NEIRA ETCHEVERRY AMALIA OLGA ISABEL (CL)
RAZMILIC BONILLA IVÁN DALIBOR (CL)
| WO2009076776A1 | 2009-06-25 | |||
| WO2013171545A1 | 2013-11-21 |
| EP0657169B1 | 2002-09-25 | |||
| CN102727609A | 2012-10-17 | |||
| US20130065843A1 | 2013-03-14 |
CHINNICI, F. ET AL.: "Improved HPLC, Determination of Phenolic Compounds in Cv. Golden Delicious Apples Using a Monolithic Column", J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 52, no. 1, 9 December 2003 (2003-12-09), DIPARTIMENTO DI SCIENZE DEGLI ALIMENTI AND DIPARTIMENTO COLTURE ARBOREE, UNIVERSITà DI BOLOGNA, 40127, BOLOGNA, ITALY, pages 3 AND 7
YURI, J. ET AL.: "Manzanas y subproductos.", REVISTA INDUALIMENTOS, 1 February 2013 (2013-02-01), pages 81 - 91
| REIVINDICACIONES 1. Procedimiento de preparación de un extracto de compuestos fenólicos a partir de frutos del raleo, CARACTERIZADO porque comprende: a) Congelar los frutos provenientes del raleo de manzanas; b) Moler dichos frutos; c) Mezclar dichos frutos molidos con un solvente de extracción; d) Extraer los compuestos fenólicos presentes en dichos frutos molidos mediante la exposición de dicha mezcla al solvente durante a lo más 6 horas con agitación continua; y e) Filtrar dicha mezcla para obtener un extracto líquido de compuestos fenólicos. 2. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el solvente de extracción se selecciona entre etanol, agua o una mezcla de los mismos. 3. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, CARACTERIZADO porque la proporción etano agua del solvente de extracción es entre 0:100 y 80:20. 4. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, CARACTERIZADO porque la proporción etanohagua del solvente de extracción es preferentemente en el rango 40:60 a 80:20. 5. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, CARACTERIZADO porque la proporción etanol:agua del solvente de extracción es 80:20. 6. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, CARACTERIZADO porque la proporción frutos del raleo a solvente de extracción se selecciona del rango 1 :10 a 2:5. 7. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, CARACTERIZADO porque la proporción frutos del raleo a solvente de extracción se selecciona preferentemente del rango 1 :10 a 1 :5. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 7, CARACTERIZADO porque la proporción frutos del raleo solvente de extracción se selecciona es 1 :5. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, CARACTERIZADO porque el tiempo de exposición de los frutos molidos con el solvente es preferentemente entre 1 y 4 horas. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, CARACTERIZADO porque el tiempo de exposición de los frutos molidos con el solvente es de 2 horas. 11. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, CARACTERIZADO porque en la etapa d) la agitación se selecciona del rango comprendido entre 50 y 200 rpm. 12. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , CARACTERIZADO porque comprende los frutos del raleo correspondientes al descarte realizado entre los 20 y los 45 días después de plena flor (DDPF). 13. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, CARACTERIZADO porque el extracto líquido es sometido a un proceso de secado. 14. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, CARACTERIZADO porque el extracto líquido es concentrado en un evaporador rotatorio al vacío 15. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, CARACTERIZADO porque el extracto seco se obtiene mediante liofilización. 16. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, CARACTERIZADO porque la temperatura de extracción está en el rango de 50 a 100°C. 17. Procedimiento de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, CARACTERIZADO porque la temperatura de extracción está en el rango de 70 a 90°C. 18. Extracto de compuestos fenólicos, CARACTERIZADO porque comprende quercetinas, floridicina, epicatequina, procianidina, ácido clorogénico, donde dicho extracto se obtiene de acuerdo a la reivindicación 1. 19. Uso del extracto preparado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, CARACTERIZADO porque sirve para preparar un producto nutracéutico útil en el tratamiento del síndrome metabólico. 20. Uso del extracto preparado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y 19, CARACTERIZADO porque sirve para preparar un producto nutracéutico que tiene un efecto en el colesterol total, triglicéridos, tejido adiposo blanco, colesterol LDL y presión sistólica. Uso del extracto preparado de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, CARACTERIZADO porque se utiliza en un alimento funcional destinado mejorar el síndrome metabólico. |
La invención se relaciona, en general, con la obtención de un extracto que contiene compuestos fenólicos a partir de frutos de raleo temprano de manzanos para su uso en la industria alimenticia y/o farmacéutica.
