Domaine de l'invention

La présente invention a pour objet une protéine dont l'activité enzymatique permet de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique. La présente invention a également pour objet un procédé pour convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, comprenant la production d'une protéine selon l'invention et son utilisation pour la production d'acide isochlorogénique à partir d'acide chlorogénique. L'invention se situe donc dans le domaine de la production et de l'utilisation d'une enzyme recombinante pour la synthèse d'une substance.

Etat de la technique

L'acide isochlorogénique, ou acide 3,5-DiCaféoylQuinique ou 3,5-DCQ, fait actuellement l'objet de nombreuses études et plusieurs propriétés pharmacologiques laissent présager des développements importants notamment dans le domaine de la prévention et/ou du traitement de maladies, telle que la maladie d'Alzheimer et du cancer, des maladies virales et dans des applications cosmétiques. Le 3,5-DCQ peut être purifié à partir de végétaux, notamment à partir de la patate douce ( Ipomoea batatas ) (Harrison et al, « Contents of caffeoylquinic acid compounds in the storage roots of sixteen sweet potato génotypes and their potential biological activity » ; J. Amer. Soc. Hort. Sci. , 133(4) :492-500, 2008). Le 3,5-DCQ est cependant synthétisé en quantités relativement faibles, sa purification à partir de végétaux est donc laborieuse et coûteuse, et n'est donc pas compatible avec une utilisation largement diffusée. Par ailleurs, différents isomères d'acide caféoylquinique peuvent être produits par une même cellule végétale, ce qui implique en outre une étape supplémentaire d'isolement du 3,5-DCQ par rapport aux autres isomères.

Il existe donc un besoin de disposer d'un moyen permettant d'obtenir, de façon fiable, aisée, et peu coûteuse, de l'acide isochlorogénique en quantité importante.

La demande internationale publiée sous le numéro WO 2013/178 705 décrit des enzymes de conversion de l'acide chlorogénique (en anglais Chlorogenic Acid, ou CGA) en acides di-, tri- ou tétracaféoylquinique. La fonction desdites enzymes est proche de celle des protéines de type HCT (Hydroxycynnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transférases) ou HQT (Hydroxycynnamoyl- CoA quinate hydroxycinnamoyl transférases), appartenant plus généralement à la famille des BAHD acyltransferases.

Kojima et Kondo (« An enzyme in sweet potato root which catalyzes the conversion of chlorogenic acid, 3-caféoylquinic acid, to isochlorogenic acid, 3,5- dicaffeoylquinic acid », Agric. Biol. Chem., 49(8), 2467-9, 1985) décrivent une enzyme, dont la fonction n'est pas précisément identifiée et dont la structure n'est pas divulguée, présente dans un extrait de patate douce et capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.

Villegas et al (« Purification and characterization of chlorogenic potato roots », Phytochemistry, vol. 26(6), 1577-81, 1987) décrivent une chlorogenate caféoyltransférase capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique).

Teutschbein et al (« Identification and localization of a lipase-like acyltransferase in phenylpropanoid metabolism of tomato ( Solanum lycopersicum », J. Biol. Chem., 285(49), p. 38374-81, 2010) décrivent l'identification d'une chlorogénate glucarate caféoyltransférase (CGT) dans un extrait de tomate.

Les inventeurs ont maintenant isolé et cloné, à partir d'extraits d'Ipomoea batatas, une enzyme appartenant à la famille des GDSL lipases/estérases, qui sont caractérisées par la présence au sein de leur séquence en acides aminés de l'enchaînement des quatre acides aminés suivants : glycine (G) - acide aspartique (D) - sérine (S) -leucine (L). Cette enzyme est désignée par : IbGDSL, pour « enzyme GDSL d'Ipomoea batatas. Les inventeurs ont également montré que cette enzyme est capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, avec une grande spécificité de substrat et une production exclusive ou quasi-exclusive de 3,5-DCQ.

La présente invention répond aux besoins cités, en effet après transformation de cellules hôte transformées par un vecteur recombinant comprenant une séquence nucléotidique codant pour une enzyme GDSL estérase/lipase selon l'invention, et mise en condition de culture appropriée, l'enzyme est détectée dans un extrait de protéines totales desdites cellules hôtes. De plus, les inventeurs ont démontré que ladite enzyme selon l'invention est fonctionnelle lorsqu'elle est présente sous une forme isolée ou dans le milieu de culture de ladite cellule hôte. La GDSL estérase/lipase selon l'invention catalyse exclusivement la formation de 3,5-DCQ, à l'exclusion de tout autre isomère. Enfin, les inventeurs ont montré que la GDSL estérase/lipase selon l'invention catalyse efficacement la conversion en 3,5-DCQ de l'acide chlorogénique présent dans un extrait végétal.

La présente invention a donc pour premier objet une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l. L'invention a pour second objet un procédé de production de l'acide isochlorogénique (3,5-DCQ) à partir de l'acide chlorogénique, ce procédé mettant en œuvre une protéine selon l'invention. L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'une protéine selon l'invention pour la production d'acide isochlorogénique (3,5-DCQ) à partir de l'acide chlorogénique.

Exposé de l'invention

Selon un premier objet, l'invention concerne une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.

Selon un aspect particulier de ce premier objet, l'invention concerne une protéine recombinante, c'est-à-dire une protéine produite par une cellule dont le matériel génétique a été modifié.

Par « comprenant » on entend que l'élément est présent mais que d'autres éléments peuvent également être présents. Dans le cas d'une séquence en acides aminés, la séquence en objet peut notamment comprendre en outre des acides aminés additionnels, du côté N-terminal ou C-terminal de ladite séquence, ces acides aminés additionnels permettant notamment de faciliter la caractérisation et/ou la purification de la protéine d'intérêt. Dans le cas d'une séquence nucléotidique, la séquence en objet peut notamment comprendre en outre des nucléotides additionnels, du côté 3' ou 5' de ladite séquence.

Par « constitué par » on entend qu'aucun autre élément que ceux qui sont mentionnés n'est présent. Cette limite inclut cependant d'éventuelles modifications post-traductionnelles de la protéine d'intérêt.

Par « présentant au moins 80% d'identité » on entend que lesdites séquences présentent au moins 80% d'identité après alignement global optimal, c'est-à-dire par alignement global entre deux séquences donnant le plus fort pourcentage d'identité entre elles. L'alignement global optimal de deux séquences peut notamment être réalisé selon l'algorithme de Needleman-Wunsch, bien connu de l'homme du métier (Needleman & Wunsch, « A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins », J. Mol. Biol., 48(3) :443-53). Les protéines selon l'invention comprennent, ou sont constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 80%, avantageusement au moins 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 après alignement global optimal. Avantageusement, les protéines selon l'invention comprennent, ou sont constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 après alignement global optimal.

