Gel de fibrina y método de obtención del mismo

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece al campo de la biotecnología y se refiere a un método de obtención de un gel de fibrina y factores de crecimiento y al gel obtenido mediante dicho método.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los geles fibrina son un tipo de "pegamento" o sellador quirúrgico. Los ingredientes de estos senadores interactúan durante la aplicación para formar un coágulo estable compuesto por una proteína de la sangre llamada fibrina.

Los geles de fibrina se utilizan actualmente durante la cirugía para varios propósitos diferentes: para controlar el sangrado en el área donde el cirujano está operando, para acelerar la cicatrización de heridas, para sellar órganos huecos del cuerpo o cubrir orificios hechos con suturas estándar, para proporcionar liberación lenta de medicamentos a los tejidos expuestos durante la cirugía.

Los geles de fibrina generalmente constan de dos componentes derivados del plasma humano: (a) un complejo de fibrinógeno (FC) altamente concentrado compuesto principalmente de fibrinógeno y fibronectina junto con cantidades catalíticas de factor XIII y plasminógeno y (b) una trombina de alta potencia.

Por la acción de la trombina, el fibrinógeno (soluble) se convierte primero en monómeros de fibrina que se agregan espontáneamente y forman el denominado coágulo de fibrina. Simultáneamente, el factor XIII (FXIII) presente en la solución es activado por la trombina en presencia de iones de calcio al factor Xllla. Los monómeros de fibrina agregados y cualquier fibronectina restante posiblemente presente se entrecruzan para formar un alto polímero mediante la formación de nuevos enlaces peptídicos. Mediante esta reacción de reticulación, la fuerza del coágulo formado aumenta sustancialmente. Generalmente, el coágulo se adhiere bien a las superficies de heridas y tejidos, lo que conduce al efecto adhesivo y hemostático (Patente de EE.UU. 7.241.603). Por lo tanto, los geles de fibrina se usan frecuentemente como adhesivos de dos componentes que comprenden un componente de complejo de fibrinógeno (FC) junto con un componente de trombina que contiene además iones de calcio.

Una ventaja particular de un gel de fibrina es que el adhesivo/gel no permanece en su sitio de aplicación como un cuerpo extraño, sino que se reabsorbe completamente como en la cicatrización natural de heridas y se reemplaza por tejido recién formado. Vahas células, por ejemplo, macrófagos y, posteriormente, fibroblastos migran al gel, lisan y reabsorben el material del gel y forman tejido nuevo. Se han usado senadores de fibrina para formar geles de fibrina in situ, y estos geles de fibrina se han usado para administrar células y factores de crecimiento (Cox et al., Tissue Eng 10:942-954, 2004; Wong et al., Thromb Haemost 89 :573-582, 2003).

No obstante, cuando estos geles se utilizan como senadores o agentes terapéuticos y se realiza la polimerización de los mismos in situ mediante la mezcla de sus componentes principales, fibrinógeno y trombina, el gel resultante no conserva todas las propiedades de los coágulos que se forman de manera natural, ya que, en la mayoría de los casos no son completamente de origen natural y eso puede llevar a desencadenar procesos de rechazo o de bioseguhdad por posibles contaminaciones. Además, cuando, además del efecto hemostático se busca favorecer procesos de regeneración o cicatrización mediante la incorporación a dichos geles de factores de crecimiento, estos, se encuentran restringidos a factores aislados pero no se dispone de geles que conserven la amplia variedad de factores de crecimiento y citoquinas que presentan los coágulos formados endógenamente por el propio organismo.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de desarrollar metodologías mejoradas para la formación de geles de fibrina que conserven todas las propiedades en cuanto a composición y actividad regeneradora de los coágulos naturales y que puedan ser utilizados de manera controlada y localizada en el tratamiento de lesiones o patologías que requieran de las propiedades regeneradoras y cicatrizantes de dichos coágulos.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En el presente documento se muestra el desarrollo de una nueva metodología para la producción de un gel de fibrina completamente natural que se obtiene a partir de la sangre de un paciente. Esto permite un alto nivel de bioseguridad y aprovecha las propiedades biológicas de las biomoléculas presentes en el plasma.

Como se muestra en los ejemplos de la solicitud, los autores de la presente invención han demostrado que el gel de fibrina que se obtiene mediante la metodología propuesta da como resultado un gel que no sufre retracción a lo largo del tiempo y que presenta una mayor fuerza de adhesión en comparación con un coágulo de fibrina convencional. A este respecto, los autores de la invención proponen una metodología en la que el gel se obtendría mediante la mezcla de un concentrado de fibrinógeno y una solución de trombina y factores de crecimiento aislados ambos a partir de la sangre de un sujeto. Además, los inventores han demostrado que mediante la eliminación de una concentración excesiva de plaquetas del concentrado de fibrinógeno se evita la formación de coágulos en dicho concentrado de fibrinógeno, coágulos que dificultan la formación del producto final y que dan lugar a generación de un gel heterogéneo. Por otra parte, la formación de coágulos debido a la presencia de plaquetas parece afectar a la capacidad de adhesión tal y como sugieren los datos de fuerza de adhesión, la cual es significativamente mayor en el gel sin plaquetas.

La polimerización del gel se produce en los dos primeros minutos desde que se mezclan los componentes, teniendo un gel fácilmente aplicable que se adhiere al tejido y se mantiene de forma consistente.

Así, en un primer aspecto la invención se refiere a un método “in vitro" para producir un gel de fibrina que comprende los siguientes pasos: a) obtener un plasma pobre en plaquetas (PPP) a partir de una muestra de sangre anticoagulada de un sujeto, b) procesar el PPP para obtener una primera composición que comprende un concentrado de fibrinógeno, c) obtener un plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de una muestra de sangre anticoagulada de un sujeto, d) activar las plaquetas del PRP obtenido en c), e) aislar el suero obtenido tras la activación de las plaquetas para obtener una segunda composición que comprende trombina y factores de crecimiento y se encuentra libre de plaquetas, f) mezclar la primera y la segunda composición, preferiblemente a una temperatura de entre 30°C y 44°C.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un gel de fibrina obtenido mediante el método del primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la invención se refiere al gel de fibrina del segundo aspecto de la invención para su uso en medicina.

En otro aspecto, la invención se refiere al gel de fibrina del segundo aspecto de la invención para su uso en el tratamiento de lesiones osteocondrales, lesiones meniscales o úlceras, en particular úlceras vasculares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Capacidad de “no-retracción” de la nueva formulación en comparación con formulaciones convencionales a nivel macroscópico (A) y microscópico (B).

Figura 2. Capacidad de adherencia de la nueva formulación en tejido real (cartílago).

Figura 3. Ensayo de viabilidad celular con calceína/etidio para marcar las células vivas (izda) y las células muertas (deha).

Figura 4. Porcentaje de coagulación de la nueva formulación según la temperatura.

Figura 5. Influencia de la eliminación de las plaquetas en la nueva formulación a nivel macroscópico y homogeneidad del concentrado de fibrinógeno y el coágulo final.

Figura 6.lnfluencia de la eliminación de las plaquetas en la nueva formulación en la fuerza de adherencia.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Todos los términos, como se usan en la presente solicitud, salvo que se indique de otra forma, se entenderán en su significado común, tal como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para ciertos términos como se usan en la presente solicitud se definirán más adelante en este apartado y pretenden aplicarse uniformemente a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, a menos que una definición expuesta expresamente de otra manera proporcione una definición más amplia.

