COMPOSICION FERTILIZANTE QUE INCLUYE TIRAMINA COMO POTEN CIADOR DE NITRÓGENO ASIMILABLE POR LAS PLANTAS Y USO DE LA

MISMA

La presente Invención se refiere a una composición fertilizante que incluye un potenciador de nitrógeno asimilable por las plantas, así como al uso de dicha composición fertilizante

Más concretamente, en un primer aspecto, la invención proporciona una composición fertilizante que incluye tiramina como potenciador de nitrógeno asimilable por las plantas, donde la tiramina mejora los niveles de nitrógeno total en la planta y de nitrógeno nítrico en la savia, constituyendo su aplicación una alternativa a los fertilizantes nitrogenados convencionales

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una combinación de la composición fertilizante descrita junio con otro fertilizante adicional y/o bioestimulante.

El nitrógeno es el nutriente mineral requerido en mayores cantidades por ios cultivos agrícolas y un factor clave que limita su productividad. Se estima que, a nivel global, los sistemas agrícolas necesitan anualmente entre 150 y 200 millones de toneladas de nitrógeno, de los cuales más de 100 se obtienen de forma industrial a través del proceso Haber Boscb y entre 50 y 70 son fijadas de forma biológica (Unkovich et al , 2008, “Measuring plant-associated nitrogen fixation in agricultura! systems”, Australian Center for Internationa! Agricuítural research, Canberra, Australia.; Lu y lian, 2017,“Global nitrogen and phosphorus fertilizer use for agriculture producíion in the past half century: shifted bot spots and nutrient imbalance”, Earth Sys Sci Data. 9: 181-92) Sin embargo, la producción de fertilizantes nitrogenados tradicionales conlleva un alto gasto energético y su aplicación tiene una baja eficacia y un considerable efecto negativo sobre el medio ambiente, principalmente debido a pérdidas por lixiviación, desnitrificación, fijación en materia orgánica y volatilización del amoniaco (Tilman et al., 2002, “Agricultura! sustainability and intensíve production practices”, Nature. 418: 671 -7: Gaüoway et al., 2008.“Transformation of the nitrogen cycíe: recent trends, questions, and potentiai Solutions", Science. 320: 889-92).

Asimismo, existe la dificultad de aportar ios nutrientes a la planta de forma controlada y acorde a los requerimientos fisiológicos de ios cultivos, provocando a menudo estrés por toxicidad (aumento de salinidad) o por carencia de nutrientes. Finalmente, dado que se pierde entre el 50 y el 70% del fertilizante aplicado (Ladha et al., 2005, “Effíciency of Fertillzer Nitrogen in Cereal Production: Retrospects and Prospeets”, Advan Agron. 87: 85-158), los costes de producción para los agricultores incrementan ostensiblemente.

En consecuencia, el impacto medioambiental negativo asociado al uso excesivo de fertilizantes nitrogenados minerales ba influido en el desarrollo de políticas específicas tanto en España como en la Unión Europea, las cuales promueven la búsqueda de alternativas sostenibles a la fertilización tradicional y establecen leyes que regulan la cantidad máxima de unidades fertilizantes que el agricultor puede aplicar dependiendo de! grado de contaminación existente en una región concreta (es el caso la región de Murcia, ver BORM n.° 140, de 18 de junio; y de ¡a UE http://ec.8urop3.eu/ ^' environment/pubs/pdf/factsheets/nitrates/es.pdf).

En este sentido, algunas soluciones diseñadas para solventar los problemas arriba mencionados consisten en el uso de inhibidores de procesos de nitrificación y de ia hidrólisis de la urea (Giao et al., 2015 “How ínhibiting nitrifícation affects nitrogen cycie and reduces environmental ímpacts of anthropogenic nitrogen input”, Glob Chang Biol. 21 (3): 1249-57; Lam et ai., 2018, “Using urease and nitrifícation Inhíbitors to decrease ammonia and nítrous oxide emissions and improve productivity in a subtropical pasture", Sci Total Envíron, DEC 10, 644:1531 -1535) o en la aplicación de inóculos de bacterias fijadoras de nitrógeno (Gupta et al·, 2012, “Endophytic Nitrogen-Fixing Bacteria as Biofertilizer”, E. Lichtfouse (ed,), Sustainable Agriculture Reviews, 1 1 , 183; Kumar et aL 2016,“Methylotrophic bacteria in sustainable agricultura", World J Microbiol BiotechnoL 32: 120; PCT WO2013141815A1 )