Selon un aspect particulier, parmi les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, les protéines comprenant au moins une séquence choisie parmi : SEQ ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 sont préférées. Selon un autre aspect particulier, parmi les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, les protéines comprenant :

- un acide aminé sérine en position 11

- et/ou un acide aminé acide aspartique en position 317

- et/ou un acide aminé acide aspartique en position 153

- et/ou un acide aminé histidine en position 320 sont préférées.

Selon un aspect encore plus particulier, parmi les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées d'une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, les protéines comprenant un acide aminé sérine en position 11, un acide aminé acide aspartique en position 317, un acide aminé acide aspartique en position 153 et un acide aminé histidine en position 320 sont préférées.

Selon un autre aspect particulier, parmi les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées d'un fragment de séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, les protéines comprenant un acide aminé sérine en position 11 et/ou un acide aminé acide aspartique en position 317 et/ou un acide aminé acide aspartique en position 153 et/ou un acide aminé histidine en position 320 sont préférées.

Selon cet aspect, les protéines selon l'invention comprenant, ou constituées, d'un fragment de séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capables de capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique comportent au moins 50 acides aminés, de préférence au moins 100 acides aminés et plus préférentiellement au moins 150 acides aminés.

Par « acide chlorogénique » on entend l'ester simple de l'acide caféique et de l'acide quinique, aussi désigné par acide caféoylquinique ou trans-5-O-caféoyl-D- quinate, de formule (I) suivante :

(I)

Un acide dicaféoylquinique, abrégé en DCQ, est un diester composé d'une molécule d'acide quinique dont deux des quatre fonctions alcool ont été estérifiées par une molécule d'acide caféique. La formule générale des DCQ est la suivante (II), dans laquelle R2, R3, R4 et Rs représentent chacun indépendamment l'un de l'autre un groupe caféoyle ou un atome d'hydrogène à condition que au moins deux de R2, R3, R4 et Rs soit différent d'un atome d'hydrogène :

Par « acide isochlorogénique », également désigné par acide 3,5-0- dicaféoylquinique ou par « 3,5-DCQ », on entend un di-ester composé d'une molécule d'acide quinique dont les fonctions alcool 3 et 5 sont estérifiées par une molécule d'acide caféique, selon la formule (III) suivante. Le 3,5-DCQ est naturellement présent notamment dans un extrait de patate douce, Ipomoea batatas.

Par « capable de capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique », on entend une protéine qui, lorsqu'elle est placée dans des conditions réactionnelles adaptée, est capable de catalyser la formation de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique par la condensation de deux molécules d'acide chlorogénique, selon le schéma réactionnel décrit dans la Figure 1.

Plus particulièrement, une protéine selon l'invention est capable de convertir de façon majoritaire, et de préférence de façon exclusive ou quasi-exclusive, l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.

Encore plus particulièrement, l'activité catalytique telle que définie ci-dessus d'une protéine selon l'invention répond à une, deux, trois ou quatre des caractéristiques suivantes : a) Vmax (vitesse initiale maximale) comprise entre 60 et 240 nanomoles. s ¹ ), b) Km (constante de Michaëlis) comprise entre 2 et 5 mM (vis-à- vis du CGA), c) pH optimal de fonctionnement compris entre 6 et 6,6 ; d) température optimale de fonctionnement comprise entre 39 et 41°C.

De façon encore plus particulière, l'activité catalytique telle que définie ci-dessus d'une protéine selon l'invention répond à une, deux, trois ou quatre des caractéristiques suivantes : a) Vmax (vitesse initiale maximale) de 7,18 micromol. Min ¹ (soit 120 nanomoles. s ¹ ) ; b) Km (constante de Michaëlis) de 3,5 mM (vis-à-vis du CGA) ; c) pH optimal de fonctionnement de 6,3 ; d) température optimale de fonctionnement de 39,9°C.

Selon un aspect plus particulier, l'invention concerne une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 95% d'identité avec SEQ ID N°1 et comprenant la séquence SEQ ID N°7, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.

Plus particulièrement, l'invention concerne une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID N°1 et capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant choisie parmi les enzymes dites « GDSL estérase/l ipase », et en particulier parmi les enzymes « GDSL estérase/l ipase » d 'Ipomoea, plus particulièrement parmi les enzymes « GDSL estérase/lipase » d 'Ipomoea batatas, et parmi les enzymes « GDSL estérase/lipase » de Solanacées, d'Astéracées et de Rubiacées.

Encore plus particulièrement, l'invention concerne une protéine comprenant, ou constituée par, la séquence en acides aminés choisie SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et étant choisie parmi les enzymes « GDSL estérase/lipase » d 'Ipomoea batatas.

Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une molécule isolée d'acide nucléique codant pour une protéine selon l'invention.

Plus particulièrement, l'invention a pour objet une molécule isolée d'acide nucléique codant pour une protéine selon l'invention, ladite molécule comprenant, ou étant constituée par, une séquence en acides nucléiques choisie parmi : SEQ ID N°2 et une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°2. Du fait de la dégénérescence du code génétique, différentes séquences d'acides nucléiques peuvent coder pour les protéines selon l'invention. Selon l'hôte choisi pour produire une protéine selon l'invention, la dégénérescence du code nucléique peut être utilisée pour que les codons de la séquence nucléotidique soient adaptés à l'usage des codons préférablement constaté chez l'hôte choisi, de façon à optimiser l'expression de la protéine d'intérêt dans la protéine hôte. Un homme du métier souhaitant produire une protéine recombinante dans une cellule hôte particulière, telle que par exemple une cellule de levure ou une cellule de plante, aura facilement accès aux codons optimaux, grâce à des logiciels facilement disponibles d'optimisation des codons. Plus particulièrement, l'invention a pour objet une molécule isolée d'acide nucléique codant pour une protéine selon l'invention, ladite molécule comprenant ou étant constituée par une séquence en acides nucléiques choisie parmi : SEQ ID N°2 et une séquence présentant au moins 95% d'identité avec SEQ ID N°2.

