Technischer Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Rolle des FATP2-Proteins (Fatty Acid Transport Protein 2) in T-Zellen bei der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen, insbesondere von Rheuma, Rheumatoider Arthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, chronischen entzündlichen Darmerkrankungen wie Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, Multiple Sklerose, und weiteren Autoimmunerkrankungen mit T-zellulärer Beteiligung. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an das FATP2- Protein binden, und auf die Verwendung von FATP2-Protein zum Screening und zur Identifizierung von FATP2-interagierenden und FATP2-inhibierenden Verbindungen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Wirkstoffe umfassen, die an das FATP2-Protein binden und/oder dieses hemmen.

Hintergrund und Stand der Technik

Autoimmunerkrankungen betreffen etwa 5 bis 8% der Bevölkerung weltweit. Sie sind mit einer hohen Morbidität und vorzeitiger Mortalität verbunden; nach den Herz-Kreislauf- und Tumorerkrankungen stellen sie die dritthäufigste Gruppe von Erkrankung dar. Bei Autoimmunkrankheiten greift das Immunsystem gesundes, körpereigenes Gewebe an, weil nicht mehr zwischen „fremd“ und „selbst“ unterschieden werden kann. Zu den systemischen Autoimmunkrankheiten zählen rheumatische Gelenkentzündungen; sie betreffen als juvenile idiopathische Arthritis (JIA) etwa 20.000 Kinder und als Rheumatoide Arthritis etwa 1,5 Millionen Erwachsene in Deutschland. Beide Erkrankungen sind Autoimmunerkrankungen unbekannten Ursprungs, die eine intermittierende chronische Entzündung der Gelenke verursacht. Neben den Zellen des angeborenen Immunsystems wie Neutrophile und Monocyten, die die Entzündungsvorgänge auslösen, bestimmen auch Zellen des adaptiven Immunsystems wie T-Zellen die chronischen Entzündungsreaktionen in den Gelenken.

Trotz inzwischen zunehmender therapeutischer Optionen sind Autoimmunerkrankungen bislang nicht heilbar. Bei einer Vielzahl von Autoimmunerkrankungen konnte die wesentliche Beteiligung von T-Zellen nachgewiesen werden, wie z.B. bei rheumatoider Arthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, Colitis ulcerosa und Multipler Sklerose. Dabei spielen insbesondere sog. „Memory“-T-Zellen (Gedächtnis-T-Zellen) eine Rolle. Diese finden sich hauptsächlich gewebeständig und sind einer Immunsuppression nicht immer zugänglich.

Ihr inflammatorisches Potential kann innerhalb der entzündeten Gelenke nicht von regulatorischen T-Zellen (Treg-Zellen) kontrolliert werden. Nahezu alle T-Zellen innerhalb der Gelenke von Patienten mit juveniler idiopathischer Arthritis zeigen den Phänotyp von Memory-T-Zellen.

Der Metabolismus von T-Zellen von Patienten mit (kindlichem) Rheuma unterscheidet sich signifikant von dem Gesunder; es findet sich eine fundamentale Dysregulation des Fettsäuremetabolismus bei Patienten mit kindlichem Rheuma, insbesondere im entzündeten Gelenk. Dies betrifft vor allem die Gedächtnis-T-Zellen, die bis zu 95% der T-Zellen im entzündeten Gelenk ausmachen.

Die Funktionen von Gedächtnis-T-Zellen sind durch metabolische Gegebenheiten determiniert, die auch mit einer Umprogrammierung ihrer Funktionen einhergehen können (sog. „metabolic reprogramming“). Für den notwendigen Energiestoffwechsel nutzen T-Zellen im Wesentlichen die drei Energieressourcen Glukose, Glutamin und Fettsäuren. Weder für Glutamin noch für Fettsäuren sind die Transportproteine bisher eindeutig identifiziert und definiert. Die metabolischen Eigenschaften von Gedächtnis-T-Zellen unterscheiden sich deutlich von den Eigenschaften von naiven und Effektor-T-Zellen (Geltink et al. 2018). Ruhende naive T- Zellen bedienen sich eines oxidativen Metabolismus, um effizient Energie zu produzieren; sie nehmen mit sehr geringer Rate Glukose auf, um die notwendige Energie für die Aufrechterhaltung ihrer betrieblichen Stoffwechselfunktionen bereitzustellen. Naive T-Zellen verwenden Pyruvat aus dem Glukose-Abbau zur ATP-Gewinnung mittels oxidativer Phosphorylierung oder Fettsäure-Oxidation. Aktivierte T-Zellen dagegen müssen proliferieren und schalten deshalb auf ein Programm zum anabolischen Wachstum um, damit sie ihre Effektor- Funktionen ausüben können. Der vorherrschende Stoffwechsel-Zustand von aktivierten T- Zellen (sowohl CD4- als auch CD8-positiven T-Zellen) ist die aerobe Glykolyse, die daduch gekennzeichnet ist, dass Pyruvat aus dem Glukose-Abbau zu Laktat umgesetzt wird, obwohl ausreichend Sauerstoff für eine vollständige Glukose-Oxidation zur Verfügung steht (Geltink et al. 2018). Dieser Prozess, der als „Warburg-Effekt“ aus früheren Studien in der Tumorbiologie bekannt ist, ist ein gemeinsames Merkmal von aktiv proliferierenden Zellen. Nachdem Effektor-Zellen ihre Aufgaben erfüllt haben, gehen sie entweder zugrunde oder verwandeln sich in Gedächtnis-T-Zellen.

Gedächtnis-T-Zellen bilden das „immunologische Gedächtnis“ des Immunsystems insofern, als sie auf eine wiederholte Begegnung mit dem Antigen mit einer stärkeren Immunreaktion („sekundäre Immunantwort“) reagieren. Die Signaltransduktions- und Stoffwechselwege, die die Bildung von Gedächtnis-T-Zellen regulieren, sind daher von großem Interesse. Die mitochondriale Fettsäure-Oxidation ist notwendig für die Entwicklung von CD8-positiven Gedächtnis-T-Zellen und abhängig vom Tumor-Nekrosefaktor-(TNF-)Rezeptor-assoziierten Faktor-6 (TRAF6) (Pearce et al. 2009). Die Fettsäure-Oxidation generiert Acetyl -Coenzym A (CoA), welches im Zitronensäure-Zyklus weiter metabolisiert werden kann, sowie FADEL und NADH+H ⁺ , die direkt verwendet werden können, um über die Elektronentransportkette Adenosintriphosphat (ATP) zu erzeugen. Freie Fettsäuren sind energiereiche Moleküle, und die Fettsäure-Oxidation könnte eine bevorzugte Energiequelle für Gedächtnis-T-Zellen („Tmem“) darstellen, da sie auf von oxidativer Phosphorylierung abhängige Stoffwechselwege angewiesen sind. Außerdem verleiht ein größerer Gehalt an Mitochondrien GedächtnisT-Zellen einen bioenergetischen Vorteil, indem er die schnelle Immunreaktion in Antwort auf eine Re-Infektion verstärkt. Im Gegensatz zu Effektor-T-Zellen, die insbesondere auf Glykolyse angewiesen sind, besitzen CD8-positive Gedächtnis-T-Zellen deshalb eine höhere respiratorische Reserve-Kapazität und verlassen sich vorwiegend auf die Fettsäure-Oxidation. In gewebeständigen CD8-positiven Gedächtnis-T-Zellen zählen Gene, die Fettsäure-bindende Proteine (FABP4 und FABP5) codieren, zu den am stärksten hochregulierten Genen, genauso wie das Gen, das für CD36 codiert, einen sog. „Lipid-scavenger cell-surface receptor“ (Pan et al. 2017). Die Daten zu CD4-positiven T-Zellen hinsichtlich ihres Fettsäure-Metabolismus sind demgegenüber noch spärlich. Es konnte aber gezeigt werden, dass die genetische Deletion von ACC1, einem geschwind! gkeits-begrenzenden Enzym der Fettsäure-Biosynthese, die Bildung von CD4-positiven Gedächtnis-T-Zellen steigert, und dass die Inhibition der ACCl-Funktion die Bildung von Gedächtnis-T-Zellen während einer Parasiten-Infektion in Mäusen erhöht (Endo et al. 2019).

Über den Aufnahmemechanismus von Fettsäuren in T-Zellen und die Identität von Transportmolekülen für Fettsäuren in T-Zellen war im Stand der Technik bisher nichts bekannt. Die therapeutischen Möglichkeiten bei Autoimmunerkrankungen sind bisher begrenzt, eine Heilung nicht möglich. Insbesondere ist keine Therapieoption, die den Metabolismus von Immunzellen zum Ziel hat, verfügbar.

Somit bestand eine der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe in der Bereitstellung von Verfahren und Mitteln zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen, sowie ihrer Verwendung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen.

In der vorliegenden Anmeldung wird die Identifizierung eines neuen molekularen Zielmoleküls („Targets“) für die Therapie von Autoimmunerkrankungen offenbart. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde das Fettsäure-Transportprotein-2 (FATP2, Fatty Acid Transport Protein 2), codiert vom SLC27A2-Gen, als Fettsäure-Transporter in T-Zellen identifiziert, und erstmals nachgewiesen, dass dessen Blockade die Funktion der T-Zellen hinsichtlich ihrer Produktion von Zytokinen, der Aktivierung ihrer Effektorfunktionen und hinsichtlich ihrer Proliferation beeinflussen.

Eine Expression des Fettsäure-Transportproteins-2 (FATP2) wurde bisher nachgewiesen in Leber, Dünndarm, Niere, Pankreas, und Plazenta (Falcon et al. 2010; Perez et al. 2020; Khan et al. 2020). Das Protein wird codiert vom Solute Carrier Family 27 Member 2" (SLC27A2')-G&n und hat im Wesentlichen zwei Funktionen, die Aktivierung langkettiger Fettsäuren als eine „Very Long-Chain Acyl-Coenzyme A (CoA)“- Synthetase (ACSVL), und den Transport Coenzym A-aktivierter langkettiger Fettsäuren als Fettsäure-Transportprotein (Falcon et al. 2010; Khan et al. 2020; Melton et al. 2013).

Das Transportmolekül FATP2 wurde von Falcon et al. (2010) mit der Entwicklung von nicht-alkoholischer Fettleber bei Mäusen in Verbindung gebracht. Andere Studien deuten darauf hin, dass das Molekül für die Pathogenese von diabetischen Nierenerkrankungen mitverantwortlich sein könnte (Khan et al. 2020). Weiter wurde gezeigt, dass eine Hochregulierung der Expression des SLC27A2-Gens bzw. des FATP2-Proteins in differenzierten Schilddrüsen-Karzinomen mit einer erhöhten Proliferation und Migration von Tumorzellen assoziiert sein kann (Feng et al. 2021), und dass das FATP2-Protein in Tumoren an einer Re- Programmierung von Neutrophilen beteiligt sein kann (Veglia et al. 2019). W02020/172510 (Wistar Institute) offenbart Verfahren zur Tumortherapie durch eine Hemmung, Blockade oder Runterregulation von FATP2 in MDSCs (Myeloid-derived Suppressor Celis, myeloide Suppressor-Zellen), einer heterogenen Population von unreifen und pathologisch aktivierten myeloiden Zellen, die sich bei Tumorpatienten in großen Mengen ansammeln, die Aktivität und Proliferation von T-Zellen und Natural Killer (NK)-Zellen unterdrücken, und durch diese immunsuppressive Wirkung das Wachstum der Tumoren begünstigen.

Die vorliegende Anmeldung offenbart das SLC27A2-Gen bzw. das FATP2-Protein erstmals als Zielmolekül und damit neuen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung von Patienten mit Autoimmunerkrankungen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfinder haben erstmals und überraschend mit dem vom SLC27A2-Gen-codierten FATP2 einen Fettsäure-Transporter in T-Zellen, insbesondere in Gedächtnis-T-Zellen identifiziert, dessen Blockade die Funktionen dieser T-Zellen (Proliferation, Produktion von Zytokinen) wesentlich beeinflusst. Dieser fundamentale Schritt für das Verständnis der T-Zellfunktion bietet erstmals die Möglichkeit, diese T-Zellfunktion gezielt zu beeinflussen und durch eine Veränderung des Metabolismus neu zu programmieren.