Por ello, en la actualidad existe una tendencia evidente en el sector de nutrición vegetal hacia la búsqueda de alternativas a la fertilización nitrogenada convencional que permitan reducir la contaminación derivada de su empleo ai mismo tiempo que se aumenta la eficiencia del uso del nitrógeno y la productividad de ¡os cultivos de una forma sostenible.

Por otra parte, ¡as plantas exudan a través de ¡as raíces una parte considerable de los compuestos orgánicos generados en la fotosíntesis (entre un 1 1 y un 40%) con el fin de regular la composición química de la rizosfera y promover ei crecimiento de aquellos microorganismos que pueden aportar beneficios a la planta en un ecosistema dado (Badri y Vivanco, 2000, "Regulation and function of roo exúdales”, Plant, Cel! and Environment 32, 666 -681 ; Zhalnina et al., 2018, “Dynamíc root exúdate chemistry and microbial substrate preferences dríve patterns in rhizosphere microbial community assembíy”, Nat Microbio!, 3(4):470- 480). Los compuestos presentes en los exudados radiculares incluyen azúcares, aminoácidos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y metaboiitos secundarios (Bais et al, 2006,“The role of root exúdales in rhizosphere interactions with plants and other organisms”, Annu Rev Piant Biol. 57:233-66). Además de la especie cultivada y su estadio fenológico, en la composición y cantidad de estos exudados influyen principalmente señales ambientales, por ejemplo, la disponibilidad de nutrientes en el suelo.

De hecho, los exudados radiculares pueden modificar la composición de las comunidades microbianas del suelo e influir en la dinámica del ciclo del nitrógeno, principalmente a través de la regulación de los procesos de nitrificación y fijación de nitrógeno dei aire (Sun et aL 2016, "Biológica! nitrification inhibitson by rice root exudates and its relationship with nitrogen-use efficiency", New Phytol. 212{3);646-656: Coskun et al , 2017,“How Plant Root Exudates Shape the Nitrogen Cycie”, Trends P!ant Sci. 22{8):681-873).

A ia vista de lo anterior, la presente invención parte de los enfoques citados de forma que, por una parte, regulando los procesos de transformación del nitrógeno en los suelos, los exudados radiculares pueden incrementar la disponibilidad de nitrógeno para las plantas y la eficiencia de su uso en suelos agrícolas y, por otra parte, constituye una alternativa ai uso de Sos fertilizantes nitrogenados tradicionales.

Por ello seria deseable disponer de fertilizantes que mimeticen a los exudados radiculares y tengan un efecto análogo que pueda permitir prescindir o reducir la aplicación de fertilizantes minerales y mitigar la contaminación ambiental y el cambio climático, y, a la vez, proporcionen una alternativa a la fertilización nitrogenada convencional para reducir la contaminación derivada de su empleo y aumentar la eficiencia del uso del nitrógeno y la productividad de los cultivos de forma sostenible.

La presente invención cumple los dos objetivos citados anteriormente, proporcionando una composición fertilizante que incluye tiramina como potenciador de nitrógeno asimilable por las plantas, donde ia tiramina mejora los niveles de nitrógeno total en la planta y de nitrógeno nítrico en la savia.

La tiramina, o 4-{2-aminoetiS)fenol, es una amina derivada del aminoácido tirosina que se encuentra de forma natural en los tejidos vegetales. Está implicada en ia defensa de las plantas frente al estrés bíótico, ya que puede actuar como neurotransmisor y neuromoduíador en receptores específicos de insectos y herbívoros (Servillo et ai., 2017,“Tyramine Patbways in Citrus Plant Defense: Gíycoconjugates of Tyramine and Its N-Methyiated Derivatives”, J Agrie Food Cbern, 1 , 85(4);892~899). Bioquímicamente, la tiramina es producida mediante ¡a descarboxüaeión de tirosina via ia acción de ia enzima tirosina descarboxilasa, obteniéndose en forma de un polvo cristalino blanco con una pureza superior al 99,5%.

