本発明者は、常法に従いマップベースクロ ーニング法により、イネの第4染色体におけ� �、CW型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝 子Rf17を含むゲノム領域(配列番号1)を特定す� �ことに成功し、更に、配列番号2に示される� ��伝子の発現を抑制又は減少することにより� ��CW型細胞質雄性不稔イネの稔性を回復する� �とに成功した。尚、配列番号2に示す塩基配� ��から成る遺伝子(ORF11)の機能は未知である。

尚、マップベースクローニング法は 単離� ��しようとする遺伝子の近傍に位置するDNAマ� ��カーを利用して、遺伝子が存在するゲノム� ��域を絞り込む方法であり、染色体歩行法と� ��呼ばれ、遺伝子の翻訳産物や機能が推定で� ��ない場合の遺伝子単離法の一つである。こ� ��手法は従来から一部の動植物における遺伝� ��単離に利用されてきたが、計画的に実験用� ��離集団を作出できる植物においてより有効� ��活用されている。本発明おけるマップベー� ��クローニングでは、日本晴型イネのゲノム� ��列(http://rgp.dna.affrc.go.jp/J/index.html)を利用し� �。

 本明細書の実施例に記載のように、本発� ��者は、配列番号2に示す塩基配列から成る遺 伝子の発現を抑制又は減少する方法として、 CW型細胞質雄性不稔性に対する稔性回復系統� ��第4染色体由来のゲノム断片であり、配列番 号1に示す塩基配列における少なくとも1611~483 5番目(最初の塩基を1番目とする)の塩基配列� �有する核酸を含むゲノム断片をCW型細胞質雄 性不稔性のイネに導入することを見出した。 このようなゲノム断片の例としては、配列番 号1に示す全塩基配列を挙げることが出来る� �

 更に、上記ゲノム断片の例として、配列� ��号1に示す塩基配列又はその一部からなる核 酸と相補的な塩基配列からなる核酸とストリ ンジェントな条件下でハイブリダイズする核 酸、及び、上記核酸と約80%以上、好ましくは 約95%以上である配列相同性を示す塩基配列か らなる核酸であって、CW型細胞質雄性不稔性� ��ネの稔性を回復させることのできるものも� ��まれる。

 ここで、ハイブリダイゼーションは、例� ��ば、Molecular cloninng third.ed.(Cold Spring Harbor� �Lab.Press,2001)に記載の方法等、当業界で公知� �方法あるいはそれに準じる方法に従って行� �ことができる。また、市販のライブラリー� �使用する場合、添付の使用説明書に記載の� �法に従って行うことができる。

 本明細書において、「ストリンジェント� ��条件下」とは、例えば、温度60℃~68℃にお� �て、ナトリウム濃度150~900mM、好ましくは600~9 00mM、pH6~8であるような条件を挙げることがで きる。

 従って、配列番号1で示される塩基配列又 はその一部からなる核酸と相補的な塩基配列 からなる核酸とハイブリダイズできる核酸と しては、例えば、該核酸の全塩基配列との相 同性の程度が、全体の平均で、約80%以上、好 ましくは約95%以上、より好ましくは99%以上で ある塩基配列を含有する核酸等を挙げること ができる。

尚、2つの塩基配列又はアミノ酸配列にお� �る配列相同性を決定するために、配列は比� �に最適な状態に前処理される。例えば、一� �の配列にギャップを入れることにより、他� �の配列とのアラインメントの最適化を行う� �その後、各部位におけるアミノ酸残基又は� �基が比較される。第一の配列におけるある� �位に、第二の配列の相当する部位と同じア� �ノ酸残基又は塩基が存在する場合、それら� �配列は、その部位において同一である。2つ� ��配列における配列相同性は、配列間での同� ��である部位数の全部位(全アミノ酸又は全塩 基)数に対する百分率で示される。