Antecedentes de la invención
Siendo la manzana un producto altamente consumido, se ha observado una insuficiente utilización del material de descarte originado por su cultivo, entre los que destacan los frutos de raleo 1 (40 días después de plena flor, DDPF). El análisis bioquímico de los frutos del raleo ha demostrado la presencia de cantidades significativas de compuestos fenólicos con actividad antioxidante, siendo 4 a 8 veces superior al contenido fenólico de manzanas maduras entre los 150 a 210 DDPF (Yuri, J.A., Sepúlveda, A. y Lepe, A. 201 1. Comportamiento del manzano en diferentes zonas productivas de Chile, Editorial Universidad de Talca, Chile, p. 200). En Chile existe una superficie plantada de 37.412 ha. de manzanos (Censo Agropecuario 2007), en donde el raleo que se realiza cada año entre noviembre y diciembre significa la eliminación de una potencial fuente de antioxidantes, pues se desecha sobre el 70% del total de la fruta, la que podría ser utilizada con un fin comercial. Cabe destacar que la labor de raleo representa un costo estimativo de $150.000 por ha., para una producción de 40 toneladas por ha. Pese a que los frutos de raleo no presentan ningún uso comercial, siendo eliminados en el mismo huerto, resulta interesante rescatar el contenido fenólico que poseen estos frutos y lograr un extracto que capture toda esa actividad antioxidante. Lo anterior es posible de lograr mediante nuevas técnicas de extracción que permitan obtener un producto rico en antioxidantes en base a frutos de raleo de manzanos.
En los últimos años se ha tomado una real conciencia de lo necesario que es una dieta equilibrada y los beneficios asociados a un adecuado consumo de frutas y hortalizas. Es así como surge el concepto de alimento funcional. Se les considera como alimentos, naturales o procesados, que además de su aporte nutritivo, poseen ingredientes que ayudan a funciones corporales específicas, incrementando el bienestar del individuo, al disminuir los riesgos de enfermedades. Es así como los alimentos funcionales resultan un complemento interesante dentro de las alternativas de fomento de buena salud. El organismo humano se encuentra sometido en todo momento a procesos químicos de oxidación que son consecuencia de factores ambientales o a sustancias químicas que se generan durante el propio metabolismo, lo que genera envejecimiento prematuro y algunas enfermedades crónicas y degenerativas terminales. Es así como se ha generalizado la recomendación de consumir antioxidantes para evitar enfermedades cardíacas y diferentes tipos de cáncer (Boyer, J., and Luis, R.H. 2004. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition Journal, 3: 1-5). Aunque los mecanismos exactos por cuales se produce dicho efecto no están completamente dilucidados, se tiene la certeza de la participación de los antioxidantes (ver Williams, R.J., Spencer, J.P.E., and Rice-Evans, C. 2004. Flavonoids: Antioxidants or Signalling molecules? Free Radical Biology & Medicine, Vol 36, N°7: 838-849). De acuerdo a lo anterior, resulta de real importancia la obtención de una metodología óptima de extracción de compuestos fenólicos presentes en los mencionados frutos.
Hay diversos documentos que divulgan procesos de obtención de extractos ricos en antioxidantes fenólicos a partir de frutas y verduras. Por ejemplo, en uno de dichos documentos se divulga la obtención de un extracto de antioxidantes polifenólicos (37,7 g de fenoles / 100 g de muestra seca) a partir de material de descarte del procesamiento de frutas y verduras, mediante una extracción con metanol a 60°C, por 36 horas (ver Laroze, L. y Zuñiga-Hansen, M.E. 2007. Phenolic antioxidant extraction from selected agroindustrial residual sources. Abstracts. Journal of Biotechnology 131 : 193-194).