Tal como se ha mencionado anteriormente, en un primer aspecto, ía presente invención proporciona una composición fertilizante que incluye tiramina como potencíador de nitrógeno asimilable por las plantas. En una forma de realización, la composición fertilizante de la invención consiste en un 100% en peso de tiramina en forma de un polvo hidrosolubie.

En otra forma de realización, la composición fertilizante de la invención comprende entre un 30 y un 80% en peso de tiramina y entre un 5 y un 30% en peso de otros componentes seleccionados del grupo consistente en azúcares, otros aminoácidos diferentes a tirosina, ácidos orgánicos, poliaminas, glicerol, rnioínositol, adenina, uracilo, citosina, guanina y combinaciones de ios mismos, estando la composición fertilizante en forma de un polvo hidrosolubie. Cuando están presentes en la presente composición fertilizante, los azúcares se seleccionan preferentemente de entre mono- y di-sacáridos tales como sacarosa, fructosa, trehalosa, glucosa, arabinosa, maltosa, asi como mezclas de los mismos. Cuando están presentes en la presente composición fertilizante, los aminoácidos diferentes a la tiramina se seleccionan preferentemente de entre treonina, Usina, femlalanina, ácido giutámico, metionina, GABA, ornitina, glicina, glutamina, ácido aspártico, serina, asparagina, tirosina, íriptófano, valina, leucína, isoleucina, prolina, 4-hidroxiproiina, arginina, histidina, alanina, cisterna, y sus mezclas. Cuando están presentes en ¡a presente composición fertilizante, los ácidos orgánicos se seleccionan preferentemente de entre ácido láctico, ácido succínico, ácido oxálico, ácido giucónico, ácido treónico, ácido fumáríco y mezclas de ios mismos.

Las poSiaminas, en caso de estar presentes en la presente composición, preferentemente se seleccionan de entre putrescina, espermidina, espermina y mezclas de las mismas. La presencia de estos otros componentes diferentes a ía tiramina en la composición de la invención se basa en ei hecho de que tales componentes forman parte de los exudados radiculares en los cultivos ensayados en ausencia de nitrógeno que se describen posteriormente o bien se encuentran descritos en la literatura como componentes de dichos exudados en condiciones normales para el desarrollo de la planta (Zhalnina et al., 2018), siendo por ello deseables deseable con el objeto antes mencionado de disponer de una composición fertilizante que mimetice los exudados radiculares con un efecto análogo que pueda permitir prescindir o reducir ia aplicación de fertilizantes minerales. La composición fertilizante de ia invención se formula en forma de polvo hidrosolubie, como se ha indicado anteriormente, pero también puede formularse como una composición liquida mediante su disolución en agua o en forma granulada mediante la adición de agentes de granulación conocidos por el experto en la materia

De acuerdo con ei segundo aspecto, la invención se refiere una composición fertilizante como la descrita anteriormente en combinación con otro fertilizante adicional seleccionado de entre fertilizantes nitrogenados, fertilizantes fosfatados, fertilizantes potásicos, fertilizantes y enmiendas cálcicas, micronutrientes, ácido bórico y leonardita, así como combinaciones de los mismos, y/o en combinación con uno o más bioestimulantes seleccionados del grupo consistente en hidroiizados de aminoácidos, extractos húmicos, extractos de algas, microorganismos vivos o extractos de microorganismos, por ejemplo Pichia guiiHermondü y Azotobacfer chroococcum , y combinaciones de los mismos. En este caso, ¡a composición de la invención está presente en la combinación en una proporción de! 0,5 ai 10% en peso

En una realización, ei fertilizante nitrogenado adicional está presente en la combinación en una proporción del 5 ai 90% en peso y se selecciona de entre urea, nitrosulfato amónico, nitrato potásico, sulfato amónico, nitrato amónico, nitrato de calcio.