Bislang war für T-Zellen der aufnehmende Rezeptor/Transporter von freien Fettsäuren, die neben Glukose eine wesentliche Energiequelle insbesondere im entzündeten Gewebe darstellen, nicht bekannt. Das als FATP2 identifizierte Fettsäuretransportprotein ist in T- Zellen in entzündeten Gelenken von Patienten, beispielsweise mit kindlichem Rheuma, 10- fach hochreguliert im Vergleich zum Blut derselben Patienten und gesunden Kontrollen. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass in Gedächtnis-T-Zellen, welche zur Proliferation gebracht werden, die FATP2-Expression 30-fach hochreguliert wird, und gleichzeitig die Fettsäureaufnahme der Zellen massiv steigt.

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Mittel zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen bereit, insbesondere zur Identifizierung von hochwirksamen Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Rheuma, Rheumatoider Arthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, chronischen entzündlichen Darmerkrankungen einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, Multiple Sklerose, und anderen Autoimmunerkrankungen mit T-zellulärer Beteiligung.

In Anbetracht des Standes der Technik war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Hemmung oder Verringerung der Fettsäureaufnahme in eine T-Zelle, der Aktivierung und/oder der Proliferation einer T-Zelle bereitzustellen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs bereitzustellen, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon bindet und/oder dieses hemmt.

Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung einer Nukleinsäure, die für das FATP2-Protein, oder ein Fragment davon, codiert, oder das FATP2-Protein selbst, oder ein Fragment davon, für die Identifizierung eines Wirkstoffs, der an FATP2, oder ein Fragment davon, bindet, bereitzustellen.

Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Wirkstoffe zur Verwendung bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung bereitzustellen, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von Rheuma, Rheumatoider Arthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, chronischen entzündlichen Darmerkrankungen einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, Multipler Sklerose, und anderen Autoimmunerkrankungen mit T-zellulärer Beteiligung, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Mittel enthalten, und von Verfahren zur Herstellung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen.

Die beschriebenen und weitere technischen Aufgaben werden durch die Vorrichtungen bzw. Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen der aktuellen Erfindung gelöst. Die abhängigen Ansprüche beschreiben bevorzugte Ausführungsformen. Wertebereiche, die durch numerische Werte begrenzt sind, sollen stets die besagten Grenzwerte beinhalten.

Die Erfindung und allgemeine vorteilhafte Ausgestaltungen werden im Folgenden näher erläutert.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt, dass T-Zellen, die in der Synovialflüssigkeit von juvenilen idiopathischen Arthritis (JIA)-Patienten vorkommen, eine verstärkte Aufnahme von Fettsäuren haben, die mit einer vermehrten Expression von FATP2/SLC27A2 einhergeht. Der Fettsäurerezeptor FATP2 ist dabei vor allem in CD4+ Gedächtniszellen exprimiert.

Fig. 1A: Aufnahme von freien Fettsäuren in CD4+ T-Zellen aus dem Blut oder dem Synovium von JIA Patienten. Die Messung erfolgte nach 15-minütiger Inkubation der Zellen mit Bodipye™FL C 12 (2 pM) und nachfolgender durchflusszytometri scher Analyse. Die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist abzüglich der jeweiligen FMO Kontrolle dargestellt (AMFI). Die Daten zeigen die mittlere Expression in 4 Patienten ± Standardfehler, **p < 0.01.

Fig. 1B: FATP2 -Proteinexpression in CD4+ T-Zellen aus dem Peripherblut (PB) oder dem Synovium (SF) von JIA Patienten (durchflusszytometri sehe Analyse). Es ist ein repräsentatives Bild gezeigt. Fig. 1 C: Expression von SLC27A2 RNA in CD4+ T-Zellen der Synovialis von JIA Patienten im Vergleich zum Blut derselben Patienten.

Fig. ID: Proteinexpression von FATP2 in CD4+ T-Zellsubtypen (Effektor-Gedächtnis-T- Zellen (Tem), Gewebeständige Gedächtnis-T-Zellen (T _m ) und naive T-Zellen (Tnaive)) aus dem Blut oder dem Synovium von JIA Patienten (durchflusszytometrische Analyse). Die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist abzüglich der jeweiligen FMO Kontrolle dargestellt (AMFI). Die Daten zeigen die mittlere Expression in 5 Patienten ± Standardfehler, ***p < 0 001. ****p < 0.0001.

Fig. IE: mRNA Expression von FATP2 im Vergleich zu anderen Stoffwechselproteinen in CD4+ Gedächtnis-T-Zellen nach 48 stündiger und 72 stündiger Stimulation mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern und in nicht stimulierten CD4+ Gedächtnis-T-Zellen. Die CD4+ Gedächtnis-T-Zellen wurden mittels magnetischer Zellseparation aus dem Blut gesunder Kontrollen isoliert. Die Daten zeigen die mittlere Expression von 4 Experimenten mit unterschiedlichen Spendern ± Standardfehler, **p < 0.01, ***p < 0.001.

Fig. 2 zeigt, dass der FATP2-Inhibitor Lipofermata die Fettsäureaufnahme in CD4+ T-Zellen inhibiert, und die IFN-y Expression und Proliferation hemmt, ohne Apoptose zu induzieren.

Fig. 2A: Aufnahme von freien Fettsäuren in CD4+ T-Zellen nach Zugabe von Lipofermata in steigenden Konzentrationen (0, 2, 5, 7,5 und 10 pM). Dazu wurden die Zellen für 48 Stunden mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern stimuliert. Die Messung erfolgte nach 15-minütiger Inkubation der Zellen mit Bodipye™ FL C12 (2 pM) und nachfolgender durchfluss- zytometri scher Analyse. Die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist abzüglich der jeweiligen FMO Kontrolle dargestellt (AMFI). Die Daten zeigen die mittlere Expression gemessen in 3 Experimenten ± Standardfehler.

Fig. 2B: Exemplarisches Histogramm der Fettsäureaufnahme in CD4+ T-Zellen ohne Zugabe von Lipofermata (rechts) und nach Lipofermata Zugabe (links).

Fig. 2C Prozentuale Anzahl IFN-y positiver CD4+ T-Zellen nach Zugabe von Lipofermata in steigender Konzentration (0, 2, 5, 7,5 und 10 pM). Dazu wurden die Zellen für 48 Stunden mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern stimuliert. Die Bestimmung IFN-y positiver Zellen erfolgte nach 5-stündiger Restimulation mit PMA und lonomycin in Anwesenheit von GolgiPlug™ mittels Durchflusszytometrie. Die Daten zeigen die mittlere Expression gemessen in 5-6 Experimenten ± Standardfehler, *p < 0.01.

Fig. 2D: Exemplarisches Punktdiagramm der IFN-y Expression ohne Zugabe von Lipofermata (links, Kontrolle) und nach Lipofermata Zugabe (rechts).

Fig. 2E: Prozentualer Anteil proliferierter CD4+ T-Zellen nach Zugabe von Lipofermata in steigender Konzentration (0, 2, 5, 7,5 und 10 pM). Dazu wurden die Zellen mit “cell proliferation dye eFlour™” gefärbt und für 48 Stunden mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern stimuliert. Die Bestimmung proliferierter Zellen erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Die Daten zeigen die mittlere Expression gemessen in 5 Experimenten ± Standardfehler, *p < 0.01.

Fig. 2F: Exemplarisches Punktdiagramm der Zellproliferation ohne Zugabe von Lipofermata (links, Kontrolle) und nach Lipofermata Zugabe (rechts).

Fig. 2G: Exemplarisches Punktdiagramm der toten Zellen mit Lipofermata Behandlung (rechts) und ohne (links, Kontrolle). Die Zellen wurden dazu für 72 Stunden mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörpern stimuliert und zur durchflusszytometri sehen Lebend/Tot- Unterscheidung mit Propidiumiodid (PI) angefärbt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Bevor die Erfindung im Detail beschrieben wird, wird darauf hingewiesen, dass diese Erfindung nicht begrenzt ist auf bestimmte Bestandteile der beschriebenen Vorrichtungen oder beschriebenen Schritte der Verfahren, da diese Verfahren bzw. Vorrichtungen variieren können. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die verwendete Terminologie hierfür nur zum Zweck für bestimmte beschriebene Ausführungsformen benutzt wird, und nicht absichtlich begrenzt ist. Es soll angemerkt werden, dass in der Beschreibung und in den anhängenden Ansprüchen die einfache Form wie „ein/eine“ oder „der/die/das“ einen singulären und/oder pluralen Gegenstand beinhaltet, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Für den Fall, dass ein Parameterbereich angegeben wurde, zählen die begrenzenden Zahlenwerte als Grenzwerte zum offenbarten bzw. beanspruchten Zahlenbereich dazu.

Es ist ferner zu beachten, dass die hier offenbarten Ausführungsformen nicht als einzelne Ausführungsformen zu verstehen sind, die sich nicht aufeinander beziehen würden. Merkmale, die im Zusammenhang mit einer Ausführungsform diskutiert werden, sollen auch im Zusammenhang mit anderen hier gezeigten Ausführungsformen als offenbart gelten. Wenn in einem Fall ein bestimmtes Merkmal nicht mit einer Ausführungsform, sondern mit einer anderen offenbart wird, wird der Fachmann verstehen, dass dies nicht unbedingt bedeutet, dass dieses Merkmal nicht mit der anderen Ausführungsform offenbart werden soll. Der Fachmann wird verstehen, dass es dem Prinzip dieser Anmeldung entspricht, das betreffende Merkmal auch für die andere Ausführungsform zu offenbaren, dass dies aber aus Gründen der Klarheit und um die Spezifikation in einem überschaubaren Umfang zu halten, nicht getan wurde.

Ferner wird der Inhalt der hierin genannten Dokumente des Standes der Technik durch Bezugnahme einbezogen. Dies gilt insbesondere für Dokumente des Standes der Technik, die Standard- oder Routineverfahren offenbaren. In diesem Fall hat die Einbeziehung durch Bezugnahme vor allem den Zweck, eine ausreichende Offenbarung zu ermöglichen und langwierige Wiederholungen zu vermeiden.

Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung oder Verringerung der Fettsäureaufnahme in eine T-Zelle, der Aktivierung und/oder der Proliferation einer T-Zelle, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(i) Hemmen oder Reduzieren der SLC27A2-Gen expression der T-Zelle,

(ii) Hemmen oder Reduzieren der Aktivität des Fettsäure-Transportproteins-2 (FATP2), und/oder

(iii) Fördern des Abbaus des FATP2-Proteins. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „T-Zellen“ auf Zellen umfassend T-Vorläufer- Zellen, T-Lymphozyten, cytotoxische (ggfs. CD8-positive) T-Zellen, (ggfs. CD4-positive) T- „Helfer“ -Zellen (Th-Zellen), Th 1 -Zellen, Th2-Zellen, Th3 -Zellen, Th9-Zellen, Thl7-Zellen, Th22-Zellen, Tfh-Zellen, Gedächtnis-T-Zellen, regulatorische T-Zellen (Treg), Suppressor- T-Zellen (Tsup), „Natural Killer“ T-Zellen (NKT-Zellen), naive T-Zellen, aktivierte T- Zellen, mucosa-assoziierte invariante T-Zellen, Alpha-Beta-T-Zellen, Gamma-Delta-T- Zellen, Thymocyten, doppelt-positive (CD4/CD8-positive) Thymocyten, primäre T-Zellen, reife immunkompetente T-Zellen, autoreaktive T-Zellen, periphere T-Zellen, synoviale T- Zellen, und T-Zell-Linien.