 上記の原理に従い、2つの塩基配列におけ る配列相同性は、例えば、Karlin及びAltschulの� ��ルゴリズム(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268、199 0及びProc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877、1993)により 決定される。このようなアルゴリズムを用い たBLASTプログラムやFASTAプログラムは、主に� �えられた配列に対し、高い配列相同性を示� �配列をデータベース中から検索するために� �いられる。これらは、例えば米国National Cent er for Biotechnology Informationのインターネット� ��のウェブサイトにおいて利用可能である。

 上記のような塩基配列の配列相同性を示� ��ような核酸は、上記のようにハイブリダイ� ��ーションを指標に得ることもでき、ゲノム� ��基配列解析等によって得られた機能未知のD NA群又は公共データベースの中から、本技術� ��野の研究者か通常用いている方法により、� ��えば、前述のBLASTソフトウェアを用いた検� �により発見することも容易である。さらに� �本発明遺伝子は種々の公知の変異導入方法� �よって得ることもできる。

CW型細胞質雄性不稔性のイネにおいて、配� ��番号2に示す塩基配列から成る遺伝子の発現 を抑制又は減少する方法としては、その他、 当業者に公知の任意の手段を使用することが 出来る。例えば、アンチセンスRNA法、及び、 本明細書の実施例に記載されているように、 RNA干渉法を用いて配列番号2の遺伝子発現を� �制することにより、CW型細胞質雄性不稔性の イネの稔性を回復させることが可能である。

 即ち、例えば、配列番号2に示す塩基配列 から成る遺伝子の発現を抑制又減少させるこ とができるようにRNA干渉を誘導し得る二重鎖 RNAを発現するよう適宜設計されたベクターを CW型細胞質雄性不稔性のイネに導入すること� ��RNA干渉を誘導することが出来る。このよう� ��ベクターとして、例えば、配列番号2に示す 塩基配列から成る遺伝子又はその3’非翻訳� �域における100~500個、好ましくは、150~200個の 連続した塩基対からなる塩基配列及びその相 補配列を含み、細胞内でRNA干渉を誘導し得る 二重鎖RNAを発現するベクターを挙げることが 出来る。その一例として、本明細書の実施例 に記載された、配列番号2に示す塩基配列に� �ける638~815番目(最初の塩基を1番目とする)の� ��続した178塩基長から成る塩基配列及びその� ��補配列を含み、細胞内でRNA干渉を誘導し得� ��二重鎖RNAを発現するベクターがある。

 上記ベクターは、当業者に公知の適当な� ��伝子工学的な手段を用いて、上記DNAをベク� ��ー内に連結することにより調製することが� ��きる。該ベクターには、宿主細胞中で本発� ��の遺伝子を発現することのできる適当なプ� ��モーター及びその他の各種制御配列(例えば 、エンハンサー配列、ターミネーター配列、 ポリアデニル化配列等を含むことが出来る。

 CW型細胞質雄性不稔性のイネにおいて配� �番号2に示す塩基配列から成る遺伝子の発現� ��抑制又は減少するために使用するゲノム領� ��又は上記ベクターは、当業者に公知の適当� ��方法、例えば、アグロバクテリウム法、凍� ��融解法及びエレクトロポレーション法等に� ��り、目的のイネに導入させることが出来る� ��

 その結果、CW型細胞質雄性不稔性のイネ� �おいて稔性が回復する。従って、かかる稔� �が回復したイネを用いて一代雑種品種を育� �し、F1種子を採種することが可能となる。

 本発明は更に、被検定イネにおける配列� ��号1に示す塩基配列の第1812番目の塩基にお� �るSNP(A/T)を同定することなら成る、CW型細胞� ��雄性不稔性に対する稔性回復遺伝子であるR f17遺伝子または該遺伝子を含むゲノム領域の 有無の識別する方法に係るものである。

 このようなSNPの同定は当業者に公知の任� ��の方法で行なうことができる。例えば、塩� ��配列決定法、SSCP(single strand conformation polym orphism)法、対立遺伝子特異的増幅法(Allele spec ific amplification: ASA)、プライマー伸長法(primer  extension)、タクマン法、侵入法、dot-blot-SNP法 、FRIP(Fluorogenic Ribonuclease Protection)法、及び� �TILLING(Targeting Induced Local Lesion in Genome)法� �を挙げることが出来る。

