本发明属于生物技术领域， 具体涉及植物杂交育种方法， 包括不育系繁殖和杂交种子制 备， 更具体地涉及一个育性基因 FL2及其突变体及其在杂交育种中的应用。

技术背景

杂交育种是提高农作物生产的有效途径， 杂交种通常比常规种具有明显的产量、 抗性和 适应性优势， 杂交种的选育通常也比常规种选育周期短、 见效快。 目前杂交育种已经成为许 多作物的主要育种方法。

作物雄性不育系的选育是杂交育种的关键环节 。 雄性不育系是雄配子发育缺陷、 雌配子 发育正常的植物个体， 作为母本接受来自父本的花粉。 雄性不育系的选育需要考虑几个因素: 1、 杂交配组： 不育系与相应的父本植物组合产生具有优良性 状的杂交后代； 2、 不育系的繁 殖： 不育系能在一定条件下恢复育性使其得到保持 ； 3、 不育系自身繁殖以及杂交制种效率: 好的不育系必须易于繁殖， 而且杂交制种产量高。 目前用于水稻杂交育种的雄性不育系包括 细胞质不育系和细胞核不育系。 细胞质雄性不育杂交育种体系涉及雄性不育系 、 恢复系和保 持系， 即所谓的三系法。 三系杂交需要有特定的恢复系和保持系， 不但制种过程复杂， 还大 大限制了杂种优势对不同品种资源的利用。 与三系法对应的二系法利用核基因控制的不育 系 和该不育系在特定生长环境条件下恢复育性的 特点， 使恢复系和保持系合二为一。 与 "三系 法"相比， "两系法"具有明显的优势， 既省去了保持系而简化了杂交种子的生产程序 ， 且 大大扩展了父本的选择范围， 可以将各种优良性状组合到杂交后代中。

用于两系杂交的不育系的关键特性是： 在一定的条件下不育系保持不育性， 可用于杂交 制种； 而条件改变时不育系可恢复育性自身繁殖， 达到保持该不育系的目的。 目前两系杂交 中采用的不育系多为光温敏不育系， 其育性受温度和光照变化影响， 这些环境因素的不稳定 会影响不育系的稳定性， 导致自交结实， 降低了杂交种子的纯度， 从而使制种风险增加。 而 且利用目前技术所能选用的用于两系杂交的不 育系十分有限， 比如粳稻品种中几乎没有很好 的两系杂交组合， 限制了品种资源的充分利用。 为了解决目前水稻杂交种育种方法中存在的缺 陷， 如不育系的稳定性、 杂交品种资源的 局限性、 制种技术复杂、 制种成本高等技术瓶颈， 人们正在尝试新的杂交育种技术， 新型的 杂交育种技术将充分利用隐性核基因控制的雄 性不育基因， 构建育性稳定不受环境影响的不 育系， 解除环境因素对杂交育种的制约， 消除生产上的潜在风险； 同时， 所利用的隐性核不 育基因应该适用于绝大多数品种， 使杂种优势资源利用大幅提高， 解决杂种优势的资源利用 问题； 本发明即提供了一种作物育性基因以及基于该 基因突变所产生的雄性不育系， 该不育 系的育性稳定、 不受环境条件影响、 能够被野生型转基因恢复。 该基因以及该基因突变产生 的不育系为构建新型杂交育种体系提供了必要 的元件。

发明简述

本发明提供了一种 DNA序列， 所述 DNA序列具有调控植物育性的功能， 其特征在于， 所 述 DNA序列选自下列组的序列之一：

a) 具有 SEQ ID NO: 1、 5或 27所示的核苷酸序列；

b) 具有 SEQ ID NO: 10或 11所示的核苷酸序列；

c) 具有 SEQ ID NO: 13或 14所示的核苷酸序列；

d) 具有 SEQ ID NO: 16或 17所示的核苷酸序列；

e) 具有 SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列；

f) 具有 SEQ ID NO: 21或 22所示的核苷酸序列；

g) 在严格条件下能够与 （a) - (0 之任一所述序列的 DNA杂交的 DNA序列； 或 h) 与 （a) - ( g) 之任一所述序列互补的 DNA序列。

上述 DNA序列编码的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2、 6、 8、 12、 15、 18、 20或 23所示。 本发明还提供了一种表达盒， 其特征在于所述表达盒包含上述的 DNA序列。

本发明还提供了一种表达载体， 其特征在于所述表达载体包含上述的表达盒。

本发明还提供了一种工程菌， 其特征在于所述工程菌包含上述的表达载体。

本发明还提供了一种基因在植物育性调控中的 应用， 其特征在于， 所述育性调控基因的 核苷酸序列选自下列组的序列之一：

a) 具有 SEQ ID NO: 1、 5或 27所示的核苷酸序列；

b) 具有 SEQ ID NO: 10或 11所示的核苷酸序列；

c) 具有 SEQ ID NO: 13或 14所示的核苷酸序列；

d) 具有 SEQ ID NO: 16或 17所示的核苷酸序列；

e) 具有 SEQ ID NO: 19所示的核苷酸序列；

f) 具有 SEQ ID NO: 21或 22所示的核苷酸序列；

g) 在严格条件下能够与 （a) - (0 之任一所述序列的 DNA杂交的 DNA序列； 或 h) 与 （a) - ( g) 之任一所述序列互补的 DNA序列。

本发明还包括一种通过突变育性调控基因 SEQ ID ΝΟ:1、 5、 10、 11、 13、 14、 16、 17、 19、 21、 22或 27获得雄性不育材料的方法。

本发明中所述的 "突变"包括在育性调控基因的核苷酸序列上进� ��取代、 缺失或添加一 个或多个核苷酸。

本发明还提供了一种恢复由相应的 SEQ ID NO:l、 5、 10、 11、 13、 14、 16、 17、 19、

21、 22或 27所示基因突变所导致的雄性不育， 使雄性不育突变体恢复成可育的方法。

本发明还包括一种突变体材料的应用， 其特征在于所述突变材料是由核苷酸序列的突 变 所造成， 所述核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1、 5、 10、 11、 13、 14、 16、 17、 19、 21、 22或 27 所示。

上述 "突变"可以是点突变， 也可以是 DNA缺失或插入突变， 也可以是通过 RNAi、 定点突变等基因沉默手段产生。

本发明还提供了将上述材料和 DNA序列应用于育种中的方法， 更具体地所述应用是指 将突变体植株作为不育系母本， 与恢复系杂交， 生产杂交种子。

本发明还提供了一种启动子， 所述启动子具有花药特异表达的特性， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3或 9所示， 本发明还包括包含上述启动子的表达盒、 载体和 /或工程菌株。