Selon un aspect encore plus particulier, l'invention a pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle des moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte donnée. Un tel vecteur peut notamment être choisi parmi les plasmides, les chromosomes artificiels de levure (Yeast Artificial Chromosomes ou YACs), les vecteurs de type binaires (pBIN, pGW) et tout type de vecteur approprié en fonction de la cellule hôte choisie. Lesdits moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte sont bien connus de l'homme du métier. Par « moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte » on entend tout moyen permettant d'obtenir ladite protéine, notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication, et éventuellement un marqueur de sélection, lesdits moyens étant liés de manière opérationnelle à la séquence nucléotidique codant pour la protéine d'intérêt. Un vecteur selon l'invention pourra comprendre en outre une séquence nucléotidique codant pour un moyen assurant l'exportation de la protéine produite dans le milieu de culture de la cellule hôte et/ou une séquence nucléotidique codant pour un moyen destiné à permettre la purification de la protéine produite. De tels moyens sont bien connus de l'homme du métier qui peut donc aisément les sélectionner et insérer, de manière fonctionnelles, lesdites séquences nucléotidiques. Pour assurer la purification de ladite protéine, l'un des moyens connus consiste en une étiquette histidine, ou série d'acides aminés histidine.

Plus particulièrement, l'invention a pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte de levure ou sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte de plante.

Les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte de levure sont bien connus de l'homme du métier, ils sont notamment présents dans les vecteurs pPICZa, pPIC9K, pAOX815 commercialisés par la société ThermoFischer.

Les moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte de plante, et notamment dans une cellule de plante couramment utilisée pour la production de protéines exogènes, telles que les cellules de tabac, de riz, de tomate, ou de plante carnivore, sont également bien connus de l'homme du métier. Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet une cellule hôte comprenant au moins une molécule isolée d'acide nucléique selon l'invention ou au moins un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte.

Plus particulièrement, l'invention concerne une cellule hôte choisie parmi les cellules de levure, en particulier les cellules de levure de la souche Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Komagataella sp. et Kluyveromyces lactis, et de préférence Pichia pastoris.

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne une cellule hôte choisie parmi les cellules de plante, en particulier Nicotiana benthamiana Ipomoea batatas, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaiiana, Zea mays, riz, Coffea arabica, tomate, asteracées (chardons, artichauts) etc.

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne une plante transgénique comprenant au moins une molécule isolée d'acide nucléique selon l'invention, au moins un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, ou au moins une cellule hôte de plante selon l'invention. De préférence, l'invention concerne une plante transgénique comprenant au moins une molécule isolée d'acide nucléique selon l'invention, au moins un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, ou au moins une cellule hôte de Nicotiana benthamiana Ipomoea batatas, Nicotiana tabacum , Arabidopsis thaiiana , Zea mays, riz, Coffea arabica, tomate ou asteracée selon l'invention.

Selon un deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant la mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'acide chlorogénique et d'une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour obtenir une composition enrichie en acide isochlorogénique.

Selon un aspect particulier, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant la mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'acide chlorogénique et d'une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour obtenir une composition enrichie en acide isochlorogénique, ledit procédé comprenant en outre :

- une étape préalable de culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine produite étant optionnellement purifiée, et/ou ledit acide chlorogénique est présent sous forme isolée ou dans une composition, ladite composition étant notamment un extrait végétal, et/ou

- une étape ultérieure d'isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction.

Selon un aspect particulier, l'invention concerne un procédé dans lequel ladite protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, est purifiée, préalablement à sa mise en contact, avec de l'acide chlorogénique. La purification est réalisée par tout moyen connu de l'homme du métier.

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne un procédé dans lequel, lors de la mise en contact de ladite protéine avec de l'acide chlorogénique, ladite protéine est présente dans une composition ou un mélange, notamment le milieu de culture, ou surnageant, d'une cellule hôte recombinante qui a produit ladite protéine.

Plus particulièrement, selon ce deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant en outre une étape préalable de culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l.

Par « conditions réactionnelles appropriées » on entend les différents paramètres permettant la réalisation de la réaction enzymatique menée par l'IbGDSL, qui catalyse la formation du 3,5-DCQ et de l'acide quinique (QA) par la condensation de deux molécules de CGA. La durée de la réaction est de préférence supérieure à 4 heures, de préférence comprise entre 4 et 60 heures, de préférence d'une durée de 50 heures. Le pH de la réaction est compris entre 5 et 7, et de préférence est de 6 ±0.5. La température de la réaction est comprise entre 30 et 40°C, et est de préférence de 35°C± 5°C. La concentration de GDSL par volume d'extrait végétal est comprise entre 0,5 mg/L à 10 mg/L, de préférence de 4,2mg de GDSL/L ± 3,4.

Selon un autre aspect particulier de ce deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant en outre une étape ultérieure d'isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction.

Selon un aspect plus particulier de ce deuxième objet, l'invention concerne un procédé pour la production d'acide isochlorogénique comprenant les étapes de : i) culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, pour exprimer une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ii) mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, de la protéine exprimée lors de l'étape i) avec de l'acide chlorogénique, et iii) isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de l'étape ii).

Dans un procédé selon le deuxième objet de l'invention, ledit acide chlorogénique est présent soit sous forme isolée, soit dans une composition, ladite composition étant notamment un extrait végétal. Par « extrait végétal » on entend le résultat de l'extraction des principes actifs d'une plante, ou d'au moins une partie de plante, par fermentation, macération, décoction ou infusion. Ledit extrait végétal peut notamment être additionné sous la forme d'un liquide ou d'une poudre. De préférence, dans un tel procédé selon l'invention, un extrait végétal comprend au moins 5% de CGA. Un tel extrait végétal peut être choisi parmi les extraits végétaux de café, myrtille, tournesol, grande bardane, endives, artichaut, nèfle du Japon, pruneau, menthe, carotte, pomme de terre, pomme et poire.

L'invention concerne en outre un procédé de production d'acide isochlorogénique comprenant les étapes de : i) culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, pour exprimer une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ii) mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, de la protéine exprimée lors de l'étape i) avec de l'acide chlorogénique, et iii) isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de l'étape ii).

Selon un aspect particulier, un procédé production d'acide isochlorogénique selon l'invention comprend les étapes de : i) Culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte de Pichia pastoris capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, pour exprimer une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant produite puis exportée dans le surnageant de culture de cellules de P. Pastoris, ii) Mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, de la protéine exprimée lors de l'étape i) avec de l'acide chlorogénique présent dans un extrait de café vert, et iii) Isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de l'étape ii).

Selon un autre aspect particulier, un procédé de production d'acide isochlorogénique selon l'invention comprend les étapes de :

• Mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, avec de l'acide chlorogénique présent dans un extrait de café vert, et

• Isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de la réaction précédente.