更に、本明細書の実施例に記載されている ようなCAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)法� ��ある。該方法は、SNPがある位置で制限酵素� ��識部位が出来るようにプライマーを設計し� ��ポリアクリルアミドゲルでPCR-RFLP分析する� �のである。この方法の利点は、安定な結果� �得られやすく、検査をする人やサンプルの� �態、DNA抽出方法などによって結果が左右さ� �にくいことである。更に、手法も比較的簡� �でDNAシーケンサ等の高価な解析装置や技術� �必要としない。

 以上の各SNP同定法に使用する、プライマ� ��、マーカーまたはプローブ等は、各測定原� ��に応じて、上記データベース及び本明細書� ��開示された配列番号1又は2で表されるDNA配� �情報に基づき当業者が容易に設計し調製す� �ことが出来る。例えば、CAPS法におけるPCRで� ��用するプライマーの長さは、通常、数十bp� �度、例えば、10~30bpの長さを有する。

例えば、プライマー、マーカーまたはプロ ーブ等として使用する各種のオリゴヌクレオ チド(オリゴDNA)は、当業者に公知の方法、例� ��ば、Carruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant.� �Biol. 47:411-418; Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:66 1; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenke l(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers(1994 )Biochemistry 33:7886-7896; Narang(1979)Meth. Enzymol. 6 8:90; Brown(1979)Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage(1981)Te tra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号)に記載 されているような周知の化学合成技術により 、in vitroにおいて合成することもできる。又 、検出のために、当業者に公知の任意の標識 物質を結合させることが出来る。

尚、被検定イネとしては、例えば、イネの 任意の一部(例えば、種子、葉及び茎等)を挙� ��ることが出来る。これら試料からのDNAの抽� ��及び調製は、当業者に公知の方法で行うこ� ��ができる。試料から調製されるDNAの種類に� ��に制限はないが、ゲノムDNA及びcDNA等を挙げ ることが出来る。これらはその性質、並びに 、試料の種類・性質等に応じた当業者に公知 の適当な方法で抽出・精製することが出来る 。例えば、ゲノムDNAの場合には、CTAB法、ボ� �ル法、及び必要に応じて、アミラーゼ又は� �ロテアーゼなど処理を伴う酵素法を使用す� �こともできる。

更に、被検定イネから抽出したDNAの量が検 出に十分であれば、特に増幅することなく、 以後の操作に供することが出来る。通常は、 PCR(Polymerase Chain Reaction)法又はRT-PCR法、並び� ��、その他のICAN(Isothermal and chimeric primer-init iated amplification of nucleic acids)法、NASABA(Nuclei c acid sequence based amplification)法、TMA(Transcript ion-mediated amplification)法およびSDA(Strand Displace ment Amplification)法等の当業者に公知の任意の� ��伝子増幅法により適当な量に増幅した後に� ��SNP同定を実施することもできる。

本発明は、更に、Rf17遺伝子の有無の識別� �法に使用するキットに係る。SNP分析の種類� �に応じて、該キットは各SNP同定法に使用す� �、プライマー、マーカーまたはプローブ等� �含む。更に、DNA増幅用の各種プライマーセ� �ト及び/又はマーカー、制限酵素、その他、� ��業者に公知の他の要素又は成分、例えば、� ��種試薬、酵素、緩衝液、並びに反応プレー� ��(容器)等の中からその構成・目的等に応じ� �、適宜、必要なものを含むことが出来る。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明 するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例 の記載によって何ら限定して解釈されるもの ではない。なお、本明細書において使用され る用語は特に言及しない場合には、当該技術 分野において通常使用される意味で用いられ ている。

又、特に記載のない場合には、各操作は、 例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory P ress, New York, 1989; Molecular cloning third.ed.(Cold  Spring Harbor Lab.Press,2001); Ausubel, F. M. et al ., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley  & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されて� ��る、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及� ��分子生物学的技術に従い実施することが出� ��る。又、本明細書中に引用された文献の記� ��内容は本明細書の開示内容の一部を構成す� ��ものである。