Die besagte Hemmung oder Reduzierung der 6ZC 742-Genexpression kann beispielsweise einen 6ZC 742-Gen-„Knock-down“, einen „Knock-out“, einen konditionalen „Gen-Knock- out“, eine Genveränderung oder Mutation im Sinne einer Insertion, Deletion und/oder Substitution, eine Genveränderung mittels eines Gen-Editierungs-Systems, eine RNA- Interferenz, siRNA und/oder Antisense-RNA umfassen.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Gene Editing System” oder „Gen- Editierungs-Systeme“ auf molekularbiologische Techniken zur zielgerichteten Veränderung von DNA, beispielsweise am SLC27A2-Gen. Zu den klassischen Gen-Editierungs-Systemen gehören beispielsweise Zink-Finger-Nucleasen (ZFNs), Transkriptions-Aktivator-ähnliche Effektor-Nucleasen (T ALENs), die CRISPR/Cas-Methode, das CRISPR/Cpfl -System und sog. Meganukleasen. Die spezifische Erkennung der DNA erfolgt bei der Zinkfingemuklease, der TALEN und der Meganuclease durch einen bestimmten Proteinteil, während sie bei den CRISPR-Systemen durch eine spezifische RNA vermittelt wird (Zhu and Zhu, 2022).

Zink-Finger-Nucleasen (ZFNs) sind künstlich hergestellte Restriktionsenzyme. Sie enthalten eine Zinkfingerdomäne, die an DNA bindet, und eine Nukleasedomäne, welche die DNA schneidet. Die Zinkfingerdomäne kann so konstruiert werden, dass sie eine bestimmte DNA- Sequenz erkennt.

TALENs sind Fusionsproteine aus einer Z4Z-£^ector-DNA-bindenden Domäne und einer Endonukleasedomäne. Durch die im Zuge eines Proteindesigns eingeführte DNA-bindende Domäne erfolgt die sequenzspezifische Bindung, danach wird von der Endonuklease ein sequenzspezifischer Schnitt ausgeführt. Die CRISPR/Cas-Methode ^Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeals"., gruppierte kurze palindromische Wiederholungen mit regelmäßigen Abständen und CRJSPR- associated, CRISPR-assoziiertes Protein) ist ein molekularbiologisches Verfahren, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern. Es können sowohl Gene mit dem CRISPR/Cas- System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden, als auch Nukleotide in einem Gen geändert werden. Das DNA-schneidende Q/.s-Enzym bindet eine bestimmte RNA-Sequenz. Auf diese RNA-Sequenz folgt eine weitere RNA-Sequenz, die per Basenpaarung an eine DNA mit komplementärer Sequenz binden kann. Die RNA dient hierbei als Brücke zwischen Cas und der zu schneidenden DNA. Durch die Komplexierung von Cas, der RNA und der DNA wird das DNA-schneidende /.s-Enzym in die räumliche Nähe der gebundenen DNA gebracht, woraufhin das Enzym die (indirekt gebundene) DNA schneidet. Im Falle einer Einfügung von DNA in die Schnittstelle wird eine weitere DNA hinzugegeben, die an ihren beiden Enden jeweils überlappende Sequenzen für eines der beiden Enden der Schnittstelle aufweist. Die einzufügende DNA wird durch die zelleigene DNA-Reparatur mit den Enden der Schnittstelle verbunden (Nidhi et al. 2021).

Die genannten Endonukleasen werden zum Einführen zielgerichteter Veränderungen im Genom von einzelnen Zellen oder komplexen Organismen eingesetzt. Die Enzyme schneiden doppel strängige DNA an einer vorbestimmten Ziel sequenz, wodurch Doppel Strangbrüche entstehen. Die Doppel Strangbrüche wiederum aktivieren DNA-Reparatur-Prozesse in der Zelle, wie das “Non-homologous end-joining" (NHEJ) oder die Homologe Reparatur, die auch als “homology directed repair" (HDR) bezeichnet wird. Während mittels NHEJ Gene gezielt inaktiviert werden, kann die HDR zum gezielten Einfügen definierter Mutationen oder ganzer DNA- Ab schnitte ins Genom herangezogen werden. Die Genom-Editierung kann zum gezielten Zerstören eines Gens (Gen-“Knockout”), zum Einführen eines Gens an einer spezifischen Stelle im Genom (Gen-“Knockin”), oder zur Einführung einer Punktmutation in einem Gen verwendet werden.

Die sog. „Basen-Editierung” (Base Editing) ist eine neue präzise Methode der Genom- Editierung, die darin besteht, einzelne Basen in der DNA-Sequenz zu verändern). Hierbei wird eine mutierte Form der Cas9-Nuklease, die die DNA nicht mehr schneiden kann, mit einer Deaminase in Form eines Fusionsproteins gekoppelt. Dieses Fusionsprotein ist in der Lage, mit einer sgRNA (“single-guide” RNA) eine gewünschte DNA-Sequenz spezifisch zu erkennen und durch Desaminierung eine Base zu verändern. Im Falle der Fusion mit Cytidin- Deaminase wird das Cytidin in Uracil umgewandelt, das durch DNA-Reparatur und Replikation mit Thymidin ersetzt wird. Dadurch wird das Basenpaar C-G zu T-A mutiert. Alternativ kann Cas9 mit einer Adenosin-Deaminase gekoppelt werden, so dass das Adenosin in Inosin umgewandelt wird, das nach DNA-Reparatur und Replikation mit Guanosin ersetzt wird. In diesem Fall wird das Basenpaar A-T in G-C umgewandelt (Zhu and Zhu, 2022).

Die RNA-Interferenz (RNAi, RNA-Silencing) ist ein natürlicher Mechanismus in eukaryont- ischen Zellen, welcher der zielgerichteten Abschaltung von Genen im Zellkern dient. Sie erlaubt ein sog. “Gene Silencing”. Die RNA-Interferenz beruht auf einer Wechselwirkung kurzer RNA-Stücke mit der mRNA unter Beteiligung mehrerer Enzymkomplexe. Als Folge der Aktivität dieser Enzymkomplexe wird die mRNA in mehrere Bruchstücke gespalten, die codierte Information damit zerstört und die Translation in ein Protein verhindert.

Bei der sog. “small interfering RNA” (siRNA) handelt es sich um kurze RNA-Fragmente, welche im Organismus zum selektiven Abbau der komplementären mRNA führen. Damit verhindern sie gezielt die Genexpression und die Bildung von Proteinen.

Antisense-RNA ist eine einzelsträngige RNA, die komplementär zu einer proteincodierenden mRNA ist. Fast alle Antisense-RNAs weisen Sekundärstrukturen wie “stem-loops” und teilweise auch komplexere Tertiär Strukturen, wie “Pseudoknoten” zwischen eben diesen Sekundärstrukutren auf. Diese Strukturelemente bestimmen die Abbaurate durch intrazelluläre Ribonukleasen sowie die Rate, mit welcher sich die Antisense-RNA mit der komplementären mRNA paart. Die Paarung unterbindet die Translation des Gens.

Die besagte Hemmung oder Reduzierung der FATP2 (Fettsäure-Transportprotein-2)-Protein- Aktivität kann die Verwendung eines Wirkstoffs umfassen, der an das FATP2-Protein bindet und/oder seine Aktivität hemmt oder reduziert.

Vorzugsweise ist die besagte T-Zelle eine synoviale T-Zelle, besonders bevorzugt eine synoviale Gedächtnis-T-Zelle. Bei dem FATP2-Protein kann es sich um ein Säugetier-, Nicht-Primaten-, Primaten- und insbesondere um ein humanes FATP2-Protein oder ein Fragment davon handeln.

Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein einer T-Zelle, oder ein Fragment davon, bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins einer T-Zelle, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert.

Das Verfahren umfasst mindestens die folgenden Schritte:

(i) Bereitstellen des FATP2-Proteins oder eines Fragments davon,

(ii) Zugabe von mindestens einem Wirkstoff, der auf Bindung an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon untersucht werden soll, und

(iii) Identifizierung des mindestens einen Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon gebunden hat.

Vorzugsweise ist der zu screenende und zu identifizierende Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung ein FATP2-Inhibitor oder FATP2- Antagonist, ein die Aktivität des FATP2-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmendes oder reduzierendes Agens.

Der Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus der Gruppe bestehend aus einer niedermolekularen Verbindung, einem Peptid, insbesondere einem natürlichen oder synthetischen Peptid oder Peptid-Derivat, und einem Biologikum oder biologischen Wirkstoff ausgewählt werden.

Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "niedermolekulare Verbindung", "kleines Molekül" ("smol") oder "chemisches Arzneimittel" auf eine organische Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (<10.000 Dalton, insbesondere < 1.000 Dalton), oft mit einer Größe in der Größenordnung von 1 nm. Viele Medikamente sind kleine Moleküle. Solche kleinen Moleküle können einen biologischen Prozess regulieren. Kleine Moleküle können in der Lage sein, eine spezifische Funktion eines Proteins zu hemmen. Im Bereich der Pharmakologie bezieht sich der Begriff "kleines Molekül" insbesondere auf Moleküle, die an spezifische biologische Makromoleküle binden und als Effektor wirken, indem sie die Aktivität oder Funktion eines Ziels verändern. Zum Beispiel gilt Acetylsalicylsäure (ASS) als niedermolekulare Verbindung, die 180 Dalton misst und aus 21 Atomen besteht. Solche niedermolekularen Verbindungen haben oft nur eine geringe Fähigkeit, eine Immunreaktion auszulösen und bleiben über die Zeit relativ stabil.

Die niedermolekulare Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann neben anderen chemischen Rückgraten, Substituenten, Gruppen oder Resten beispielsweise Alkyl-, Alkenyl, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryl-, Alkylen-, Arylen-, Amino-, Halogen-, Carboxylatderivat-, Cycloalkyl-, Carbonylderivat-, Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylen-, Sulfonat-, Sulfat-, Phosphonat-, Phosphat-, Phosphin-, Phosphinoxidgruppen umfassen.

Das "Biologikum", "biologische Arzneimittel", "biologische Therapeutikum", "Biopharmazeutikum" oder der "biologische Wirkstoff' gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Antikörper, oder ein antigen-bindendes Fragment davon, oder ein antigen-bindendes Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Molekül oder Protein, oder ein Aptamer, oder eine Nukleinsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, ist der Wirkstoff Mitglied einer „Bibliothek“ von Verbindungen.

Die "Bibliothek" (Mischung) von Verbindungen kann z. B. niedermolekulare Verbindungen, natürliche oder synthetische Peptide oder Peptid-Derivate, bzw. Biologika oder biologische Wirkstoffe oder biologische Verbindungen umfassen.

Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "(kombinatorische) Verbindungsbibliothek" oder "Bibliothek von Verbindungen" auf Sammlungen von jeweils chemischen Verbindungen, kleinen Molekülen, natürlichen oder synthetischen Peptiden oder Peptid-Derivaten, bzw. Makromolekülen wie Proteinen oder anderen Biologika, in denen jeweils eine große Anzahl verwandter chemischer, pepti discher bzw. biologischer Spezies von Molekülen enthalten sind, die zusammen in bestimmten Screening-Assays oder Identifizierungsschritten verwendet werden können.