本发明还提供了一种在植物中表达目的核苷酸 序列的方法， 所述方法包括向植物体导入 DNA构建体， 所述 DNA构建体含有启动子及操作性连接于所述启动 子的目的核苷酸序列， 其中所述启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3或 9所示。

所述的 "目的核苷酸序列"可以是结构基因、 调节基因、 结构基因的反义基因、 调节基因 的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小 RNA， 其在花粉发育晚期的特异性表达可以调 节花粉的育性及花粉萌发。

本发明还包括上述 DNA序列和或启动子在以下 （a) 至 （d) 中任一项中的应用：

( a) 培育植物品种或品系；

(b ) 培育授粉受精能力增强的植物品种或品系；

( c) 培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系；

( d) 培育雄性不育植物品种或品系。

本发明还提供了一种用于保持雄性不育植株的 纯合隐性状态的方法， 所述方法包括： a) 提供第一植株， 其包含 FL2基因的纯合隐性等位基因， 并且其是雄性不育的； b ) 向第一植株中引入下述构建体， 形成第二植株， 所述第二植株包含 FL2基因的纯合隐性 等位基因和所述构建体， 且构建体在第二植株中为半合状态， 所述构建体包含：

i) 第一核苷酸序列， 其包含 FL2核苷酸序列， 当在第一植株中表达时其将恢复雄性生 育力；

ϋ) 第二核苷酸序列， 当其表达时， 会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或 功能， 具体为花粉失活基因 ZM-PA; 以及

c) 用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受 精， 以产生保持了所述第一植株纯合隐性 状态的后代。 附图说明

图 1 0sFL2突变体和野生型黄华占小花形态。

图 2 0sFL2突变体和野生型黄华占花药形态。

图 3 0sFL2突变体和野生型黄华占花粉染色分析。

图 4 0sFL2突变体和野生型黄华占雌器官形态比较。

图 5 0sFL2突变体柱头外露情况， 箭头指露出的柱头。

图 6为黄华占 0sFL2、 0sFL2突变体和日本晴 0sFL2 的 cDNA序列比对结果， 其中 HHZ表示 黄华占 0sFL2序列， Mutant表示 0sFL2突变体序列， Nip表示日本晴中的 0sFL2序列。

图 7为黄华占 0sFL2、 0sFL2突变体和日本晴 0sFL2的 蛋白质序列比对结果， 其中 HHZ表示 黄华占 0sFL2序列， Mutant表示 0sFL2突变体序列， Nip表示日本晴中的 0sFL2序列。

图 8 0sFL2在不同水稻组织器官中的表达水平分析。

图 9 0sFL2基因的启动子表达载体。

图 10 0sFL2基因的启动子驱动 GUS基因在水稻花药中特异表达。

图 11 水稻雄性不育突变体 （0sFL2 ) 的转基因功能互补载体。

图 12 0sFL2基因的 RNAi干扰载体。

图 13 0sFL2基因在 RNAi干扰载体的转基因植株的幼穗花药中的表� �水平， 其中 1_10代表 转基因植株， 11代表野生型植株。

图 14 0sFL2基因编码的蛋白与大麦、 高粱、 小米 （谷子）、 二穗短柄草、 玉米基因组中的同 源蛋白的序列比对图。

图 15是 pZN3载体图。

图 16显示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒� ��

图 17为转基因植株所收获的种子的荧光分离比分� ��， 该图表明种子均显示 1 : 1的分离比。 发明详述

本文提到的所有参考文献都通过弓 I用并入本文。

除非有相反指明， 本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发 明所属领域普通技术 人员通常所理解的相同的含义。 除非有相反指明， 本文所使用的或提到的技术是本领域普通 技术人员公知的标准技术。 材料、 方法和例子仅作阐述用， 而非加以限制。

本发明包括一种育性相关基因及其核苷酸和 蛋白序列， 还包括通过操作该基因在调控植株雄 性生育力中的应用。 非限制性地举例而言， 下文描述的任何方法都可与本发明所提供的相 应 核苷酸序列一起使用， 例如， 将所述育性基因的突变体序列引入植株以导致 植株雄性不育、 使植株内源序列突变、 向植株中引入该序列的反义序列、 使用发卡形式、 或将其与其它核苷 酸序列连接起来调控植株的表型， 或者是本领域技术人员已知的可用于影响植株 的雄性生育 力的多种方法中的任一方法。

本发明所提供的育性基因 FL2， 是一个花粉发育相关的基因。 在水稻中该育性基因位于 第 10号染色体上， 其在籼稻中的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1、 4或 27所示， 氨基酸序列如 SEQ ID N0 : 2所示； 在粳稻中其核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 5所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0 : 6所示； 在大麦中该育性基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 10或 11所示， 其氨基酸序列 如 SEQ ID NO : 12所示； 在高粱中该育性基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 13或 14所示， 其 氨基酸序列如 SEQ ID NO : 15所示； 在玉米中该育性基因 ZmFL2的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 16或 17所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 18所示； 在谷子中该育性基因的核苷酸序列 如 SEQ ID NO : 19所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 20所示； 在二穗短柄草中该育性基因的 核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 21或 22所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0 : 23所示。

本发明还包括下列组的序列之一： a) 与上述 FL2基因序列具有至少 90% (优选为至少 95%) 序列相似性， 且具有相同功能的 DNA序列； b) 在严格条件下能够与 （a) 所述序列的 DNA杂交的 DNA序列； c) 与上述任一所述序列互补的 DNA序列。

上述所述育性基因， 可从各种植物中分离获得。 本领域技术人员应该知晓， 本发明所述 的育性恢复基因包括与 FL2基因高度同源， 并且具有同样的育性调控功能的高度同源的功 能 等价体序列。 所述高度同源的功能等价体序列包括在严谨条 件下能够与本发明所公开的 FL2 基因的核苷酸序列杂交的 DNA序列。 本发明中所使用的 "严谨条件"是公知的， 包括诸如在 含 400mM NaCl 40mM PIPES (pH6. 4) 禾 B ImM EDTA的杂交液中于 60°C杂交 12-16小时， 然 后在 65°C下用含 0. 1SDS、 和 0. 1%SSC的洗涤液洗涤 15-60分钟。