Con el fin de aumentar la extracción de compuestos fenólicos se han desarrollado metodologías alternativas en las que se utilizan enzimas. Por ejemplo, en Laroze et al. 2010 se muestra el aumento de la extracción de compuestos fenólicos mediante la utilización una relación material vegetal a solvente de 1 :20, por 18 horas, a una temperatura de 50°C y agitación a 150 rpm (ver Laroze, L, Soto, C. y Zuñiga-Hansen, M.E. 2010. Phenolic antioxidants extraction from raspberry wastes assisted by-enzymes. Electronic Journal of Biotechnology), donde se determinó que el tratamiento enzimático fue útil sólo cuando hubo una mezcla con mayor contenido de agua (agua-etanol 75:25). Cuando se utilizó una mezcla de agua-etanol de 25:75, se obtuvo una mejor extracción de antioxidantes.
Otro proyecto que trabaja con material de descarte de Berries (FONDEF, D07/1045), busca establecer un proceso biotecnológico para la recuperación de compuestos fenólicos con actividad antioxidante desde fruta fresca no comercializada y residuos del proceso. Recientemente Zuñiga y Caballero (Centro de Estudios en Alimentos y Salud, CREAS), han señalado que han obtenido jugo de verduras con bioactivos provenientes de los descartes de vegetales y hortalizas como lechuga, zanahoria, repollo morado y betarraga. La propuesta consideró el uso de técnicas de extracción y secado de la materia prima para la obtención de un concentrado de productos bioactivos factibles de ser utilizado en la formulación de nuevos productos.
También se han desarrollado procesos de obtención de un extracto acuoso rico en antioxidantes a partir de frutas cítricas, usando un tratamiento con agua y extracción sólida, separación tecnológica y/o tecnología de membrana en el extracto resultado en "serum", para luego ser sometido a un proceso de adsorción en resina y elución de los componentes antioxidantes adsorbidos en la resina por solventes, con preferencia de solventes como etanol o acetato de etilo y recolectando el solvente. Las fracciones de solventes pueden ser evaporados para obtener compuestos fenólicos secos (ver US 6528099 B1 ).
En el estado del arte se describen múltiples procedimientos de obtención de compuestos fenólicos a partir de manzanas entre los que destacan, por ejemplo, "Enhancing polyphenol extraction from unripe apples by carbohydrate-hydrolyzing enzymes" Hu-zhe Zheng, In-Wook Hwang, and Shin-Kyo Chung. J Zhejiang Univ. Sci. B. 2009 December; 10(12): 912-919, en el cual se divulga el empleo de manzanas inmaduras provenientes de raleo y/o caídas naturalmente del árbol como materia prima para la extracción de compuestos fenólicos. Por otra parte, en KR201001 12226 (A) se señala un método de extracción de compuestos fenólicos utilizando manzanas caídas que comprende el uso de enzimas sacarolíticas. El documento KR20110066042 (A) se refiere a una composición cosmética que contiene extracto de manzana inmadura como un ingrediente activo. El extracto de manzana inmadura fue aislado mediante un método que utiliza agua, etanol, o un disolvente de mezcla de agua y etanol, donde dicho extracto contiene 0,04% o más de quercetina sobre la base de 100% en peso y además, contiene 0,6% en peso de catequina, 0,9% en peso de ácido clorogénico, y 0,4% en peso de epicatechin.