Par « café vert » on entend on entend les grains de plantes du genre Coffea avant cuisson ou torréfaction, notamment les grains des espèces Coffea canephora ou Coffea arabica. De préférence, par « café vert » on entend Coffea canephora.

Par « extrait de café vert » on entend un extrait obtenu par extraction solide / liquide dans de l'éthanol pour récupérer les métabolites contenus dans les grains de café vert séchés. L'éthanol utilisé est pur ou sous la forme d'une solution aqueuse d'alcool, celle-ci comprenant de 10% à 99,9% d'alcool, plus particulièrement entre 40% et 90%, et encore plus particulièrement entre 50% et 85%. Optionnellement, la caféine est enlevée de l'extrait par un traitement avec de l'acétate d'éthyle ou un mélange acétate d'éthyle / hexane. L'extrait est réduit sous forme de poudre par la mise en œuvre de tout procédé adapté et connu de l'homme du métier, et notamment l'atomisation ou la lyophilisation.

Dans un extrait de café vert selon l'invention, l'acide chlorogénique est présent à une concentration minimale d'au moins 2 mM, de préférence au moins 5 mM, au moins 7,5 mM, de préférence 10 mM.

Selon un aspect encore plus particulier, un procédé de production d'acide isochlorogénique selon l'invention comprend les étapes de :

• Culture, dans un milieu de culture et des conditions appropriés, d'une cellule hôte de Pichia pastoris capable d'exprimer une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, pour exprimer une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant produite puis exportée dans le surnageant de culture de cellules de P. Pastoris

• Mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, de la protéine exprimée lors de l'étape i) avec de l'acide chlorogénique présent dans un extrait de café vert, et

• Isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction de l'étape précédente

Selon un autre aspect particulier, l'invention a pour objet le produit susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention, ledit procédé comprenant la mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'un extrait de café vert dont la concentration en acide chlorogénique est supérieure à égale à 2mM, et d'une protéine capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique et comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi :

SEQ ID N°l,

Une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, Un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite SEQ ID N°1 et

Un fragment comportant au moins 50 acides aminés de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l.

Selon un autre aspect plus particulier, l'invention a pour objet le produit susceptible d'être obtenu par un procédé selon l'invention, ledit procédé comprenant :

• Une étape de culture de P. pastoris transformée par un vecteur d'expression ayant intégré le gène codant pour la protéine IbGSDL de SEQ ID N°l, dans un milieu nutritif et des conditions appropriées, ladite protéine étant produite puis exportée dans le surnageant de culture,

• La purification optionnelle de la protéine de SEQ ID N°l,

• La mise en contact, dans des conditions réactionnelles appropriées, d'un extrait de café vert dont la concentration en acide chlorogénique est supérieure à égale à 2mM, avec ledit surnageant de culture, ou optionnellement avec ladite protéine purifiée.

• Optionnellement une étape ultérieure d'isolement de l'acide isochlorogénique produit lors de la réaction.

Selon un troisième objet, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une protéine, ladite protéine comprenant, ou étant constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ou d'une cellule hôte exprimant une telle protéine, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.

Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant mise en contact avec l'acide chlorogénique, dans des conditions réactionnelles appropriées, sans avoir été préalablement isolée de la cellule hôte ou du milieu de culture dans lequel la cellule hôte a été cultivée pour produire ladite protéine.

Selon un autre aspect particulier, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, ladite protéine étant mise en contact avec l'acide chlorogénique, dans des conditions réactionnelles appropriées, après avoir été préalablement isolée ou purifiée à partir de la cellule hôte ou du milieu de culture dans lequel la cellule hôte a été cultivée pour produire ladite protéine. Encore plus particulièrement, dans une utilisation selon l'invention ladite protéine, isolée de la cellule hôte ou purifiée à du milieu de culture, est ajoutée à une solution comprenant majoritairement, ou uniquement, de l'acide chlorogénique. Alternativement, dans une utilisation selon l'invention ladite protéine, isolée de la cellule hôte ou purifiée à du milieu de culture, est ajoutée à un extrait comprenant notamment de l'acide chlorogénique.

Selon un autre aspect particulier de ce troisième objet, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une cellule hôte exprimant une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.

Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation d'au moins une cellule de levure exprimant une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique. De préférence, ladite cellule de levure est une cellule de la souche Pichia pastoris transformée par un vecteur recombinant comprenant au moins une molécule d'acide nucléique selon l'invention, chacune desdites au moins une molécule étant placée sous le contrôle de moyens nécessaires à l'expression de ladite protéine dans une cellule hôte. Un tel vecteur est notamment choisi parmi les plasmides, les Yeast Artificial Chromosomes (YACs), les vecteurs de type binaires (pBIN, pGW) et tout type de vecteur approprié en fonction de la cellule hôte.

Selon un autre aspect particulier de ce troisième objet, l'invention concerne l'utilisation d'au moins une cellule hôte de plante exprimant une protéine comprenant, ou constituée par, une séquence en acides aminés choisie parmi : SEQ ID N°l, une séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, un fragment de ladite SEQ ID N°1 et un fragment de ladite séquence présentant au moins 80% d'identité avec SEQ ID N°l, ladite protéine étant capable de convertir l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique, pour convertir de l'acide chlorogénique en acide isochlorogénique.

Description des figures et modes de réalisation

D'autres avantages et caractéristiques apparaîtront à l'examen de la description détaillée d'un mode de réalisation nullement limitatif, et des figures annexées, dans lesquels :

La Figure 1 (Exemple 1) représente le schéma de la réaction enzymatique menée par l'IbGDSL, qui catalyse la formation du 3,5-DCQ et de l'acide quinique (QA) par la condensation de deux molécules de CGA.

Les Figures 2A et 2B (Exemple 1) représentent respectivement la détection de l'enzyme par un test western-blot réalisé en utilisant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'étiquette de six histidines en position C-terminale de la protéine, qui met en évidence la production l'IbGDSL (taille prédite de 40,1 kDa) par des plants de N. benthamiana (Figure IA) et des cellules de P. pastoris (Figure IB). Dans chacune des figures, la colonne 1 représente l'analyse menée sur l'hôte de production transformé avec le vecteur vide (témoin négatif) et la colonne 2 représente l'analyse menée sur l'hôte de production transformé avec le vecteur comprenant le gène d'intérêt.

Les Figures 3A, 3B et 3C (Exemple 2) représentent respectivement la concentration en 3,5-DCQ (en mM) (Fig. 3A et 3B), ou la vitesse de bioconversion en 3,5-DCQ (en micromoles/minutes) (Fig. 3C), en fonction du pH (Fig. 3A), de la température (Fig. 3B) ou de la concentration en substrat CGA (en mM) (Fig. 3C).