Método de la invención

En un primer aspecto la invención se refiere a un método “in vitro" para producir un gel de fibrina que comprende los siguientes pasos: a) obtener un plasma pobre en plaquetas (PPP) a partir de una muestra de sangre anticoagulada de un sujeto, b) procesar el PPP para obtener una primera composición que comprende un concentrado de fibrinógeno, c) obtener un plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de una muestra de sangre anticoagulada de un sujeto, d) activar las plaquetas del PRP obtenido en c), e) aislar el suero obtenido tras la activación de las plaquetas para obtener una segunda composición que comprende trombina y factores de crecimiento y se encuentra libre de plaquetas, f) mezclar la primera y la segunda composición.

En una realización preferida, el método, en el paso f), comprende mezclar la primera y la segunda composición a una temperatura de entre 30°C y 44°C, por ejemplo a aproximadamente 37°C.

El término “in vitro", como se usa aquí, se refiere a que el método no se lleva a cabo en el cuerpo de un sujeto humano o animal, sino en células o fluidos aislados de dicho sujeto o en un tubo de ensayo.

El término "fibrina", como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína fibrilar con la capacidad de formar redes tridimensionales. Esta proteína desempeña un papel importante en el proceso de coagulación en vista de sus propiedades. Tiene la estructura de un polo con tres áreas globulares. Tiene la capacidad de crear agregados con otras moléculas que forman un coágulo blando. No se encuentra normalmente en la sangre, se forma a partir del fibrinógeno circulante, que, mediante la acción de la enzima denominada trombina, se convierte en fibrina, que tiene efectos coagulantes. El "gel de fibrina", también conocido como “matriz de fibrina”, "pegamento de fibrina", "adhesivo tisular de fibrina", “sellador de fibrina” o “scaffold de fibrina” se refiere a un agente hemostático en forma de gel semisólido (composición semisólida) derivado de las proteínas de coagulación del plasma.

El gel de fibrina es un agente hemostático quirúrgico derivado de las proteínas de coagulación del plasma. Los senadores de fibrina se usan ampliamente para controlar el sangrado en una variedad de entornos quirúrgicos, y su uso ha aumentado debido al advenimiento de los procedimientos quirúrgicos mínimamente invasivos que requieren una hemostasia meticulosa para una visualization adecuada del campo quirúrgico. Los senadores de fibrina se pueden usar para la hemostasia, el cierre de heridas y el sellado de tejidos y se han recomendado como los agentes que más se acercan al sellador operativo ideal. A diferencia de los adhesivos sintéticos, los senadores de fibrina tienen la ventaja de ser biocompatibles y biodegradables, y no están asociados con inflamación, reacciones a cuerpos extraños, necrosis tisular o fibrosis extensa. La reabsorción del coágulo de fibrina se logra durante la cicatrización normal de la herida entre días y semanas después de la aplicación, según el tipo de cirugía, la actividad proteolítica del sitio tratado y la cantidad de sellador utilizado.

Los senadores de fibrina normalmente se derivan de proteínas plasmáticas y contienen dos componentes principales: fibrinógeno y trombina. Cuando se mezclan fibrinógeno y trombina, el componente de fibrinógeno se convierte en monómeros de fibrina. La polimerización de los monómeros de fibrina da como resultado la formación de un coágulo de fibrina semirrígido que es capaz de interactuar de forma covalente y no covalente con las estructuras tisulares. El coágulo puede estabilizarse aún más mediante el entrecruzamiento de las cadenas alfa y gamma de fibrina en una reacción catalizada por el factor XIII activado. Este entrecruzamiento estimula la adherencia de los fibroblastos y promueve su crecimiento normal en el coágulo. Al imitar las últimas etapas del sistema de coagulación fisiológica, estos procesos permiten que los senadores de fibrina detengan la pérdida de sangre y ayuden al proceso de cicatrización de heridas.

El término “fibrinógeno”, conocido también como “factor I de la coagulación” se refiere en el presente documento a una glicoproteína fibrosa y adhesiva que se encuentra en el plasma sanguíneo en una cantidad aproximada de 200 a 400 mg/dL y que tiene un importante papel en todas las fases de la hemostasia. El fibrinógeno está constituido por tres pares de cadenas: dos Aa, dos Bp y dos y, que se enrollan formando una hélice alfa. La estructura terciana del fibrinógeno está representada por tres dominios: un nodulo central o dominio E, constituido por los extremos N-terminales de las cadenas y dos nodulos laterales o dominios D, formados por los extremos C-terminales. Los fibrinopéptidos A y B ubicados en el dominio central E son ricos en residuos de ácido glutámico y ácido aspártico que le confieren una alta densidad de cargas negativas inducen la repulsión entre moléculas de fibrinógeno adyacentes. La formación de fibrina estable depende de la habilidad de la trombina para escindir los enlaces Arg16-Gly17 y Arg14-Gly15, en los extremos N-terminales de las cadenas Aa y B del fibrinógeno y liberar los fibrinopéptidos A y B, respectivamente. Esto causa la pérdida de las cargas negativas presentes en los dominios E y favorece la formación de los monómeros de fibrina que se asocian entre sí por uniones electrostáticas débiles, para formar los polímeros de fibrina, que se estabilizan por el FXIII activado.

El término "sangre", como se usa en el presente documento, se refiere a un fluido tisular que fluye a través de los capilares, venas y arterias de todos los vertebrados. Su característico color rojo se debe a la presencia del contenido de pigmento rojo de los eritrocitos. Es un tipo especializado de tejido conjuntivo con una matriz coloidal líquida y constitución compleja. De hecho, la sangre comprende una fase sólida formada por células (incluyendo leucocitos, eritrocitos y plaquetas) y una fase líquida, representada por el plasma. Su función principal es la distribución logística y la integración sistémica, cuya contención en los vasos (espacio vascular) apoya su distribución (circulación sanguínea) en la mayor parte del organismo.

El término "eritrocitos" o "glóbulos rojos", en el sentido usado en la presente descripción, se refiere a los corpúsculos sanguíneos que transportarán el oxígeno y el dióxido de carbono en la sangre. Se sabe que los corpúsculos carecen de núcleos y orgánulos (solo en mamíferos), por lo que no pueden considerarse estrictamente células. Contienen algunas vías enzimáticas, y su citoplasma está ocupado casi por completo por la hemoglobina, una proteína responsable del transporte de oxígeno. En la membrana plasmática de los eritrocitos se encuentran las glicoproteínas (CD) que definen los diferentes grupos sanguíneos y otros identificadores celulares. Los eritrocitos tienen forma de disco, son bicóncavos, deprimidos en el centro; esto aumenta el área de superficie eficaz de la membrana. Los eritrocitos maduros carecen de núcleo, porque se desaloja en la última etapa de la maduración en la médula ósea antes de introducirse en el torrente sanguíneo.

El término “anticoagulada” se utiliza en el presente documento para referirse a sangre que ha sido tratada con un anticoagulante. Por su parte, el término "anticoagulante", en el sentido usado en la presente descripción, se refiere a una sustancia endógena o exógena que interfiere con o inhibe la coagulación de la sangre. Los ejemplos no limitantes de anticoagulantes son los activadores de antitrombina III y la heparina, ardeparina de bajo peso molecular, certoparina, nadroparina, logiparina, parnaparina, reviparina y tedelparina, y antitrombina recombinante III, inhibidor del factor tisular (TF)- Factor Vila, como los mutantes TF, anticuerpos anti-TF, inhibidores del factor Vil, inhibidores de la trombina tales como inhibidores del factor Xa antiestatina, TAP (péptido anticoagulante de garrapatas), DX9065, lefaxina, fondaparinux, terostatina, YM-75466 y ZK-807,834, anticuerpos contra el factor IXa y Xa, activadores de la vía de la proteína C e inhibidores selectivos de la trombina como argatrobán, bivalirudina, efegatrán, H376/95, hirugeno, inogatrán, melagatrán, napsagatrán, UK-156406 y ximelagatrán, y compuestos químicos que capturan los iones de calcio, tales como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), citrato (en general, citrato de sodio) y oxalato.

