin.

Verschiedene Familien von Enzymen werden in vitro und in vivo zur Manipulation von DNA eingesetzt. Zu diesen Enzymfamilien gehören beispielsweise Restrikti- onsendonukleasen, Exonukleasen, DNAsel, DNA-Reparaturenzyme und DNA- Methyltransferasen. Die spezifischeren dieser Enzyme (Restriktionsendonuklea- sen und DNA-Methyltransferasen) erkennen allerdings typischerweise relativ kur¬ ze DNA-Sequenzen von 4 bis 8 Basenpaaren, welche beispielsweise im mensch¬ lichen Genom 102-106 mal vorkommen. Somit ist eine gezielte, exklusive Adressie- rung einzelner bestimmter Gene durch diese Enzyme nicht möglich. Für zukünfti¬ ge Applikationen in der Biotechnologie und molekularen Medizin werden jedoch solche gezielten Adressierungen benötigt. Derartige Anwendungen erfordern da¬ her eine Methode, die es gestattet, die Spezifität von Enzymen, die mit DNA inter- agieren, gezielt zu erweitern. Um unterschiedliche Gene und DNA-Sequenzen zu adressieren, sollten diese Enzyme hochspezifisch und programmierbar sein, d.h. ihre Erkennungssequenz muss gezielt veränderbar sein.

Die vorliegende Erfindung beschreibt das Prinzip und die Verwendung von hoch¬ spezifisch mit DNA interagierenden Enzym-Konjugaten mit programmierbarer Spezifität. Diese erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate bestehen aus Enzymen, die über Linker kovalent mit Oligonukleotidderivaten verknüpft sind. Stand der Technik Der Stand der Technik kennt die hochspezifische Ausbildung von Tripelhelices mit Oligodesoxynukleotiden oder Peptidnukleinsäuren (peptide nucleic acids, PNAs). Triplex bildende Oligodesoxynukleotide benötigen eine DNA-Erkennungssequenz von 10-20 Basenpaaren. Anfangs wurde die Tripelhelix-Strategie nur bei DNA an¬ gewandt, bei der ein Strang ausschließlich Purine enthielt [AJ. Cheng und M.W. van Dyke (1994): Oligodeoxyribonucleotide length and sequence effects on inter- molecular purine-purine-pyrimidine triple helix formation. Nucleic Acids Research 22; 4742-4747]. Die DE 198 42 527 A1 beschreibt dagegen ein Verfahren zur Bil¬ dung Tripelhelix-bildender Oligomere auch für solche Nukleinsäure-Bereiche, in denen weder eine Homopurin- noch eine Homopyrimidin-Sequenz vorliegt, was die Flexibilität der adressierbaren Erkennungsstellen erhöht. In der genannten Pa¬ tentschrift wird darauf hingewiesen, dass die gleiche Vorgehensweise auch für die. Ausbildung von Doppelhelices gilt. Weder die genannte Homopurin-Strategie noch DE 198 42 527 A1 gestatten es allerdings, Nukleasen oder andere Enzyme spezi¬ fisch an bestimmte DNA-Regionen zu lenken.

Dagegen können PNAs im Prinzip jede DNA-Sequenz spezifisch erkennen, führen aber in Kombination mit Nukleasen zu DNA-Spaltungen, deren Position stark vari¬ ieren kann, da Nukleasen i.d.R. mehrere Zielstellen besitzen [K.l. Izvolsky, V.V. Demidov, P.E. Nielsen und M. D. Kamenetskii (2000): Sequence-specific protecti- on of duplex DNA against restriction and methylation enzymes by pseudocomple- mentary PNAs. Biochemistry 39; 10908-10913]. Die spezifische Erkennung von DNA mit Oligodesoxynukleotiden oder PNAs wird im Sinne einer Antigen-Technologie eingesetzt. Hierbei wird durch die Gabe eines TFOs (Tripelhelix-forming oligonucleotide = Tripelhelix-bildendes Oligonukleotid) die Ausbildung einer Tripelhelix im Gen- oder Promotorbereich eines Zielgens in- duziert, wodurch die Transkriptionsinitiation oder -elongation inhibiert wird [L. Good und P.E. Nielsen (1998): Antisense inhibition of gene expression in bacteria by PNA targeted to mRNA. Nature Biotechnology 16; 355-358]. Außerdem wurde die sequenzspezifische Erkennung von DNA mit TFOs für gezielte Mutagenese eingesetzt und um homologe Rekombinationen zu stimulieren [M. P. Knauert und P.M. Glazer (2001): Triplex forming oligonucleotides: sequence-specific tools für gene targeting. Human Molecular Genetics 10; 2243-2251]. Allerdings lassen sich bei allen diesen Vorgehensweisen die Ereignisse, die nach Ausbildung der Tripel¬ helix ablaufen (Inaktivierung der Genexpression, homologe Rekombination, Muta¬ genese) nicht vorherbestimmen und sind schwer zu beeinflussen. Eine Erweiterung der DNA-Erkennungsspezifität kann durch Fusion mit anderen DNA-bindenden Proteinen erzielt werden. Die DE 197 56 975 A1 beschreibt ein Protein, welches das zelluläre Protein p27 inhibiert und damit die durch p27 be¬ wirkte Hemmung der Zeilproliferation aufhebt, sowie Nukleinsäurekonstrukte aus Aktivierungs-, Binde- und Transkriptionssequenzen, die für das Inhibitorprotein von p27 codieren und für die Gentherapie von Erkrankungen verwendet werden sollen. Nachteil dieser Konstrukte ist, dass für die meisten potenziellen Zielse¬ quenzen keine geeignete DNA-Bindungsdomäne als Fusionspartner zur Verfü¬ gung steht, welche die Sequenz mit hinreichender Affinität und Spezifität bindet. Der Stand der Technik kennt Verfahren zur Herstellung von Konjugaten aus Nuk- leinsäuren und/oder Proteinen und weiteren Informations- und Funktionseinheiten wie Antikörpern, Enzymen und anderen Biomolekülen. So beschreibt die DE 197 45 668 A1 ein Verfahren zur Kopplung von Oligonukleotiden und Biomolekülen für Bioanalytik, Sensorik und Diagnostik. Die DE 44 21 079 C1 beschreibt chimäre Peptid-Nukleinsäure-Fragmente, die die zielgerichtete Einbringung in Zellorganel- len und Zellen ermöglichen soll. Beide Verfahren gestatten jedoch keine zielge¬ richtete Adressierung bestimmter Sequenzen in vitro und in vivo. Eine Alternative zur hochspezifischen Spaltung von DNA sind selten schneidende Restriktionsendonukleasen, die 8 und mehr Basen erkennen. Sog. Homing- endonukleasen wurden von Chevalier und Stoddard beschrieben [B. S. Chevalier und B. L. Stoddard (2001 ): Homing endonucleases: structural and functional insight into the catalysts of intron/intein mobility, Nucleic Acids Research 29; 3757-3774]. Sie erkennen wesentlich längere DNA-Sequenzen. Es gibt allerdings nur wenige dieser Endonukleasen, und im Falle von Homingendonukleasen sind die Erken¬ nungssequenzen oft nicht genau definiert. Hochspezifische DNA- Methyltransferasen sind nicht bekannt. Ein weiteres Problem ist, dass die Regio¬ nen der DNA, die adressiert werden sollen, normalerweise keine Erkennungsse¬ quenz für eines dieser Enzyme enthalten.

Die vorliegende Erfindung zeichnet sich gegenüber dem Stand der Technik da- durch aus, dass sie Konjugate aus Enzymen und sog. Spezifitätsankern bereit¬ stellt, die über einen Linker chemisch miteinander verknüpft sind. Spezifitätsanker sind dabei Oligodeoxynukleotide oder Peptidnukleinsäuren, die mit der Erken¬ nungsstelle der zu adressierenden DNA Doppel- oder Tripelhelices bilden. Die Erkennungsstelle auf der Ziel-DNA des Konjugates ist durch die Erkennungsse- quenzen des Spezifitätsankers und des Enzyms gegeben, wodurch das Konjugat hochspezifisch mit der Ziel-DNA wechselwirkt.

Aufgabe Aufgabe der Erfindung ist es, hochspezifisch mit DNA wechselwirkende Enzym- Konjugate mit programmierbarer Spezifität und ein Verfahren zu ihrer Herstellung bereitzustellen, wobei unter hochspezifisch mit DNA wechselwirkenden Enzym- Konjugaten verstanden wird, dass - innerhalb der Ziel-DNA genau eine Erkennungssequenz des Enzym- Konjugates existiert, - es sich bei der Wechselwirkung der Enzym-Konjugate mit der Erkennungsse¬ quenz auf der Ziel-DNA um eine enzymatisch katalysierte Reaktion handelt, - die enzymatisch katalysierte Reaktion ausgewählt ist aus der Gruppe Spal¬ tung oder Methylierung und homologe Rekombination und Induktion einer DNA-Reparatur oder gezielte Hemmung der Genexpression durch spezifische Methylierung der Ziel-DNA, und - die an der Erkennungsequenz der Ziel-DNA stattfindende, durch das Enzym- Konjugat katalysierte Reaktion mindestens zehnmal schneller abläuft als jede andere in Gegenwart des Enzym-Konjugats an anderen als der Erkennungs- sequenz der Ziel-DNA ablaufende Reaktion.