功能等价体序列还包括与本发明所公开的 FL2基因所示的序列有至少 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 或 99%序列相似性， 且具有育性调控功能的 DNA序列， 可以从任何植物中分离获 得。 其中， 序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息 学算法来获得， 包括 Myers和 Miller算法（Bioinformatics, 4 (1)： 11-17， 1988)、 Needleman-Wunsch全局比对法

(J. Mol. Biol. , 48 (3)： 443-53， 1970)、 Smith-Waterman局部比对法（J. Mol. Biol.， 147： 195-197， 1981)、 Pearson和 Lipman相似性搜索法（PNAS, 85 (8)： 2444-2448， 1988)、 Karlin和 Altschul的算法（Altschul等， J. Mol. Biol. , 215 (3)： 403-410， 1990； PNAS, 90： 5873-5877， 1993)。 这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

本发明所述的基因序列可以从任何植物中分离 获得， 包括但不限于芸苔属、 玉米、 小麦、 高粱、 两节荠属、 白芥、 蓖麻子、 芝麻、 棉籽、 亚麻子、 大豆、 拟南芥属、 菜豆属、 花生、 苜蓿、 燕麦、 油菜籽、 大麦、 燕麦、 黑麦 （Rye)、 粟、 蜀黍、 小黑麦、 单粒小麦、 斯佩尔特 小麦 （Spelt )、 双粒小麦、 亚麻、 格兰马草 （Gramma grass ), 摩擦禾、 假蜀黍、 羊茅、 多 年生麦草、 甘蔗、 红莓苔子、 番木瓜、 香蕉、 红花、 油棕、 香瓜、 苹果、 黄瓜、 石斛、 剑兰、 菊花、 百合科、 棉花、 桉、 向日葵、 芸苔、 甜菜、 咖啡、 观赏植物和松类等。 优选地， 植物 包括玉米、 大豆、 红花、 芥菜、 小麦、 大麦、 黑麦、 稻、 棉花和高粱。

本发明还提供了通过影响 FL2的核苷酸序列或者通过调控 FL2基因的转录表达从而影响 植株育性的方法。 所述影响植株育性是指通过调控 FL2基因的表达， 从而使所述植株的育性 发生改变， 如导致植株雄性不育。 具体地， 取决于具体应用需求， 可以通过多种方法来影响 FL2基因在植物体内的表达， 从而达到调控植株雄性育性的效果。 更具体地， 调控 FL2基因 的表达可以使用许多本领域普通技术人员可获 得的工具进行， 例如， 通过突变、 诱变、 反义 基因的转入、 共抑制或发夹结构的引入等， 都可以用于破坏 FL2基因的正常表达， 从而获得 雄性不育的植株。 另一方面， 本发明还包括通过将野生型 FL2的核苷酸序列引入植株来恢复 FL2表达被破坏的植株的雄性生育力。

本发明还提供了一种 FL2基因的不育突变体序列及其雄性不育突变体 材料。 更具体地， 所述雄性不育突变体材料是通过突变水稻内源 的 FL2基因， 或突变与其高度同源的基因的核 苷酸序列， 使该植物体丧失雄性育性的过程。 所述 "突变"包括但不限于以下方法， 如用物 理或化学的方法导致的基因突变， 化学方法包括用 EMS等诱变剂处理所导致的诱变， 所述突 变还可以是点突变， 也可以是 DNA缺失或插入突变， 还可以是通过 RNAi、 定点突变等基因 沉默手段产生。

具体地， 本发明还提供了一种水稻雄性不育突变体， 其含有突变后的雄性不育基因， 所 述突变后的雄性不育基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 7所示， 氨基酸序列如 SEQ ID N0 : 8所 示。 与野生型相比， 在不育突变体中， 该基因编码区的第 1688位点由 G突变为 A (图 6) ， 导致对应的其编码的蛋白序列的第 563位点的氨基酸由甘氨酸 （G) 变为天门冬氨酸 （D) 。 本领域技术人员应该知晓， 可以将所述核苷酸序列 SEQ ID NO : 7构建到植物表达载体， 进行 植物转化， 从而获得新的转基因的雄性不育突变体材料。

本发明还提供了一种 FL2基因的启动子， 所述启动子具有在花粉中特异表达的功能， 相 应启动子的序列为 FL2基因从 ATG到上游 700bp至 2500bp左右的核苷酸序列。 更具体地， 在水稻中， 所述 0sFL2基因启动子的核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 3或 SEQ ID N0 : 9所示。 将 SEQ ID N0 : 3或 SEQ ID NO : 9与报告基因 GUS相连， 转化植物， 检测分析转基因植株中的 GUS表达活性和表达模式， 通过在转基因植株的根、 茎、 叶和花中都进行 GUS染色分析， 结 果发现 0sFL2启动子驱动 GUS基因主要在水稻花药中表达，更具体地在花 药发育的 P7期特异 性的高表达。 说明本发明所提供的 SEQ ID N0 : 3或 SEQ ID NO : 9启动子是一个花药特异性表 达的启动子。

本发明所提供的植物花粉特异表达启动子， 含有序列表中 SEQ ID N0 : 3或 SEQ ID NO : 9 所示的核苷酸序列， 或包含与 SEQ ID N0 : 3或 SEQ ID N0 : 9中所列核苷酸序列具有 90%以上 相似性的核苷酸序列， 或包含来源于 SEQ ID NO : 3或 SEQ ID NO : 9序列上的 100个及 100以 上连续的核苷酸片段， 并且可以驱动与该启动子操作性连接的核苷酸 序列在植物花粉中的表 达。 含有上述序列的表达载体、 转基因细胞系以及宿主菌等均属于本发明的保 护范围。 扩增 本发明所公开的 SEQ ID N0 : 3或 SEQ ID N0 : 9启动子的任一核苷酸片段的引物对也在本发� � 的保护范围之内。

本发明所提供的启动子核苷酸序列还可用于从 水稻以外的其它植物中分离相应序列， 尤 其是从其他单子叶植物中进行同源克隆。 根据这些相应序列与本文所列启动子序列间的 序列 同源性， 或与本启动子基因的同源性， 使用如 PCR、 杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。 因此， 根据它们与本发明所列的 SEQ ID N0 : 3或 SEQ ID N0 : 9启动子序列 （或其片段） 间的 序列相似性而分离的相应片段， 也包括在实施方案中。