En una realización particular, el anticoagulante es citrato de sodio.

En una realización particular, el anticoagulante, preferiblemente el citrato de sodio, está comprendido en una solución, preferiblemente acuosa. En una realización particular, el citrato de sodio, está comprendido en una solución, preferiblemente acuosa, que comprende ácido cítrico.

En otra realización, el anticoagulante, preferiblemente el citrato de sodio, está presente en una concentración de entre 1% y 10%, de entre 2% y 8%, de entre 2% y 6%, de entre 3% y 5%, de entre 3% y 4%, más específicamente a una concentración de 3,8 % (w/v), w/v refiriéndose al peso de anticoagulante con respecto al volumen de la solución.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier animal con circulación sanguínea, preferentemente un mamífero, más preferentemente un primate, y aún más preferentemente, un ser humano, varón o mujer, de cualquier edad o raza. El término "plasma" o la expresión "plasma sanguíneo", en la presente invención, se refiere a la porción fluida no celular de la sangre de humanos o animales que se encuentra antes de la coagulación. Se compone de agua al 90 %, proteína al 7 % y el 3 % restante de grasa, glucosa, vitaminas, hormonas, oxígeno, dióxido de carbono y nitrógeno, además de productos de desecho metabólicos como el ácido úrico. Es el componente principal de la sangre, que representa aproximadamente el 55 % del volumen total de sangre, mientras que el 45 % restante corresponde a los elementos formados. La viscosidad del plasma sanguíneo es 1 ,5 veces la del agua. Las principales proteínas plasmáticas son las siguientes: albúmina, que también participa en el transporte de lípidos; globulinas, que están relacionadas principalmente con los mecanismos de defensa del organismo (por ejemplo, inmunoglobulinas) o con el transporte del hierro (transferrina); fibrinógeno, una proteína que es esencial para la coagulación de la sangre; protrombina, proteína que participa en el proceso de coagulación; y las lipoproteínas de baja y alta densidad (LDL y HDL, respectivamente) que participan en el transporte del colesterol. El conjunto de proteínas plasmáticas, también denominadas "factores plasmáticos", realiza las funciones, entre otras, de:

- mantener el volumen plasmático y el volumen sanguíneo,

- proteger y mantener la estabilidad del pH de la sangre,

- participar en la viscosidad de la sangre, y por lo tanto, contribuir mínimamente a la resistencia vascular periférica y la presión vascular (presión arterial), e

- intervenir en la concentración de iones de equilibrio electroquímico (denominado efecto Donnan).

La primera composición del método de la invención se obtiene a partir de un plasma sanguíneo pobre en plaquetas (PPP). La expresión "plasma pobre en plaquetas" o "PPP", en la presente invención, se refiere a una fracción de plasma, esto es, la porción fluida no celular de la sangre de humanos o animales que se encuentra antes de la coagulación, que queda tras la obtención y la separación de un concentrado de plaquetas o "cPLT" a partir de una muestra de sangre. El plasma contendría proteínas, electrolitos, anticuerpos, antígenos, hormonas, factores de crecimiento y fibrinógeno. El PPP puede tener niveles elevados de fibrinógeno, que tiene la capacidad de formar un coágulo rico en fibrina una vez activado.

En una realización particular, el PPP a partir del cual se obtiene la primera composición del método de la invención que comprende el concentrado de fibrinógeno contiene una concentración plaquetaria de entre 1x10 ² y 1x10 ⁵ , de entre 1x10 ³ y 1x10 ⁵ , de manera más particular de entre 1x10 ⁴ y 1x10 ⁵ plaquetas/pL. En otra realización particular la concentración plaquetaria es inferior a 1 x 10 ⁵ plaquetas/pL. En otra realización particular, la concentración plaquetaria es inferior a 1x10 ⁴ plaquetas/pL.

El término "plaquetas", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades de células pequeñas (2-3 micrometres de diámetro), ovaladas y sin núcleo generadas en condiciones normales en la médula ósea a partir de la fragmentación citoplasmática de los megacañocitos. Las plaquetas circulan en la sangre de todos los mamíferos y participan en la hemostasia, participando en la formación de los coágulos de sangre. Las plaquetas liberan un gran número de factores de crecimiento y/o citoquinas, incluyendo el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF, también abreviado como PDGFAA), un potente agente quimiotáctico y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-pi ), que estimula la formación de la matriz extracelular. Dependiendo de ciertas condiciones, las plaquetas también sintetizan muchas otras moléculas, tal como se ha comentado anteriormente, esenciales del proceso inflamatorio, y del proceso reparador y regenerativo de los tejidos. Estos factores de crecimiento o moléculas han demostrado desempeñar un papel importante en la regeneración y reparación del tejido conjuntivo. Otras proteínas y factores de crecimiento producidos por plaquetas y procesos inflamatorios asociados, Reparadores y regenerativos incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos básico (BFGF), el factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1), el factor de crecimiento de tipo insulina 2 (IGF- 2), el factor de crecimiento epitelial (EGF), el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), la interleucina 8, el factor de crecimiento de queratinocitos, el factor de crecimiento del tejido conjuntivo. La aplicación local de todos estos factores de crecimiento, moléculas y proteínas producidos por las plaquetas participa en y acelera el proceso de curación de diferentes lesiones. Las plaquetas también liberan grandes cantidades de trombina y adenosina difosfato ADP, calcio, tromboxano A2, PF4, PAI-1 , fibrinógeno, fibronectina, trombomodulina, FV, FXIII, RANTES, trombospondina, VWVF PF-3, serotonina, enzimas hidrolíticas, etc.

En una realización el plasma sanguíneo (PPP) se obtiene mediante centrifugación de la muestra de sangre anti coagulada a una velocidad de al menos 1300 g, preferiblemente de al menos 1500 g, en particular a una velocidad de entre 1300 y 2500 g, de entre 1300 y 2200 g, de entre 1300 y 2000 g, de entre 1300 y 1800 g, de entre 1400 y 1600 g. En una realización, el plasma sanguíneo (PPP) se obtiene mediante centrifugación de la muestra de sangre anti coagulada durante al menos: 10 minutos, 11 minutos, 12 minutos, 13 minutos, 14 minutos, 15 minutos, 16 minutos, 17 minutos, 18 minutos, 19 minutos o 20 minutos, preferiblemente al menos 15 minutos; en particular hasta: 45 minutos, 40 minutos, 35 minutos, 30 minutos o 25 minutos. En otra realización, estas velocidades y tiempos se combinan. Un experto en la materia sabrá combinar y vahar las condiciones de velocidad de centrifugación y tiempo de centrifugación modificándolas de manera compensatoria, esto es aumentando la fuerza de centrifugación y disminuyendo el tiempo de centrifugación o de manera alternativa disminuyendo la velocidad de centrifugación y aumentando el tiempo para obtener el PPP.

En una realización más particular el PPP se obtiene mediante centrifugación de la muestra de sangre anticoagulada a una velocidad de al menos 1300 g durante al menos 10 minutos. En otra realización particular, el PPP se obtiene mediante la centrifugación de sangre anticoagulada a una velocidad de al menos 1500 g durante al menos 15 minutos. Los límites superiores de estos valores pueden ser los indicados arriba.

Tras la obtención del PPP, por ejemplo tras separarlo de los demás componentes sanguíneos por centrifugación como se indicó anteriormente, este se recoge mediante métodos comunes para el experto en la materia.

En el contexto de la presente invención, el concentrado de fibhnógeno se puede aislar a partir del PPP mediante diferentes metodologías de precipitación de proteínas y posterior solución de las mismas conocidas en el estado de la técnica.

La precipitación de las proteínas del PPP se pude realizar, por ejemplo mediante precipitación salina o mediante precipitación alcohólica.