Die Aufgabe der Bereitstellung hochspezifisch mit DNA wechselwirkender Enzym- Konjugate mit programmierbarer Spezifität wird erfindungsgemäß gelöst durch die Merkmale des Anspruchs 1 , d.h. durch Enzym-Konjugate, bei denen ein Enzym über je einen Linker kovalent an mindestens einen sog. Spezifitätsanker gebunden ist, wobei - das Enzym auf seiner Oberfläche eine reaktive funktionelle Gruppe zur bin- dung eines Linkers aufweist, - es sich bei dem mindestens einen Spezifitätsanker um eine Oligonukleotidver- bindung handelt, die über eine komplementäre Basenpaarung mit einer Triplex-Bildungsstelle (TFS) der Ziel-DNA eine Tripelhelix ausbildet, und die am 5'-Ende oder am 3'-Ende eine reaktive funktionelle Gruppe aufweist, - der Spezifitätsanker eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zur Triplex-Bindungsstelle aufweist, - der mindestens eine Linker eine molekulare Verbindung darstellt, die mindes¬ tens eine Kette aus mindestens zwei Kohlenstoffatomen enthält, wobei die Kette an zwei Stellen mit gleichen oder verschiedenen reaktiven funktionellen Gruppen derivatisiert ist, - je eine der beiden reaktiven funktionellen Gruppen des mindestens einen Lin¬ kers eine kovalente chemische Bindung mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms und der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezifitätsankers ausbildet, und - Enzym und Spezifitätsanker mit einen Abstand von mindestens zwei Basen- paaren an die Ziel-DNA gebunden werden.

Die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Enzym- Konjugate bereitszustellen, wird erfindungsgemäß gelöst durch Anspruch 13, in¬ dem nacheinander folgende Schritte durchgeführt werden: - Umsetzung des Linkers mit dem Spezifitätsanker, wobei eine reaktive funktionelle Gruppe des Linkers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Spezifitätsankers eine kovalente chemische Bindung eingeht, - Umsetzung mit dem Enzym, wobei die zweite reaktive funktionelle Grup- pe des Linkers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms eine kovalente chemische Bindung eingeht, - Reinigung des Endproduktes.

Dem Fachmann ist bekannt, dass es sich bei Enzymen um biokatalytisch wirkende Proteine handelt, die substrat- und reaktionsspezifisch wirken, d.h. jedes Enzym katalysiert einen ganz bestimmten Reaktionsablauf, und dies auch nur bei be¬ stimmten Substraten, nämlich solchen, die nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip genau in die Bindungsstelle des betreffenden Enzyms passen. Als „spezifisch mit DNA interagierend" werden in der vorliegenden Erfindung Enzyme und Enzym- Konjugate verstanden, die substrat- und reaktionsspezifisch nur mit solchen DNA- Bereichen wechselwirken, deren Basensequenz nach dem Schlüssel-Schloss- Prinzip zur Erkennungsstelle des Enzyms passt. Diese Basensequenz bezeichnet der Fachmann als Erkennungssequenz (der Ziel-DNA). Dem Fachmann ist be¬ kannt, dass es zahlreiche DNA-Moleküle gibt, die die Erkennungssequenz für ein bestimmtes Enzym mehrfach aufweisen. Als „hochspezifisch mit DNA interagierend" werden dagegen in der vorliegenden Erfindung solche Enzym-Konjugate bezeichnet, deren Bindung und nachfolgende substrat- und reaktionsspezifische Wechselwirkung mit der Ziel-DNA von zwei Faktoren abhängt: zum Einen - wie im Falle der oben beschriebenen spezifischen Interaktion - von der Erkennungssequenz für das Enzym, zum Anderen von einer Triplex-Bildungsstelle (TFS) auf der Ziel-DNA, wobei diese TFS benachbart zur Erkennungssequenz für das Enzym liegen muss. Dabei legen Oligonukleotid- und Linkeranteil des Enzym-Konjugates fest, an welcher Stelle der Ziel-DNA und in welchem Abstand zum Enzymanteil des Enzym-Konjugates die Triplexbildung zwi- sehen TFS der Ziel-DNA und Triplex-bildendem Olignukleotidanteil des Enzym- Konjugates erfolgt. Die Spezifität eines derartigen erfindungsgemäßen Enzym- Konjugates kann daher „programmiert" werden, d.h. selbst im Falle von Ziel-DNA, die mehr als eine Erkennungssequenz für ein gewähltes Enzym aufweist, wird durch Kopplung mit einem bestimmten Triplex-bildenden Oligonukleotid und einem Linker (= „Programmierung") erreicht, dass auf der Ziel-DNA genau eine Erken¬ nungssequenz für das Konjugat aus Enzym und TFO existiert. Sollte diese Erken¬ nungssequenz für das Konjugat aus Enzym und TFO mehr als einmal in einer ge¬ nomischen Ziel-DNA auftreten, wird die Anzahl derjenigen Stellen der Ziel-DNA, an die das Konjugat bindet, dennoch gegenüber der Anzahl der Bindungsstellen des unkonjugierten Enzyms minimiert durch das Erfordernis einer der Erken¬ nungssequenz des Enzyms benachbarten TFS (s.o.).

Zur Herstellung von Enzym-Konjugaten mit programmierbarer Spezifität wird das Enzym chemisch über einen Linker an ein Reagenz gekoppelt, das in der Lage ist, DNA spezifisch zu erkennen. Dieses Reagenz wird nachfolgend als „Spezifitäts- anker" bezeichnet. Solche Spezifitätsanker sind z.B. Oligodesoxynukleotide oder Peptidnukleinsäuren (peptide nucleic aeids, PNA), welche doppelsträngige DNA spezifisch über die Ausbildung einer Doppel- (duplex invasion oder double duplex invasion) und/oder Tripelhelix erkennen können. Die DNA-Erkennung über Doppel- bzw. Tripelhelices erfolgt nach Regeln der Basenpaarung, so dass vorhersagbar ist, welche Sequenz der zu verwendende Spezifitätsanker aufweisen muss, um eine bestimmte Zielse¬ quenz zu erkennen. Der Spezifitätsanker muss eine Sequenzhomologie von min¬ destens 85 % zur TFS der Ziel-DNA aufweisen. Bei einer Länge des Spezifitäts ankers von 12 Basenpaaren entspricht eine Sequenzhomologie von 85 % einer Fehlpaarung. Homologie meint dabei eine komplementäre Identität der intramole¬ kularen Nukleotidbasenpaarung von TFO und TFS, so dass 100 % Sequenzhomo¬ logie bedeuten, dass jeder Nukleotidbase des TFO nach den Regeln der Basen¬ paarung eine jeweils komplementäre Nukleotidbase auf der TFS gegenübersteht. Unter Linker wird eine molekulare Verbindung verstanden, die mindestens eine Kohlenwasserstoffkette aus mindestens zwei C-Atomen enthält, wobei die Kette an zwei Stellen mit gleichen oder verschiedenen reaktiven funktionellen Gruppen derivatisiert ist, wobei Linker mit zwei verschiedenen reaktiven funktionellen Grup¬ pen bevorzugt sind. Diese reaktiven funktionellen Gruppen bilden in bekannten chemischen Reaktionen kovalente chemische Bindungen aus, wobei zuerst eine der funktionellen Gruppen an den Spezifitätsanker und die andere an das Enzym bindet. Alternativ wird zuerst die kovalente Bindung zwischen Linker und Enzym und danach diejenige zwischen Linker und Spezifitätsanker gebildet. Bei diesen chemischen Reaktionen handelt es sich beispielsweise, aber nicht erschöpfend, um die Bildung von Ether-, Thioether-, Ester-, Thioester- oder Amidbindungen. Bevorzugt besteht der Linker aus der kovalenten Verknüpfung eines 5'-Link oder 3'-Link mit einem Crosslinker. Dabei stellt der 5'-Link oder 3'-Link eine molekulare Verbindung dar, die 1. eine Kohlenwasserstoffkette aus mindestens zwei C- Atomen enthält, 2. an das 5'-Ende oder 3'-Ende des Spezifitätsankers gebunden ist und die 3. an einer Stelle eine reaktive funktionelle Gruppe enthält. Dem Fach- mann ist bekannt, dass Nukleinsäurederivate wie Oligodesoxyribonukleotide (ODN) oder PNA, die chemisch mit einem solchen 5'-Link oder 3'-Link verbunden sind, kommerziell erhältlich sind. Bei der reaktiven funktionellen Gruppe handelt es sich z.B. um eine primäre Aminogruppe. Der Crosslinker stellt eine molekulare Verbindung aus mindestens einer Kohlen¬ wasserstoffkette dar, wobei diese mindestens eine Kohlenwasserstoffkette min¬ destens zwei C-Atome enthält und an zwei Stellen reaktive funktionelle Gruppen enthält. Bei den reaktiven funktionellen Gruppen handelt es sich beispielsweise um Ester-, Carbonsäure-, Imid- und/oder Aminogruppen, bevorzugt um Succinimi- dester- und Maleimidogruppen. Stellt der Crosslinker einen Teil der erfindungsge¬ mäßen Enzym-Konjugate dar, so ist eine seiner reaktiven funktionellen Gruppen mit dem Enzym und die andere mit der reaktiven funktionellen Gruppe des che¬ misch an den Spezifitätsanker gebundenen 5'-Link oder 3'-Link jeweils kovalent verbunden. Unter „programmierbarer Spezifität" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate dergestalt mit einer komplementären DNA-Adresse versehen werden, dass ihre Wechselwirkung mit DNA nach dem Fachmann bekannten Regeln genau einstellbar und hochspezi¬ fisch ist. Die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate - Enzyme, Spezifitätsanker, 5'-Link, 3'-Link und Crosslinker - sind nachfolgend im Detail be¬ schrieben.