Les Figures 4A, 4B et 4C (Exemple 3) représentent respectivement les chromatogrammes du standard de 3,5-DCQ (Fig. 4A) et des réactions enzymatiques de conversion du CGA en 3,5-DCQ menées avec les surnageants de culture de P. pastoris transformée avec le vecteur vide (Fig. 4B) ou transformée avec le vecteur portant le gène codant l'IbGDSL (Fig. 4C) après 3 jours d'induction au méthanol. Les pics avec un temps de rétention à 3,2 minutes et à 8,3 minutes correspondent respectivement au CGA (m/z neg 353) et au 3,5-DCQ (m/z neg 515).

Les Figures 5A et 5B (Exemple 3) représentent les chromatogrammes des réactions de bioconversion de l'acide chlorogénique en 3,5-DCQ via l'ajout du substrat directement dans les cultures de P. pastoris transformées soit avec le vecteur vide (Fig. 5A) soit avec le vecteur portant le gène codant l'IbGDSL (Fig. 5B). Dans chacune des figures, de haut en bas et avec un décalage vers la droite, se trouvent respectivement, les chromatogrammes correspondant respectivement à T0 avant l'ajout de CGA, 6 heures après l'ajout de CGA et 120 heures après l'ajout de CGA. Les pics avec un temps de rétention à 3,2 minutes et à 8,3 minutes correspondent respectivement au CGA (m/z neg 353) et au 3,5-DCQ (m/z neg 515).

Les Figures 6A et 6B (Exemple 3) représentent respectivement, en fonction du temps de réaction (en heures), le taux de conversion de CGA pur en 3,5-DCQ (en % molaire) (Fig. 6A) ou la concentration en 3,5-DCQ (en mg/L) (Fig. 6B). La limite théorique à 50% correspond au rendement maximal obtenu lorsque toutes les molécules de CGA sont transformées en 3,5-DCQ (rendement stoechiométrique de 2 pour 1 respectivement). Figure 6A : courbes avec triangles (CGA 5 mM ou 1,9 g/L), croix claires (CGA 7,5 mM ou 2,6 g/L), croix foncées (CGA 9 mM ou 3,2 g/L), carrés foncés (CGA 10 mM ou 3,6 g/L), carrés clairs (CGA 15 mM ou 5,5 g/L). Figure 6B : courbes avec triangles (CGA 5 mM ou 1,9 g/L), croix claires (CGA 7,5 mM ou 2,6 g/L), traits (CGA 9 mM ou 3,2 g/L), carrés foncés (CGA 10 mM ou 3,6 g/L), carrés clairs (CGA 15 mM ou 5,5 g/L).

La Figure 7A (Exemple 4) représente un chromatogramme montrant la composition en dérivés d'acide caféique d'un extrait hydro-alcoolique de café vert, avec : pic 1 : MCQ1 (autre isomère d'acide mono-caféoylquinique) , pic 2 : MCQ2 (autre isomère d'acide mono-caféoylquinique) , pic 3 : CGA (acide chlorogénique, acide 5-O-caféoyl quinique) ; pic 4 : CA (acide caféique) ; pic 5 : MFQ (acide monoferuloyl quinique) ; pic 7 : 4,5-DCQ (acide 3,4 dicaféoyl quinique) ; pic 8 : 3,5-DCQ (acide 3,5 dicaféoyl quinique) ; pic 9 : 3,4-DCQ (acide 4,5 dicaféoyl quinique).

La Figure 7B (Exemple 4) représente un chromatogramme d'un extrait hydro alcoolique de café vert obtenu avant (trace noire) et après 50h (trace claire) de bioconversion par l'IbGDSL, dans l'extrait de café vert ; la concentration de substrat initiale est équivalente à 10 mM de CGA. Pic 1 : MCQ ; pic 2 : CGA ; pic 3 : MFQ ; pic 4 : 4,5-DCQ ; pic 5 : 3,5-DCQ ; pic 6 : 3,4-DCQ. La différence des traces claire et noire est notamment visible au niveau du pic 5 : 3,5-DCQ.

La Figure 8 (Exemple 4) représente la teneur en DCQ (mg/L) obtenue pour différentes concentrations d'extrait de café vert, exprimées en équivalent CGA, en fonction du temps de réaction (en heures). Le surnageant de milieu de culture de P. pastoris contenant l'enzyme GDSL a été concentré 37 fois. Courbe avec trait continu (CGA 1 mM), ronds clairs (CGA 3,5 mM), losanges (CGA 5 mM), carrés foncés (CGA 10 mM).

La Figure 9 (Exemple 4) représente la teneur en 3,5-DCQ (mg/L) mesurée dans un extrait de café vert bioconverti par une suspension cellulaire de P. pastoris exprimant l'IbGDSL (GDSL+) ou ne l'exprimant pas (GDSL-), en fonction du temps (en jours). La Figure 10 (Exemple 4) représente la teneur en 3,5-DCQ (mg/L) obtenue par bioconversion enzymatique par IbGDSL d'une solution de café vert contenant 5 mM de CGA, en fonction du temps (en heures) lorsque le surnageant de milieu de culture de P. pastoris contenant l'enzyme GDSL a été concentré 10 fois (ronds), 20 fois (triangles) ou 37 fois (carrés).

La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples 1 à 4 suivants, qui sont donnés pour illustrer l'invention et non pour en limiter la portée.

EXEMPLES

Exemple 1 : Identification, production et caractérisation d'une enzyme recombinante GDSL d'Ipomoea batatas.

1.1. Matériel et méthodes

Une banque d'ADN complémentaire d' batatas a été préparée selon le protocole décrit dans WO2013/178 705 à partir de racines issues de plants cultivés en conditions aéroponiques riches en 3,5-DCQ. En parallèle, la fragmentation d'un extrait protéique complexe issu d'un tubercule d Ί. batatas riche en 3,5-DCQ a été effectuée afin de sélectionner étape par étape les protéines présentant une activité d'acide isochlorogénique synthase. A la fin de cette expérimentation, des profils SDS-PAGE ont été obtenus et les protéines observées ont été séquencées. 400 peptides ont été obtenus et leur séquence en acides aminés a été alignée avec la banque d'ADNc d' batatas à l'aide du programme tBIastn qui compare une séquence peptidique aux produits de traduction d'une séquence nucléotidique. Ainsi, les séquences présentant de fortes homologies avec les peptides séquençés ont été détectées parmi toutes les séquences composant le transcriptome du tissu.