En una realización particular la precipitación se realiza mediante precipitación salina. Dicha precipitación consiste en agregar iones salinos a la solución para provocar la restricción de las moléculas de agua disponibles para las proteínas, lo que conduce a la destrucción de los enlaces de hidrógeno. La interacción entre las proteínas es más fuerte que entre la proteína y las moléculas de agua disponibles, lo que provoca la agregación y precipitación de la proteína. Algunos ejemplos de sales utilizadas son el sulfato de zinc y el sulfato de amonio.

En otra realización, preferida, la precipitación se realiza mediante el empleo de una solución alcohólica. La adición de alcohol a la solución reduce la hidratación de las proteínas, al eliminar el agua y las proteínas circundantes, lo que conduce a la agregación y precipitación. Ejemplos de alcoholes para la precipitación de proteínas incluyen, sin limitación, un alcanol, tal como el etanol, metanol e isopropanol, preferiblemente el etanol. La solución alcohólica se añade preferiblemente en un volumen de entre 5% y 15%, más preferiblemente en un volumen de aproximadamente 10%, con respecto al volumen del PPP. En una realización, la solución alcohólica comprende al menos 70%, preferiblemente al menos 90%, tal como 96%, en volumen de alcohol con respecto al volumen total de la solución.

En una realización particular, el concentrado de fibrinógeno se obtiene a partir del PPP mediante precipitación alcohólica y posterior disolución del precipitado obtenido. En una realización más particular el concentrado de fibrinógeno se obtiene a partir del PPP mediante precipitación con una solución etanólica y posterior disolución del precipitado obtenido.

Opcionalmente, la mezcla se enfría durante la precipitación, preferiblemente a una temperatura de entre 2°C y 8°C, más preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 4°C. En una realización, se mantiene esta temperatura durante al menos: 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 25 minutos, 30 minutos, preferiblemente al menos 30 minutos, en una realización hasta: 120 minutos, 90 minutos o 60 minutos.

Posteriormente se aíslan las proteínas de la mezcla precipitada, opcionalmente enfriada, por ejemplo, la mezcla precipitada, opcionalmente enfriada, puede someterse a una centrifugación adicional. En una realización particular, la centrifugación adicional se realiza a una velocidad de al menos 300 g, tal como entre 300 g y 900 g, por ejemplo a 580 g. En una realización particular, la centrifugación adicional se realiza durante al menos 5 minutos, tal como entre 5 y 20 minutos, o entre 6 y 10 minutos, por ejemplo durante 8 minutos. En una realización particular, estas velocidades y tiempos se combinan. Tras la centrifugación adicional, se decanta el sobrenadante y se preserva el precipitado formado (normalmente en forma de pellet). Finalmente, el precipitado aislado se disuelve mediante calentamiento y/o por adición de una solución ¡sotónica, preferiblemente mediante calentamiento. Preferiblemente, el calentamiento se realiza a una temperatura de al menos 30°C, tal como de entre 30°C y 44°C, preferiblemente de entre 34°C y 40°C, por ejemplo a aproximadamente 37°C.

En otra realización, la disolución se realiza por calentamiento a la temperatura del posterior mezclado de la primera composición con la segunda composición, esto es, a la temperatura de la etapa f) del primer aspecto de la invención.

En una realización preferida, se mantiene la temperatura de la solución resultante, primera composición del método de la invención, a la temperatura de calentamiento hasta su mezcla con la segunda composición del método de la invención.

En una realización particular, la primera composición que comprende el concentrado de fibrinógeno se obtiene del plasma sanguíneo (PPP) mediante un procedimiento que comprende los siguientes pasos: a) precipitar las proteínas del plasma, en particular como se indicó anteriormente; b) opcionalmente enfriar durante la precipitación de la etapa a), en particular como se indicó anteriormente; c) aislar el precipitado obtenido en a) o b), en particular como se indicó anteriormente; y d) disolver dicho precipitado, en particular como se indicó anteriormente.

En una realización más particular, el procedimiento de obtención de un concentrado de fibrinógeno a partir de PPP comprende los siguientes pasos: a) adición de una solución alcohólica, preferiblemente etanólica, al plasma, preferiblemente en un volumen de entre 5% y 15%, más preferiblemente en un volumen de aproximadamente 10%, con respecto al volumen de dicho plasma; b) enfriamiento de la mezcla obtenida en a) a una temperatura de entre 2°C y 8°C, por ejemplo a una temperatura de aproximadamente 4°C; c) aislar el precipitado obtenido en b) mediante centrifugación a una velocidad de al menos 580 g durante al menos 8 minutos; d) disolución del precipitado aislado por calentamiento, preferiblemente a una temperatura de entre 30°C y 44°C, por ejemplo a aproximadamente 37°C. En un caso particular de la realización anterior, la etapa d) de disolución del precipitado, la disolución se realiza por calentamiento a una temperatura de entre 34°C a 40°C; en otro caso particular, en dicha etapa d) de disolución del precipitado, la disolución se realiza por calentamiento a la temperatura del posterior mezclado de la primera composición con la segunda composición.

En una realización particular, la concentración de fibrinógeno en la primera composición de la invención es de entre unas 6 y 9 veces superior a la concentración del fibrinógeno en el plasma sanguíneo. En una realización particular, la concentración de fibrinógeno en la primera composición de la invención es de entre 8 y 80 mg/ml, más concretamente de entre 10 y 70 mg/ml, de entre 12 y 60 mg/ml, de entre 12 y 50 mg/ml, de entre 12 y 40 mg/ml, preferiblemente de entre 12 y 36 mg/ml.

En otra realización particular, la concentración plaquetaria de la primera composición de la invención es inferior a: 1 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 2 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 3 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 4 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 5 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 6 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 7 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 8 x 10 ⁵ plaquetas/pl y 9 x 10 ⁵ plaquetas/pl, más preferiblemente inferior a 3,5 x10 ⁵ plaquetas/pl.

La segunda composición del método de la invención se obtiene a partir de un plasma rico en plaquetas. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "plasma rico en plaquetas" o “PRP” se entiende que se refiere a cualquier preparación de plasma que presenta una densidad más alta, más preferentemente dos veces la densidad, y todavía más preferentemente cuatro veces la densidad, de plaquetas que la muestra de sangre a partir de la que se ha derivado el plasma. En una realización, el plasma rico en plaquetas se caracteriza por una concentración de plaquetas superior, por ejemplo dos, tres o cuatro veces superior, a la observada en la muestra de sangre a partir de la que se ha derivado el plasma, que es de entre 150.000 y 350.000 plaquetas por microlitro de sangre (pl/pl) . Así, en una realización particular el nivel de plaquetas del PRP es de entre 300.000 y 700.000 pl/pl, de entre 400.000 y 900.000 pl/pl, de entre 600.000 y 1.200.000 pl/pl.

El plasma rico en plaquetas es plasma que contiene plaquetas concentradas y puede prepararse a partir de sangre completa, utilizando una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Por ejemplo, el plasma rico en plaquetas que resulta útil en la práctica de la invención puede prepararse sometiendo sangre completa a centrifugación para separar el plasma rico en plaquetas de los glóbulos rojos. La fracción de plasma rico en plaquetas seguidamente se somete a una segunda ronda de centrifugación para producir un pellet de plaquetas y un sobrenadante de plasma pobre en plaquetas. Una mayor parte del plasma pobre en plaquetas puede eliminarse, dejando plaquetas concentradas y una pequeña proporción de plasma pobre en plaquetas.

En una realización particular la preparación de PRP es un método que comprende:

I) tratar una muestra de sangre de un sujeto con anticoagulante, en donde el significado de anticoagulante es el mismo que se proporcionó anteriormente;

II) centrifugar la muestra; y

III) obtener el sobrenadante, siendo el sobrenadante el PRP.