本发明所述的 "启动子"是指一种 DNA调控区域， 其通常包含能指导 RNA聚合酶 II在特 定编码序列的合适转录起始位点起始■合成的 TATA盒。 启动子还可包含其它识别序列， 这些识别序列通常位于 TATA盒的上游或 5' 端， 通常被称为上游启动子元件， 起调控转录 效率的作用。 本领域技术人员应该知晓， 虽然已经鉴定了针对本发明公开的启动子区域 的核 苷酸序列， 但是分离和鉴定处于本发明鉴定的特定启动子 区域的 TATA盒上游区域的其它调 控元件也在本发明的范围内。 因此， 本文公开的启动子区域通常被进一步界定为包 含上游调 控元件， 例如用于调控编码序列的组织表达性和时间表 达功能的那些元件、 增强子等。 以相 同的方式， 可以鉴定、 分离出使得能在目标组织 (例如雄性组织）中进行表达的启动子元件， 将其与其它核心启动子一起使用， 以验证雄性组织优先的表达。 核心启动子指起始转录所需 的最小限度的序列， 例如被称为 TATA盒的序列， 这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具 有的。 因此， 可选地， FL2基因的上游启动子可与其自身的或来自其它 来源的核心启动子关 联使用。

核心启动子可以是任何一种已知的核心启动子 ， 例如花椰菜花叶病毒 35S或 19S启动子 (美国专利 No. 5, 352, 605)、 泛素启动子（美国专利 No. 5, 510, 474)、 IN2核心启动子 (美国专利 No. 5, 364, 780)或玄参花叶病毒启动子。

所述基因启动子的功能可以通过以下方法进行 分析： 将启动子序列与报告基因可操作性 连接， 形成可转化的构建体， 再将该构建体转入植株中， 在获得转基因后代中， 通过观察报 告基因在植物各个组织器官中的表达情况来确 认其表达特性； 或者将上述构建体亚克隆进用 于瞬时表达实验的表达载体， 通过瞬时表达实验来检测启动子或其调控区的 功能

用来测试启动子或调控区域功能的适当表达载 体的选择将取决于宿主和将该表达载体引 入宿主的方法， 这类方法是本领域普通技术人员所熟知的。 对于真核生物， 在载体中的区域 包括控制转录起始和控制加工的区域。 这些区域被可操作地连接到报告基因， 所述报告基因 包括 YFP、 UidA、 GUS基因或荧光素酶。 包含位于基因组片段中的推定调控区的表达载 体可 以被引入完整的组织， 例如阶段性花粉， 或引入愈伤组织， 以进行功能验证。

此外， 本发明的启动子可与并非 FL2基因的核苷酸序列相连， 以表达其它异源核苷酸序 列。 本发明的启动子核苷酸序列及其片段和变体可 与异源核苷酸序列一起组装在一个表达盒 中， 用于在目的植株中表达， 更具体地， 在该植株的雄性器官中表达。 所述表达盒有合适的 限制性酶切位点， 用于插入所述启动子和异源核苷酸序列。 这些表达盒可用于对任何植株进 行遗传操作， 以获得想要的相应表型 。

本发明所公开的 FL2启动子，更具体地为水稻中的 FL2启动子，可用于驱动下列异源核苷 酸序列的表达，以使转化的植株获得雄性不育 的表型。 所述异源核苷酸序列可编码促使碳水 化合物降解的酶或修饰酶、 淀粉酶、 脱支酶和果胶酶， 更具体的如 a淀粉酶基因、 茁长素 (auxin) , rot B、 细胞毒素基因、 白喉毒素、 DAM甲基化酶、 亲和素， 或者可选自原核调控 系统， 还可以是显性的雄性不育基因。

在某些实施方式中， 本发明中所提到的可操作地连接在本发明启动 子下游的核酸， 其中 所述的 "核酸"可以是操作性连接于本文所公开的启动� ��之上的结构基因、 调节基因、 结构 基因的反义基因、 调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表 达的小 RNA。

更具体地， 可以将本发明所提供的育性调控基因 SEQ ID N0 : 1和 SEQ ID N0 : 5构建到启 动子 SEQ ID N0 : 3或 SEQ ID N0 : 9的下游， 从而驱动该育性调控基因在花粉中的特异表达 ， 或是通过 RNAi的技术原理， 构建由 SEQ ID NO : 3或 SEQ ID NO : 9启动的可以沉默 SEQ ID NO : 1基因的 RNAi载体， 从而获得 SEQ ID NO : 1基因的雄性不育突变体。

本发明所提供的启动子序列可分离自任何植物 ， 包括但不限于芸苔属、 玉米、 小麦、 高 粱、 两节荠属、 白芥、 蓖麻子、 芝麻、 棉籽、 亚麻子、 大豆、 拟南芥属、 菜豆属、 花生、 苜 蓿、 燕麦、 油菜籽、 大麦、 燕麦、 黑麦 （Rye)、 粟、 蜀黍、 小黑麦、 单粒小麦、 斯佩尔特小 麦 （Spelt )、 双粒小麦、 亚麻、 格兰马草 （Gramma grass ), 摩擦禾、 假蜀黍、 羊茅、 多年 生麦草、 甘蔗、 红莓苔子、 番木瓜、 香蕉、 红花、 油棕、 香瓜、 苹果、 黄瓜、 石斛、 剑兰、 菊花、 百合科、 棉花、 桉、 向日葵、 芸苔、 甜菜、 咖啡、 观赏植物和松类等。 优选地， 植物 包括玉米、 大豆、 红花、 芥菜、 小麦、 大麦、 黑麦、 稻、 棉花和高粱。

本发明还包括含有 FL2基因和 /或其启动子的构建体， 所述构建体包括通常所说的载体 或表达盒。 所述构建体中的启动子可以是天然启动子或被 取代的启动子， 其将驱动所连核苷 酸序列在植株中的表达。 构建体中的启动子可以是诱导型启动子。 当将 FL2基因的核苷酸序 列与另一个启动子相连， 优选的是， 该启动子在花粉发育早期充分驱动该序列的表 达，例如 可以在花粉发育的 P7期特异性表达。 具体地， 可使用的启动子的种类包括组成型病毒启动 子， 例如花椰菜花叶病毒 (CaMV) 19S和 35S启动子， 或玄参花叶病毒 35S启动子，或泛素启 动子。