Bei den Enzymen, welche erfindungsgemäß über je einen Linker kovalent an min- destens einen sog. Spezifitätsanker gebunden sind, handelt es sich um Typ Il-Restriktionsendonukleasen, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend AcH, Alu\, Bfa\, BsaJ\, Bsl\, BsoR, BssK\, BstU\, Cac8\, Cha\, Csp6\, CwJI, Ddβ\, Dpn\, DpnW, Fmu\, Fnu4H\, Haelll, Hha\, Hinü, HinPI, HpaU, MaeU, Maβ\\\, Mbo\, Mnl\, Mse\, Msp\, Mwo\, MaIII, MaIV, Rsal, Sau3A\, Sau96\, ScrR, Tai\, Taq\, Tsp4C\, TspsO9\, AcIWl, Alw26\, AM, AsuHPl, AvaW, Bbv\, Bcc\, ßcefl, Bin\, Bsb\, BscGl, Bsel\,BseN\, BsmA\, BsmF\, BspLUIHW, Bsή, BsrS\, Bst7l\, BstF5\, BstNl, Cje\, CjeP\, EcoRW, Faul, Fin\, Fok\, Hga\, Hph\, MboU, NcH, Ple\, SfaN\, Sim\, Tau\, T/71, Tsel, Tsp45\, TspR\, VpallA\, Acc\, Afl\\\, Apo\, /Aval, ßanl, ßanll, Bmgl, Bsa\, BsaH\, BsaW\, BsiEl, BsiHKAΪ, BsoBl, Bsp1286\, BsrF\, BstY\, Dsa\, Eae\, EcoO109\, Gc(ZII, Hael, Haell, Hin4\, HincW, Mme\, MsIl, MspAW, Nsp\, Scf\, Sty\, Tat\, TtNIIW, Aat\, Accll3\, Acc65\, AclN\, AfIW, Alw44\, Apa\, Apaü, Ase\, Asp718\, /WrII, Sa/l, ßamHI, Bbu\, Bbs\, BcH, Bf ή, BgIW, Bln\, BpH, Bpm\, Bsa\, BsaM\, BseR\, ßsmßl, ßsml, Bsp120\, Bspl407\, Bsp19\, Bsphft, BspLUIH, BspM\, BspT\, BsrG\, BstllO7\, Bst98\, Dra\, EamllO4\, Eaή, Ecll36\\, Eco147\, Eco255\, E- co57\, EcoN\, EcoR\, EcoRV, EcoT22\, HindlW, Hpa\, Kpn\, Mfe\, Msc\, Λ/col, Λ/ctel, Miel, NsH, Psü, PvuW, Sac\, Sca\, Spe\, Sph\, Ssp\, Sst\, Stu\, Xba\, AatW, Bbe\, BsH, BsiW\, BsmB\, BspD\, BsrB\, BssHW, Bst2B\, Cla\, Eag\, EcH, Eco47W\, Ehel, Esp3\, Fsp\, Kas\, Mlu\, Naή, Nru\, PfH 1081, PmH, Psp1406\, Pvu\, SacW, Snaßl, Xho\, Asc\, Bae\, Fse\, Noü, Päd, Pme\, PpuM\, Rsή\, SanD\, Sap\, SexA\, SfH, Sgfl, SgrA\, Srft, Sse8387\, Swa\ Asp\, BgH, Bsg\, Dralll, DsaV, EcIXi, Ksp632\, Mae\, Mam\, Mcή, Mun\, Rle\, Ssp4800\, andere spezifisch DNA spaltende Nukleasen, insbesondere Homingendo- nukleasen, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend, I-Crel, I-Ppol, F-Scel, F-Scell, F-SwI, F-Tevl, F-Tet/Il, \-Ama\, \-Ani\, I-Ceul, \-CeuA\\P, \-Chu\, I-Cmoel, I-Cpal, I-Cpall, I-Crel, \-Crepsb\P, 1-CrepsbllP, 1-CrepsblllP, \-Crepsb\\/P, \-Csm\, \-Cvu\, \-CvuA\P, I-Dcf/I, \-Ddi\\, \-Diή, \-Dmo\, \-Hmu\, \-Hmu\\, \-HspN\P, l-L/al, \-Mso\, l-Λ/aal, l-Λ/anl, l-Λ/c/IP, 1-Λ/α/rlP, \-Nit\, l-Λ/yal, \-Nsp236\P, \-Pak\, \-Pbo\P, \-Pcu\P, \-PcuA\, 1-PcuVI, \-PgήP, \-Pob\P, \-Poή, 1-PorllP, 1-PpblP, I-Ppol, 1-SPBetelP, I-Scal, I-Scel, I-Scell, I-Scelll, 1-ScelV, 1-SceV, 1-SceVI, 1-SceVII, 1-SexlP, 1-SnelP, 1-SpomCP, 1-SpomlP, l-SpomllP, l-SqrulP, \-Ssp6803\, \-SthPhiJP, \-SthPhiST3P, \-SthPhiS3bP, l-TcfelP, \-Tev\, \-Tev\\, \-Tev\W, \-UarAP, \-UarHGPA1P, \-UarHGPA13P, Pl-Pspl Pl-SPßetelP, Pl-Scel, PI-TfUl, PI-TYuII, P\-Thy\, PI-77/I, PI-77/II. DNA-Reparaturenzyme, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend, MutH und Vsr, - DNA-Methyltransferasen, wie beispielsweise, aber nicht erschöpfend, M.Sssl, M.Hhal, EcoDam, DNA-Methyltransferasen aus Säugern oder katalytisch akti¬ ve aktive Fragmente davon, darunter beispielsweise die humanen Methyltrans- ferasen DNMT1 , DNMT3a und DNMT3b,

Die Bindung des Enzyms an den Linker erfolgt durch Ausbildung einer kovalenten chemischen Bindung zwischen einer reaktiven funktionellen Gruppe des Linkers und der auf der Oberfläche zugänglichen reaktiven funktionellen Gruppe des En¬ zyms. Bei dieser auf der Oberfläche zugänglichen reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms handelt es sich beispielsweise um ein singuläres Cystein im Falle einer Restriktionsendonuklease oder um einen mit Hilfe einer ortsspezifischen Mu- tagenese in eine Methyltransferase eingeführtes Cystein. Alternativ sind bei¬ spielsweise Enzyme ohne oberflächlich zugängliches Cystein einsetzbar, wobei in diesem Falle bevorzugt Oligonukleotidderivate eingesetzt werden, die einen 5'- SH-Link oder 3'-SH-l_ink aufweisen. Dem Fachmann ist bekannt, wie er weitere oberflächlich zugängliche funktionelle Gruppen in Enzyme einführen kann. Er kann diese Methoden, ohne den Schutzbereich der Patentansprüche zu verlassen, ver¬ wenden, um die im Rahmen der vorliegenden Erfindung einzusetzenden Enzyme gegebenenfalls dergestalt zu modifizieren, dass sie mit einem Linker umsetzbar sind.