Verfahren zur Herstellung von Molekülbibliotheken niedermolekularer chemischer Verbindungen („Compound Libraries“) und zur Hochdurchsatz-Prüfung („High-Throughput- Screening“) der Verbindungen auf Wechselwirkung mit dem Target-Molekül sind im Stand der Technik beschrieben (zum Beispiel, Volochnyuk et al. 2019). Diese Verfahren umfassen auch sog. „Fokus-Libraries“, hochgradig annotierte und vor-selektierte chemische Molekülbibliotheken (Wassermann et al. 2014), DNA-codierte Bibliotheken chemischer Verbindungen (Martin et al. 2020), und chemoinformatik-basierte virtuelle Molekülbibliotheken (Saldivar-Gonzalez et al. 2020). Die Verwendung sog. „Phage Display“-Technologien zur Identifizierung von geeigneten „Small-Molecule“ -Wirkstoff en wurde beispielsweise beschrieben von Takakusagi et al., 2020. Zahlreiche andere Peptid- und Anti-körper- „Display“-Technologien wie „Bacterial Display“, „Yeast Surface Display“ und „Mammalian Surface Display“ sowie „Ribosome Display“ sind beschrieben in Valldorf et al.,

Verfahren zur Herstellung von Molekülbibliotheken, deren Immobilisierung und deren Hochdurchsatz-Prüfung („High-Throughput-Screening“) von biologischen Molekülen, beispielsweise von Peptiden, Peptid-Derivaten, Proteinen, Antikörpern, antigen-bindenden Antikörper-Fragmenten, antigen-bindenden Antikörper-Derivaten, oder antikörper-ähnlichen Molekülen, sind im Stand der Technik ebenfalls beschrieben (für Peptid-Bibliotheken beispielsweise in Bozovicar und Bratkovic 2019; Schwaar et al. 2019; für Antikörper-Bibliotheken in Lin und Lerner 2021).

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins oder eines Fragments davon hemmt oder reduziert, ist das Biologikum ein Antikörper, ein antigen-bindendes Fragment davon, ein antigen-bindendes Derivat davon, ein antikörperähnliches Molekül oder Protein, ein Aptamer, oder eine Nukleinsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins oder eines Fragments davon hemmt oder reduziert, ist das FATP2-Protein an eine feste Phase gebunden oder liegt in Lösung vor.

Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die das FATP2-Protein oder ein Fragment davon kodiert, oder die Verwendung des FATP2-Proteins oder eines Fragments davon, in einem Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins oder eines Fragments davon hemmt oder reduziert.

Zur Expression des FATP2-Proteins oder eines Fragments davon wird eine Nukleinsäure, die das FATP2-Protein oder ein Fragment davon kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor, z.B. ein geeignetes Expressionsplasmid, kloniert wie beschrieben (Green und Sambrook 2012). Das rekombinante Expressionsprotein wird durch Transfektion in eine für die Expression des FATP2-Proteins oder eines Fragments davon geeignete Zelle eingeschleust, die Zelle in Zellkultur mit einem geeigneten Zellkulturmedium propagiert, und das exprimierte Protein aus den Zellen und/oder dem Zellkulturmedium gereinigt.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Transfektion“ auf jegliches Verfahren zum absichtlichen Einbringen einer fremden Nukleinsäure in eine eukaryontische Zelle. Für eine Transfektion in eukaryontische Zellen können verschiedene Arten von Nukleinsäuren verwendet werden, insbesondere Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA), sowie kleine, nicht codierende RNAs wie siRNA, shRNA, und miRNA.

Hinsichtlich der Transfektion werden stabile und transiente Transfektion unterschieden. Bei der stabilen Transfektion wird durch Integration der in die Zelle eingeführten Nukleinsäure in das zelluläre Genom eine Langzeit-Expression des Transgens erreicht, während die transiente Transfektion, bei der die Expression des Transgens nur vorübergehend erfolgt, keine Integration der Nukleinsäure in das zelluläre Genom erfordert (Fus-Kujawa et al. 2021).

Die Auswahl der optimalen Transfektionsmethode hängt von verschiedenen Faktoren ab, insbesondere dem Typ und Ursprung der Ziel- bzw. Produktionszelle sowie der Art der eingeführten Nukleinsäure. Für die Einführung von fremder (modifizierter homologer und/ oder heterologer) Nukleinsäure, die das/die gewünschte(n) Transgen(e) codiert, in eukaryontische Zellen können physikalische, chemische und virale vector-basierte Transfektions- methoden verwendet werden. Physikalische Transfektionsverfahren umfassen z.B. Elektro- poration, Sonoporation, Magnetofektion, Microinjektion und biolistische Verfahren. Zu den chemischen Transfektionsverfahren zählen die Calciumphosphat-Methode, die Verwendung von Dendrimeren, kationischen Polymeren wie Diethylaminoethyl-dextran (DEAE-dextran), Nanopartikeln, nicht-liposomalen Nanopartikeln, und liposomaler Transfektion. Bei der Transfektion mittels viraler Vektoren (sog. „Transduktion“) kommen insbesondere genetisch modifizierte Retro- und Lentiviren, Adenoviren, und adeno-assoziierte Viren (AAV) zum Einsatz (Fus-Kujawa et al. 2021).

Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, erhalten durch besagtes Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein einer T-Zelle oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins einer T-Zelle, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, bzw. erhalten durch eine der oben beschriebenen Ausführungsformen des besagten Verfahrens.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon in einer T-Zelle bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, und/oder den Abbau des FATP2-Proteins fördert.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, der die Expression des SLC27A2-Gens in einer T-Zelle hemmt oder reduziert, vorzugsweise wobei die T-Zelle eine synoviale T-Zelle ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, wobei der Wirkstoff eine niedermolekulare Verbindung (smol), ein Peptid oder Peptid- Derivat, oder ein Biologikum ist, vorzugsweise wobei das Biologikum ein Antikörper oder ein antigen-bindendes Fragment davon, oder ein antigen-bindendes Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, oder ein Aptamer oder eine Nukleinsäure ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Wirkstoff spezifisch mit einer hohen oder besonders hohen Affinität und/oder Avidität an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon. In einer bevorzugten Ausführungsform reduziert oder hemmt der Wirkstoff, wenn er an FATP2 gebunden ist, die FATP2- Aktivität.

Der Begriff "spezifisch binden", wie hier verwendet, bedeutet, dass der Wirkstoff eine Dissoziationskonstante KD bezüglich seiner Bindung an das FATP2-Proteinmolekül oder ein Epitop davon von höchstens etwa 100 pM aufweist. In einer Ausführungsform ist die KD etwa 100 pM oder niedriger, etwa 50 pM oder niedriger, etwa 30 pM oder niedriger, etwa 20 pM oder niedriger, etwa 10 pM oder niedriger, etwa 5 pM oder niedriger, etwa 1 pM oder niedriger, etwa 900 nM oder niedriger, etwa 800 nM oder niedriger, etwa 700 nM oder niedriger, etwa 600 nM oder niedriger, etwa 500 nM oder niedriger, etwa 400 nM oder niedriger, etwa 300 nM oder niedriger, etwa 200 nM oder niedriger, etwa 100 nM oder niedriger, etwa 90 nM oder niedriger, etwa 80 nM oder niedriger, etwa 70 nM oder niedriger, etwa 60 nM oder niedriger, etwa 50 nM oder niedriger, etwa 40 nM oder niedriger, etwa 30 nM oder niedriger, etwa 20 nM oder niedriger, oder etwa 10 nM oder niedriger, etwa 1 nM oder niedriger, etwa 900 pM oder niedriger, etwa 800 pM oder niedriger, etwa 700 pM oder niedriger, etwa 600 pM oder niedriger, etwa 500 pM oder niedriger, etwa 400 pM oder niedriger, etwa 300 pM oder niedriger, etwa 200 pM oder niedriger, etwa 100 pM oder niedriger, etwa 90 pM oder niedriger, etwa 80 pM oder niedriger, etwa 70 pM oder niedriger, etwa 60 pM oder niedriger, etwa 50 pM oder niedriger, etwa 40 pM oder niedriger, etwa 30 pM oder niedriger, etwa 20 pM oder niedriger oder etwa 10 pM oder niedriger oder etwa 1 pM oder niedriger.

Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper, oder ein antigen-bindendes Fragment oder antigen-bindendes Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, das spezifisch an das FATP2-Protein, vorzugsweise an das FATP2-Protein in einer T-Zelle, bindet.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung besagten Antikörper, oder antigen -bindendes Fragment oder antigen-bindendes Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, wobei der Antikörper, oder das antigen-bindende Fragment oder Derivat davon, oder das antikörperähnliche Protein die FATP2- Aktivität inhibiert, d.h. als Inhibitor oder Antagonist von FATP2 wirkt.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Antikörper" auf ein Protein, das aus einer oder mehreren Polypeptidketten besteht, die von Immunglobulin-Genen oder Fragmenten von Immunglobulin-Genen oder von diesen abgeleiteten cDNAs kodiert werden. Zu diesen Immunglobulin-Genen gehören die Gene der leichten Kette kappa, lambda und der schweren Kette alpha, delta, epsilon, gamma und mu der konstanten Region sowie jedes der vielen verschiedenen Gene der variablen Region.

Die grundlegende Struktureinheit des Immunglobulins (Antikörpers) ist normalerweise ein Tetramer, das aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten besteht, den leichten Ketten (L, mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa) und den schweren Ketten (H, mit einem Molekulargewicht von etwa 50-70 kDa). Jede schwere Kette besteht aus einer variablen Region der schweren Kette (abgekürzt als VH oder VH) und einer konstanten Region der schweren Kette (abgekürzt als CH oder CH). Die konstante Region der schweren Kette besteht aus drei Domänen, nämlich CHI, CH2 und CH3. Jede leichte Kette enthält eine variable Region der leichten Kette (abgekürzt als VL oder VL) und eine konstante Region der leichten Kette (abgekürzt als CL oder CL). Die VH- und VL-Regionen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, die auch als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR) bezeichnet werden, durchsetzt mit Regionen, die eher konserviert sind und als Framework-Regionen (FR) bezeichnet werden. Jede VH- und VL-Region besteht aus drei CDRs und vier FRs, die vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der Reihenfolge FR1, CDRI, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 angeordnet sind. Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten bilden eine Bindungsdomäne, die mit einem Antigen interagiert.

Die CDRs sind am wichtigsten für die Bindung des Antikörpers bzw. des antigenbindenden Teils davon. Die FRs können durch andere Sequenzen ersetzt werden, sofern die dreidimensionale Struktur, die für die Bindung des Antigens erforderlich ist, erhalten bleibt.

Der Begriff "antigenbindender Teil" des (monoklonalen) Antikörpers bezieht sich auf ein oder mehrere Fragmente eines Antikörpers, die die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an das Antigen in seiner nativen Form beibehalten. Beispiele für antigenbindende Teile des Antikörpers umfassen ein Fab-Fragment, ein monovalentes Fragment, das aus den VL-, VH-, CL- und CHI -Domänen besteht, ein F(ab')2-Fragment, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke an der Schamierregion verbunden sind, ein Fd-Fragment, bestehend aus der VH- und CHI -Domäne, ein Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers, und ein dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne und einer isolierten komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) besteht.

Der Antikörper, das Antikörperfragment oder das Antikörperderivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein monoklonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann vom Isotyp IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM sein. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "monoklonaler Antikörper (mAb)" auf eine Antikörperzusammensetzung mit einer homogenen Antikörperpopulation, d.h. einer homogenen Population, die aus einem ganzen Immunglobulin oder einem Fragment oder Derivat davon besteht. Besonders bevorzugt ist ein solcher Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IgG, IgD, IgE, IgA und/oder IgM, oder ein Fragment oder Derivat davon.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Fragment" auf Fragmente eines solchen Antikörpers, die ihre Zielbindungskapazitäten beibehalten, z.B. eine CDR (komplementaritätsbestimmende Region), eine hypervariable Region, eine variable Domäne (Fv), eine schwere IgG-Kette (bestehend aus VH-, CHI-, Scharnier-, CH2- und CH3 -Regionen), eine leichte IgG-Kette (bestehend aus VL- und CL-Regionen) und/oder eine Fab und/oder F(ab)2.

Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Derivat" auf Proteinkonstrukte, die sich strukturell von dem gängigen Antikörperkonzept unterscheiden, aber dennoch eine gewisse strukturelle Verwandtschaft zu diesem aufweisen, z. B. scFv, Fab und/oder F(ab)2, sowie auf bi-, tri- oder höher-spezifische Antikörperkonstrukte. Alle diese Elemente werden im Folgenden erläutert.