组织特异表达启动子可用于靶向特定的植物组 织中增强转录和 /或表达。 启动子可在目 标组织中表达也在其它植物组织中表达， 可在目标组织中强烈表达以及比其它组织程度 低得 多的表达， 或者可高度优选在目标组织中表达。 在一种实施方式中， 启动子是偏好在植物的 雄性或雌性组织中特异表达的类型。 本发明不必须在方法中使用任何特定的雄性组 织优先型 启动子， 本领域技术人员已知的很多此类启动子中的任 何都可以使用。 本文描述的天然的 FL2启动子是可使用的启动子的一个例子。 另一种此类启动子是 5126启动子、 MS45启动子、 MS26启动子、 BS92-7启动子、 SGB6调控元件和 TA29启动子等， 其偏好于指导其连接的基 因在植物雄性组织中的表达。 某些构建体中还可以包括配子组织优先表达启 动子。 雄性配子 优先表达启动子包括 PG47启动子以及 ZM13启动子。

上述构建体中还可包括其它组分， 这主要取决于载体构建的目的和用途， 例如可进一步 包括选择标记基因、 靶向或调控序列、 稳定序列或引导序列、 内含子等。 表达盒还将在目标 异源核苷酸序列的 3' 端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止子 。 终止子可以是本发明 所提供基因的终止子， 也可以是来自外源的终止子。 更具体地， 上述终止子可以是胭脂氨酸 合酶或章鱼碱合酶终止区域。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定 细胞器， 例如质体、 造粉体， 或者引向内 质网， 或在细胞表面或细胞外分泌的情况下， 表达盒还可包含用于编码转运肽的核苷酸序列 。 此类转运肽是本领域所公知的， 其包括但不限于 Rubisco的小亚基、 植物 EPSP合酶、 玉米 Brittle-1叶绿体转运肽等。

在制备表达盒的过程中， 可对多种 DNA片段加以操作， 以提供处于合适方向， 或是处于 正确读码框中的 DNA序列。 为达到此目的， 可使用衔接子或接头， 将 DNA片段连起来， 或者 进一步包括其它操作， 以提供方便的限制性酶切位点等。

进一步地， 本发明所提供的构建体中还可包括选择标记基 因， 用于选择经转化的细胞 或组织。 所述选择标记基因包括赋予抗生素抗性或对除 草剂抗性的基因。 合适的选择标记基 因包括但不限于:氯霉素抗性基因， 潮霉素抗性基因， 链霉素抗性基因， 奇霉素抗性基因， 磺胺类抗性基因， 草甘磷抗性基因， 草丁嶙抗性基因。 所述选择标记基因还可以是红色荧光 基因、 青色荧光蛋白基因、 黄色荧光蛋白基因、 荧光素酶基因、 绿色荧光蛋白基因、 花青甙 pi等基因。

本发明所提供的表达盒或载体可被插入质粒、 粘粒、 酵母人工染色体、 细菌人工染色体 或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。 优选的宿主细胞是细菌细胞， 尤其是用于克隆 或储存多核苷酸、 或用于转化植物细胞的细菌细胞， 例如大肠杆菌、 根瘤土壤杆菌和毛根土 壤杆菌。 当宿主细胞是植物细胞时， 表达盒或载体可被插入被转化的植物细胞的基 因组中。 插入可以是定位的或随机的插入。 优选地， 插入通过诸如同源重组来实现。 另外， 表达盒或 载体可保持在染色体外。 本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的核 、 叶绿体、 线粒体和 /或质体中。 优选地， 本发明的表达盒或载体被插入植物细胞核的染 色体 DNA中。

本发明还包括所公开的 FL2基因及其启动子的应用， 在某些应用的实施方式中， 可以应 用本发明所提供的 FL2基因或其启动子来实现 FL2或其他类似育性相关基因突变所获得的雄 性不育系的繁殖和保持。

具体地， 上述雄性不育系的繁殖和保持， 是指以纯合隐性核雄性不育突变体为转化受体 材料， 将紧密连锁的 3个目标基因转化至该不育突变体受体植株中� � 所述 3个目标基因分别 是育性恢复基因、 花粉失活基因和颜色标记筛选基因。 其中， 育性恢复基因可使不育的转化 受体育性恢复， 花粉失活基因可使含有转化的外源基因的花粉 失活， 即失去授精能力， 筛选 基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分 拣， 分拣出的非转基因种子用作不育系生产杂 交种， 转基因种子用作保持系来源源不断地、 稳定地生产不育系。

更具体地， 根据本发明的一个实施例， 可以以水稻核隐性不育 / V ^突变体为转化 受体材料， 将紧密连锁的 3个目标基因转化至该不育系： 其中， 育性恢复基因 0sFL2可使转 化受体育性恢复； 花粉失活基因 Zm-PA可使含有外源基因的花粉失活， 即失去授精能力； 荧 光色选基因 RFP (r)用于转基因种子和非转基因种子的分拣， 分拣出的非转基因种子用作不 育系生产杂交种， 转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生 产不育系。 由于该技术利用 生物技术生产非转基因产品， 解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题， 即三系法资源利 用率低而两系法中不育系育性不稳定的问题。

本发明的所提供的花粉特异表达启动子可用于 外源基因在花粉中的特异性表达， 从而避 免该外源基因在植物其他组织中持续表达所带 来的不利影响， 还可以用于植物花粉生长发育 相关基因的功能分析和鉴定； 可用于雄性不育系和恢复系的创建； 并可应用于花粉败育实验 中， 从而避免由植物转基因漂移或花粉逃逸所带来 的生物安全问题， 对植物雄性不育系和恢 复系的创造具有重要意义。

本发明还提供了一种植物的生产方法， 其包括：

( 1 ) 构建本发明第二方面或第五方面所提供的表达 盒；

( 2 ) 将步骤 （1 ) 获得的表达盒导入植物细胞；

( 3 ) 再生出转基因植物； 和

( 4) 选择出转基因植物； 并且

( 5 ) 任选地， 增殖步骤 （4) 获得的植物以获得后代。

本发明的转基因植物使用植物生物技术领域技 术人员已知的转化方法制备。 任何方法可 被用于将重组表达载体转化进植物细胞中， 以产生本发明的转基因植物。 转化方法可包括直 接和间接的转化方法。 合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的 DNA摄入、 脂质体介导的转化、 使用基因枪导入、 电穿孔、 以及显微注射， 等。 在本发明的具体实施方式中， 本发明使用了 基于土壤杆菌的转化技术 （可参见 Horsch RB等（1985) Science 225： 1229； White FF， Vectors for Gene Transfer in Higher Plants , Transgenic Plants , 第 1卷，