En CN 102885909 (A) la invención se refiere a un método libre de residuos para la extracción de compuestos fenólicos de manzana, donde el método comprende lixiviación del orujo con etanol, extracción de polifenoles mediante ultrasonido, obtención de polifenoles por absorción a una resina macroporosa, elución en etanol, secado al vacío o secado por pulverización. En el documento "A profile of physicochemical and antioxidant changes during fruit growth for the utilisation of unripe apples" Hu-Zhe Zheng, Young-ll Kim, Shin-Kyo Chung. Food Chemistry, Volume 131 , Issue 1 , 1 March 2012, Pages 106-1 10, se describen los parámetros fisicoquímicos asociados con la calidad del fruto, actividad antioxidante y cambios en la composición de polifenoles durante el crecimiento de manzana Fuji desde el día 25 al día 105 después de plena floración (DDPF). En dicho documento se concluye que la fecha para un raleo rentable de manzanas inmaduras para utilizar como fuente de antioxidantes puede ser alrededor del día 85 DDPF.
En "Simultaneous separation and purification of total polyphenols, chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples" Lijun Sun, Yurong Guo, Chengcheng Fu, Jingjing Li, Zhuo ü. Food Chemistry, Volume 136, Issue 2, 15 January 2013, Pages 1022-1029, se desarrolló una separación preparativa eficiente de polifenoles de manzanas jóvenes provenientes de raleo (TYA), donde dicho método proporciona un enfoque potencial para uso industrial y farmacéutico.
En "Phenolic Compounds Contení and Tyrosinase Inhibitory Effect of Unripe Apple Extracts" Sang Yoon Choi, Sung Soo Kim, Yeonmi Lee, Bog-Hieu Lee and Chankyu Han. J. Appl. Biol. Chem. 53(2), 87-90 (2010) se describe un método de preparación de extracto fenólico a partir de manzanas inmaduras molidas, donde el proceso de extracción de compuestos fenólicos divulgado incluye la adición de etanol seguido de un periodo de incubación a temperatura ambiente, proceso que se repite tres veces. El extracto que se obtiene se filtra a través de un papel de filtro y a continuación, se concentra por completo usando un evaporador rotatorio para obtener el extracto fenólico de manzana.
FR 2826008 (A1) divulga un método de extracción de los polifenoles a partir de manzanas o derivados de manzana que implica la extracción con una solución alcohólica acuosa que contiene 0-90% en volumen de alcohol, un rango de temperatura de 20-100°C, con una relación solvente/manzana de 5-15/1 (volumen/peso). También se menciona un extracto polifenólico que comprende, en peso, 15-30% los derivados cinámicos, los derivados de catequina 0-30%, los derivados de Floretina 20-30% , los derivados de quercetina 25-50% y que contiene 30- 70% de taninos de catequina con respecto a los polifenoles totales.
Surangi, H. et al. (Apple peel flavonoid - and triterpene - enriched extracts differentially affect cholesterol homeostasis in hamsters. Journal of Functional Foods. 2012. 4: 963-971) realizaron ensayos con extractos de piel de manzana, rico en flavonoides y otro en triterpenos, en Hámster en dosis de 50 mg/Kg/día (28 días), logrando disminuir el colesterol sérico solo con el extracto que contenía flavonoides.
Por otra parte, el mercado ya dispone del Ingrediente Applephenon™ que corresponde a un derivado de manzanas inmaduras, el cual ha demostrado contener diez veces el nivel de polifenoles que se encuentran en manzanas maduras. Tiene una amplia gama de aplicaciones como por ejemplo suplementos nutricionales para alimentos procesados y bebidas, confitería, cosméticos y desodorantes. Así como también del producto comercial "Yuensun", el cual se obtiene de frutos inmaduros de manzanas por medio de una extracción sólido-liquido, que se caracteriza por contener un contenido de polifenoles entre 10-50%.
Descripción detallada de las figuras
Figura 1. Procedimiento de extracción de compuestos fenólicos.
Figura 2. Concentración de fenoles totales (Folin/Ciocalteu) en frutos de tres cultivares de manzano. Temporada 2007/2008.
Figura 3. Actividad Antioxidante (DPPH) en frutos de tres cultivares de manzano. Temporada 2007/2008.