Après avoir identifié une séquence candidate à partir de la banque d'ADNc, sa séquence codante a été isolée à partir d'une extraction d'ARN messagers totaux convertis en ADNc. Pour cela, les ARNm de racines d' batatas cultivées en conditions aéroponiques ont été extraits à l'aide d'un kit d'extraction commercial spécifique aux tissus végétaux selon les instructions du fournisseur (RNeasy ^® Plant Mini Kit -QIAGEN). Après avoir dosé et vérifié la qualité des ARNm extraits, l'ADNc codant la protéine candidate a été amplifié à l'aide, d'une part, d'amorces spécifiques à la séquence, dessinées de telle manière à rajouter une étiquette de six histidines en position C-terminale de la protéine, nécessaire à sa détection après production et à sa purification, et, d'autre part, d'un kit commercial permettant en une seule étape la conversion des ARNm en ADNc et l'amplification de la séquence par PCR (Polymerase Chain Reaction) (SuperScript™ III One-Step RT- PC R System with Platinum™ Taq High Fidelity DNA Polymerase - INVITROGEN). L'amplicon obtenu a ensuite été cloné dans un vecteur commercial basique (pCR™8/GW/TOPO™- INVITROGEN) permettant son séquençage et son intégration dans plusieurs vecteurs dédiés à divers systèmes d'expression.

L'alignement de peptides sur la banque d'ADNc d 'Ipomea batatas a permis d'identifier un gène codant une GDSL estérase/l ipase parmi tous les transcrits séquencés. Les séquences peptidique et nucléotidique codant pour IbGDSL sont respectivement SEQ ID N°1 et SEQ ID N°2.

Le gène codant pour IbGDSL est intégré par la suite dans un vecteur d'expression dédié aux cellules végétales par recombinaison homologue. Au moment de l'amplification du gène, une étiquette (en anglais : « tag ») composée de 6 histidines est rajoutée à la fin du gène pour avoir après transcription et traduction une protéine marquée en C-terminal. Cette étiquette permet une purification aisée de la protéine par chromatographie d'affinité.

Ce vecteur est ensuite introduit dans Agrobacterium tumefaciens de souche EHA105 capable de transfecter un ADN d'intérêt dans les cellules végétales selon la méthode de congélation et décongélation décrite dans le travail de Chen et al (« Enhanced recovery of transformants of Agrobacterium tumefaciens after freeze-thaw transformation and drug sélection. » BioTechniques 16 (4) : 664-68, 1994). Les bactéries ayant intégré le vecteur auront acquis en même temps une résistance à un antibiotique permettant ainsi leur sélection parmi les bactéries non transformées en présence de cet agent antibiotique.

Pour la transformation transitoire de N. benthamiana, les agrobactéries portant le vecteur recombinant sont mises en culture dans 15 mL de milieu nutritif additionné de l'antibiotique de sélection et sont incubées à 28°C sous agitation à 200rpm pendant 24 heures. Le lendemain, 3 heures avant la transformation, 100 mM d'acétosyringone sont ajoutés aux cultures d 'a g ro bactéries pour activer leur virulence. Après ce laps de temps, les bactéries sont centrifugées et reprises dans du milieu nutritif une à deux fois pour éliminer les antibiotiques et à la fin, reprises dans le tampon d'infiltration à pH 5,6 (MES 10 mM, acétosyringone 100 mM). La D06oonm (densité optique) de la suspension bactérienne est ajustée à 0.5.

Les parties aériennes des plusieurs pieds de N. benthamiana âgés de 3-4 semaines cultivés en chambre de culture avec une photopériode de 16 h/8 h jour/nuit sous lumière artificielle (70 pmol m -2 s -1) à 26 °C avec 70 % d'humidité sont intégralement immergées dans la solution d'agrobactéries et soumises à une infiltration sous vide dans une cloche reliée à une pompe. Une étape de dépression est réalisée jusqu'à 20 mbar pour provoquer l'entrée des agrobactéries dans les tissus avant le rétablissement aux conditions de pression atmosphérique. Les plants de N. benthamiana sont ensuite replacés en culture dans les mêmes conditions environnementales décrites précédemment pendant 6 jours. C'est durant ce lapse de temps que les agrobactéries transfecteront l'ADN d'intérêt correspondant au gène de l'IbGDSL dans les cellules végétales et que la protéine sera produite par les machineries de transcription et de traduction des cellules de l'hôte.

La confirmation de la production de la protéine par ce système a été déterminée par western-blot utilisant un anticoprs dirigé spécifiquement contre l'étiquette composée de 6 histidines ajoutée en position C-terminale de la protéine (Fig. 2A).

En parallèle, le gène codant la protéine est intégré dans un vecteur d'expression dédié à P. pastoris par recombinaison homologue. Ce vecteur permet l'expression et la sécrétion de la protéine dans le milieu de culture en présence de méthanol. Le protocole classique de transformation de P. pastoris utilisé dans ce travail est décrit dans Cregg et Russell (« Transformation ». In Pichia Protocols, édité par David R. Higgins et James M. Cregg, 27-39. Methods in Molecular Biology™. Totowa, NJ: Humana Press. https://doi.Org/10.1385/0-89603-421-6:27, 1998). La confirmation de la production de l'enzyme a été menée comme décrit précédemment par western blot (Fig. 2B). 1.2. Résultats

Les résultats montrent que, après avoir transformé les hôtes de production, l'enzyme a été détectée par western-blot dans un extrait de protéines totales issu des feuilles de N. benthamiana agroinfiltrées et dans le surnageant de levures génétiquement transformées. Ainsi, contrairement au témoin négatif (Fig. 2A puits 1) une bande aux alentours de 40 kDa est observée pour les tissus de N. benthamiana agroinfiltrés depuis 6 jours avec le gène codant l'IbGDSL (Fig. 2A puits 2). De même, la culture de P. pastoris transformée par le gène de l'IbGDSL a produit et sécrété l'enzyme dans le milieu de culture en 3 jours (Fig. 2B puits 2) contrairement au témoin négatif transformé avec le vecteur vide (Fig. 2A puits 1).

Exemple 2 : Caractérisation de l'activité catalytique d'IbGDSL recombinante purifiée.