Bei den Spezifitätsankern handelt es sich um Oligonukleotide und Oligonukleotid- analoga - zusammengefasst als „Oligonukleotidverbindungen" bezeichnet -, die aus 10 bis 20 Nukleotiden bestehen, um eine spezifische Adressierung zu ge¬ währleisten und eine Paarung einzugehen, die hinreichend stabil ist, um unter den Reaktionsbedingungen in der Zelle oder in vitro eine Bindung des Konjugats an die Zielsequenz sicherzustellen, die eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zur TFS der Ziel-DNA aufweisen, beispielsweise um - Oligodesoxyribonukleotide (ODN) und ihre Derivate, darunter beispielsweise Oligonukleotide, deren Phosphatgerüst teilweise Phosphodiester- und teilwei- se oder ausschließlich modifizierte Phosphorothioatgruppen aufweist, Me- thylphosphonat-, H-Phosphonat- oder andere phosphatanaloge Gruppen auf¬ weist oder durch andere Verbindungen ersetzt ist, wie beispielsweise die Me- thylen(methylimino)- oder Methylencarboxamid-Gruppe, sowie ODN1 deren Ri- boseeinheit am 2'-C- oder 4'-C-Atom modifiziert ist oder durch einen anderen Zucker ersetzt ist, wie beispielsweise das α-Anomer der Desoxyribose, Peptidnukleinsäuren (PNA), - Threose-Nukleinsäureanaloga (TNA), beispielsweise α-Threofuranosyl-(3'->2')-Oligonukleotide, die mit DNA eine Tripelhelix bilden oder spezifisch mit einem Strang der DNA eine Paarung eingehen können

Dem Fachmann ist bekannt, dass zahlreiche der genannten Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga, mit einem 5'-Link oder 3'-Link versehen, kommerziell er¬ hältlich sind, während er nicht kommerziell erhältliche, beispielsweise mit einem 3'- oder 5'-Link versehene TNAs, PNAs und Oligonukleotidderivate mit ß- anomerer Ribose mit Hilfe seines Fachwissens selbst herstellen kann. Bevorzugt werden Olignukleotide und Oligonukleotidanaloga mit einem 5'-Aminolink verwen¬ det, wobei es sich bei dem 5'-Aminolink beispielsweise um eine ω- Aminoalkylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen handelt, besonders bevorzugt mit 2 bis 12 C-Atomen, verwendet, darunter ω-Aminohexyl- und ω-Amino-n- dodecylgruppen. Alternativ werden Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga mit einem 5'-SH-Link oder 3'-SH-Link verwendet.

Als Crosslinker, die kovalent an die reaktive funktionelle Gruppe des 5-Link oder 3'-Link des Spezifitätsankers und die oberflächlich zugängliche reaktive funktionel- Ie Gruppe des Enzyms gebunden werden, sind Verbindungen geeignet, die über zwei reaktive funktionelle Gruppen verfügen, von denen eine spezifisch mit der reaktiven funktionellen Gruppe des 5'-Link oder 3'-Link des TFO und die andere mit der oberflächlich zugänglichen reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms verbunden wird, beispielsweise eine Succinimidester- und eine Maleimidfunktion, wie es in N-(γ-Maleimidobutyryloxy-)succinimidester der Fall ist. Weitere Crosslin- ker sind dem Fachmann bekannt und können, ohne den Schutzbereich der Pa¬ tentansprüche zu verlassen, verwendet werden. Die beiden reaktiven funktionellen Gruppen des Crosslinkers sind bevorzugt in einem Abstand von 1 bis 20 CH2- Gruppen und ganz besonders bevorzugt in einem Abstand von 6 bis 12 CH2- Gruppen angeordnet. Erfindungsgemäß deckt die durch Verknüpfung von Crosslinker und 5'-Link oder 3'-l_ink gebildete, als Linker bezeichnete Einheit, auf der Ziel-DNA des Enzym- Konjugates einen Abstand von mindestens 2 Basenpaaren, bevorzugt 2 bis 20 bp, zwischen Erkennungssequenz für das Enzym und der Adresse für das TFO auf der Ziel-DNA ab.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Enzyme mit programmierbarer Spezifität erfolgt durch eine kovalente Kopplung von Spezifitätsanker und Enzym mit Hilfe bifunktioneller Crosslinker. Es werden kommerziell erhältliche Crosslinker wie bei- spielsweise N-(γ-Maleidobutyryloxy-)succinimidester eingesetzt, die auf der einen Seite des Spezifitätsankers mit der reaktiven funktionellen Gruppe des 5'-Link o- der 3'-Link reagieren und auf der anderen Seite mit der oberflächlich zugängli¬ chen, d.h. zum Lösungsmittel hin exponierten, reaktiven funktionellen Gruppe des Enzyms, bei der es sich beispielsweise um ein Cystein oder eine nicht natürliche Aminosäure handelt. Das mit dem TFO verknüpfte Enzym muss von dem freien Enzym abgetrennt werden, was durch chromatographische Verfahren geschieht, beispielsweise durch lonenaustauschchromatographie.

Tripelhelixbildung mit Oligodesoxyribonukleotiden oder PNAs ist hochspezifisch. Während Oligodesoxyribonukleotide eine DNA-Erkennungssequenz von 10 bis 20 Basenpaaren benötigen, können PNAs jede Sequenz spezifisch erkennen. Die vorliegende Erfindung nutzt diese Spezifität, um die Spezifität der DNA-Erkennung eines mit DNA interagierenden Enzyms zu erhöhen, indem die inhärente Spezifität des mit DNA interagierenden Enzyms beibehalten und erweitert wird. Damit wird sichergestellt, dass an der DNA eine chemisch definierte Modifikation vorgenom¬ men wird. So wird die DNA z.B. von einem erfindungsgemäßen TFO- Restriktionsendonuklease-Konjugat weiterhin an der für das Restriktionsenzym definierten Spaltposition gespalten. Ein erfindungsgemäßes TFO- Methyltransferase-Konjugat überträgt Methylgruppen weiterhin nur auf die Zielba- se innerhalb der Erkennungssequenz der Methyltransferase. In beiden Fällen werden durch die erfindungsgemäßen Konjugate aber nicht alle Zielsequenzen dieses Enzyms auf der Ziel-DNA-gespalten bzw. methyliert, sondern nur diejeni¬ gen, welche benachbart auch die Erkennungssequenz für das TFO aufweisen.

Die erfindungsgemäßen hochspezifisch mit DNA wechselwirkenden Enzym- Konjugate mit programmierbarer Spezifität sind für zahlreiche Anwendungen ge¬ eignet, bei denen unterschiedliche Gene und DNA-Sequenzen, unabhängig da¬ von, ob sie aus Prokarya, Eukarya oder Archaea stammen, gezielt adressiert wer¬ den müssen und/oder eine spezifische Manipulation von DNA erforderlich ist. Un- ter gezielter Adressierung ist hierbei die exklusive Adressierung von solchen Er¬ kennungssequenzen eines Enzyms zu verstehen, die einer TFS benachbart sind. Dabei findet keine enzymatische Reaktion an solchen Erkennungsstellen des En¬ zyms statt, welche keiner TFS benachbart sind. Eine spezifische Manipulation von DNA bedeutet, dass die Manipulation ortsspezifisch bezogen auf Sequenz und Spalt- oder Modifikationsstelle ist und eine definierte chemische Reaktion kataly¬ siert wird. So können programmierbare Restriktionsendonuklease-Konjugate zur Manipulati¬ on großer DNA-Moleküle in vitro eingesetzt werden, da sie für die gezielte Spal- tung jeder geforderten Stelle der Ziel-DNA programmierbar sind. Unter „groß" werden dabei DNA-Moleküle verstanden, die aus mindestens 10.000 Basenpaa¬ ren bestehen. Diese programmierbaren Restriktionsenzym-Konjugate sind daher beispielsweise zur Klonierung und Charakterisierung von kleinen und großen DNA-Fragmenten geeignet. Die erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate eignen sich für das in vitro-Mapping genomischer DNA. Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass es hierbei - und bei allen anderen in vitro-Verwendungen - nicht zwingend erforderlich ist, dass die Erkennungssequenz für ein erfindungsgemäßes Enzym-Konjugat auf der Ziel- DNA nur ein einziges Mal vorkommt. Zur Verwendung in vitro sind solche erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate geeig¬ net, bei denen der Spezifitätsanker eine Sequenzhomologie von mindestens 85 % zur TFS der Ziel-DNA aufweist und bei denen die an der Erkennungsequenz der Ziel-DNA stattfindende, durch das Enzym-Konjugat katalysierte Reaktion mindes¬ tens zehnmal schneller abläuft als jede andere in Gegenwart des Enzym- Konjugats an anderen als der Erkennungssequenz der Ziel-DNA ablaufende Re¬ aktion. Bevorzugt werden solche erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate für in vitro-Verwendungen eingesetzt, bei denen die Sequenzhomologie zwischen TFO und TFS 90 % bis 100 % beträgt und die durch das Enzym-Konjugat katalysierte Reaktion mindestens 100 mal schneller abläuft als jede andere in Gegenwart des Enzym-Konjugats an anderen als der Erkennungssequenz der Ziel-DNA ablaufen¬ de Reaktion. Ganz besonders bevorzugt sind Enzym-Konjugate, bei denen der Spezifitätsanker eine Sequenzhomologie von 100 % zur TFS der Ziel-DNA aufweist und die an der Erkennungsequenz der Ziel-DNA stattfindende, durch das Enzym-Konjugat kata¬ lysierte Reaktion mindestens tausend Mal schneller abläuft als jede andere in Ge¬ genwart des Enzym-Konjugats an anderen als der Erkennungssequenz der Ziel- DNA ablaufende Reaktion. Diese ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate eignet sich außerdem für Verwendun- gen in vivo, sofern auf der Ziel-DNA genau eine Erkennungssequenz für dieses Enzym-Konjugat existiert und diese Erkennungssequenz genau einmal auf der Ziel-DNA vorliegt.