Figura 4. Evolución de la concentración de fenoles totales, contenido de fenoles totales, actividad antioxidante en los extractos y actividad antioxidante en los frutos enteros de manzanas cvs. Gala (A y
B), Granny Smith (C y D) y Fuji (E y F), de huertos convencionales y orgánicos, en diferentes estados de desarrollo, durante la temporada 2009/2010. Curvas a cosecha. CFT: Concentración de Fenoles Totales: CNFT: Contenido de Fenoles Totales, AAE: Actividad Antioxidante del Extracto; AAFC: Actividad Antioxidante del Fruto completo.
Figura 5. Diagrama de flujo del procedimiento de preparación de un extracto de compuestos fenólicos a partir de frutos del raleo de manzanos. Descripción detallada de la invención
La presente invención corresponde a un procedimiento de preparación de un extracto concentrado que comprende compuestos fenólicos y que tiene una alta actividad antioxidante a partir de frutos del raleo de manzanos que comprende:
a) Congelar los frutos provenientes del raleo de manzanas;
b) Moler los frutos;
c) Mezclar los frutos molidos con un solvente de extracción;
d) Extraer los compuestos fenólicos presentes en dichos frutos molidos mediante la exposición a la mezcla de solventes durante 2 horas con agitación continua;
e) Filtrar dicha mezcla para obtener un extracto líquido de compuestos fenólicos
f) Concentrar en evaporador rotatorio al vacío; y g) liofilizar (Figura 1 )
En relación a la materia prima a utilizar en la preparación del extracto concentrado a partir de material de descarte de huertos de manzano, conocida como frutos de raleo, podemos definir como óptimo el período que considera el descarte entre 20 a 45 días después de plena flor (DDPF), particularmente, 26 a 45 DDPF, más particularmente 30 a 45 DDPF. Esto se afirma considerando los resultados logrados en tres temporadas al determinar el contenido fenólico y actividad antioxidante durante todo el período de desarrollo de frutos de manzanos cvs Galaxy, Granny Smith y Fuji.
Con el descarte de la temporada 2007/2008, se realizó una primera evaluación, obteniéndose los resultados que se grafican en las figuras 2 y 3, donde se puede observar que el contenido fenólico y actividad antioxidante entre 30 y 40 DDPF es muy superior, independiente del cultivar, al período comprendido entre 90 DDPF y la cosecha.
En una publicación realizada el año 2012, se muestran resultados de evaluaciones de la temporada 2009/2010, en donde se cuantificó la concentración y contenido fenólico en un rango más amplio de DDPF y además con fruta procedente de huertos de cultivo convencional y orgánico. Se visualiza que existe un alza cercana a los 40 DDPF en los tres cultivares y en ambos tipos de cultivo (Figura 4).
Lo antes mencionado se confirmó con resultados de la temporada 2011/2012.
En relación al contenido fenólico y, por ende, su actividad antioxidante, éstas incrementan al aumentar el tamaño del fruto. Debido a ello, algunos autores deciden usar como materia prima fruta inmadura de 85 DDPF ("A profile of physicochemical and antioxidant changes during fruit growth for the utilization of unripe apples" Hu-Zhe Zheng, Young-ll Kim, Shin-Kyo Chung. Food Chemistry, Volume 131 , Issue 1 , 1 March 2012, Pages 106-110). En nuestra opinión es preferible utilizar fruta de descarte de huerto y no aquella con mayor desarrollo, cuyo objetivo es ser consumida como fruta fresca. De ésta forma no se afecta la cosecha comercial.
La metodología utilizada en la obtención del extracto de elevado nivel de antioxidante a partir de frutos de raleo, se preparó con el propósito de maximizar la recuperación de Quercetinas, considerando que éstas, por su estructura química, son reconocidas como muy buenos antioxidantes.
Entre las ventajas de la presente invención destaca que la materia prima (frutos de raleo temprano) corresponde a material de descarte de huertos de manzanas. De acuerdo a la superficie de manzanos en Chile (aprox. 37.000 ha), se podría llegar a recuperar alrededor de 6.100 Ton de extracto. Tan solo el 1% del extracto, permitiría obtener una producción de 60 Ton de producto. Otra ventaja que presenta la metodología desarrollada por el Centro de Pomáceas (CP) es la extracción de compuestos fenólicos en manzanas, independiente de la variedad. Adicionalmente, la materia prima posee un muy elevado contenido antioxidante, que oscila entre 4 a 7 veces más que el contenido que se puede obtener a partir de frutos cosechados. Por otra parte, al utilizar etanol como solvente para la extracción de compuestos fenólicos, se traduce en menores costos económicos a diferencia de otros métodos de extracción (metanol), además de presentar menor toxicidad.