Engineering and Uti l ization, Academic Press , 1993， pp. 15-38; Jenes B

等. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants , 第 1卷，

Engineering and Uti l ization, Academic Press , 1993， pp. 128-143， 等）。 土壤杆菌菌 株 (例如根瘤土壤杆菌或毛根土壤杆菌)包含质粒 (Ti或 Ri质粒)和 T-DNA元件， 所述质粒和 元件在用土壤杆菌转染后被转移至植物， 而 T-DNA被整合进植物细胞的基因组中。 T-DNA可 位于 Ri-质粒或 Ti-质粒上， 或独立地包含在所谓的双元载体中。 土壤杆菌介导的转化方法 描述于例如中。 土壤杆菌介导的转化最适合双子叶植物， 但是也适合单子叶植物。 土壤杆菌 对植物的转化描述于例如中。 转化可导致瞬时或稳定的转化和表达。 尽管本发明的核苷酸序 列可被插入落入这些广泛种类中的任何植物和 植物细胞中， 但是其尤其适用于作物植物细胞。

与现有技术相比， 本发明具有如下的有益效果： 本发明提供了一种水稻花粉发育基因以 及基于该基因突变所产生的雄性不育系， 该不育系的育性稳定、 不受环境条件影响、 能够被 野生型转基因恢复。 该基因以及该基因突变产生的不育系为构建第 三代杂交育种体系提供了 必要的元件， 该基因突变产生的雄性不育系， 用来生产杂交种子， 对于突破并改良现有的 "三系"和 "两系"杂交技术有重要意义。 具体实》式

下面对本发明的实施例作详细说明， 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实 施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例 1、水稻雄性 突变体 C osfW雌

该突变体的获得是通过 EMS诱变籼稻黄华占种子 （M0)， EMS诱变浓度和时间是 0. 7%， 12 小时， 来自 M0代种子植株结实后混收， 获得突变体库 （Ml )。 来自 Ml代种子的植株在种子 成熟期用于筛选， 获得不育株。 不育株割稻桩再生， 再生株在生殖期用 I2-KI染色检测花粉 发育和染色反应。 其中一个突变体表现为无花粉型不育 (no pollen) , 命名为 os/Y 实施例 2、水稻雄性 突变体 osfW遗传分析

_0ι5 /72突变体不育株与野生型黄华占杂交， 80棵 F1代植株全部表现为可育。 再将 F1代进行 自交， 获得的 300棵 F2代植株中， 78棵表现为无花粉型不育， 222棵植株表型为完全可育， 不育与可育植株的分离比接近 1 : 3， 显示该突变是由隐性核基因控制。

实施例 3、水稻雄性 突变体 osfW育性稳定性分析

为了确定 突变体育性是否受环境光照温度等条件影响， 不育株与野生型黄华占杂 交产生的 F2代植株在深圳、 三亚、 湖南、 北京种植， 进一步观察植株育性和表型分离比。 在所有区域， 不育株： 可育株均表现为 1 : 3分离比 （表 1 )， 割稻桩再生的不育株仍表现为 不育， 说明该突变体不育性状不受环境因素影响。

表 1： 水稻雄性不育突变体 （ 0sFL2 ) 杂交 F2代分离比 深圳 88 31 0. 034

三亚 104 29 0. 150

湖南 65 21 0. 000

北京 61 19 0. 033 实施例 4、水稻雄性 突变体 osfW [器官表型分析

与野生型相比， 突变体植株生长发育正常， 同期开花。 外稃和内稃大小、 形态、 开张尺 寸、 开张时间与野生型没有差别 （图 1 ) 。 但突变体花药瘦小， 呈白色 （图 2) ， 花药不开 裂， 没有花粉 ， 进一步用 I2-KI溶液对突变体的花粉进行染色检测， 结果如图 3所示， 野 生型的花粉染色正常， 而突变体没有花粉。 突变体的雌器官 （包括子房， 花柱， 柱头） 均比 野生型略大 （图 4) 。 突变体柱头外露率达 89% 以上 （图 5) ， 而野生型黄华占柱头很少外 露。 将不育突变体植株与可育植株混播， 在自然生长条件下， 不育突变体接受可育株异花授 粉可以恢复结实， 对 100株突变体植株的结实率进行统计， 结实率均可达 40%以上， 而在赶 粉的条件下， 不育突变体植株接受可育株异花授粉， 结实率则可达 70-80%。 进一步观察突 变体的种子发育正常， 没有裂颖。 实施例 5、水稻雄性不育突变体基因的克隆

突变体基因克隆采取 Mutmap 方法， 即利用突变体与原野生亲本杂交构建 F2群体， 通过 重测序进行基因定位的方法。 将不育株与野生型黄华占杂交， 选取 30棵 F2代不育植株， 取 叶片提取基因组 DNA， 等量混合后用于高通量基因组测序， 共获得 20Gb 基因组序列数据， 相当于 50x水稻基因组。 与野生型黄华占基因组序列比较显示突变基因 可能是第 10染色体 上的 0sl0g38050等位基因。 在野生型黄华占中该基因的编码区全长 1767 bp，其核苷酸序列 如 SEQ ID N0 : 1所示。 SEQ ID NO : 1所编码的蛋白含 588个氨基酸， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0 : 2所示。 在不育突变体中， 该基因编码区的第 1688位点由 G突变为 A (图 6) ， 导致对 应的其编码的蛋白序列的第 563位点的氨基酸由甘氨酸 （G) 变为天门冬氨酸 （D) (图 7) 。 采用最新的 SNP (单核苷酸多态性） 研究工具 HRM (High Resolution Melt , 即高分辨率熔 解） 分析， 进一步验证所有的无花粉植株均携带纯合突变 型位点， 而可育植株携带纯和野生 型或杂合型位点。 该位点为纯和野生型的植株自交后代全部可育 ， 该位点为杂合型的植株自 交后代表现不育： 可育 1 : 3分离。 该基因 cDNA编码区在粳稻日本晴和野生型黄华占之间� � 在核苷酸序列多态性 （图 6) ， 与黄华占相比， 具体为粳稻日本晴在该基因的核苷酸序列的 第 59-64位的出现一个片段的缺失， 具体缺失片段是 CC GCCG, 第 451位的 G突变为 T, 第