Nach dem derzeitigen Stand der Technik ist die geringe Ausbeute, mit der in ZeI- len eingebrachte DNA durch Rekombination in das Gen integriert wird, ein zentra¬ les Problem der Gentherapie. Das Einbringen eines spezifischen Doppelstrang¬ bruchs erhöht die Ausbeute der Rekombination mehr als 1000-fach. Die erfin¬ dungsgemäßen programmierbaren Restriktionsendonuklease-Konjugate schnei¬ den die DNA dagegen gezielt an der Zielstelle, stimulieren dadurch die homologe Rekombination und steigern damit die Effizienz des Austausche von Ziel-DNA- Sequenzen mit dem Ziel der DNA-Reparatur durch exogene DNA (gene targeting). Hierbei ist auch sichergestellt, dass die exogene DNA an einem vorbestimmten Ort in das Genom integriert wird. Programmierbare Restriktionsendonuklease- Konjugate eignen sich somit für die Gentherapie und die experimentelle Genetik zur Erzeugung von Organismen, beispielsweise tierischen oder pflanzlichen Orga- nismen, mit Veränderungen in der DNA-Sequenz. Des Weiteren stimulieren die erfindungsgemäßen hochspezifisch mit DNA wechselwirkenden Enzyme die DNA- Reparatur in Zellen durch einen gezielten Doppelstrangbruch. Eine gezielte DNA-Methylierung mit Hilfe der erfindungsgemäßen hochspezifisch mit DNA wechselwirkenden Enzyme ist für die in vitro-Manipulation von DNA ge¬ eignet, indem beispielsweise DNA gezielt an einem Adeninrest einer GATC- Sequenz methyliert und die modifizierte Sequenz durch das Restriktionsenzym Dpnl gezielt gespalten wird. Da DNA-Methylierung eine stabile Repression der Genexpression induziert, eig- nen sich erfindungsgemäße programmierbare DNA-Methyltransferasen zur Re¬ pression der Genexpression. Eine gezielte Repression von Genen hat eine Reihe von biomedizinischen Anwendungen, denen gemein ist, dass z.B. die Expression eines Krankheitsgens inhibiert wird. Bei den in Frage kommenden gewünschten Inhibierungsreaktionen handelt es sich beispielsweise um die Repression der Ex- pression von Onkogenen in der Tumortherapie oder die Repression der Expressi¬ on viraler Proteine bei der Bekämpfung von viralen Infektionen. Bei amyloiden Speichererkrankungen (z.B. Parkinson, Alzheimer) wird die Expression des Vor¬ läuferproteins inhibiert und damit die Progression der Krankheit gestoppt. Ein Vor¬ teil der erfindungsgemäßen programmierbaren DNA-Methyltransferase- Konjugaten ist, dass ein einmal verändertes Methylierungsmuster der DNA stabil bleibt und vom zellulären Methylierungssystem erhalten wird. Daher ist keine dau¬ erhafte Anwesenheit der erfindungsgemäßen programmierten DNA- Methyltransferase erforderlich, und die genomische DNA-Sequenz der Zielzelle bleibt unverändert. Die erfindungsgemäßen Enzym-Konjugate sind des weiteren als Hilfsmittel für die biomedizinische Forschung geeignet, beispielsweise für die experimentelle Reduk¬ tion der Expression eines Gens, für die Herstellung transgener Organismen oder zur Manipulation von DNA, besonders für die Manipulation großer DNA-Moleküle.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung von Kits verwendet wer¬ den, die Mittel zur Kopplung von Crosslinkeren an Enzyme und mit einem 5'-Link oder 3'-Link versehene Spezifitätsanker bereitstellen, so dass die mit einem 5'- Link oder 3'-Link versehenen Spezifitätsanker zunächst mit den bereit gestellten Crosslinkem und anschließend mit den bereit gestellten Enzymen zu erfindungs¬ gemäßen Enzymkonjugaten umgesetzt werden. Dem Hersteller des erfindungs¬ gemäßen Kits ist aus seinem allgemeinen Wissen bekannt, wie er die einzelnen Komponenten des Kits, z.B. Enzyme, Crosslinker, Spezifitätsanker und Puffer, herstellt, formuliert und lagert.

Die erfindungsgemäßen hochspezifisch mit DNA interagierenden Enzym- Konjugate mit programmierbarer Spezifität können als Arzneimittel für Patienten zur Therapie, Diagnostik und Prophylaxe von Erkrankungen verwendet werden, bei denen eine Störung der Genexpression auftritt, wobei unter Störung sowohl pathogene Hyper- als auch Hypoexpression verstanden wird. Bei diesen Erkran¬ kungen handelt es sich beispielsweise um Viruserkrankungen (z.B. AIDS, Herpes simplex), Tumorerkrankungen (z.B. chronische myeloische Leukämie), amyloide Speichererkrankungen (Creutzfeld-Jakob-Krankheit, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson). Des Weiteren zählen hierzu monogen hereditäre Erkrankungen, dar- unter Muskoviszidose (Cystische Fibrose), Phenylketonurie, Albinismus, Adreno- genitales Syndrom, Mukopolysaccharidosen, Galaktosämie, hereditäre Taubstummheit, Xeroderma pigmentosum, Sichelzellanämie, Brachydaktylie, A- chondroplasie, Apert-Syndrom, Neurofibromatose, Marfan-Syndrom, Osteogene¬ sis imperfecta Typ I1 Chorea Huntington, Myotone Dystrophie, Rot-Grün- Farbsinnstörungen, Hämophilie A und B, Muskeldystrophie Typ Duchenne / Typ Becker, Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel, Glykogenspeicherkrankhei- ten (z.B. Pompe). Der Begriff Patient bezieht sich dabei gleichermaßen auf Menschen und Wirbeltie¬ re. Damit können die Arzneimittel in der Human- und Veterinärmedizin verwendet werden. Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen von Verbindungen gemäß den Ansprüchen deren Salze, Ester, oder Amide können, sofern sie nach zuver¬ lässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen. Die therapeutisch wirksamen Ver¬ bindungen der vorliegenden Erfindung können dem Patienten als Teil einer phar- mazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intracistemal, intravaginal, intraperitoneal, intravasculär, intrathekal, intravesikal, topisch, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Spray¬ form (Aerosol) verabreicht werden. Die intravenöse, subkutane, intraperitoneale oder intrathekale Gabe kann dabei kontinuierlich mittels einer Pumpe oder Dosier- einheit erfolgen. Dosierungsformen für die örtliche Administration der erfindungs¬ gemäßen Verbindungen schließen Salben, Puder, Zäpfchen, Sprays und Inhalati¬ onsmittel ein. Die aktive Komponente wird dabei unter sterilen Bedingungen mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen stabilisierenden und/oder konservierenden Zusätzen, Puffern, Verdünnungs- und Treibmitteln je nach Bedarf vermischt. Ausführungsbeispiele