Les tests enzymatiques in vitro sont menés sur l'enzyme recombinante purifiée produite dans un système végétal. Après 6 jours de co-culture, les feuilles de N. benthamiana agro-infiltrées avec le vecteur portant le gène d'intérêt, sont récoltées et broyées dans un tampon d'extraction (20 mM sodium phosphate, 0,5 M NaCI, pH 7,4). L'extrait est ensuite centrifugé et le surnageant dans lequel se trouve la totalité des protéines solubles dont l'IbGDSL est récupéré et stérilisé par filtration 0,2 pm. La purification de la protéine est ensuite menée selon les instructions du fournisseur sur des colonnes de Nickel (HisTrap HP-GE HEALTHCARE). La fraction d'élution récupérée après purification contenant la protéine est concentrée et dessalée sur des unités de centrifugation avec un seuil de coupure à lOkDa (Amicon ^® Ultra 0,5 mL Centrifugal Filters -PMNL lOkDa - MILLIPORE).

Les tests enzymatiques sont effectués dans un volume de 50 pl avec 200 à 400 ng de la protéine purifiée (soit quelques pl). Le pH réactionnel optimal sera déterminé à l'aide d'un polytampon (0,1 M Tris/20 mM MES/ 0,1 M acide acétique) à partir duquel une gamme de 4 à 9 en pH sera construite. Une solution mère d'acide chlorogénique (CGA) à 100 mM est préparée peu avant les expérimentations à partir d'une poudre de CGA avec un niveau de pureté supérieur à 99% diluée dans le polytampon à pH 6,5. Après chaque réaction, 150 mI d'éthanol absolu sont rajoutés aux 50 mI réactionnels pour stopper la réaction et extraire les molécules produites présentes dans la réaction. L'essai est ensuite centrifugé et le surnageant est récupéré pour analyses en UPLC-MS.

L'appareil utilisé pour l'étape d'analyse est une UPLC Shimadzu Nexera X2 (les pompes LC-30AD, passeur d'échantillon SIL-30AC, four CTO-20A, détecteurs à barrette de diodes SPD-M20A ; Kyoto, Japon) fonctionnant en phase inverse avec une colonne Kinetex Biphenyl (00F-4622-AN, Phenomenex, Torrance, CA, USA) de dimensions 150 mm x 2.1 mm, 2.6 pm. La phase mobile est constituée d'un solvant A (Eau ultrapure Mili-Q, Merck Millipore +0.1% d'acide formique, Carlo Erba, Val-de-Reuil, France) et d'un solvant B (Acetonitrile, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Allemagne) dont le gradient a été programmé de la façon suivante : phase B (%) 5-25% (0-10 min) ; 25-90% (10-10,5 min) ; 90% (10,5- 12 min), 90-5% (12-12,1 min), 5% (12,1-14,1 min). Le débit d'analyse est de 0,5 mb/min avec une température de four de 40°C. En sortie de colonne, un détecteur à barrettes de diodes enregistre les spectres UV entre 220 et 370 nm. L'appareil est couplé à un spectromètre de masse (Shimadzu LCMS-2020) fonctionnant avec une ionisation par électrospray (4,5 kV) en mode négatif dans une gamme de m/z entre 100 et 1000. Le logiciel LabSolutions (version 5.60 SP2) est utilisé pour exploiter le système.

La quantification en 3,5-DCQ se fait grâce à la mesure de l'aire du pic d'un standard de 3,5-DCQ à 330 nm. Le standard 3,5-DCQ est préparé à la concentration de 100 mg/L dans un mélange DMSO/eau selon le ratio 70/30 et acidifié au pH 3 avec de l'acide chlorhydrique. Les teneurs des autres composés (acide chlorogénique et les autres isomères de DCQ) sont exprimées en équivalents de 3,5-DCQ. La teneur est calculée selon la formule suivante pour un composé :

Teneur en 3,5

(aire du pic correspondant au 3,5 - DCQ à 330 nm de l' échantillon) 100 (aire du pic correspondant au 3,5 - DCQ à 330 nm de la solution standard )

Le 3,5-DCQ est utilisé comme standard de quantification pour les différents composés 3,4-DCQ et 4,5-DCQ car ces derniers appartiennent à la même famille de molécules. Les expérimentations visant à déterminer les paramètres physicochimiques indispensables à l'IbGDSL pour convertir du CGA en 3,5-DCQ ont été menées sur l'enzyme purifiée produite dans le système d'expression végétal.

L'IbGDSL est une estérase/lipase capable de condenser deux molécules de CGA en 3,5-DCQ en transférant le groupement caféoyl d'une molécule de CGA sur une autre molécule de CGA (Fig. 1). Par conséquent, le CGA est utilisé ici comme donneur d'acyl. L'ajout d'acide caféique dans le milieu réactionnel ne favorise pas la formation de 3,5-DCQ.

Une gamme de pH entre 4 et 9 a été établie afin de déterminer le pH optimal pour la conversion du CGA en 3,5-DCQ grâce à l'IbGDSL. Sur une réaction de 50pl, une quantité fixe d'IbGDSL purifiée est mise en contact avec une concentration fixe de lOmM du CGA à des conditions de pH différentes établies par le polytampon. La réaction est incubée pendant 30 minutes à 25°C et stoppée avec de l'éthanol. La courbe obtenue a permis de déterminer que le pH réactionnel optimal est situé entre 6 et 7 (Fig. 3A).

Pour déterminer la température réactionnelle optimale pour la conversion du CGA en 3,5-DCQ grâce à l'IbGDSL, une gamme de température a été établie entre 15 et 45°C. Avec une quantité fixe d'IbGDSL purifiée, une concentration fixe de lOmM de CGA et le polytampon à un pH 6,5, la température optimale à la conversion est estimée entre 34 et 41°C, avec un maximum à 37°C (Fig. 3B).

Une gamme de concentration de CGA a été établie afin de déterminer le seuil de concentration du substrat à partir duquel une inhibition de l'activité de l'IbGDSL par le produit est observée. Avec une quantité d'enzyme fixe et un pH établi à 6.5, un ralentissement de l'activité enzymatique est observé à partir de la concentration 10 mM de CGA après 30 minutes d'incubation à 36°C (Fig. 3C).

Exemple 3 : Caractérisation de l'activité d'IbGDSL recombinante présente dans le surnageant de culture de P. pastoris

La bioconversion de CGA en 3,5-DCQ in vivo passe par l'établissement d'une culture de P. pastoris métaboliquement très active. Les levures sont mises en culture dans le milieu nutritif contenant un tampon composé de lOOmM potassium phosphate avec un pH ajusté à pH 6.0. Celui-ci permet de maintenir à un pH 6 le milieu dans lequel seront en contact l'enzyme obtenue à partir des cellules microbiennes et le substrat. Après avoir établi un inoculum de 25 ml de culture de levure pendant une nuit à 30°C sous agitation de 250-300 rpm, celui-ci est utilisé pour inoculer un volume de 100-200 ml de milieu nutritif de telle manière à obtenir une D06oonm aux alentours de 1. Dans cette culture est ajouté 0,5% de méthanol afin d'initier la production d'IbGDSL. L'ajout de méthanol est à renouveler toutes les 24 heures pour maintenir le niveau d'induction de la production de la protéine. Trois jours après l'établissement de cette culture, le CGA est rajouté directement dans le milieu de telle manière à établir une concentration finale de lOmM.