Weitere dem Fachmann bekannte Antikörperderivate sind Diabodies, Camelid-Antikörper, Domain-Antikörper, bivalente Homodimere mit zwei Ketten, die aus scFvs bestehen, IgAs (zwei IgG- Strukturen, die durch eine J-Kette und eine sekretorische Komponente verbunden sind), Hai-Antikörper, Antikörper, die aus Neuwelt-Primaten-Gerüst plus Nicht-Neuwelt- Primaten-CDR bestehen, dimerisierte Konstrukte, die CH3+VL+VH umfassen, andere Gerüstproteinformate, die CDRs umfassen, und Antikörperkonjugate.

Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "antikörperähnliches Protein" auf ein Protein, das (z. B. durch Mutagenese von Ig-Schleifen) so verändert wurde, dass es spezifisch an ein Zielmolekül bindet. Typischerweise umfasst ein solches antikörperähnliches Protein mindestens eine variable Peptidschleife, die an beiden Enden an ein Proteingerüst gebunden ist. Diese doppelte strukturelle Einschränkung erhöht die Bindungsaffinität des antikörperähnlichen Proteins auf ein Niveau, das mit dem eines Antikörpers vergleichbar ist. Die Länge der variablen Peptidschleife besteht typischerweise aus 10 bis 20 Aminosäuren. Das Gerüstprotein kann jedes Protein mit guten Löslichkeitseigenschaften sein. Vorzugsweise ist das Gerüstprotein ein kleines globuläres Protein. Antikörperähnliche Proteine umfassen ohne Einschränkung Affibodies, Anticaline und designte Ankyrin-Proteine und Affilin-Proteine. Antikörperähnliche Proteine können aus großen Bibliotheken von Mutanten abgeleitet werden, z. B. durch Panning aus großen Phage-Display -Bibliotheken, und können in Analogie zu regulären Antikörpern isoliert werden. Auch können antikörperähnliche Bindungsproteine durch kombinatorische Mutagenese von oberflächenexponierten Resten in globulären Proteinen erhalten werden. Antikörperähnliche Proteine wurden beschrieben beispielsweise in Binz et al. (2005) und Hosse et al. (2006).

Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Fab" auf ein IgG-Fragment, das die Antigenbindungsregion umfasst, wobei das Fragment aus einer konstanten und einer variablen Domäne jeweils der schweren und leichten Kette des Antikörpers zusammengesetzt ist.

Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "F(ab)2" auf ein IgG-Fragment, das aus zwei Fab-Fragmenten besteht, die durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind.

Der hier verwendete Begriff "scFv" bezieht sich auf ein variables Einzelkettenfragment, das eine Fusion der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen ist, die durch einen kurzen Linker miteinander verbunden sind, der üblicherweise Serin- (S) und/oder Glycin- (G) Reste umfasst. Dieses chimäre Molekül behält die Spezifität des ursprünglichen Immunglobulins bei, trotz der Entfernung der konstanten Regionen und der Einführung eines Linker-Peptids.

Modifizierte Antikörperformate sind z.B. bi- oder tri spezifische Antikörperkonstrukte, antikörperbasierte Fusionsproteine, Immunkonjugate und ähnliches.

IgG, scFv, Fab und/oder F(ab)2 sind Antikörperformate, die dem Fachmann gut bekannt sind. Detailierte Ausführungen und Techniken sind in entsprechenden Lehrbüchern zu finden.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das antigenbindende Fragment davon oder das antigenbindende Derivat davon ein muriner, ein chimärer, ein humanisierter oder ein humaner Antikörper bzw. ein antigenbindendes Fragment oder ein antigenbindendes Derivat davon. Monoklonale Antikörper (mAb), die von der Maus stammen, können unerwünschte immunologische Nebenwirkungen verursachen, da sie ein Protein einer anderen Spezies enthalten, das eine Immunantwort induzieren kann. Um dieses Problem zu überwinden, wurden Methoden zur Humanisierung und Reifung von Antikörpern entwickelt, um Antikörpermoleküle mit minimaler Immunogenität bei Anwendung am Menschen zu erzeugen, während die Spezifität und Affinität des nicht-humanen parentalen Antikörpers im Idealfall erhalten bleibt. Bei diesen Methoden werden z. B. die Gerüstregionen eines Maus- mAbs durch entsprechende humane Gerüstregionen ersetzt (sog. CDR-Grafting). W0200907861 offenbart die Erzeugung humanisierter Formen von Maus-Antikörpern durch Verknüpfung der CDR-Regionen nicht-humaner Antikörper mit humanen konstanten Regionen mittels rekombinanter DNA-Technologie. US6548640 beschreibt CDR- Transplantationstechniken, und US5859205 beschreibt die Herstellung humanisierter Antikörper.

Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "humanisierter Antikörper" auf einen Antikörper, ein Fragment oder ein Derivat davon, bei dem mindestens ein Teil der konstanten Regionen und/oder der Gerüstregionen und optional ein Teil der CDR-Regionen des Antikörpers von humanen Immunglobulinsequenzen abgeleitet oder an diese angepasst ist.

Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff wie oben beschrieben oder einen Antikörper, ein antigen-bindendes Fragment oder ein antigenbindendes Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, wie oben beschrieben, zur Verwendung bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung.

Dabei handelt es sich bei der Autoimmunerkrankung vorzugsweise um Rheuma, Rheumatoide Arthritis, juvenile idiopathische Arthritis, chronische entzündliche Darmerkrankungen einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, Multiple Sklerose, und anderen Autoimmunerkrankungen mit T-zellulärer Beteiligung.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Wirkstoff wie oben beschrieben, oder den Antikörper, das antigen-bindende Fragment oder antigen-bindende Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, wie oben beschrieben, und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, zur Verwendung bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung, vorzugsweise wobei besagte Autoimmunerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rheuma, Rheumatoider Arthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, chronischen entzündlichen Darmerkrankungen einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, Multiple Sklerose, und anderen Autoimmunerkrankungen mit T-zellulärer Beteiligung.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist/sind der/die besagte(n) pharmazeutisch verträgliche(n) Hilfsstoff(e) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pharmazeutisch verträglichen Puffern, Tensiden, Verdünnungsmitteln, Trägem, Hilfsstoffen, Füllstoffen, Bindemittel, Schmiermitteln, Gleitmitteln, Desinfektionsmitteln, Adsorptionsmitteln und/oder Konservierungsmitteln.

Die besagte pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form von Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln oder Perlen verabreicht werden. In wässriger Form kann die pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung bereit sein, während die Formulierung in lyophilisierter Form vor der Verabreichung in eine flüssige Form überführt werden muss, z. B. durch Zugabe von Wasser für Injektionszwecke, das ein Konservierungsmittel wie z. B., aber nicht beschränkt auf, Benzylalkohol, Antioxidantien wie Vitamin A, Vitamin E, Vitamin C, Retinylpalmitat und Selen, die Aminosäuren Cystein und Methionin, Zitronensäure und Natriumcitrat, synthetische Konservierungsmittel wie die Parabene Methylparaben und Propylparaben enthalten kann oder nicht.

Die pharmazeutische Formulierung kann ferner einen oder mehrere Stabilisatoren enthalten, die z. B. eine Aminosäure, ein Zuckerpolyol, ein Disaccharid und/oder ein Polysaccharid sein können. Die pharmazeutische Formulierung kann weiterhin ein oder mehrere Tenside, ein oder mehrere Isotonisierungsmittel und/oder einen oder mehrere Metallionenchelatoren und/oder ein oder mehrere Konservierungsmittel enthalten.

Die pharmazeutische Formulierung, wie hierin beschrieben, kann zumindest für eine orale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung geeignet sein. Alternativ kann der Wirkstoff oder Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Depotformulierung bereitgestellt werden, die die verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs über einen bestimmten Zeitraum ermöglicht. Weiterhin wird eine Primärverpackung, wie z. B. eine vorgefüllte Spritze oder ein vorgefüllter Pen, ein Fläschchen oder ein Infusionsbeutel, bereitgestellt, die die besagte pharmazeutische Formulierung gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfasst.

Die vorgefüllte Spritze oder der Pen kann die Formulierung entweder in gefriergetrockneter Form (die dann vor der Verabreichung z. B. mit Wasser für Injektionszwecke aufgelöst werden muss) oder in wässriger Form enthalten. Die Spritze oder der Pen ist häufig ein Einwegartikel zum einmaligen Gebrauch und kann ein Volumen zwischen 0,1 und 20 ml haben. Die Spritze oder der Pen kann jedoch auch eine Mehrwegspritze oder ein Mehrdosen- Pen sein.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein bindet, in einem Verfahren zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, vorzugsweise wobei besagte Autoimmunerkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rheuma, Rheumatoider Arthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, chronischen entzündlichen Darmerkrankungen einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, Multiple Sklerose, und anderen Autoimmunerkrankungen mit T-zellulärer Beteiligung. Vorzugsweise hemmt der Wirkstoff, wenn er an FATP2 gebunden ist, die FATP2-Aktivität.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein bindet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, wobei die Autoimmunerkrankung vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rheuma, Rheumatoider Arthritis, juveniler idiopathischer Arthritis, chronischen entzündlichen Darmerkrankungen einschließlich Colitis ulcerosa und Morbus Crohn, Multiple Sklerose, und anderen Autoimmunerkrankungen mit T-zellulärer Beteiligung. Vorzugsweise hemmt der Wirkstoff, wenn er an FATP2 gebunden ist, die F ATP2- Aktivität.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Autoimmunerkrankung, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein bindet und/oder dieses hemmt, in einer therapeutisch wirksamen Dosis oder Menge an ein menschliches oder tierisches Subjekt umfasst. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "wirksame Dosis" oder "wirksame Menge" eine Dosis oder eine Menge des Wirkstoffs, die bezüglich der Dosierungen und Verabreichungs- Zeiträume notwendig ist, um bei einem Patienten das erwünschte therapeutische Ergebnis zu erzielen. Wirksame Mengen können in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Krankheitszustand, dem Alter, dem Geschlecht und/oder dem Gewicht des Patienten, der pharmazeutischen Formulierung, der Unterart der zu behandelnden Krankheit und dergleichen variieren, können aber dennoch von einem Fachmann routinemäßig bestimmt werden.

Gemäß einem siebten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffs gemäß dem Verfahren zur Identifizierung des besagten Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, wie oben beschrieben, ferner umfassend die Aufreinigung des besagten Wirkstoffs.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend

(i) das Verfahren zur Identifizierung des besagten Wirkstoffs, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, wie oben beschrieben, und ferner

(ii) das Mischen des identifizierten Wirkstoffs mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Gemäß einem achten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine Kombination aus

(i) dem Wirkstoff, der an das FATP2-Protein oder ein Fragment davon in einer T-Zelle bindet, und/oder die Aktivität des FATP2-Proteins, oder eines Fragments davon, in einer T- Zelle, hemmt oder reduziert, wie oben beschrieben, oder dem Antikörper oder antigenbindenden Fragment oder antigen-bindenden Derivat davon oder dem antikörperähnlichen Protein wie oben beschrieben, oder der pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend den Wirkstoff wie oben beschrieben, oder den Antikörper, das antigen-bindende Fragment oder antigen-bindende Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, wie oben beschrieben, und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, und

(ii) einer oder mehreren weiteren therapeutisch aktiven Verbindungen. Gemäß einem neunten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein therapeutisches Kit, umfassend:

(i) die pharmazeutische Zusammensetzung wie oben beschrieben,

(ii) eine Vorrichtung zur Verabreichung der besagten Zusammensetzung, und

(iii) optional eine Gebrauchsanweisung.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird durch die im Folgenden gezeigten und diskutierten Beispiele und Zeichnungen genauer erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Beispiele und Zeichnungen nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken.