1. Proteine und Oligonukleotide Als Bindungspartner zur Herstellung eines adressierten Restriktionsenzyms wird die einzelsträngige Variante scPvull des Restriktionsenzyms Pvull verwendet, da in dieser Variante ein einzelnes Cystein für die Kopplung mit dem TFO einführbar ist. Am C-Terminus von scPvull wird ein His6-tag, gefolgt von vier Glycinresten und einem Cysteinrest eingeführt: [2-157]-GSGG-[2-157J-H6G4C. Diese einen Cysteinrest enthaltende Variante des ScPvUlI-H6G4C wird durch eine PCR-basierte ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung von pRIZ'-scPvull als Templat hergestellt. Die PCR-basierte ortsspezifische Mutagenese. ist dem Fachmann bekannt und in RD Kirsch, E JoIy: An imporved PCR-mutagenesis stra- tegy for two-site mutagenesis or sequence swapping between related genes. Nuc- leic Acids Res 1998, 26, 1848-1850 beschrieben. Die Verwendung von pRIZ'- scPvull als Templat ist dem Fachmann beispielsweise aus A Simoncsits, ML Tjornhammar, T Rasko, A Kiss, S Pongor: Covalent joining of the subunits of a homodimeric type Il restriction endonuclease: single-chain Pvull endonuclease, J Mol Biol 2001 , 309, 89-97 bekannt. Die His6-tagged scPvull-Variante wird nach der dem Fachmann aus W Wende, W Grindl, F Christ, A Pingoud, V Pingoud: Binding, bending and cleavage of DNA Substrates by the homing endonuclease Pl-Scel, Nucleic Acids Res 1996, 24, 4123-4132 bekannten Methode exprimiert und aufgereinigt und in 0,03 M K-Phosphat pH 7,2, 0,5 M NaCI, 0,2 M Imidazol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,01 % Lubrol (w/v) bei 4 0C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Triplex bildende Oligonukleotide (TFO) enthalten einen 5'-C6-Spacer oder einen 5'-C6-Spacer mit einer terminalen Aminogruppe (Eurogentec, Köln, Deutschland): 5'-NH2-[CH2]6/12-MPMPMPMPMPPPPPPT-3', wobei M für 5-Methyl-2'- desoxycytidin und P für 5-[1-Propinyl]-2'-desoxyuridin steht.

2. Gelelektrophoretischer Mobilitätsshift-Assay Gelelektrophoretische Mobilitätsshift-Assays werden mit den TFO und einem kom¬ plementären doppelsträngigen Oligonukleotid durchgeführt. Hierzu werden 50 bis 500 nM TFO mit 500 nM 32P-markiertem doppelsträngigem 5'- d(GAGAGAGAGAAAAAAA) -3' in 10 mM Tris-Phosphat, pH 7,2, 1 mM Spermin bei 37 0C für 1 h in einem Volumen von 15 μl inkubiert. Anschließend werden 5 μl 10 mM Tris-Phosphat pH 7,2, 25 % (w/v) Sucrose zugegeben. Die Komplexbil¬ dung wird mittels Gelelektrophorese über 15%-ige Polyacrylamidgele in 10 mM Tris-Phosphat, pH 7,2, bestimmt. Nach der Elektrophorese werden die Gele ge- trocknet und die radioaktiven Banden mit einem Instant Imager (Canberrra Pa¬ ckard) sichtbar gemacht. Die quantitative Auswertung der gelelektrophoretischen Mobilitätsshift-Assays ergibt für die Bindung zwischen TFO und ds DNA eine Bin¬ dungskonstante KaSs=6,4*10'7M"1.

3. Assay zur Untersuchung des Schutzes von Restriktionsenzymen vor Spaltung Der Assay zur Untersuchung des Schutzes von Restriktionsenzymen vor Spaltung wird mit einem 150 bp DNA-Substrat durchgeführt, das eine Fokl-Stelle und eine daneben liegende, die Spaltungsstelle von Fokl überlappende Tripelhelix- Bildungsstelle (TFS) stromabwärts aufweist. 1 μM Substrat wird in 10 mM Tris- Phosphat pH 7,2 mit 10 μM TFO oder - im Falle der Kontrolle - einem nicht spezi¬ fischen Hexadecadeoxyribonukleotid für 4 h bei 37 0C in 70 μl Gesamtvolumen inkubiert. Anschließend werden 40 U Fokl in Spaltungspuffer bis zu einem Endvo¬ lumen von 100 μl zugegeben. Nach 30, 60, 90, 120, 300, 600, 1200,1800, 2700 und 3600 Sekunden werden 10 μl-Aliquote entnommen und die Reaktion durch Zugabe von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 50 mM beendet. Nach Zu¬ gabe von 5 μl Ladepuffer (10 % w/v) Ficoll, 10 % (w/v) Glycerin, 0,2 % (w/v) Bromphenolblau, 0,2 % Xylencyanol) wird der Spaltungsschutz durch Elektropho¬ rese über 12 %-ige Polyacrylamidgele in 80 mM Tris-Phosphat pH 8,2, 2 mM ED- TA bestimmt. Die Banden werden durch Färben des Gels mit Ethidiumbromid (0,1 μg/ml) und Bestrahlen mit UV-Licht sichtbar gemacht.

4. Crosslinking-Reaktion Zur Aktivierung des Oligonukleotids werden 500 μM TFO mit 40 mM des bifunktio- nalen Crosslinkers N-(γ-Maleidobutyryloxy)-succinimidester (GMBS) (Pierce Che¬ mical, Rockford / Illinois, USA) in 140 mM NaCI, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1 ,4 mM K2HPO4, pH 7,2 (PBS-Puffer) für eine Stunde bei 23 0C inkubiert. Nicht umgesetzter Crosslinker wird mittels Anionenaustauschchromatographie in zwei Schritten entfernt, wobei im ersten Schritt eine NAP®5- und im zweiten Schritt eine NAP®-10-Säule (Amersham, Braunschweig, Deutschland) verwendet wird. Das entsalzte aktivierte TFO wird in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Reines, ent¬ salztes aktiviertes TFO wird in einer Ausbeute von >70 %, bezogen auf das als Edukt eingesetzte nicht aktivierte TFO, erhalten. Das entsalzte aktivierte TFO wird in 80 μl PBS-Puffer gelöst. Für die Crosslinking-Reaktion zwischen Oligonukleotid und Protein werden 80 μM aktiviertes TFO für 1 h bei 23 0C mit 20 μM scPvull- H6G4C inkubiert. Das scPvull-H6G4C wird zuvor für 4 h gegen PBS-Puffer dialy- siert, um DTT zu entfernen. Die Ausbeute der Crosslinking-Reaktion wird mittels 15%-iger SDS-PAGE bestimmt.

5. Protein-TFO-Aufreinigung Nicht kovalent mit dem TFO verknüpfte ScPvUlI-HeG4C wird durch Anionen- austauschchromatographie von quervernetztem scPvull-H6G4C-c6/ci2-TFO ge¬ trennt, wobei DE52 in 10 mM Tris-HCL pH 7,5, 3 mM EDTA und ein linearer Gra¬ dient von 100 mM bis 400 mM NaCI verwendet werden. Der Proteingehalt jeder Fraktion wird mittels 15 %-iger SDS-PAGE bestimmt. scPvull-H6G4C eluiert mit dem ersten Durchfluss, d.h. bevor mit der Gradientenelution begonnen wird, wo¬ hingegen scPvull-H6G4C-c6/ci2-TFO während der Gradientenelution bei einer NaCI-Konzentration von 350 mM bis 390 mM eluiert. Das aufgereinigte scPvull- H6G4C-c6/ci2-TFO wird gegen PBS-Puffer dialysiert, welcher 25 % PEG 10000 enthält, und anschließend bis zur weiteren Verwendung bei 4 0C gelagert.

6. Substrate für DNA-Spaltungsversuche Für die DNA-Spaltungsversuche werden radioaktiv markierte 239 bp-Substrate, die eine Pvull-Schnittstelle enthalten, mittels PCR unter Verwendung von [α-32P] dATP hergestellt. Als Templat für die Herstellung des 239 bp-PCR-Produktes wird das pAT153-Plasmid verwendet, welches eine Pvull- an Stelle einer BamHI- Schnittstelle enthält, wobei die folgenden Primer eingesetzt werden: 5'- GGCCTCTTGCGGGAGATCTTCCATTCCG AC-31 und 5'-∞GTACTO^CGACAGTCGGCGCACATCAGACAGCTGACAGGACGGGT&3' (Die Pvull-Schnittstelle ist CAGCTG). Das nicht adressierte 478 bp-Substrat enthält keine TFS-Stelle und wird mittels PCR mit demselben Plasmid hergestellt, wobei [σ-32P]dATP und 5'- ATAGGCGC- CAGCAACCGCACCTGTG-3' und δ'-AATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTC-S' als Primer verwendet werden. Dieses nicht adressierte Substrat besitzt dieselbe Sequenz wie die adressierten Spal¬ tungssubstrate (siehe unten) mit Ausnahme seiner größeren Anzahl von Basen¬ paaren und der TFS. Alle Substrate werden über PCR-Säulen aufgereinigt (Qia- gen, Hilden, Deutschland). Die Reinheit wird mittels nativer PAGE bestimmt. Die Konzentration wird unter der Voraussetzung bestimmt, dass 1 OD260nm 50 ng/μl entspricht.