En una realización, la centrifugación de la muestra de sangre anti coagulada se realiza a una velocidad de al menos 150 g, de al menos 300 g, de al menos 350 g, de al menos 400 g, de al menos 450 g, de al menos 500 g, de al menos 550 g, de al menos 600 g, de al menos 650 g, de al menos 700 g, de al menos 750 g, de al menos 800 g, de al menos 850 g, de al menos 900 g, de al menos 950 g, o de al menos 1000 g, y preferiblemente de al menos 580 g, y preferiblemente a una velocidad de hasta: 1100 g, 1400 g, 1500 g, 1600 g, 1700g, 1800g, 1900 g o 2000g. En una realización, la centrifugación de la muestra de sangre anti coagulada se realiza durante al menos 2 minutos, al menos 3 minutos, al menos 4 minutos, al menos 5 minutos, al menos 6 minutos, al menos 7 minutos, al menos 8 minutos, al menos 9 minutos, al menos 10 minutos, al menos 11 minutos, al menos 12 minutos, al menos 13 minutos, al menos 14 minutos, al menos 15 minutos, al menos 16 minutos, al menos 17 minutos, al menos 18 minutos, al menos 19 minutos o al menos 20 minutos, preferiblemente durante al menos 8 minutos, en particular hasta: 45 minutos, 40 minutos, 35 minutos, 30 minutos o 25 minutos. En otra realización, estas velocidades y tiempos se combinan.

En otra realización particular, la centrifugación de la muestra de sangre anti coagulada se realiza a una velocidad de al menos 150 g, de al menos 300 g, de al menos 350 g, de al menos 400 g, de al menos 450 g, de al menos 500 g, de al menos 550 g, de al menos 600 g, de al menos 650 g, de al menos 700 g, de al menos 750 g, de al menos 800 g, de al menos 850 g, de al menos 900 g, de al menos 950 g, o de al menos 1000 g, y preferiblemente de al menos 580 g, y preferiblemente a una velocidad de hasta: 1400 g, y durante al menos 2 minutos, al menos 3 minutos, al menos 4 minutos, al menos 5 minutos, al menos 6 minutos, al menos 7 minutos, al menos 8 minutos, al menos 9 minutos, al menos 10 minutos, al menos 11 minutos, al menos 12 minutos, al menos 13 minutos, en particular hasta 14 minutos. Tal y como conoce un experto en la materia, las condiciones para la obtención de PRP pueden ser diversas y, según el conocimiento general común se pueden combinar condiciones de velocidad y de tiempo de centrifugación, de tal manera que aumente la velocidad de centrifugación y disminuya el tiempo de centrifugación o viceversa de manera compensatoria para obtener el PRP. Un experto en la materia sabrá combinar dichas variables para obtener el producto deseado.

En una realización particular el PRP a partir del cual se obtiene la segunda composición del método de la invención que comprende trombina y factores de crecimiento se obtiene mediante centrifugación de la muestra de sangre anticoagulada a una velocidad de al menos 580g durante al menos 8 minutos. En una realización más particular, el PRP se obtiene mediante centrifugación de la muestra de sangre anti coagulada a una velocidad de entre 580 g y 1400 g durante entre 8 y 14 minutos.

El término "trombina", en la presente invención, se refiere a una enzima de glicoproteína que no es un constituyente normal de la sangre en circulación, sino que se genera a partir de protrombina y el factor II en presencia de iones de calcio y mediante una reacción catalizada por el factor activado Xa, en la etapa final de las dos cascadas convergentes de reacciones, la vía intrínseca y la vía extrínseca de la coagulación. La trombina activa la degradación del fibrinógeno en monómeros de fibrina, además de activar el factor XIII o el factor estabilizador de la fibrina. Caben señalar otras funciones biológicas importantes de la trombina: 1) la activación de las plaquetas para que liberen los componentes (citoquinas) de sus gránulos a y gránulas densos; 2) la potenciación de la síntesis, liberación y expresión de proteínas de las células endoteliales (angiogénesis); y 3) inducción potente de quimiotaxis de los neutrófilos (factores inflamatorios) y macrófagos (producción de citoquinas).

La expresión "factor de crecimiento" según se utiliza en la presente invención se refiere a mediadores intercelulares, que incluyen entre otros, factores de crecimiento, citoquinas y quimiocinas almacenados en el citoplasma de las plaquetas y que son liberados después de la agregación de las mismas o la formación de coágulos. Esta secreción es intensa en las primeras horas y las plaquetas continúan sintetizando dichos mediadores a partir de sus reservas de ARNm durante al menos otros 7 días. Se secretan más de 800 proteínas diferentes en los medios circundantes, que tienen un efecto paracrino en diferentes tipos de células: miocitos, células tendinosas, células madre mesenquimales de diferentes orígenes, condrocitos, osteoblastos, fibroblastos y células endoteliales. Se estimula la proliferación celular, la angiogénesis y la migración celular, lo que da como resultado la regeneración de tejidos. También hay informes que confirman que las plaquetas secretan péptidos antimicrobianos, lo que sugiere un efecto antibiótico.

De manera particular los mediadores incluirían, sin estar limitados a los mismos, factores de crecimiento, citoquinas proinflamatorias, citoquinas antiinflamatorias y quimiocinas. Ejemplos concretos de dichos mediadores, incluyen, sin estar limitados a los mismos, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento endotelial (VEGF) y factor de crecimiento transformante (TGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), junto con las citoquinas antiinflamatorias y proinflamatorias interleuquina (IL)-4, IL-8, IL-13, IL-17, IL-10 factor de necrosis tumoral (TNF)-a e interferon (IFN)-a., sin estar limitados a los mismos. Asimismo, entre dichos mediadores intercelulares se encontrarían también compuestos con antiinflamatorios y analgésicos, en parte ocasionados por la presencia en las plaquetas de elevadas cantidades de la quimiocina RANTES (CCL5).

Por lo tanto, en el sentido de la presente invención, la expresión "factor de crecimiento" engloba a todas las demás moléculas, tales como proteínas de señalización, péptidos, glicoproteínas, mucoproteínas u hormonas que no se consideran citoquinas, pero que ejercen una función de señalización entre las células.

Uno de los factores de crecimiento más destacado producido por las plaquetas sería el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), que es secretado por las plaquetas durante las primeras fases de curación de heridas y fracturas.

El PDGF incluye tanto el PDGF-A (n.° de acceso de Genbank NP_002598) como el PDGF-B ((n.° de acceso de Genbank NP_002599) que pueden homodimerizarse o heterodimerizarse para producir tres ¡soformas diferentes: PDGF-AA, PDGF-AB o PDGF-BB. PDGF-A es solo capaz de unirse al receptor PDGF a (PDGFR-a, incluidos los homod ¡meros de PDGFR-a/a). PDGF-B puede unirse tanto al PDGFR-a como a un segundo receptor de PDGF (PDGFR-P). Más específicamente, PDGF-B puede unirse a homodímeros de PDGFR-a/a y PDGFR-p/p, así como a heterodímeros de PDGFR-a/p.

La expresión "libre de plaquetas" se utiliza aquí para incluir plasmas y composiciones que carecen por completo de estos materiales. En el contexto de la presente invención, la activación de las plaquetas ha provocado la cascada de coagulación y esto hace que se rompan las plaquetas liberando todo su contenido al medio, por lo que, el suero que se extrae, que comprende trombina y factores de crecimiento, estaría libre de plaquetas.

La expresión “activación de las plaquetas” se refiere en el presente documento al proceso mediante el cual las plaquetas presentes en el plasma se agregan para dar lugar a la formación del coágulo y la secreción de los factores de crecimiento o mediadores intercelulares de sus gránulos citoplasmáticos. Las plaquetas pueden ser activadas por un gran número de sustancias, a las cuales reaccionan en pocos segundos. Cuando son expuestas a estos agonistas, las plaquetas presentan diferentes respuestas, que se encuentran íntimamente asociadas ¡n vivo, pero que, in vitro, pueden ser estudiadas separadamente: adhesión y cambio de forma, agregación, secreción y expresión de actividad procoagulante.