Con la invención propuesta, la extracción de compuestos fenólicos se realiza en un menor tiempo (2 horas) en comparación con otros procedimientos (16 horas), por lo cual tiene aplicación industrial. El mercado potencial del producto recae en la industria de compuestos naturales, tanto en el área nutracéutica, para mejorar los síntomas en pacientes que poseen síndrome metabólico, como en el área de suplementos alimenticios, aumentaría la ingesta de antioxidantes en la dieta humana, entre otras.
En particular, la mezcla de solventes, la temperatura y el periodo de extracción del procedimiento propuesto son los óptimos para la recuperación de Quercetinas 2 , compuestos que por su estructura química presentan importante actividad antioxidante.
Quercetinas: Flavonol que se encuentra presente en altas concentraciones tanto en frutas como en verduras. Es el flavonoide más abundante y habitual en la dieta humana, destacando por su elevada actividad antioxidante. En la Tabla 1 se visualiza que la extracción de fenoles es menos eficiente en agua pura, es mejor agregar algo de etanol; en tanto en la Tabla 2 se aprecia que catequinas y epicatequinas son más solubles en agua, a diferencia de floridicina, que es mejor extraída en solución alcohólica, al igual que quercetinas (Tabla 3). Para éstas una solución al 80% de etanol en agua permite extraer significativamente más quercetinas, casi duplicando a lo que se obtiene en una mezcla al 40%.
Tabla 1. Efecto de la concentración de la mezcla Etanol / H 2 0
Proporción mezcla mg EAC */ g de tejido fresco
Etanol / H 2 0 Fenoles Antioxidantes
00 / 100 4,5 b 1,5 b
40 / 60 9,2 a 4,3 a
80 / 20 9,1 a 4,4 a
Valor p 0,00 0,00
Significancia: n.s., no significativo; *: p < 0,05; **; p < 0,01. Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente. *Equivalente Acido Clorogénico
Tabla 2. Efecto de la concentración mezcla Etanol/H 2 0 en la extracción de fenoles específicos.
Proporción mezcla ug fenol / g de tejido fresco
Etanol / H 2 0 Ac Clorogénico Catequina Procianidina Epicatequina Floridicina
00 / 100 1142 b 141 a 377 c 550 a 238 b
40 / 60 2130 a 96 a 1736 a 674 a 786 a
80 / 20 1248 b 44 b 1170 b 505 a 609 a
Valor p 0,00 0,00 0,00 0,14 0,00
Significancia: n.s., no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01. Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente. Tabla 3. Efecto de concentración mezcla Etanol/H20 sobre Quercetinas glicosiladas.
Proporción mezcla ug Quercetina glicosilada / g de tejido fresco
Etanol / H 2 0 Rutinósldo Galactósido Glucósido Xilósido Arabinósido Ramnósido Q.totales
00/ 100 2,4 a 17 b 5,5 b 7,9 b 7,2 b 30 b 70 c
40 / 60 4,1 a 54 a 15 a 25 a 45 b 15 c 158 b
80 / 20 3,1 a 71 a 12,7 a 35 a 82 a 76 a 286 a
Valor p 0,22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Significancia: n.s., no significativo; *: p 0,05; **: p < 0,01. Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente.
El estudio de la proporción de material vegetal.solvente (Tabla 4), demuestra como óptimo la relación 1 :5.
Tabla 4. Efecto relación material vegetal solvente de extracción
Tejido Fenoles Antioxidantes
g en 10 mL solvente mg EAC/ g de tejido fresco
1 10,43 b 6,62 b
2 12,53 a 10,39 a
4 9,43 c 6,08 c
5 7,39 d 6,72 b
valor p 0,0 0,0
Significancia: n.s., no significativo; *: p < 0,05; **; p < 0,01. Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente.