7. Kompetionsversuch: Spaltung von Substraten mit und ohne TFS In diesem Kompetitionsversuch wird die Spaltung eines 478 bp-Substrates ohne TFS mit derjenigen eines 239 bp-Substrates mit einer TFS im Abstand von 9 bp zur Pvull-Schnittstelle verglichen. Es wird scPvull-Ci2-TFO verwendet. Die Präin¬ kubation des scPvull-ci2-TFO mit den jeweiligen DNA-Substraten wird bei 23 0C für 10-15 h in dem für die Tripelhelixbildung geeigneten Puffer 10 mM Tris- Phosphat pH 7,2, 1 mM Spermin, 3 mM EGTA in Abwesenheit von Mg2+ durchge¬ führt, um die Bindung der Pvull-Schnittstellen ohne benachbarte TFS sowie DNA- Spaltung zu verhindern, welche beide die Anwesenheit von Mg2+ erfordern. Bei dieser Präinkubation werden im Wesentlichen äquimolare Konzentrationen von scPvull-ci2-TFO und adressiertem DNA-Substrat eingesetzt, um eine im Wesentli¬ chen stöchiometrische Bindung der TFS zu erreichen und freies Enzym im Reakti¬ onsgemisch zu vermeiden. Die Spaltung wird durch Zugabe von Pvull- Spaltungspuffer, bestehend aus 10 mM Tris-HCI pH 7,2, mit MgCI2 in verschiede¬ nen Konzentrationen gestartet. Dabei betragen die Endkonzentrationen 1 ,25 mM, 2,5 mM und 5 mM MgCI2. Die Präferenz für das adressierte Substrat ist abhängig von der MgCI2-Konzentration: Mit abnehmender MgCI2-Konzentration nimmt die Geschwindigkeit der Spaltung des nicht adressierten 478 bp-Substrates ab und erreicht bei einer Konzentration von 1 ,25 mM MgCI2 den Wert Null, wohingegen die Geschwindigkeit der Spaltung des adressierten 239 bp-Substrates unverändert bleibt (Fig. 5 a und 5b). Bei einer MgC^-Konzentration von 1 ,25 mM liegen in der Reaktionsmischung die gleichen Mengen an gebildetem Produkt und scPvull-Ci2- TFO vor, so lange die Menge des eingesetzten scPvull-ci2-TFO die Menge des adressierten Substrates nicht übersteigt. Werden mehr als stöchiometrische Men¬ gen des Enzyms im Vergleich zur DNA zugegeben, so tritt zusätzlich Spaltung des nicht adressierten Substrates ein, wobei die letztgenannte Spaltung mit einer im Wesentlichen sehr geringen Geschwindigkeit verläuft.

8. Einfluss des Abstandes zwischen TFS und Pvull-Schnittstelle und der Länge des Linkers auf die Spaltung In verschiedenen Abständen zur Puvll-Schnittstelle wird durch ortsspezifische Mu- tagenese eine angrenzende Tripelhelix-Bildungsstelle (TFS, triple helix forming Site) eingeführt, und zwar 3, 5, 7, 9, 11 bzw. 13 bp stromabwärts der TFS, so dass alle adressierten 239mer-Substrate angrenzend an die Pvull-Schnittstelle (fett) dieselbe Sequenz mit Ausnahme der TFS (unterstrichen) besitzen: 3 bp 5'- CGGTACTCGACGTTTTTTTCTCTCTCTCAGACAGCTG ...-3" 5 bp 5'- CGGTACTCGA I I I I I I I CTCTCTCTCGCAGACAGCTG...-3' 7 bp 51- CGGTACTCTTTTTTTCTCTCTCTCCAGCAGACAGCTG...-31 9 bp 5'- CGGTAC I I I I I I I CTCTCTCTCCACAGCAGACAGCTG ...-3' 11 bp 5'- CGG I I I I I I I I CTCTCTCTCCGCACAGCAGAC AGCTG...-3' 13 bp 5'- CGTTTTTTTCTCTCTCTCGGCGCACAGCAGACAGCTG...-3'

Außerdem werden zwei scPvull-TFO-Konjugate wie oben beschrieben hergestellt, die sich nur in der Länge des Linkers unterscheiden: scPvull-cβ-TFO und scPvull- C12-TFO. Um die DNA-Spaltung zu bestimmen, werden 45 nM jedes Substrats mit 5 nM SCPvUlI-H6G4C-Ce-TFO bzw. scPvull-Ci2-TFO bei 37 0C in 10 mM Tris- Phosphat pH 7,2, 10 mM MgCI2, und 1 mM Spermin gespalten. Die Spaltung wird nach 5, 10, 20, 30, 60 bzw. 110 min durch Zugabe von EDTA bis zu einer End- konzentration von 50 mM beendet. Die Reaktionsprodukte werden durch Elektrophorese über 12 %-ige PAGE-GeIe bestimmt. Anschließend werden die Gele getrocknet und die radioaktiven Banden mittels Autoradiographie unter Ver¬ wendung eines Instant Imager-Systems (Canberra Packard, Rüsselsheim, Deutschland) bestimmt. Die Ziel gerichtete Spaltung von 45 nM scPvull-H6G4C-c6/ci2-TFO wird im Kompe- titionsversuch durch gleichzeitiges Inkubieren mit je 45 nM des adressierten und des nicht adressierten Substrates in 10 mM Tris-Phosphat pH 7,2, 1 mM Spermin, 3 mM EGTA bei 23 0C für 12 bis 18 h untersucht. EGTA wird dem Präinkubati¬ onspuffer zugesetzt, um Ca2+-lonen zu komplexieren, die selbst bei niedrigen Konzentrationen die spezifische Bindung des nicht adressierten Substrates an die Pvull-Stelle stimulieren. Die Spaltungsreaktion wird bei 37 0C gestartet, indem identische Volumina des Spaltungspuffers 10 mM Tris-HCI pH 7,2 zugegeben werden, die verschiedene Konzentrationen an MgCI2 enthalten, wobei die End¬ konzentration an MgCI2 1 ,25 mM, 2,5 mM bzw. 5 mM beträgt. Die Spaltungsreak- tion wird gestoppt, und die Spaltungsprodukte werden wie oben beschrieben be¬ stimmt.

Die Spaltungsgeschwindigkeiten der nicht adressierten Substrate sind in allen Re¬ aktionen, die mit 1 ,25 mM MgCI2 durchgeführt werden, sehr gering und etwa 1.400-fach niedriger als die der adressierten Substrate. Die Geschwindigkeitskon- stanten für die Spaltung des nicht adressierten Substrates durch scPvull-c6-TF0 bzw. scPvul 1-C12-TFO betragen kniCht adressierte 2) = 0,002 min'1 bzw. kniCht adressiert«*) = 0,001 min"1. Für die adressierten Substrate ergeben sich bis zu 1.400-fach höhere Spaltungsgeschwindigkeiten, siehe Tab. 1. Am schnellsten findet die Spaltung dabei statt, wenn der Abstand zwischen Pvull-Schnittstelle und TFS 9 bp bis 11 bp beträgt. Bei Verwendung von scPvull-ci2-TFO stellt auch die DNA mit 13 bp Ab¬ stand zwischen Pvull-Schnittstelle und TFS ein gutes Substrat dar. Die für scPvu- II-C12-TFO ermittelten Spaltungsgeschwindigkeiten sind höher als die für scPvull- C12-TFO. Die Spaltungsgeschwindigkeit von Substraten, bei denen der Abstand zwischen Pvull-Schnittstelle und TFS kürzer als 7 bp ist, nimmt mit geringer wer¬ dendem Abstand ab, wobei dieser Effekt bei scPvull-cβ-TFO stärker ist als bei scPvull-ci2-TFO. Spaltungsgeschwindigkeiten der adressierten Substrate sowie die für die Reaktion in Gegenwart von 1 ,25 mM MgCb bestimmten Präferenzen sind in Tab. 1 darge- stellt: Tabelle 1 : Geschwindigkeitskonstanten für die Spaltung des 239 bp-Substrates durch SCPVUII-C6/C12-TFO

Tab.1 zeigt die Geschwindigkeitskonstanten der Spaltung für sechs verschiedene adressierte 239 bp-Substrate, die sich im Abstand zwischen Pvull-Spaltungsstelle und Tripelhelixbindungsstelle (TFS) unterscheiden. Der angegebene Fehlerbe¬ reich basiert auf drei unabhängigen Messungen. Die Spaltungspräferenz stellt das Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten des adressierten 239-bp-Substrates und des nicht adressierten 478 bp-Substrates dar. Aufgeführt sind die Daten für die SCPVUII-CΘ-TFO- und scPvull-ci2-TFO-Varianten, die sich in der Länge der Spacer unterscheiden (6 oder 12 Methylengruppen zwischen Protein und Oligo- nukleotid).