En otra realización, el fertilizante fosfatado adicional está presente en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso y se selecciona de entre roca fosfórica, triple superfosfato, simple superfosfato, superfosfato concentrado, ácido fosfórico

Aún en otra realización, el fertilizante potásico adicional está presente en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso y se selecciona de entre cloruro de potasio, sulfato potásico, sulfato doble de potasio y magnesio, hidróxido de potasio.

En otra realización, el fertilizante cáicico adicional está presente en la combinación en una proporción del 5 a! 90% en peso y se selecciona de entre cloruro de calcio, cianamida cálcica, sulfato de calcio, dolomita, caliza, óxido de calcio, hidróxido de calcio.

Aún en otra realización, el fertilizante con mlcronutrientes adicional está presente en la combinación en una proporción del 1 al 30% en peso y se selecciona de entre sulfato férrico, sulfato de magnesio, sulfato de zinc, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, molibdato amónico, cloruro de cobalto. En una realización adicional, el ácido bórico como fertilizante adicional está presente en ia combinación en una proporción del 1 al 30% en peso.

En otra realización, la leonardita como fertilizante adicional está presente en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso.

En el caso de la combinación de la composición fertilizante de ¡a invención con bloestimulantes tal como se ha descrito anteriormente, preferentemente ios bioestimulantes están presentes en la combinación en una proporción del 5 al 90% en peso.

Es también objeto de ia invención el uso de las composiciones fertilizantes aquí descritas en forma de polvo hídrosoiuble, en forma granulada o en forma líquida previa disolución de agua para su aplicación por fertirrígación o vía foliar.

En caso de uso de ia composición de la invención en forma de polvo hídrosoiuble por fertirrígación o vía foliar previa disolución en agua, preferentemente ésta se aplica en una cantidad de 0,5 a 20 kg/ha y de 0,06 a 1 kg/ha respectivamente. En caso de uso de la composición de la invención en combinación con otro fertilizante adicional en forma de granulado, preferentemente dicha combinación se aplica de forma directa en una cantidad de 75 a 1.500 Kg/ha.

En caso de uso de la composición de la invención en combinación con bioestimulantes en forma líquida para su aplicación por fertirrígación o vía foliar, preferentemente ésta se aplica en una cantidad de 0,5 a 20 kg/ha y de 0,06 a 1 kg/ha respectivamente.

Ejemplos

1 Ensayo de obtención e identificación de exudados radícuiares en aus&ncía de nitrógeno Con el objetivo caracterizar en detalle la respuesta de los cultivos a la deficiencia de nitrógeno e identificar los metabolitos exudados por las raíces que tienen mayor influencia en la dinámica del nitrógeno en el suelo, la Solicitante analizó el perfil diferencial de exudados de dos especies de cultivos de interés agronómico, maíz y tomate, en ausencia de nitrógeno. A continuación se describe brevemente e! ensayo para determinar los exudados radiculares emitidas en ausencia de nitrógeno.

El procedimiento, similar ai usado por otros autores (Naveed et al , 2017, "Plañí exudates may stabilize or weaken soil depending on species, origin and time", European Journal of Solí Science) fue el mismo tanto para las semillas de maíz (variedad LG 34.90) como para las de tomate (variedad Agora Hybrid F1 ) Las semillas se esterilizaron superficialmente realizando un lavado de 5 minutos con etanol al 96%, seguido de 10 minutos en lejía al 5%. A continuación, las semillas se lavaron extensamente y se dejaron hidratar en agua MilliQ estéril durante 4 horas. Para su germinación, las semillas se colocaron en un lecho de papel de filtro humedecido con agua MilliQ estéril. Las semillas se dejaron germinar en oscuridad durante 4 días, tras So cual se dispusieron las plántulas en bandejas de cultivo hidropónico, sumergiendo las ralees en solución nutritiva Hoagiand estándar. En cada bandeja se colocaron 12 plantas, destinándose tres bandejas (cada una correspondiente a una repetición biológica) al tratamiento control y otras tres al de ausencia de nitrógeno. Las plantas crecieron con una temperatura y fotoperiodo de 25°G y 16 h luz/22 ^Q G y 8 h oscuridad y una intensidad lumínica de 4.000 luxes en superficie.