Las plaquetas activadas cambian su forma haciéndose más esféricas, y formando pseudopodos en su superficie. De esta forma toman una forma estrellada. Tras la activación se produce la secreción de gránulos. Las plaquetas contienen gránulos alfa y gránulos densos. Las plaquetas activadas excretan el contenido de estos gránulos dentro de sus sistemas canaliculares y en la sangre circundante. Existen dos tipos de gránulos: (i) gránulos densos (contienen ADP o ATP, calcio, y serotonina) y (¡i) gránulos- a (contienen factor 4 plaquetario, factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF beta 1), factor de crecimiento derivado de plaquetas, fibronectina, B-tromboglobulina, FvW, fibrinógeno, y factores de coagulación (factor V y VIII), entre otros.

En una realización particular las plaquetas son activadas por una sustancia seleccionada de entre cloruro de calcio, trombina y colágeno, preferiblemente cloruro de calcio. La activación de las plaquetas se lleva a cabo mediante la adición de esa sustancia al PRP. En una realización más preferida la activación de las plaquetas se lleva a cabo mediante la adición de una solución, preferiblemente acuosa, de cloruro de calcio, de al menos el 5%, tal como del 5 al 30%, más preferiblemente del 10% en peso de cloruro de calcio relativo al volumen de la solución (w/v). La solución de cloruro de calcio se añade preferiblemente en un volumen de entre 0,05% y 1 %, más preferiblemente en un volumen de aproximadamente 0,2%, con respecto al volumen del PRP.

En otra realización las plaquetas se activan mecánicamente mediante el contacto con microesferas de vidrio.

La activación de las plaquetas desencadena un proceso de coagulación, y tras la retirada del coágulo resultante, se obtiene una solución (un suero) que constituye la segunda composición de la invención. Esta composición comprende trombina y factores de crecimiento y se encuentra libre de plaquetas.

El coágulo puede retirarse mecánicamente por medio de cualquier instrumento útil para tal fin, como por ejemplo unas pinzas. Alternativamente el suero obtenido tras la activación de las plaquetas se puede aislar mediante su absorción por medio de una pipeta o jeringuilla adecuada para tal fin.

En una realización, la primera y/o segunda composición se calienta a la temperatura de mezclado de la etapa f) antes de someterla a dicha etapa f).

El término "centrifugación" se refiere a un método mediante el que los sólidos de diferentes densidades se separan de los líquidos a través de una fuerza de rotación, que aplica a la mezcla una fuerza centrífuga superior a la de la gravedad. Los sólidos y las partículas de mayor densidad se sedimentan. Los ejemplos de centrifugación incluyen, sin limitación, centrifugación diferencial, ¡sopícnica, zonal o ultracenthfugación. En el contexto de la presente invención se prefiere la centrifugación diferencial.

Las centrífugas utilizadas en el contexto de la presente invención pueden obtenerse de una diversidad de fuentes, incluyendo, por ejemplo, la centrífuga PLACONTM, que puede obtenerse de OCT USA Inc., Torrence. En una realización particular, la muestra de sangre de la que se obtiene la primera composición y la muestra de sangre de la que se obtiene la segunda composición proceden de un mismo sujeto.

En una realización particular, la muestra de sangre de la que se obtiene la primera composición y la muestra de sangre de la que se obtiene la segunda composición proceden de diferentes extracciones sanguíneas de un mismo sujeto.

En otra realización particular la muestra de sangre de la que se obtiene la primera composición y la muestra de sangre de la que se obtiene la segunda composición proceden de una misma extracción. De manera particular, cuando las composiciones primera y segunda del método de la invención se obtienen de una misma extracción, entonces la primera composición se obtiene a partir de un volumen de entre el 60% y el 80% de la muestra total de sangre y la segunda composición se obtiene a partir de un volumen de entre el 20% y el 40% de la muestra de sangre extraída. En otra realización, la primera composición se obtiene a partir de un volumen del 80% de la sangre extraída y la segunda composición se obtiene a partir del 20% del volumen de sangre restante.

En otra realización particular, las composiciones primera y segunda del método de la invención se mezclan en una proporción volumétrica de entre 5:1 a 1 :5, más concretamente a una proporción volumétrica 1 :1.

En una realización, las composiciones primera y segunda se calientan por separado a la temperatura del mezclado de la etapa f) y se mantiene esta temperatura hasta el mezclado de la etapa f).

Gel de la invención

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un gel de fibrina obtenido mediante el método del primer aspecto de la invención.

En una realización particular, el gel de fibrina presenta una fuerza de adhesión por superficie de entre 200 mN/cm ² y 600 mN/cm ² medida en una máquina de ensayos uniaxial. Dicha máquina de ensayos universal es capaz de controlar con precisión tanto el desplazamiento del indentador como la fuerza aplicada. De manera más particular, el equipo utilizado en la medición es una máquina de ensayos uniaxial Zwick/Roell modelo ZwickiLine Z1 .0 (sn: 734188-2019). La celda de carga empleada ha sido una Zwick/Roell Xforce P de carga máxima 50 N (sn: 781140). El software para controlar la máquina y registrar tanto la carga como el desplazamiento ha sido el Zwich/Roell testXpert III v1.4 con todos los parches instalados hasta la versión sx406-218-5. La calibración de la máquina ha sido realizada in situ de acuerdo a la norma DIN EN ISO 9513:2013-05 (laboratorio Deusche Akkreditierungsstelle GmbH, Alemania).

En otra realización particular, el gel del segundo aspecto de la invención presenta un módulo de Young de entre 11 KPA y 16 KPA, una capacidad de absorber energía de entre 4 y 4,5 mJ/m y un swelling de entre 1 ,1 y 1 ,63 medido como la proporción entre el peso del gel hidratado y deshidratado.

En dicha realización particular, las medidas del módulo de Young y la absorción de energía se realizan mediante ensayos de indentation instrumentada con indentador esférico. Más concretamente, la esfera de acero utilizada para las indentaciones es de 5 milímetros de diámetro y las indentaciones se realizan directamente sobre las placas de pocilios P24 donde se fabrican los materiales ensayados. El número promedio de ensayos sobre cada pocilio es de 6. En particular para dicha realización, se ha empleado una máquina de ensayos universal capaz de controlar con precisión tanto el desplazamiento del indentador como la fuerza aplicada. El equipo utilizado es una máquina de ensayos uniaxial Zwick/Roell modelo ZwickiLine Z1.0 (sn: 734188-2019). La celda de carga empleada ha sido una Zwick/Roell Xforce P de carga máxima 50 N (sn: 781140). El software para controlar la máquina y registrar tanto la carga como el desplazamiento ha sido el Zwich/Roell testXpert III v1.4 con todos los parches instalados hasta la versión sx406-218-5. En el momento de realizar los experimentos la máquina estaba calibrada acorde a la norma DIN EN ISO 9513:2013-05. La calibración del equipo ha sido realizada in-situ por el laboratorio Deusche Akkreditierungsstelle GmbH de Alemania.

En una realización adicional, el porcentaje de coagulación del gel de fibrina es de entre 67% y 87% medido como el peso del coágulo formado tras el mezclado de la etapa f) sobre el peso combinado de la primera y segunda composición antes de su mezclado. El peso del coágulo puede medirse por ejemplo tinco minutos tras comenzar el mezclado. En otra realización particular, la concentración plaquetaria en el gel de fibrina es inferior a: 5 x 10 ⁴ plaquetas/pl, x 6 x 10 ⁴ plaquetas/pl, 7 x 10 ⁴ plaquetas/pl, 8 x 10 ⁴ plaquetas/pl, 9 x 10 ⁴ plaquetas/pl, 1 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 2 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 3 x 10 ⁵ plaquetas/pl, 4 x 10 ⁵ plaquetas/pl y 5 x 10 ⁵ plaquetas/pl, más preferiblemente 1 ,075 x 10 ⁵ plaquetas/pl.