9. Adressierte Spaltung von Plasmiden mit mehreren Schnittstellen Für die Ziel gerichtete Spaltung eines Plasmidsubstrates durch ScPvUlI-H6G4C- C6/C12-TFO wird ein 5556 bp-Plasmid mit 5 Pvull-Stellen verwendet, das eine Pvull- Schnittstelle im Abstand von 9 bp zu einer TFS aufweist. Wird das überspiralisierte Plasmids ohne Präinkubation mit Pvull oder scPvull-ci2-TFO gespalten, so resul- tieren fünf Spaltungsfragmente. Präinkubation und Spaltung des überspiralisierten und Hindlll-Iinearisierten Plas¬ mids werden wie für die PCR-Produkte beschrieben durchgeführt. Dabei werden scPvull-ci2-TFO und überspiralisiertes bzw. Hindlll-Iinearisiertes Plasmid in einem im Wesentlichen stöchiometrischen Verhältnis eingesetzt. Die Spaltungsprodukte werden mittels Elektrophorese über ein 0,8 %-iges Agarosegel bestimmt. Das Gel wird anschließend mit SYBR Gold gefärbt und mit Hilfe einer geeigneten Software analysiert (Biometra, Göttingen, Deutschland). Die Analyse der Längen der Spal- tungsprodukte des überspiralisierten und des linearisierten Plasmids zeigen, dass nur die adressierte Schnittstelle geschnitten wird. Die quantitative Analyse der In¬ tensitäten der verschiedenen DNA-Banden ergibt Geschwindigkeitskonstanten für die Spaltung der adressierten Schnittstelle des überspiralisierten und des lineari¬ sierten Plasmids von kübersPiraiisiert = 1,4 min'1 sowie k|inear = 3,9 min"1. Eine Spaltung im Bereich der Pvull-Schnittstellen ohne benachbarte TFS wird nicht beobachtet, da eine etwa 1000-fach höhere Spaltungspräferenz für die adressierte Pvull- Schnittstelle vorliegt. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Bezugszeichenliste

1. DNA 2. Spezifitätsanker (TFO) 3. Linker 4. Enzym 5. Erkennungssequenz des Spezifitätsankers 6. Erkennungssequenz des Enzyms 7. Erkennungsstelle des Konjugats aus Spezifitätsanker und Enzym 8. Zellmembran 9. Zellkernmembran 10. Plasmidvektor 11. programmierbares Restriktionsenzym 12. verändertes Zielgen 13. Upstream-Homologieregion 14. Downstream-Homologieregion 15. neue Genprodukte 16. Zielzelle mit retroviralem Genprodukt 17. retrovirales Genom 18. Genom der Zielzelle vor der adressierten Methylierung 19. Zielsequenz für die DNA-Methylierung 20. methylierte Zielregion 21. Chromatin-Kondensation 22. Tochterzellen ohne retrovirales Genprodukt Abbildungslegenden

Fig. 1 Dargestellt ist das Prinzip der Herstellung von hoch spezifischen mit DNA 1 inter- agierenden Enzymen mit programmierbarer Spezifität. Spezifitätsanker 2 und En¬ zym 4 sind über einen Linker 3 chemisch miteinander verbunden. Der Linker 3 legt den Abstand zwischen Spezifitätsanker 2 und Enzym 4 fest. Die Erkennungsstelle 7 des Konjugats aus Spezifitätsanker und Enzym ist durch die Erkennungsse¬ quenz des Spezifitätsankers 5 bzw. des Enzyms 6 festgelegt.

Fig. 2 Prinzip des Genaustauschs mit Hilfe einer programmierbaren Restriktionsendo- nuklease 11. A) Das programmierbare Restriktionsenzym 11 wird zusammen mit einem Plasmidvektor 10 in die Zelle eingebracht. Der Vektor 10 enthält das verän¬ derte Zielgen 12, das flankiert ist von Bereichen, die zur genomischen Re¬ gion homolog sind (Upstream-Homologieregion 13, Downstream- Homologieregion 14). B) Die genomische DNA wird vom programmierbaren Restriktionsenzym 11 gespalten. Die Genkopie auf dem Plasmidvektor 10 enthält keine Erken¬ nungssequenz für das programmierbare Restriktionsenzym 10. C) Dadurch wird die homologe Rekombination stimuliert, und es kommt zum Austausch des internen DNA-Abschnitts gegen den externen (gene targe- ting). D) Es kommt zu einer stabilen Veränderung des Genoms; alle Nachkommen weisen die neuen Genprodukte 15 auf.

Fig. 3 Prinzip der gezielten Inhibition der Gentranskription durch DNA-Methylierung E) Eine programmierbare DNA-Methyltransferase wird in eine Zielzelle 16 ein¬ gebracht, die z.B. ein retrovirales Genom 17 in ihr Genom 18 integriert hat. Die Zielsequenz 19 wird methyliert. F) Die Methylierung breitet sich im Bereich der Zielregion 20 aus, und die Ex- pressionsaktivität der entsprechenden DNA-Region sinkt. G) Es kommt zur Chromatin-Kondensation 21 , Histon-Deacetylierung und Histon-Methylierung. Die Expression der DNA wird dauerhaft abgeschaltet. H) Dieser Zustand ist stabil und wird an Tochterzellen 22 vererbt. Damit ist das integrierte Retrovirus still gelegt. Dem Fachmann ist ohne Weiteres ersichtlich, dass nach demselben Prinzip auch andere Gene gezielt inaktivierbar sind, deren Expression eine pathogene Wirkung hat, z.B. Onkogene oder Gene, deren Proteinprodukte zur Ausbildung von Aggre¬ gaten in Zellen führen.

Fig. 4 Die Herstellung eines programmierten Restriktionsenzyms ist schematisch darge¬ stellt. Die einzelsträngige Variante von Pvull wird über einen (CH2)6- oder (CH2)i2- Linker unter Verwendung eines chemischen Crosslinkers mit einem Tripelhelix bildenden Oligonukleotid (TFO) verknüpft. Das Endprodukt scPvull-cδ/ci2-TFO weist eine zweiteilige Erkennungsstelle auf: die Pvull-Erkennungstelle und die Tri- pelhelixbindungsstelle (TFS). Die Spaltung des Doppelstranges findet in der Pvull- Stelle statt, jedoch nur, wenn diese der TFS benachbart ist.

Fig. 5a und b: Die Fig. 5a und b stellen die adressierte (239 bp-Substrat) und die nicht adressier¬ te DNA-Spaltung (478 bp-Substrat) durch scPvull-c6/ci2-TFO bei zwei verschiede¬ nen Mg2+-Konzentrationen dar. Eingesetzt werden ein 239 bp-Substrat, das eine TFS in einem Abstand von 9 bp zur Pvull-Schnittstelle aufweist, sowie ein 478 bp- Substrat, welches keine TFS besitzt. 45 nM jedes Substrates werden zum Zwecke der Tripelhelix-Bildung mit 40 nM scPvull-c6/ci2-TFO in Gegenwart von Spermin inkubiert. Nach Zugabe von 1 ,25 mM (Fig. 5a) oder 5 mM (Fig. 5b) MgCI2 werden die kinetischen Daten der Spaltung bestimmt. Während das nicht adressierte Sub¬ strat (♦) bei einer MgCfe-Konzentration von 5 mM im Wesentlichen ebenso schnell gespalten wird wie das adressierte Substrat (■), ist eine Spaltung bei ei- ner MgCI2-Konzentration von 1 ,25 mM im Wesentlichen nicht feststellbar. Im Ge¬ gensatz dazu wird das adressierte Substrat sowohl bei 5 mM als auch bei 1 ,25 mM MgCb schnell gespalten. Fig. 6 Fig. 6 zeigt die adressierte Spaltung eines 5556 bp-Plasmids durch scPvull-c6/ci2- TFO. Das Plasmid besitzt fünf Pvull-Schnittstellen (in Fig. 6 mit P bezeichnet); eine davon weist eine TFS im Abstand von 9 bp auf und ist mit *fc gekennzeich- net. Zum Zwecke der Tripelhelixbildung werden 50 nm des Plasmids mit 45 nM scPvull-c6/ci2-TFO in Gegenwart von Spermin präinkubiert. Aliquote des Reakti¬ onsgemisches werden 0, 1 , 10, 30, 60, 120 und 300 Minuten nach Zugabe von MgCI2 entnommen und die Reaktionsprodukte mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Oberer bzw. unterer Teil der Abbildung zeigen die Ergebnisse der ad- ressierten Spaltung der überspiralisierten bzw. linearisierten Form des Plasmids. Durch die substöchiometrische Zugabe von scPvull-cβ/ci2-TFO ist die Spaltung nicht vollständig. Bahn 1 im oberen Gel zeigt das Ergebnis des Kontrollspaltungs- experiments, bei dem das überspiralisierte Plasmid ohne Präinkubation für 5 min mit scPvull-c6/ci2-TFO in Spaltungspuffer inkubiert wird. In diesem Fall wird das Plasmid an allen fünf Pvull-Spaltungsstellen gespalten.