La première étape de cette expérimentation est de montrer si l'IbGDSL produite par P. pastoris est capable de convertir le CGA en 3,5-DCQ sachant que l'enzyme d'origine pourrait être potentiellement glycosylée trois fois et que les arbres glycaniques générés par P. pastoris ne sont pas composés et organisés de la même façon que les arbres glycaniques de plante. Ces différences pourraient influencer directement la stabilité et empêcher la bonne activité de l'enzyme. Pour ce faire, les surnageants de deux cultures de P. pastoris, l'une transformée avec le vecteur vide (témoin négatif) et l'autre avec le vecteur portant le gène codant l'IbGDSL ont été récupérés après 3 jours d'induction au méthanol. Ces surnageants ont été incubés à des conditions de pH de 6,5 avec lOmM d'acide chlorogénique pendant 30 minutes à 36°C. La réaction enzymatique est ensuite stoppée avec l'ajout d'éthanol et analysée en UPLC-MS.

Les résultats obtenus démontrent que contrairement au témoin négatif (Fig. 4B) le surnageant dans lequel a été sécrétée l'IbGDSL présente un pic avec le même temps de rétention (8,3 min) et la même masse (m/z neg 515) (Fig. 4C) que le standard de 3,5-DCQ (Fig. 4A). L'enzyme synthétisée par ce système d'expression hétérologue microbien est donc bien fonctionnelle malgré certaines différences au niveau post-traductionnel. Il faut prendre en compte que l'incubation n'a duré que 30 minutes ce qui pourrait expliquer la faible intensité du pic.

La seconde étape de cette expérimentation est de montrer si le CGA directement rajouté dans le milieu de culture de P. pastoris exprimant l'enzyme pourrait être directement converti en 3,5-DCQ. L'objectif est de s'affranchir au besoin de l'étape de purification de l'enzyme.

Après avoir induit l'expression de la protéine avec du méthanol pendant 3 jours, le CGA est ajouté directement dans la culture dont le pH est tamponné à 6 à une concentration finale de lOmM et laisser en contact avec les cellules microbiennes pendant 3 jours. Cette expérimentation a été menée à 30°C, température idéale pour la culture et la croissance de l'organisme P. pastoris.

Le surnageant est ensuite analysé en UPLC-MS. Les résultats obtenus présentés dans la Figure 5B montrent que la culture de P. pastoris exprimant l'IbGDSL est capable de convertir le CGA en 3,5-DCQ en 3 jours avec une très grande efficacité. En effet, nous avons estimé un rendement de bioconversion aux alentours de 44%, la limité stoechiométrique maximale étant 50% puisqu'il faut deux molécules de CGA pour former une molécule de 3,5-DCQ.

Nous avons démontré que le CGA peut être ajouté indifféremment tous les jours, ou en début de phase d'induction, ou en fin de phase d'induction, sans affecter le taux de conversion final obtenu.

Les cinétiques de conversion du CGA pur en 3,5 CDQ ont été établies (Fig. 6A) en fonction des concentrations de départ en CGA. Après 50 heures de bioconversion, on constate qu'un rendement maximum de 32% est obtenu pour les deux concentrations 5 et 7,5 mM. Les concentrations supérieures à 7,5 mM testées ici dégradent les rendements finaux en 3,5-DCQ.

Les teneurs en 3,5 CDQ mesurées à l'issue des 50 heures de bioconversion montrent des quantités maximales de l'ordre de 1,2 g/L pour des concentrations en CGA pur de départ de 7,5 et 9 mM (Fig. 6B).

Exemple 4 : Bioconversion de l'acide chlorogénique d'un extrait de café vert en 3,5-DCQ par le surnageant de culture de cellules de P. pastoris exprimant l'IbGDSL, sécrétée dans ledit milieu de culture

La réaction de bioconversion du CGA en 3,5-DCQ a également été réalisée à partir d'un extrait de café vert ( Coffea canephora ) dont la composition est indiquée en Fig. 7A. Cet extrait de café vert, comprenant une concentration en CGA équivalente à 10 mM et bioconverti sur une période de 50 heures, à 30°C et à un pH de 6, a conduit à un nouvel extrait dont la composition est présentée sur la Fig. 7B. On constate que l'IbGDSL catalyse exclusivement la formation du 3,5- DCQ, à l'exclusion de tout autre isomère. Par ailleurs, aucun autre substrat contenant un acide caféique que l'acide chlorogénique n'est biotransformé car on n'observe pas de diminution des pics à l'exception de celui correspondant au CGA. La bioconversion de l'extrait de café vert avec la IbGDSL permet de multiplier par 4,5 la teneur en 3,5-DCQ initialement présente dans l'extrait (200 mg/L à To et 900 mg à Tsoh) pour une concentration de départ en CGA équivalente à 10 mM.

Une bioconversion du CGA en 3,5-DCQ, à partir de l'extrait de café vert, a été réalisée après 4 et 7 jours, dans l'objectif d'analyser l'effet d'une réaction à la GDSL se déroulant sur un temps long (Fig. 9). On constate que la teneur mesurée en 3,5-DCQ n'augmente pas entre le 4 ^ème et le 7 ^ème jour et il n'y a donc pas d'intérêt particulier à réaliser des fermentations longues. La concentration de l'enzyme IbGDSL obtenue par fermentation de P. pastoris permet d'accélérer la vitesse de réaction de la conversion de CGA en 3,5-DCQ (Fig. 10). On constate que le même niveau de concentration en 3,5-DCQ peut-être obtenu pour des facteurs de concentration en enzyme de 10, 20 et 37 fois après 60 h de bioconversion. En conclusion, l'enzyme IbGDSL recombinante obtenu par des cultures de P. pastoris constitue un catalyseur efficace permettant d'obtenir du la conversion de l'acide chlorogénique en 3,5-DCQ en grande quantité, soit en convertissant de l'acide chlorogénique pur, soit en transformant un extrait végétal contenant naturellement de l'acide chlorogénique tel qu'un extrait de café vert.