En una realización, el método de la invención no comprende ninguna etapa de liofilización.

Usos médicos

En un tercer aspecto, la invención se refiere al gel de fibrina del segundo aspecto de la invención para su uso en medicina.

Alternativamente, la invención se refiere al uso del gel de fibrina del segundo aspecto de la invención para la preparación de un medicamento.

Por otro lado, la presente invención proporciona métodos de tratamiento y uso del gel de fibrina de la invención para el tratamiento de tejidos lesionados o traumatizados, incluidos cartílagos y defectos óseos. El método de tratamiento descrito aquí es ventajoso porque requiere una preparación mínima para su uso por parte del médico.

Los usos del gel de fibrina son múltiples. Puede funcionar como un andamio y puede usarse como un implante per se, para proporcionar soporte mecánico a un sitio defectuoso o lesionado in situ y/o para proporcionar una matriz dentro de la cual puedan proliferan y se diferenciarse las células del sitio defectuoso o lesionado. Por ejemplo, para la reparación del cartílago.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere al gel de fibrina del segundo aspecto de la invención para su uso en el tratamiento de lesiones osteocondrales, lesiones meniscales o úlceras, en particular úlceras vasculares.

Alternativamente la invención se refiere a un método de tratamiento o prevención de lesiones osteocondrales, lesiones meniscales o úlceras, en particular úlceras vasculares, en donde el método comprende la administración a un paciente con necesidad de dicho tratamiento del gel de fibrina de acuerdo al segundo aspecto de la invención.

Asimismo, de manera alternativa, la invención se refiere al uso del gel de fibrina de acuerdo al segundo aspecto de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de lesiones osteocondrales, lesiones meniscales o úlceras, en particular úlceras vasculares.

Los tratamientos o usos contemplan la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del gel de fibrina a un paciente. El término “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad suficiente del gel de fibrina para proporcionar el efecto deseado, es decir, lograr una prevención, curación, retraso, reducción de la gravedad o mejora apreciables de uno o más síntomas derivados de una enfermedad, y generalmente estará determinado por, entre otras causas, las características del propio agente y el efecto terapéutico a conseguir. También dependerá del sujeto a tratar, la gravedad de la enfermedad que padezca dicho sujeto, la forma farmacéutica elegida, etc. Por tal motivo, el experto en la materia será quien deberá ajustar las dosis en función de las variables antes mencionadas. En una realización, la cantidad eficaz produce la mejora de uno o más síntomas de la enfermedad que se está tratando.

Según se utiliza en el presente documento, la “lesión osteocondral” o “lesión de cartílago” es aquella que se produce en la unidad osteocondral de la articulación, el tejido que comprende tanto el hueso como el cartílago que recubre al hueso de nuestras articulaciones y facilita el engranaje articular y protege la articulación del rozamiento excesivo.

Cartílago, en la forma aquí utilizada, hace referencia a un tipo de tejido conjuntivo que contiene condrocitos incluidos en un material intercelular (al que a menudo se hace referencia como la “matriz del cartílago") que comprende fibrillas de colágeno (predominantemente colágeno de tipo II junto con otros tipos minoritarios, p. ej. , los tipos IX y XI), diferentes proteogl ¡canos (p. ej., proteogl ¡canos de condroitinsulfato, de queratansulfato y de dermatansulfato), otras proteínas, y agua. Cartílago, en la forma aquí utilizada, incluye cartílago articular y de menisco. El cartílago articular cubre las superficies de las porciones de los huesos de las articulaciones y permite el movimiento de las articulaciones sin contacto directo de hueso con hueso, y de este modo previene el desgaste y el daño a superficies óseas yuxtapuestas. El cartílago articular sano más típico se describe también como “hialino", es decir, con un aspecto característico de vidrio esmerilado. El cartílago de menisco se encuentra por lo general en articulaciones que están expuestas tanto a concusión como a movimiento. Estas localizaciones de cartílago de menisco incluyen las articulaciones temporo-mandibular, esterno-clavicular, acromio-clavicular, de muñeca y de rodilla.

Las articulaciones son uno de los medios comunes por los que los huesos del esqueleto se encuentran conectados. Los extremos de los huesos articulados normales están cubiertos de tejido cartilaginoso articular, que permite el movimiento de los huesos prácticamente sin rozamiento de unos con otros.

El cartílago articular está caracterizado por una organización estructural particular. Está formado por células especializadas (condrocitos) incluidas en un material intercelular (al que a menudo se hace referencia en la literatura como la \matriz cartilaginosa"), rico en proteoglicanos, fibrillas de colágeno predominantemente de tipo II, otras proteínas y agua. El tejido cartilaginoso no está ¡nervado ni penetrado por los sistemas vascular o linfático. Sin embargo, en la articulación madura de seres adultos, el tejido óseo subcondral subyacente, que forma una placa estrecha y continua entre el tejido óseo y el cartílago, está ¡nervado y vascularizado. Por debajo de esta placa ósea, el tejido óseo forma trabéculas, que contienen la médula. En las articulaciones inmaduras, el cartílago articular lleva por debajo únicamente trabéculas de hueso primario. Una porción del tejido de menisco presente en las articulaciones está formado también por cartílago cuya reposición es similar a la del cartílago articular.

En tejido cartilaginoso se reconocen dos tipos de defectos o lesiones, es decir, defectos de grosor completo y defectos de superficie. Estos defectos difieren no sólo en el grado de daño físico ocasionado al cartílago, sino también en la naturaleza de la respuesta reparadora que cada tipo de lesión puede inducir.

Los defectos de grosor completo se extienden al hueso subcondral y pueden causar dolor fuerte ya que la placa ósea contiene terminaciones nerviosas de los centros nerviosos sensoriales. Estos defectos se originan por lo general derivados de un trauma importante o durante las últimas etapas de una enfermedad degenerativa de las articulaciones, como la osteoarthtis. Los defectos de grosor completo pueden, en ocasiones, conducir a hemorragia y a la inducción de una reacción de reparación desde el hueso subcondral. El tejido de reparación formado es un tipo de cartílago fibroso vascularizado, con propiedades biomecánicas insuficientes, y no persiste a largo plazo.

Los defectos de superficie en tejido cartilaginoso articular quedan restringidos al tejido cartilaginoso mismo. Estos defectos son importantes debido a que no curan y no muestran predisposición para las reacciones de reparación.

Estos defectos pueden aparecer como fisuras, formaciones de césped o surcos en la superficie del cartílago, o pueden presentar un aspecto de ’’carne áspera" en el tejido afectado. Contienen vasos no hemorrágicos (puntos de sangre) como los que se observan en los defectos de grosor completo. Los defectos de superficie pueden tener una causa desconocida, pero a menudo son el resultado de desórdenes mecánicos que conducen al desgaste del tejido cartilaginoso. Los desórdenes mecánicos pueden estar ocasionados por un trauma en la articulación, p. ej., un desplazamiento de tejido de menisco roto hacia el interior de la articulación, meniscectomía, una laxación de la articulación producida por un ligamento roto, alineamiento defectuoso de articulaciones, o fractura ósea, o por enfermedades hereditarias. Los defectos de superficie son también característicos de las primeras etapas de enfermedades degenerativas de las articulaciones, como la osteoartritis. Debido a que el tejido cartilaginoso no está ¡nervado ni vascularizado, los defectos de superficie no son dolorosos. Sin embargo, aunque indoloros, los defectos de superficie no curan y a menudo degeneran en defectos de grosor completo.