La solución nutritiva se reemplazó por solución fresca cada tres dias y se mantuvo en todo momento aireada mediante sondas de burbujeo. Después de 10 días de crecimiento, se sometió a las plantas al tratamiento de depleción de nitrógeno. Para ello, tres bandejas se incubaron durante tres días con solución Hoagiand modificada sin nitrógeno, Incubando las tres bandejas restantes con solución completa. Concluida la incubación, se procedió a la obtención de los exudados radiculares Las plantas se retiraron cuidadosamente de las bandejas de cultivo y se lavaron con abundante agua, aplicándose un último ¡avado con agua destilada. Las plantas correspondientes a cada bandeja se dispusieron en matraces de cuello ancho conteniendo 2GQ mi de agua MilliQ, quedando ¡as ralees inmersas en el agua. Las plantas se incubaron en los matraces durante 6 h. Posteriormente, se retiraron las plantas y se eliminó el material insoluble de la solución filtrando con filtros de 0,20 um. El material filtrado se uiíracongeló en nitrógeno liquido y se sometió a iiofilización El material seco obtenido se pesó y se analizó mediante Cromatografía de Gases-Masas previa derivatizadón con metoxiamina y N- metil-(tnmetilsililtrifluoroacetamlda).

En ¡a Tabla 1 se muestran ios metabolítos exudados por ¡as p¡antas y sus rallos en condiciones de ausencia de nitrógeno respecto a las condiciones control.

i Aumento de metabolítos emitidos en ausencia de nitrógeno, Ratio N/N j i Maíz | Tomate j

I Treonina j 7 _« 5Ü ^. j ^. Usina 1 6 68 j i Lisina i 3,58 | Ácido giutámíco i 4,94 I i Ácido lácti I i . . . i

| Sacarosa | 3,05 i Ácido láctico | 4,65 | j Feñiíaianiña . { ^. 2 7. j . Urea .

| Ácido giutámíco { 2,37 ¡ Feniiaianina 4, 12 I

I Metionina i 2,28 | Tiramina | 3,04 j

[ ^. GABA 1 ^. 2.24 | Proiíña j 2 ^~ 92 j

. . . . .

i Acido succinico | 2,18 j Leucina | 2 81 j j Ácido oxálico j 1 ,98 i Isoleucina | 2,55 j i f rebatosa j 1 ,92 ; Fructosa j 2, 10 I

I . Urea . | . Ϊ7b 5 [ . Glicina j ^. 2.09 ^. |

| Ácido gücérico | 1 ,71 | Omitiría j 1 ,85 I

Teniendo en cuenta estos resultados, se seleccionaron los 7 metabolitos con un raíio respecto al control mayor que 2 y que estuviesen presentes en ¡os exudados de ambos cultivos. Estos metabolitos fueron: Usina, ácido gíutámico, sacarosa, ácido láctico, urea, ácido oxálica y tiramina. Se aplicó cada uno de ios metabolitos por separado a una dosis de 1 kg/ha en una maceta con 3 kg de tierra, se sembraron plantas de maíz (4 macetas por tratamiento con una planta por maceta) y se observó el efecto sobre su peso seco a las 8 semanas. El efecto de ios metabolitos se comparó con un control negativo (sin tratamiento) y un control positivo con un fertilizante nitrogenado convencional (nitrosulfato amónico a una dosis de 300 unidades fertilizantes de nitrógeno por hectárea). La tierra provenía de un suelo agrícola que había permanecido un año sin fertilizar ni cultivar, condiciones bajo las cuales la disponibilidad de las formas directamente asimilables por las plantas (NHU ⁺ y NOs ) es generalmente baja (Kiba y Krapp, 2016, “Plant Nitrogen Acquisition Under Lo Availabiiity: Regulation of Uptake and Root Arcbitecture”, Plant Ceil Physiol, 57{4):707-14). Todos los metabolitos mejoraron el crecimiento del maíz como se muestra en la Tabla 2 siguiente.

Tabla 2

Los resultados anteriores indican que la tiramina es e! metabolito que mejora en mayor medida el crecimiento del maíz, consiguiendo ei mismo resultado que el tratamiento nitrogenado convencional con nitrosulfato amónico.