Die Erfindung ist nicht auf die offengelegten Ausführungsformen beschränkt. Andere Variationen der offengelegten Ausführungsformen können von Fachleuten bei der Ausführung der beanspruchten Erfindung aus einem Studium der Zeichnungen, der Offenbarung und der beigefügten Ansprüche verstanden und ausgeführt werden. In den Ansprüchen schließt das Wort "umfassend" andere Elemente oder Schritte nicht aus, und der unbestimmte Artikel "ein" oder "eine" schließt eine Mehrzahl nicht aus. Die bloße Tatsache, dass bestimmte Maßnahmen in voneinander verschiedenen abhängigen Ansprüchen rezitiert werden, bedeutet nicht, dass eine Kombination dieser Maßnahmen nicht vorteilhaft eingesetzt werden kann. Etwaige Bezugszeichen in den Ansprüchen sind nicht als Einschränkung des Anwendungsbereichs zu verstehen.

Alle hier offengelegten Aminosäuresequenzen sind vom N-Terminus zum C-Terminus dargestellt; alle hier offengelegten Nukleinsäuresequenzen sind 5'->3' dargestellt.

Beispiel 1: Erhöhte Fettsäureaufnahme von T-Zellen in der Synovialflüssigkeit von JIA- Patienten mittels des Transportproteins FATP2

Die Erfinder konnten zeigen, dass T-Zellen, die in der Synovialflüssigkeit von juvenilen idiopathischen Arthritis (JIA)-Patienten vorkommen, eine verstärkte Aufnahme von Fett-

ZI säuren aufweisen, die mit einer vermehrten Expression von FATP24S7T ’27/42 einhergeht. Der Fettsäurerezeptor FATP2 ist dabei vor allem in CD4+ Gedächtniszellen exprimiert (Fig. 1).

Beispiel 1A: Aufnahme von freien Fettsäuren in CD4-positiven T-Zellen aus dem Blut bzw. dem Synovium von JIA-Patienten

Die Aufnahme von freien Fettsäuren in CD4+ T-Zellen aus dem Blut oder dem Synovium von juvenilen idiopathischen Arthritis (JIA)-Patienten wurde bestimmt (Fig. 1 A). Die Messung erfolgte nach 15-minütiger Inkubation der Zellen mit Bodipye™FL C12 (2 pM) und nachfolgender durchflusszytometri scher Analyse. Die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist abzüglich der jeweiligen FMO Kontrolle dargestellt (AMFI). Die Daten zeigen die mittlere Expression in vier Patienten ± Standardfehler, **p < 0.01.

Die Daten zeigen, dass die Aufnahme von freien Fettsäuren durch CD4-positive T-Zellen in der Synovialflüssigkeit von JIA-Patienten im Vergleich zum peripheren Blut drastisch erhöht ist. Die Daten legen auch nahe, dass die Fettsäureoxidation eine wichtige Rolle bei Gedächtnis-T-Zellen spielt, damit sie ihre Funktionen ausüben können.

Dies bestätigt eine frühere Publikation der Arbeitsgruppe von Andreas Radbruch, in der gezeigt wird, dass T-Zellen in der Synovialflüssigkeit, um proliferieren zu können, von Fettsäuren abhängen (Hradilkova et al. 2019). Allerdings wurde von der Arbeitsgruppe von Andreas Radbruch vorgeschlagen, dass diese Abhängigkeit von dem Transkriptionsfaktor TWIST1 abhängig sei, der vorwiegend in PDl-positiven T-Zellen exprimiert wird. Allerdings konnte nicht festgestellt werden, dass TWIST 1 in normalen CD4-positiven Effektor-Zellen in der Synovialflüssigkeit hochreguliert ist, und die Expression in regulatorischen T-Zellen (Tregs) der Synovialflüssigkeit war nicht nachweisbar (RNAseq- Einzelzell-Daten, Bas Vastert, UMC Utrecht, persönliche Mitteilung). Außerdem ist die Expression von CD36, einem anderen Rezeptor für die Aufnahme von Lipiden, in regulatorischen T-Zellen (Tregs) der Synovialflüssigkeit sowie T-Zellen der Synovialflüssigkeit (Daten nicht gezeigt) im Vergleich zu peripherem Blut drastisch reduziert, was im Gegensatz steht zu publizierten Daten für murine CD8-positive ruhende T-Gedächtniszellen (Pan, Tian et al., 2017, Survival of tissue-resident memory T cells requires exogenous lipid uptake and metabolism, Nature Vol. 543, p. 252-256). Dies ist außerdem interessant, weil CD36 gewöhnlich in Treg-Zellen hochreguliert ist in hypoxischer Umgebung (wie beispiels- weise in Tumoren) mit erhöhter Glykolyse und Laktat-Konzentration (um die 5 mmol/liter, was ungefähr der Konzentration entspricht, die in der Synovialflüssigkeit von JIA-Patienten vorliegt), wo es für die Suppression von CD8-positiven T-Zellen kritisch ist.

Stattdessen fanden die Erfinder überraschenderweise eine spezifische Hochregulation des Fettsäure-Transporters 2 (FATP2, auch SLC27A2 genannt) in CD4-positiven T-Effektor- zellen in der Synovialflüssigkeit und noch mehr in CD4-positiven Treg-Zellen der Synovialflüssigkeit im Vergleich zum peripheren Blut von gesunden Kindern, gesunden Erwachsenen und Kindern mit JIA (Fig. 2), was für den Effekt, den die Erfinder bezüglich des Fettsäure-Transports beobachtet haben, verantwortlich sein dürfte.

Beispiel 1B: FATP2-Proteinexpression in CD4-positiven T-Zellen aus dem Blut bzw. dem Synovium von JIA-Patienten

Die FATP2-Proteinexpression in CD4+ T-Zellen aus dem Peripherblut (PB) bzw. dem Synovium (SF) von JIA-Patienten wurde mittels durchflusszytometrischer Analyse bestimmt (Fig. 1 B). Es ist ein repräsentatives Bild gezeigt. Außerdem wurde die Expression von 5ZC2742-RNA in CD4+ T-Zellen der Synovialis von JIA Patienten im Vergleich zum Blut derselben Patienten bestimmt (Fig. 1 C).

Weiterhin wurde die Proteinexpression von FATP2 in CD4+ T-Zellsubtypen (Effektor- Gedächtnis-T-Zellen (T _em ), gewebeständige Gedächtnis-T-Zellen (T _m ) und naive T-Zellen (Tnaive)) aus dem Blut bzw. Synovium von JIA-Patienten mittels durchflusszytometrischer Analyse bestimmt (Fig. 1 D). Die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist abzüglich der jeweiligen FMO Kontrolle dargestellt (AMFI). Die Daten zeigen die mittlere Expression in fünf Patienten ± Standardfehler, ***p < 0.001. ****p < 0.0001.

Beispiel IC: SLC2 Z42-mRNA-Expression in stimulierten und nicht-stimulierten CD4- positiven Gedächtnis-T-Zellen aus dem Blut gesunder Kontrollen

Die mRNA-Expression von 5ZC 742/FATP2 im Vergleich zu anderen Stoffwechselproteinen in CD4+ Gedächtnis-T-Zellen nach 48-stündiger und 72-stündiger Stimulation mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern sowie in nicht-stimulierten CD4+ Gedächtnis-T- Zellen wurde bestimmt (Fig. 1 E). Die CD4+ Gedächtnis-T-Zellen wurden mittels magnetischer Zell-Separation aus dem Blut gesunder Kontroll-Personen isoliert. Die Daten zeigen die mittlere Expression von vier Experimenten mit unterschiedlichen Spendern ± Standardfehler, **p < 0.01, ***p < 0.001.

Die Daten belegen, dass SLC27A21F ATP2 in stimulierten Gedächtnis-T-Zellen im Vergleich zu anderen Stoffwechselproteinen sehr stark hochreguliert wird. Die mRNA-Expression von SLC27A2/F ATP2 war drastisch höher in MACS-isolierten, humanen naiven CD4+ und CD45R0 CD4+ Gedächtnis-T-Zellen aus dem peripheren Blut gesunder Spender nach Stimulation als ohne Stimulation. Die Daten lassen auf eine spezifische Rolle dieses Transport-Proteins an der Aktivierung der Gedächtnis-T-Zellen schließen.

Beispiel 2: Blockade der Fettsäureaufnahme in Gedächtnis-T-Zellen vermindert IFNy- Produktion und Proliferation der Zellen

Einige niedermolekulare Antagonisten von FATP2 wurden bereits beschrieben, welche die Fettsäureaufnahme in Zellen hemmen, beispielsweise Lipofermata (Adeshakin et al. 2021) und Grassofermata (Saini et al. 2015). Die Erfinder konnten zeigen, dass der FATP2- Inhibitor Lipofermata die Fettsäureaufnahme in CD4+ T-Zellen inhibiert sowie die fFN-y- Expression und Proliferation der T-Zellen hemmt, ohne Apoptose zu induzieren (Fig. 2). Mit Hilfe von Lipofermata konnte also die Funktion von FATP2 in T-Zellen eindeutig bestätigt werden.

Mittels Lipofermata (5-Bromo-5'-phenyl-spiro[3H-indole-3,2'(3'H)-[l,3,4]thiadiaz ol]-2(lH)- one) kann die Fettsäureaufnahme in den Gedächtnis-T-Zellen effektiv blockiert und die Proliferation und die Produktion von Entzündungsmediatoren gehemmt werden. Damit ist dieser Aufnahmeweg von zentraler Bedeutung für den Metabolismus von T-Zellen, welche in der Pathogenese des kindlichen Rheuma, aber auch anderer Autoimmunerkrankungen eine wesentliche Rolle spielen. Eine gezielte Blockade dieses Signalweges eröffnet die Ausnutzung eines komplett neuen Wirkmechanismus' in der Therapie von Autoimmunerkrankungen.

Die Aufnahme von freien Fettsäuren in CD4+ T-Zellen nach Zugabe von Lipofermata in steigenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 7,5 und 10 pM wurde untersucht (Fig. 2 A). Dazu wurden die Zellen für 48 Stunden mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpem stimuliert. Die Messung erfolgte nach 15-minütiger Inkubation der Zellen mit Bodipye™FL C12 (2 pM) und nachfolgender durchflusszytometri scher Analyse. Die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) ist abzüglich der jeweiligen FMO Kontrolle dargestellt (AMFI). Die Daten zeigen die mittlere Expression gemessen in drei Experimenten ± Standardfehler.

Fig. 2 B zeigt ein exemplarisches Histogramm der Fettsäureaufnahme in CD4+ T-Zellen ohne Zugabe von Lipofermata (rechts) und nach Lipofermata Zugabe (links).

Außerdem wurde die prozentuale Anzahl IFN-y-positiver CD4+ T-Zellen nach Zugabe von Lipofermata in steigenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 7,5 und 10 pM untersucht (Fig. 2 C). Dazu wurden die Zellen für 48 Stunden mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpem stimuliert. Die Bestimmung IFN-y-positiver Zellen erfolgte nach 5-stündiger Restimulation mit PMA und lonomycin in Anwesenheit von GolgiPlug™ mittels Durchflusszytometrie. Die Daten zeigen die mittlere Expression gemessen in 5-6 Experimenten ± Standardfehler, *p < 0.01.

Fig. 2 D zeigt ein exemplarisches Punktdiagramm der IFN-y-Expression ohne Zugabe von Lipofermata (links) und nach Lipofermata Zugabe (rechts).

Weiterhin wurde der prozentuale Anteil proliferierter CD4+ T-Zellen nach Zugabe von Lipofermata in steigenden Konzentrationen von 0, 2, 5, 7,5 und 10 pM bestimmt (Fig. 2 E). Dazu wurden die Zellen mit “Cell proliferation dye eFlour™” gefärbt und für 48 Stunden mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpem stimuliert. Die Bestimmung proliferierter Zellen erfolgte mittels Durchflusszytometrie. Die Daten zeigen die mittlere Expression gemessen in fünf Experimenten ± Standardfehler, *p < 0.01.