1371位的 G突变为 A,导致对应的该基因的氨基酸序列在第 20-21位处出现 2个氨基酸残基 的多态性 ， 第 151位的氨基酸残基由丙氨酸 A突变为丝氨酸 S (图 7) ， 具体的在粳稻日 本晴中， 该基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0:5所示， 其编码的氨基酸序列如 SEQ ID N0:6所 示。 进一步分析， 该基因在籼稻品种 9311 和野生型黄华占之间没有多态性。 实施例 6、 0sFL2基因在水稻各器官中的表达分析

根据 0sFL2的 cDNA序列设计引物， 上游引物为 F1 5' GCCTCACCGTCCTCCTCTAC 3'

(SEQ ID N0:33) ， 下游引物为 R1 5' CGGGTCCGAGAACACCAC 3' (SEQ ID N0:34), 同 时以水稻 Actin基因作为内参对照设计引物， 上游引物为 5' GCTATGTACGTCGCCATCCA'

(SEQ ID N0:35), 下游引物为 5' GGACAGTGTGGCTGACACCAT ' (SEQ ID N0:36)。 用黄华 占水稻材料提取总 RNA并合成 cDNA模板。 采取实时定量 PCR方法， 分析 0sFL2基因在水稻 根、 茎、 叶、 外稃、 内稃、 颖片、 雌蕊和幼穗颖花原基分化期 （st _ag e6)、 幼穗花粉母细胞 减数分裂时期 （st _ag e7) 及四分体形成阶段 （st _ag e8)、 小孢子早期 （st _ag e9)、 小孢子中晚 期 （stagelO) 及成熟花粉期 （st _ag el2) 的表达谱， 其结果如图 8所示， 该基因在幼穗花粉 母细胞减数分裂时期 （st _ag e7)特异表达且表达量很高， 在花粉母细胞四分体形成阶段

(stageS) 表达量开始降低， 而在根、 茎、 叶、 种子及其它幼穗发育时期表达水平很低 。 实施例 7、 0sFL2基因的启动子表达载体构建及功能分析

0sFL2基因的启动子表达载体 （图 9) 的构建： 用引物 0sFL2-Pro- F (ggatccGGATTTCGAGGATCAAGCT, SEQ ID NO: 37)和 0sFL2- Pro- R

( gtcgacTTTCGCCGGGCAAATTCGC, SEQ ID NO: 38) 扩增水稻基因组得到 2520bp的 0sFL2基因 启动子片段 （SEQ ID N0:3) ， 将该片段用 Sail和 BamHI双酶切后连入启动子检测载体 pHPG中得到 p0sFL2-pro载体。 通过农杆菌介导的方法转化至野生型水稻愈伤 组织中， 并筛 选再生得到 12株转基因水稻植株。 通过分析 B-半乳糖苷酶的活性分析 0sFL2启动子的表达 模式， 在转基因的植株的根、 茎、 叶和花中通过 GUS染色分析， 发现 0sFL2启动子驱动 GUS 主要在水稻花粉中表达， 所述启动子的 GUS染色结果如图 10所示。 此外， 将启动子 SEQ ID NO :9连上 GUS进行功能验证发现， 其染色结果与 SEQ ID N0:3的结果一致， 均为花药特异 表达型的启动子。 实施例 8、 水稻雄性^ 突变体 osf 的转基因功會 补 互补载体的构建 （图 11 ) ： 用引物 0sFL2-Res-F (gtttaaacGGATTTCGAGGATCAAGCT， SEQ ID ：39)和03?12-1¾3-1^ ( ggatccACCCTGCATTTTTTATGCC, SEQ ID NO : 40) 扩增水稻基因组 获得含有 0sFL2起始密码子 ATG上游的 2500bp左右的碱基和终止密码子 TGA后的 497个碱 基的全长序列片段 （SEQ ID NO: 4) ， 将该片段用 Pmel和 BamHI双酶切后连入基因组互补 表达载体中得到 p0sFL2-Re _S 载体。 通过农杆菌介导的方法转化至黄华占 突变体的种 子诱导的愈伤组织中， 筛选再生得到转基因植株， 共获得 8株转基因阳性植株， 所有转基因 阳性植株均表现可育。 这些分析进一步证明基因 0sFL2参与花粉发育调控， 该基因突变导致 无花粉表型。 实施例 9、 0sFL2基因的 RNAi干扰的转基因株系的获得与表型分析

0sFL2基因的 RNAi干扰载体 （图 12) 的构建： 用引物 0sFL2_Fl _ag - F (GCGTCGCCGACAACCC， SEQ ID N0 : 41)和0sFL2-Flag-R (TGGAGAAGGCCCGCGAC, SEQ ID N0 : 42) 扩增水稻 cDNA得到 474bp的 0sFL2基因片段， 分别用带有 Kpnl和 BamHI酶切位点 的两对扩增引物扩增得到正反向的 0sFL2基因片段 1和 0sFL2基因片段 2， 酶切连入 pRNAi 载体中得到 p0sFL2-RNAi。 通过农杆菌介导的方法转化日本晴的愈伤组织 ， 筛选再生后共获 得 10棵转基因植株， 其中有 7株雄性育性出现明显下降。 采用实施例 6中根据 0sFL2和 Actin的 cDNA设计的引物对进行实时定量 PCR, 分析 0sFL2基因在割稻桩再生植株的幼穗花 粉母细胞减数分裂及四分体形成时期 （P7期）中的表达水平， 结果显示 RNAi干扰载体转基 因的不育植株中 0sFL2的 RNA表达水平明显下降 （图 13) 。 这些分析进一步证明基因

0sFL2参与花粉发育调控， 该基因突变导致无花粉表型。 实施例 10、 0sFL2突变体植株与恢复系的杂交分析

黄华占 0sFL2突变体植株能够被多个生产中常用的恢复� ��授粉， 产生可育种子。 部分组 合的杂交种子显示出明显的杂种优势， 说明该黄华占突变体在杂交育种中有一定的应 用价值， 可以作为不育系的候选材料加以培育。 黄华占 0sFL2突变体植株与多个恢复系杂交产生的 F2代不育植株， 仍表现出柱头高度外露 （外露率达 60-88%) ， 说明该突变体基因与柱头外 露性状连锁遗传。 柱头高度外露性状有利于异花授粉， 提高杂交种制种效率。 实施例 11、 0sFL2基因编码的蛋白与大麦、 髙粱、 玉米基因组中预测的同源蛋白的序列比 对 在 NCBI数据库中， 利用 protein blast工具， 对水稻 0sFL2基因编码的蛋白全序列在 蛋白数据库中进行查找， 得到了大麦、 高粱、 玉米、 谷子 (又称小米）、 二穗短柄草的基因组 中预测的同源蛋白， 将这些蛋白序列进行比对分析， 结果显示来自不同植物的同源蛋白都具 有非常相似的保守序列， 彼此之间同源性很高 （图 14)， 表明该蛋白在植物花的雄性器官发 育过程中生物学功能保守， 起着非常重要的作用。