El ensayo del tiempo de extracción realizado en una primera instancia, no mostró diferencias significativas referentes al contenido fenólico, pero sí en cuanto a los antioxidantes (Tabla 5), por lo que en una segunda oportunidad se estudió el efecto del tiempo de extracción sobre quercetinas, obteniéndose como óptimo 2 horas, lo que se visualiza en Tabla 6.
Tabla 5. Efecto del tiempo de extracción en etanol al 80%. Tiempo mg EAC / g de tejido fresco
(horas) Fenoles Antioxidantes
2 6,6 1,3 b
4 6,9 1,7 a
6 7 2,0 a valor p n.s 0,00
Significancia: n.s., no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01. Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente.
Tabla 6. Efecto del período de incubación a 80°C, sobre el contenido de Quercetinas glicosiladas.
Incubación ug de Quercetinas glicosiladas / g de tejido fresco
Horas Rutinósido Galactósido Glucósido Xilósido Arabinósido Ramnósido Q. totales
1 4 80 b 23 38 b 98 46 b 285 b
2 4 122 a 20 47 a 116 52 a 375 a
4 4 84 b 25 38 b 117 44 b 291 b valor p 0,64 0,00 0,09 0,00 0,05 0,01 0,00
Significancia: n.s., no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01. Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente.
Los resultados sobre el efecto de la temperatura (4, 50 y 80°C) sobre la extracción, se muestran en las Tablas 7 y 8, donde se puede visualizar que es mejor hacerlo a 80 °C al considerar contenido fenólico, siendo el resultado es significativamente importante al estudiar el efecto sobre quercetinas.
Tabla 7. Efecto de la temperatura en extracción con Etanol al 80% por 6 H.
Temperatura de extracción mg / g de tejido fresco
Fenoles Antioxidantes
4 4,6 b 2,8 b
50 6,3 ab 4,0 a
80 7,5 a 4,6 a
Valor p 0,03 0,00
Significancia: n.s., no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01. Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente.
Tabla 8. Efecto de la temperatura en cuantificación de Quercetinas glicosiladas en Etanol al 80%. ug Quercetina glicosilada / g de tejido fresco
Temperatura se
Rutinósido Galactósido Glucósido Xiiósido Arabinósido Ramnósido Q.totales
50 4,1 b 125 b 19 b 52 b 125 b 98 b 423 b
80 • 5,8 a 187 a 28 a 79 a 188 a 142 a 630 a
Valor p 0,01 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Significancia: n.s., no significativo; *: p < 0,05; **: p < 0,01. Valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente.
Por todo lo anterior se consideró como una metodología adecuada para extraer compuestos fenólicos a partir de frutos pequeños de manzana, una que considere una relación material vegetal solvente igual 1 :5 en etanol al 80 %, por 2 horas y a 80°C.
Una realización preferente de la preparación de un extracto de compuestos fenólicos a partir de frutos del raleo comprende:
a) Congelar los frutos provenientes del raleo de manzanas;
b) Moler los frutos;
c) Mezclar los frutos molidos con un solvente de extracción;
d) Extraer los compuestos fenólicos presentes en los frutos molidos mediante la exposición de dicha mezcla al solvente durante a lo más 6 horas con agitación continua; y
e) Filtrar la mezcla para obtener un extracto líquido de compuestos fenólicos.
f) Concentrar en evaporador rotatorio al vacío; y g) Liofilizar (Figura 1)
El solvente de extracción se selecciona entre etanol, agua o una mezcla de los mismos.
En una realización, la proporción etanol:agua del solvente de extracción está en el rango de 0:100 y 80:20, preferentemente en el rango 40:60 a 80:20 y más preferentemente la proporción etanol:agua del solvente de extracción es 80:20.
En una realización la proporción frutos del raleo a solvente de extracción se selecciona del rango 1 : 10 a 2:5, preferentemente del rango 1 : 10 a 1 :5 y más preferentemente es 1 :5.