Fig. 2 F zeigt ein exemplarisches Punktdiagramm der Zellproliferation ohne Zugabe von Lipofermata (links) und nach Lipofermata Zugabe (rechts).

Fig. 2 G zeigt ein exemplarisches Punktdiagramm der toten Zellen mit Lipofermata- Behandlung (rechts) und ohne (links). Die Zellen wurden dazu für 72 Stunden mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern stimuliert und zur durchflusszytometri sehen Lebend/Tot- Unterscheidung mit Propidiumiodid (PI) angefärbt. Zusammenfassend zeigen die vorliegenden Daten eine drastisch erhöhte Aufnahme von freien Fettsäuren in T-Zellen in der Synovialflüssigkeit von JIA-Patienten, die zur spezifischen Hochregulation von SLC 27A2 -codiertem FATP2 in Beziehung gesetzt werden konnte, und die eine Änderung im Metabolismus und somit der Funktion dieser Zellen anzeigt. Dabei ist zu berücksichtigen, dass praktisch alle Effektor-T-Zellen im Synovium den Gedächtnis-Phänotyp repräsentieren. Die gesteigerte Expression von SLC 27A2 -codiertem FATP2 konnte durch einen spezifischen Inhibitor (Lipofermata, Veglia et al. 2019) blockiert werden. Um den Effekt dieses Inhibitors auf T-Zellen zu testen, wurden CD4+ T-Zellen aus dem Blut gesunder Spender isoliert und in Gegenwart oder Abwesenheit von Lipofermata mit Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpern stimuliert. Dabei zeigte sich, dass Lipofermata die T-Zell-Proliferation praktisch komplett blockierte, und die IFN-y-Produktion konzentrationsabhängig reduzierte, ohne Apoptose zu induzieren.

Beispiel 3: Screening auf Wirkstoffe., die an das Transportprotein FATP2 binden und/oder sie hemmen

Screening-Experimente ermöglichen die Identifizierung und Validierung von niedermolekularen therapeutischen Verbindungen, Peptiden und/oder Biologika, die an das FATP2- Protein binden und/oder dessen Aktivität hemmen.

Es werden DNA-verschlüsselte Substanzbibliotheken generiert und gescreent, wie beschrieben (Kunig et al. 2018). Weiterhin werden Phage Display-Technologien (Takakusagi et al. 2020), Zelloberflächen-Display oder Ribosom-Display-Technologien (Valldorf et al. 2022) und/oder kombinatorische Peptid-Bibliotheken (Bozovicar und Bratkovic 2019) verwendet. Dazu werden rekombinantes FATP2-Protein oder Fragmente davon, die einen Tag zur Markierung, Identifizierung oder Reinigung tragen können, z.B. einen His-Tag oder einen FLAG-tag, in bakteriellen Expressionssystemen wie E. coli, oder in Insektenzellen oder Säugetierzellen exprimiert.

Das gereinigte FATP2-Protein wird mit Substanzen aus der Substanzbibliothek inkubiert und durch Immunpräzipitation isoliert. Die an das FATP2-Protein gebundenen Verbindungen werden z.B. durch Sanger- Sequenzierung der DNA-Barcodes identifiziert. Die identifizierten Agentien und Verbindungen werden anschliessend in entsprechenden Bioassays auf ihre Wirkung auf die Funktion von FATP2, dessen Fettsäure-Transportaktivität, sowie die IFN-y- Produktion und die Proliferation von Gedächtnis-T-Zellen getestet. Zu diesem Zweck werden auch experimentelle Maus-zzz-vzvo-Modelle eingesetzt.

Für die Identifizierung und Validierung von niedermolekularen therapeutischen Verbindungen, Peptiden und/oder Biologika, die eine Wirkung auf die FATP2- Aktivität oder seine Expression ausüben, wird ein zzz-vz7ro-Fluorochrom-Reportersystem auf Basis humaner Zellen etabliert, wobei beispielsweise die Expression des eGFP-FATP2-Fusionsproteins oder ein Luciferase-basiertes Reportersystem verwendet wird, um Substanzbibliotheken in Assays mit 384 bis 1.536 Vertiefungen auf die Identifizierung von Verbindungen zu screenen, die die eGFP -Fluoreszenz oder den Luciferase-Spiegel als Readout reduzieren. Die Expression dieser humanen FATP2-Fusionsreporterkonstrukte in den genannten Zellen kann z. B. durch Transfektion und Selektion über Resistenzgenkassetten oder durch virale Transduktion erfolgen. Für diese Assays werden humane Zelllinien wie z.B. 293 T-Zellen eingesetzt. Parallel zu diesem Screening werden Zytotoxizitätsassays durchgeführt, um Verbindungen auszuschliesen, die einen Effekt auf die Reporterfluoreszenz oder -aktivitat aufgrund von unspezifischer Toxizität oder Auslösung von Apoptose ausüben.

Literatur:

Adeshakin A.O. et al. (2021). Lipidomics data showing the effect of lipofermata on myeloid- derived suppressor cells in the spleens of tumor-bearing mice. Data in Brief. https://doi.Org/10.1016/j.dib.2021.106882.

Binz H.K., Amstutz P., und Plückthun A. (2005). Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nature Biotechnology Vol. 23 Nr. 10, p. 1257-1268.

Bozovicar K. und Bratkovic T. (2019). Evolving a peptide: Library platforms and diversification strategies. Int. J. Mol. Sei. Vol. 21 No. 215; doi: 10.3390/ijms21010215.

Chen Y. et al. (2020). Involvement of FATP2-mediated tubular lipid metabolic reprogramming in renal fibrogenesis. Cell Death and Disease Vol. 11, No. 994 https://doi.org/10.1038/s41419-020-03199-x. Endo Y. et al. (2019). ACC1 determines memory potential of individual CD4+ T cells by regulating de novo fatty acid biosynthesis. Nature Metabolism Vol. 1, p. 261-275.

Falcon A. et al. (2010). FATP2 is a hepatic fatty acid transporter and peroxisomal very long- chain acyl-CoA synthetase. Am J Physiol Endocrinol Metab Vol. 299, p. E384-E393.

Feng K. et al. (2022). Upregulated 5ZC2742/FATP2 in differentiated thyroid carcinoma promotes tumor proliferation and migration. J Clin Lab Anal. Vol. 36, p. e24148. https://doi.org/10.1002/jcla.24148.

Fus-Kujawa A. et al. (2021). An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Front. Bioeng. Biotechnol. Vol. 9:701031.

Green M.R. and Sambrook J. (2012). Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Fourth Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Hradilkova K. et al. (2019). Regulation of fatty acid oxidation by Twist 1 in the metabolic adaptation of T helper lymphocytes to chronic inflammation. Arthritis & Rheumatology Vol. 71 No. 10, p. 1756-1765.

Hosse R.J., Rothe A., und Power B.E. (2006). A new generation of protein display scaffolds for molecular recognition. Protein Science Vol. 15, p. 14-27.

Khan S. et al. (2020). Fatty acid transport protein-2 regulates glycemic control and diabetic kidney disease progression. JCI Insight Vol. 5 No. 15, p. el36845. https://doi.org/10.1172/ j ci. insight.136845.

Kunig V. et al. (2018). DNA-encoded libraries - an efficient small molecule discovery technology for the biomedical sciences. Biol. Chem. Vol. 399 No. 7, p. 691-710.

Lin C.-W. und Lerner R.A. (2021). Antibody libraries as tools to discover functional antibodies and receptor pleiotropism. Int. J. Mol. Sei. Vol. 22 No. 4123. https://doi.org/ 10.3390/ijms22084123. Martin A. et al. (2020). Navigating the DNA encoded libraries chemical space.

Communications Chemistry Vol. 3 No. 127. https://doi.org/10.1038/s42004-020-00374-l.

Melton E.M. et al. (2013). Overexpression of human fatty acid transport protein 2/very long chain acyl-CoA synthetase 1 (FATP2/Acsvll) reveals distinct patterns of trafficking of exogenous fatty acids. Biochem Biophys Res Commun. Vol. 440 No. 4, p. 743-748.

Nidhi S. et al. (2021). Novel CRISPR-Cas Systems: an updated review of the current achievements, applications, and future research perspectives. Int. J. Mol. Set. Vol. 22, p. 3327. https://doi.org/10.3390/ijms22073327.

Ohl K. et al. (2018). The transcription factor CREM drives an inflammatory phenotype of T cells in oligoarticular juvenile idiopathic arthritis. Pediatric Rheumatology Vol. 16 No. 39. https://doi.org/10.1186/sl2969-018-0253-x.

Pearce E.L. et al. (2009). Enhancing CD8 T cell memory by modulating fatty acid metabolism. Nature Vol. 460 No. 7251, p. 103-107.

Perez V.M. et al. (2020). Deletion of fatty acid transport protein 2 (FATP2) in the mouse liver changes the metabolic landscape by increasing the expression of PPARa-regulated genes. J. Biol. Chem. Vol. 295 No. 17, p. 5737-5750.

Saini N. et al. (2015). Fatty acid transport protein-2 inhibitor Grassofermata/CB5 protects cells against lipid accumulation and toxicity. Biochem Biophys Res Commun. Vol. 465 No. 3, p. 534-541.

Saldivar-Gonzalez F.I. et al. (2020). Chemoinformatics-based enumeration of chemical libraries: a tutorial. Journal of Cheminformatics Vol. 12 No. 64. https://doi.org/10.1186/sl3321-020-00466-z. Schwaar T. et al. (2019). Effcient screening of combinatorial peptide libraries by spatially ordered beads immobilized on conventional glass slides. High-Throughput Vol. 8 No. 11. doi: 10.3390/ht8020011.

Takakusagi T. el al. (2020). Phage display technology for target determination of smallmolecule therapeutics: an update. Expert Opinion on Drug Discovery Vol. 15 No. 10, p. 1199-1211.

Valldorf B. et al., Antibody display technologies: selecting the cream of the crop. Biol. Chem. Vol. 403 No. 5-6, p. 455-477.

Veglia F. et al. (2019). Fatty acid transporter 2 reprograms neutrophils in cancer. Nature Vol. 569 No. 7754, p. 73-78.

Volochnyuk D.M. et al. (2019). Evolution of commercially available compounds for HTS. Drug Discovery Today Vol. 24 No. 2, p. 390-402.

Wassermann A.M. et al. (2014). Composition and applications of focus libraries to phenotypic assays. Frontiers in Pharmacology Vol. 5 No. 164. doi: 10.3389/fphar.2014.00164.

Zhu G. und Zhu H. (2022). Modified gene editing systems: diverse bioengineering tools and crop improvement. Front. Plant Sei. Vol. 13, p. 847169. doi: 10.3389/fpls.2022.847169.