2. Aplicación de / a composición fertilizante y de ¡a combinación de la invención Se prepararon tres composiciones fertilizantes en forma de polvo h drosoluble de acuerdo con la invención con la siguiente composición:

A: un 100% en peso de tiramina

B: una combinación de entre un 30 y un 80% en peso de tiramina y entre un 5 y un 30% de sacarosa, entre un 5 y un 30% de ácido giutámico y entre un 5 y un 30% de urea;

C; una combinación de entre un 30 y un 80% en peso de tiramina y entre un 5 y un 30% de ácido oxálico, entre un 5 y un 30% de ácido láctico y entre un 5 y un 30% de Usina.

Estos productos (A, B, C) se probaron en ensayos de campo con plantas de maíz y de tomate, comparándose con un control negativo (sin tratamiento) y con un control positivo de fertilización nitrogenada convencional consistente en nitrosulfato amónico (D). Las dosis y modo de aplicación fueron las siguientes:

Para el maíz;

» A: 7,6 kg/ha vía fertirriego.

» B; 7,6 kg/ha vía fertirriego.

C: 7,6 kg/ba vía fertirriego. D: Nitrosulfato amónico: 300 unidades fertilizantes de nitrógeno por hectárea

- Para el tomate:

A: 5,0 kg/ha vía fertirriego.

B: 5,0 kg/ha vía fertirriego.

C: 5,0 kg/ha vía fertirriego.

* D: Nitrosulfato amónico: 230 unidades fertilizantes de nitrógeno por hectárea

Los tratamientos mejoraron considerablemente el rendimiento y el contenido en nitrógeno de! maíz (Tablas 3 y 4), así como del tomate (Tablas 5 y 6)

Tabla 3

Tabla 4

Tabla 5

Tabla 8

Con objeto de determinar si el aumento en el contenido en nitrógeno y nitratos en savia en los tratamientos estudiados se debe a un aumento en la disponibilidad de nitrógeno asimilable para las plantas, se realizaron los balances de nitrógeno en los ensayos con plantas de maíz y tomate El análisis del suelo empleado para los ensayos determinó que éste contenía 7,4 ppm de nitrógeno mineral (MH% y NO?/), lo que corresponde a 29 kg/ha (considerando 30 centímetros de suelo arable y una densidad promedio de 1 .300 kg/m ³ , la masa por hectárea seria de aproximadamente 3 900 toneladas). Asimismo, se determinó el contenido en nitrógeno total del suelo, que era del 0, 15%, lo que corresponde a 5 850 kg/ha, de los cuales 5 831 kg/ha son de nitrógeno orgánico, no disponible para las plantas.

Entre los tratamientos A, B y C, el tratamiento que aporta mayor cantidad de unidades fertilizantes de nitrógeno sería el tratamiento B en la siguiente combinación: 35% tiramina, 5% sacarosa, 30% ácido glutámico y 30% urea. El contenido en nitrógeno de esta mezcla sería del 20,22%, lo que supondría una aplicación máxima de unidades fertilizantes de nitrógeno a través de los tratamientos aquí descritos de 15,4 kg/ha en el caso deí maíz y de 10,1 kg/ba en el caso del tomate.

Teniendo en cuenta el peso seco de la biomasa de las plantas de maíz y tomate (véanse las Tablas 7 y 8) y el porcentaje de nitrógeno total en las plantas (Tablas 4 y 6), se pueden calcular los kg de nitrógeno presentes en la biomasa obtenida por hectárea. Como se puede constatar, la cantidad de nitrógeno en la biomasa seca es muy superior en todos los casos a la suma de nitrógeno disponible en el suelo y el aportado por los tratamientos fertilizantes aquí propuestos. Por tanto, necesariamente el aumento en contenido en nitrógeno de las plantas se debe a un aumento en la disponibilidad de nitrógeno asimilable para las plantas gracias a la composición fertilizante con potenciador de nitrógeno asimilable.

Tabla 7

| Balance de nitrógeno en planta de maíz | l . , . , - - - \

Peso seco biomasa (Trt/ha) j kg de N en biomasa seca/ha ¡

I ^. Control ^. ] ^. §702 ^. f ^. 127,18 ^. ]

labia 8