En otra realización el tiempo de exposición de los frutos molidos con el solvente está entre 1 y 4 horas; preferentemente 2 horas.
En una realización preferente en la etapa la d) la agitación se selecciona del rango comprendido entre 50 y 200 rpm, preferentemente 150 rpm.
En una realización preferente los frutos del raleo correspondientes al descarte realizado entre los 20 y los 45 días después de plena flor (DDPF).
En una realización preferente la temperatura de extracción está en el rango de 50 a 100°C; preferentemente en el rango de 70 a 90°C, más preferentemente a 80°C.
En una realización preferente el procedimiento de preparación del extracto líquido es sometido a un proceso de secado por liofilización.
En una realización preferente el extracto de compuestos fenólicos, comprende quercetinas, floridicina, epicatequina, procianidina, ácido clorogénico.
En una realización preferente la presente invención se relaciona con la preparación de un extracto concentrado de elevado contenido antioxidante a partir de frutos de manzano, de alrededor de 35 a 45 días después de plena flor (DDPF) almacenados entre 0-1 °C, hasta el momento de ser usados. Los frutos congelados son molidos para posteriormente ser mezclados con el solvente de extracción en una relación 1 :5, donde el solvente utilizado es una mezcla etanokagua (80:20). El proceso de extracción se realiza por 2 horas a 80°C, con agitación continua a 150 revoluciones por minuto (rpm). Posteriormente, se filtra para descartar el componente sólido y la fracción líquida se evapora al vacío para recuperar el etanol y finalmente se elimina el agua por liofilización.
Otra realización protege el uso de un extracto de compuestos fenólicos en un producto nutracéutico o en un alimento funcional para el tratamiento del síndrome metabólico, preparado mediante el procedimiento antes divulgado.
Ejemplo de aplicación
A partir de 1000 g de frutos de raleo fue posible obtener 66 g de extracto en polvo que corresponde al producto final del procedimiento de extracción divulgado en la presente solicitud, lo que indica que este se ha concentrado aproximadamente 15 veces.
El prototipo (extracto) logrado en diferentes temporadas, muestra un nivel de compuestos fenólicos y capacidad antioxidante sin diferencias significativas, pese a las variaciones estacionales. En la primera temporada se obtuvo 17,0 g de Fenoles Totales (EAC)/100 g de producto final, con un ORAC de 174.000 ± 48.000 (ET), en tanto en la segunda temporada se obtuvo 22,0 g de Fenoles totales (EAC)/100 g de producto final, con un ORAC de 182.000 ± 26.000. Entre los fenoles totales destacan Quercetinas y Floridicina, las cuales presentaron en ambas temporadas un promedio de 16±2% y 30±3% respectivamente.
Se realizaron paneles sensoriales con el prototipo obtenido, para ver su aceptabilidad al ser incorporado en distintas proporciones a muestras de jugo y puré de manzana.
Se han realizado ensayos biológicos en ratones CF-1. En la primera oportunidad se probaron dosis de hasta 400 mg de Fenoles Totales (EAC)/kg ratón/día, en tanto en una segunda se ensayó dosis de 50 y 25 mg de Fenoles Totales (EAC)/kg ratón/día y los resultados señalan efectos positivos sobre los animales que han desarrollado síndrome metabólico, pues los extractos permiten mejorar parámetros, tales como: colesterol total, triglicéridos, tejido adiposo blanco, colesterol LDL y presión sistólica. El efecto sobre estas variables mostró relación con la dosis administrada.
Además, se ensayó la toxicidad oral aguda en ratones, según la norma 423 de la OECD y se demostró que el producto logrado no presenta toxicidad. Adicionalmente, el análisis histopatológico de duodeno, hígado y riñon no muestra signos de patología aguda ni crónica. Se concluyó que la dosis letal para el cincuenta por ciento de los animales en el producto estudiado, se encuentra por sobre la concentración de 2.000 miligramos por kilogramo de peso de animal.