其中， 在大麦中该育性基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0 : 10或 11所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 12所示； 在高粱中该育性基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 13或 14所示， 其氨 基酸序列如 SEQ ID NO : 15所示； 在玉米中该育性基因 ZmFL2的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 16 或 17所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 18所示； 在谷子中该育性基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO : 19所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO : 20所示； 在二穗短柄草中该育性基因的核苷酸 序列如 SEQ ID N0 : 21或 22所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0 : 23所示。 实施例 12、 0sFL2基因在新一代杂交育种技术中的应用

0sFL2基因可以用于新一代杂交育种技术， 该技术的核心思想是： 以水稻核隐性雄性不 育突变体为转化受体材料， 通过将紧密连锁的 3个目标基因转化至不育突变体中， 其中， 育 性恢复基因可使转化受体育性恢复， 花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活， 即失去授 精能力， 筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子 的分拣， 分拣出的非转基因种子即为 不育系， 而转基因种子用作保持系。 通过保持系给不育系授粉杂交， 可以在不育系上结实， 由此繁殖不育系。 而保持系通过自交可以源源不断地得以繁殖。 由于该技术利用生物技术生 产非转基因产品， 解决了水稻杂交制种过程中面临的瓶颈问题， 即三系法资源利用率低而两 系法中不育系育性不稳定的问题。

根据以上原理， 发明人采用水稻 0sFL2基因构建了表达载体 pZN3。 在构建水稻的植物 表达载体之前， 发明人首先分别对表达载体内的 Zm-PA、 0sFL2和 RFP三个表达盒单独进行 了水稻转化， 并进一步对各个表达盒的功能进行了验证。 结果表明各个表达盒单独转化水稻 时， 都能够工作良好， 达到预期的设计效果。

进一步，发明人通过装配下述 DNA元件， 构建了图 15所示的 pZN3载体：

1) 以 pCAMBIA2300载体为基础；

2) 基因表达盒 LTP2 : RFP{r) -PINI I , C rJ基因 （SEQ ID NO: 24 ) 的开放读码框连 接于 LTP2 启动子 （SEQ ID NO : 25 ) 和 PINI I 终止子 （SEQ ID NO : 26 ) 之间， 重组成 C W的基因表达盒 （LTP2: RFP(r) : PINI I ); 3) 基因表达盒， 目标基因 及其启动子和终止子的全长核苷酸序列如 SEQ ID NO: 4所示， 其中 Os/^ *基因的启动子序列如 SEQ ID NO: 3所示， 其终止子序列如 SEQ ID NO: 28所示， Os/^ 基因的基因组 DNA序列如 SEQ ID NO: 27所示， 其核苷酸序列编码 的蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示；

4) 基因表达盒 PG47 : ZM-BT1 : ZM-PA-. IN2-1 , 目标基因 (其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 29所示） 的开放读码框连接于启动子 PG47 (其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 30所示）、 转运肽 ZM-BT1 (其核苷酸序列如 SEQ ID NO: 31所示） 的下游， 终止子 IN2-1 (其核苷酸序 列如 SEQ ID NO: 32所示） 的上游。 水稻转化： 利用电激法将质粒 PZN3转入农杆菌 AglO菌株， 利用农杆菌介导法对含有纯 合的 0sFL2隐性不育位点的黄华占水稻进行遗传转化� �� 得到 26株单拷贝转基因植株材料。 具体的转化受体材料的获得是通过： 使突变体杂合植株结实产生的种子，通过 HRM ( high resolut ion melt ing ) 方法鉴定分离其中的含有纯合 as/72隐性不育位点的黄华占种子， 诱 导愈伤进行转化。

转基因水稻植株的花粉育性检测： 对上述所得到的 26株单拷贝转基因水稻 （含有纯合 的 0sFL2隐性不育位点） 植株进行分析发现， 转基因植株和非转基因对照植株之间没有明显 的形态差异， 但是花粉育性明显不同。 对 PZN3构建体转化水稻得到的转基因植株材料， 进 行花粉可染率检测， 同时对野生型水稻进行花粉可染率检测 （图 16)。 采用的方法为： 在水 稻开花期， 从转基因水稻植株、 及其野生型对照植株各随机抽取单株， 各株取一朵花， 每朵 花取 1 个花药， 置于载玻片中央， 滴加一滴 1%的 I2-KI溶液， 用镊子和解剖针释放花粉后， 盖上盖玻片， 在显微镜下观察、 计数可染色花粉数和花粉总数， 可以着色为深蓝色的为可育 花粉， 而不能够着色的为败育花粉 （图 16显示了染色后的可育花粉粒和不可育花粉粒� ��。 分 析转基因水稻植株的花粉可染率。 结果显示对照植株的可着色的花粉占 98%〜100%； 而多个 随机抽取的转基因植株中， 正常花粉 （可着色） 与败育花粉 （不能着色） 比例接近 1 : 1， 表 明所构建的保持系可以产生等量的携带外源基 因的花粉和不携带外源基因的花粉， 即构建体 PZN3使转基因株系花粉的 50%失活。 该结果表明本发明所提供的载体能够达到预期 的花粉失 活功能。

转基因水稻植株的荧光种子与非荧光种子分离 分析： 对上述实施例所得到的 26株单拷 贝转基因水稻植株 （含有纯合的 0sFL2隐性不育位点） 所结 T1代种子进行荧光分离比例调 查， 结果表明这些种子均显示 1 : 1分离比 （图 17)， 即携带外源基因的荧光种子和不携带外 源基因的非荧光种子表现为 1 : 1分离， 表明本发明所提供的载体各元件作为整体表达 良好， 可以实现创制和繁殖不育系的目的； 其中， 0sFL2 基因可以恢复雄性不育突变体受体的育性， Zm-PA基因和 RFP基因的表达可以分别实现预期的花粉失活功 能和种子筛选标记功能。