Sequenzen:

Humanes FATP2, Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen

(SLC27A2, Solute Carrier Family 27 Member 2, Homo sapiens, human;

NCBI Entrez Gene Nr. 11001)

SEQ ID Nr. 1, Nukleotid-Sequenz-Eintrag enthaltend die humane FATP2-Sequenz: aatacgacta cacctgctcc ggagcccgcg gcggtacctg cagcggagga getetgtett 60 ccccttcatc tcacgcgagc ccggcgtccc gccgcgtgcg ccccggcgca gcccgccagt 120 ccgcccggag cccgcccagt cgccgcgctg cacgcccggg gtgaaccctc tgccctcgct 180 gggacagagg gccccgcagc egteatgett tccgccatct acacagtcct ggcgggactg 240 ctgttcctgc cgctcctggt gaacctctgc tgcccatact tcttccagga cataggctac 300 ttcttgaagg tggccgccgt gggccggagg gtgcgcagct acgggcagcg gcggccggcg 360 cgcaccatcc tgcgggcgtt cctggagaaa gcgcgccaga cgccacacaa gccttttctg 420 ctcttccgcg acgagactct cacctacgcg caggtggacc ggcgcagcaa tcaagtggcc 480 cgggcgctgc acgaccacct cggcctgcgc cagggagact gcgtggcgct ccttatgggt 540 aacgagccgg cctacgtgtg gctgtggctg gggctggtga agctgggctg tgccatggcg 600 tgcctcaatt acaacatccg cgcgaagtcc ctgctgcact gcttccagtg ctgcggggcg 660 aaggtgctgc tggtgtcgcc agaactacaa gcagctgtcg aagagatact gccaagcctt 720 aaaaaagatg atgtgtccat ctattatgtg agcagaactt ctaacacaga tgggattgac 780 tctttcctgg acaaagtgga tgaagtatca actgaaccta tcccagagtc atggaggtct 840 gaagtcactt tttccactcc tgccttatac atttatactt ctggaaccac aggtcttcca 900 aaagcagcca tgatcactca tcagcgcata tggtatggaa ctggcctcac ttttgtaagc 960 ggattgaagg cagatgatgt catctatatc actctgccct tttaccacag tgctgcacta 1020 ctgattggca ttcacggatg tattgtggct ggtgctactc ttgccttgcg gactaaattt 1080 tcagccagcc agttttggga tgactgcaga aaatacaacg tcactgtcat tcagtatatc 1140 ggtgaactgc ttcggtattt atgcaactca ccacagaaac caaatgaccg tgatcataaa 1200 gtgagactgg cactgggaaa tggcttacga ggagatgtgt ggagacaatt tgtcaagaga 1260 tttggggaca tatgcatcta tgagttctat gctgccactg aaggcaatat tggatttatg 1320 aattatgcga gaaaagttgg tgctgttgga agagtaaact acctacagaa aaaaatcata 1380 acttatgacc tgattaaata tgatgtggag aaagatgaac ctgtccgtga tgaaaatgga 1440 tattgcgtca gagttcccaa aggtgaagtt ggacttctgg tttgcaaaat cacacaactt 1500 acaccattta atggctatgc tggagcaaag gctcagacag agaagaaaaa actgagagat 1560 gtctttaaga aaggagacct ctatttcaac agtggagatc tcttaatggt tgaccatgaa 1620 aatttcatct atttccacga cagagttgga gatacattcc ggtggaaagg ggaaaatgtg 1680 gccaccactg aagttgctga tacagttgga ctggttgatt ttgtccaaga agtaaatgtt 1740 tatggagtgc atgtgccaga tcatgagggt cgcattggca tggcctccat caaaatgaaa 1800 gaaaaccatg aatttgatgg aaagaaactc tttcagcaca ttgctgatta cctacctagt 1860 tatgcaaggc cccggtttct aagaatacag gacaccattg agatcactgg aacttttaaa 1920 caccgcaaaa tgaccctggt ggaggagggc tttaaccctg ctgtcatcaa agatgccttg 1980 tatttcttgg atgacacagc aaaaatgtat gtgcctatga ctgaggacat ctataatgcc 2040 ataagtgcta aaaccctgaa actctgaata ttcccaggag gataactcaa catttccaga 2100 aagaaactga atggacagcc acttgatata atccaacttt aatttgattg aagattgtga 2160 ggaaattttg taggaaattt gcatacccgt aaagggagac ttttttaaat aacagttgag 2220 tctttgcaag taaaaagatt tagagattat tatttttcag tgtgcaccta ctgtttgtat 2280 ttgcaaactg agcttgttgg agggaaggca ttatttttta aaatacttag taaattaaat 2340 gaac 2344

SEQ ID Nr. 2, codierende Nukleotid-Sequenz des humanen FATP2 (Nukl. 205 - 2067 von SEQ ID Nr. 1): atgctttccg ccatctacac agtcctggcg ggactgctgt tcctgccgct cctggtgaac 60 ctctgctgcc catacttctt ccaggacata ggctacttct tgaaggtggc cgccgtgggc 120 cggagggtgc gcagctacgg gcagcggcgg ccggcgcgca ccatcctgcg ggcgttcctg 180 gagaaagcgc gccagacgcc acacaagcct tttctgctct tccgcgacga gactctcacc 240 tacgcgcagg tggaccggcg cagcaatcaa gtggcccggg cgctgcacga ccacctcggc 300 ctgcgccagg gagactgcgt ggcgctcctt atgggtaacg agccggccta cgtgtggctg 360 tggctggggc tggtgaagct gggctgtgcc atggcgtgcc tcaattacaa catccgcgcg 420 aagtccctgc tgcactgctt ccagtgctgc ggggcgaagg tgctgctggt gtcgccagaa 480 ctacaagcag ctgtcgaaga gatactgcca agccttaaaa aagatgatgt gtccatctat 540 tatgtgagca gaacttctaa cacagatggg attgactctt tcctggacaa agtggatgaa 600 gtatcaactg aacctatccc agagtcatgg aggtctgaag tcactttttc cactcctgcc 660 ttatacattt atacttctgg aaccacaggt cttccaaaag cagccatgat cactcatcag 720 cgcatatggt atggaactgg cctcactttt gtaagcggat tgaaggcaga tgatgtcatc 780 tatatcactc tgccctttta ccacagtgct gcactactga ttggcattca cggatgtatt 840 gtggctggtg ctactcttgc cttgcggact aaattttcag ccagccagtt ttgggatgac 900 tgcagaaaat acaacgtcac tgtcattcag tatatcggtg aactgcttcg gtatttatgc 960 aactcaccac agaaaccaaa tgaccgtgat cataaagtga gactggcact gggaaatggc 1020 ttacgaggag atgtgtggag acaatttgtc aagagatttg gggacatatg catctatgag 1080 ttctatgctg ccactgaagg caatattgga tttatgaatt atgcgagaaa agttggtgct 1140 gttggaagag taaactacct acagaaaaaa atcataactt atgacctgat taaatatgat 1200 gtggagaaag atgaacctgt ccgtgatgaa aatggatatt gcgtcagagt tcccaaaggt 1260 gaagttggac ttctggtttg caaaatcaca caacttacac catttaatgg ctatgctgga 1320 gcaaaggctc agacagagaa gaaaaaactg agagatgtct ttaagaaagg agacctctat 1380 ttcaacagtg gagatctctt aatggttgac catgaaaatt tcatctattt ccacgacaga 1440 gttggagata cattccggtg gaaaggggaa aatgtggcca ccactgaagt tgctgataca 1500 gttggactgg ttgattttgt ccaagaagta aatgtttatg gagtgcatgt gccagatcat 1560 gagggtcgca ttggcatggc ctccatcaaa atgaaagaaa accatgaatt tgatggaaag 1620 aaactctttc agcacattgc tgattaccta cctagttatg caaggccccg gtttctaaga 1680 atacaggaca ccattgagat cactggaact tttaaacacc gcaaaatgac cctggtggag 1740 gagggcttta accctgctgt catcaaagat gccttgtatt tcttggatga cacagcaaaa 1800 atgtatgtgc ctatgactga ggacatctat aatgccataa gtgctaaaac cctgaaactc 1860 tga 1863

SEQ ID Nr. 3, Aminosäure-Sequenz von humanem FATP2:

Met Leu Ser Ala Ile Tyr Thr Val Leu Ala Gly Leu Leu Phe Leu Pro

Leu Leu Val Asn Leu Cys Cys Pro Tyr Phe Phe Gin Asp Ile Gly Tyr

Phe Leu Lys Val Ala Ala Val Gly Arg Arg Val Arg Ser Tyr Gly Gin 35 40 45

Arg Arg Pro Ala Arg Thr Ile Leu Arg Ala Phe Leu Glu Lys Ala Arg 50 55 60

Gin Thr Pro His Lys Pro Phe Leu Leu Phe Arg Asp Glu Thr Leu Thr 65 70 75 80

Tyr Ala Gin Val Asp Arg Arg Ser Asn Gin Val Ala Arg Ala Leu His

85 90 95

Asp His Leu Gly Leu Arg Gin Gly Asp Cys Val Ala Leu Leu Met Gly

100 105 110

Asn Glu Pro Ala Tyr Val Trp Leu Trp Leu Gly Leu Val Lys Leu Gly 115 120 125

Cys Ala Met Ala Cys Leu Asn Tyr Asn Ile Arg Ala Lys Ser Leu Leu

130 135 140

His Cys Phe Gin Cys Cys Gly Ala Lys Val Leu Leu Val Ser Pro Glu 145 150 155 160

Leu Gin Ala Ala Val Glu Glu Ile Leu Pro Ser Leu Lys Lys Asp Asp

165 170 175

Val Ser Ile Tyr Tyr Val Ser Arg Thr Ser Asn Thr Asp Gly Ile Asp 180 185 190

Ser Phe Leu Asp Lys Val Asp Glu Val Ser Thr Glu Pro Ile Pro Glu

195 200 205

Ser Trp Arg Ser Glu Val Thr Phe Ser Thr Pro Ala Leu Tyr Ile Tyr 210 215 220

Thr Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Ala Ala Met Ile Thr His Gin 225 230 235 240

Arg Ile Trp Tyr Gly Thr Gly Leu Thr Phe Val Ser Gly Leu Lys Ala

245 250 255

Asp Asp Val Ile Tyr Ile Thr Leu Pro Phe Tyr His Ser Ala Ala Leu 260 265 270

Leu Ile Gly Ile His Gly Cys Ile Val Ala Gly Ala Thr Leu Ala Leu

275 280 285

Arg Thr Lys Phe Ser Ala Ser Gin Phe Trp Asp Asp Cys Arg Lys Tyr 290 295 300

Asn Val Thr Val Ile Gin Tyr Ile Gly Glu Leu Leu Arg Tyr Leu Cys 305 310 315 320

Asn Ser Pro Gin Lys Pro Asn Asp Arg Asp His Lys Val Arg Leu Ala

325 330 335 Leu Gly Asn Gly Leu Arg Gly Asp Val Trp Arg Gin Phe Val Lys Arg

340 345 350

Phe Gly Asp Ile Cys Ile Tyr Glu Phe Tyr Ala Ala Thr Glu Gly Asn

355 360 365

Ile Gly Phe Met Asn Tyr Ala Arg Lys Val Gly Ala Val Gly Arg Val

370 375 380

Asn Tyr Leu Gin Lys Lys Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Ile Lys Tyr Asp 385 390 395 400 Val Glu Lys Asp Glu Pro Val Arg Asp Glu Asn Gly Tyr Cys Val Arg

405 410 415

Val Pro Lys Gly Glu Val Gly Leu Leu Val Cys Lys Ile Thr Gin Leu

420 425 430

Thr Pro Phe Asn Gly Tyr Ala Gly Ala Lys Ala Gin Thr Glu Lys Lys

435 440 445

Lys Leu Arg Asp Val Phe Lys Lys Gly Asp Leu Tyr Phe Asn Ser Gly

450 455 460

Asp Leu Leu Met Val Asp His Glu Asn Phe Ile Tyr Phe His Asp Arg 465 470 475 480 Val Gly Asp Thr Phe Arg Trp Lys Gly Glu Asn Val Ala Thr Thr Glu

485 490 495

Val Ala Asp Thr Val Gly Leu Val Asp Phe Val Gin Glu Val Asn Val

500 505 510

Tyr Gly Val His Val Pro Asp His Glu Gly Arg Ile Gly Met Ala Ser

515 520 525

Ile Lys Met Lys Glu Asn His Glu Phe Asp Gly Lys Lys Leu Phe Gin

530 535 540

His Ile Ala Asp Tyr Leu Pro Ser Tyr Ala Arg Pro Arg Phe Leu Arg 545 550 555 560 Ile Gin Asp Thr Ile Glu Ile Thr Gly Thr Phe Lys His Arg Lys Met

565 570 575

Thr Leu Val Glu Glu Gly Phe Asn Pro Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu

580 585 590

Tyr Phe Leu Asp Asp Thr Ala Lys Met Tyr Val Pro Met Thr Glu Asp

595 600 605

Ile Tyr Asn Ala Ile Ser Ala Lys Thr Leu Lys Leu

610 615 620