En general se cree que debido a que el cartílago articular carece de vasculatura, el tejido cartilaginoso dañado no recibe estímulos suficientes o apropiados para inducir una respuesta de reparación. Se ha construido la teoría de que los condrocitos del tejido cartilaginoso por lo general no están expuestos a cantidades suficientes de agentes estimuladores de la reparación tales como factores de crecimiento y coágulos de fibrina, típicamente presentes en tejido vascularizado dañado.

Un acercamiento experimental utilizado para exponer un tejido cartilaginoso dañado a estímulos de reparación, implica perforar o raspar a través del cartílago hacia el interior del hueso subcondral para producir hemorragia [Buckwaiter y col., (1990), s upra]. Desafortunadamente, la respuesta de reparación del tejido a este trauma quirúrgico, es por lo general comparable a la observada que tiene lugar de forma natural en los defectos de grosor completo que causan hemorragia, a saber, formación de un tipo de cartílago fibroso que exhibe propiedades biomecánicas insuficientes, y que no persiste a largo plazo.

El tratamiento de defectos en cartílago puede efectuarse durante un procedimiento artroscópico o quirúrgico sencillo, utilizando el gel de la invención. Según algunos métodos, después de la identificación del defecto, el defecto se trata mediante las etapas de (1) rellenar el área del defecto con una enzima, que degrada los proteoglicanos presentes sobre la superficie del defecto, (2) retirar la enzima, y (3) recomponer el defecto con una composición que comprende el gel, un agente de proliferación y un factor de transformación en un sistema de suministro apropiado.

El gel de fibrina se puede usar junto con otros procedimientos terapéuticos, incluido el rasurado condral, láser o condroplastia por abrasión y técnicas de perforación o microfractura.

Los defectos o lesiones en cartílago en animales se identifican visualmente con facilidad durante un examen artroscópico de la articulación, o durante un simple examen de la lesión o defecto durante una cirugía abierta. Los defectos en cartílago pueden también identificarse por inferencia utilizando la tomografía asistida por ordenador (barrido por CAT) (del inglés, Computer Aided Tomography), exámen por rayos X, formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) (del inglés, Magnetic Resonance Imaging), análisis de fluido sinovial o marcadores séricos, o mediante cualquier otro procedimiento conocido en la técnica.

Una vez que el defecto ha sido identificado, el cirujano puede elegir modificar el defecto quirúrgicamemte a fin de aumentar la capacidad del defecto para retener físicamente las disoluciones y el material del gel aquí descrito. Preferiblemente, en lugar de presentar una geometría plana o ligeramente cóncava, el defecto presenta o se modela para que presente bordes verticales, o se socava para que retenga mejor las disoluciones y material añadido aquí descrito.

Además de las anteriores medidas mecánicas, que mejorarán la adherencia del gel al sitio del defecto, medidas químicas pueden también aumentar la adhesión del gel. Estas medidas incluyen degradar las capas superficiales de proteoglicanos de cartílago situados sobre la superficie del defecto, para dejar expuestas las fibrillas de colágeno del cartílago de manera que puedan interaccionar con las fibrillas de fibrina. Los proteoglicanos situados sobre la superficie del cartílago no sólo tienden a interferir con la adherencia al cartílago de una matriz de fibrina, sino que también inhiben localmente la actividad de la trombina.

Además, la adhesión de la matriz al cartílago del defecto puede también ser incrementada utilizando cola de fibrina (es decir, el factor sanguíneo XIII o factor de estabilización de fibrina) para promover la formación de enlaces químicos (reticulación) de las fibrillas del gel a las fibrillas de colágeno del cartílago situadas sobre la superficie del defecto. Puede utilizarse la enzima transglutaminasa para obtener el mismo efecto. También pueden utilizarse otros compuestos capaces de promover la adhesión de materiales extracelulares.

En uno de los métodos, la superficie del defecto se seca empapando el área con un tejido absorbente esterilizado, y el volumen del defecto se rellena con una disolución enzimática esterilizada durante un período de 2-10 minutos, para degradar los proteoglicanos presentes sobre la superficie del cartílago. Para degradar los proteoglicanos pueden utilizarse enzimas diferentes, por separado o en combinación, en disoluciones acuosas tamponadas y esterilizadas. El pH de la disolución debe ajustarse a fin de optimizar la actividad enzimática.

Enzimas útiles para degradar los proteoglicanos en los métodos de este invento incluyen condroitinasa ABC, condroitinasa AC, hialuronidasa, pepsina, tripsina, quimotripsina, papaína, pronasa, estromelisina y proteasa de Staph V8. La concentración apropiada de una enzima o combinación de enzimas en particular, dependerá de la actividad de la disolución enzimática.

La cantidad de tiempo que la disolución enzimática se aplica, debe mantenerse al mínimo para que tenga lugar la degradación de los proteoglicanos predominantemente en el área de la reparación. El tiempo total del procedimiento debe mantenerse al mínimo, especialmente durante una artrotomía abierta, debido a que el cartílago puede dañarse por exposición al aire. Por estas razones, en las realizaciones de los métodos que incluyen la etapa de degradación de los proteoglicanos mediante digestión enzimática, son preferidos tiempos de digestión de menos de 10 minutos y los tiempos de digestión de menos de 5 minutos son muy preferidos. Después de que la enzima ha degradado los proteoglicanos de la superficie del defecto, la disolución enzimática debe ser retirada del área del defecto. La retirada de la disolución enzimática debe efectuarse utilizando un aspirador equipado con una punta de succión fina, embebiendo después con material de algodón. De manera alternativa, la disolución enzimática puede separarse embebiéndola con material de algodón solo.

Después de retirar la disolución enzimática, el defecto debe ser aclarado cuidadosamente, preferiblemente tres veces, con disolución salina fisológica esterilizada (p. ej., NaCI 0,15 M). El sitio del defecto aclarado debe ser secado a continuación. Para secar el sitio del defecto pueden utilizarse gasa o material de algodón esterilizados.

De manera alternativa, o en adición a la etapa de tratamiento enzimático, el sitio del defecto puede ser recompuesto con un compuesto, tal como cola de fibrina o transglutaminasa, para aumentar la adhesión de la matriz al sitio del defecto. En una realización preferida, al sitio del defecto se aplica cola de fibrina o transglutaminasa, después de que el sitio del defecto ha sido aclarado y secado después del tratamiento enzimático.

El sitio del defecto se recompone a continuación con el gel de la invención aquí descrito, para rellenar el defecto preferiblemente hasta sus bordes con la composición de la matriz, de manera que se forma una superficie plana.

En una realización particular, el gel de fibrina de la invención se inyecta en el lugar de la lesión durante el proceso de polimerización, es decir, una vez mezclados los componentes del mismo en el exterior de la lesión, aún en forma líquida y en los momentos previos a la formación del gel. Así, la polimerización se completa en el lugar de la lesión adaptándose al defecto concreto. Puesto que, como se ha indicado la formación del coágulo tras la mezcla de la composición 1 y de la composición 2 se produce en los siguientes 1 o 2 minutos, la aplicación de la composición al lugar de la lesión ha de realizarse a la mayor brevedad posible una vez que produce la mezcla de las composiciones.

El sellador se puede aplicar con una aguja, como un rociador o usando otros dispositivos. Después de que el sitio del defecto es recompuesto con el gel, deben cerrarse las incisiones efectuadas en la cápsula de la articulación y en la piel, y terminarse la artroscopia o la cirugía abierta.

Los métodos aquí descritos pueden también utilizarse para reparar defectos lesiones meniscales.

El término “lesión meniscal” se refiere a aquella que se produce en el menisco de la rodilla, la estructura anatómica que se sitúa de forma intraarticular en la rodilla y facilita la estabilidad y amortiguación de la articulación.

El menisco está formado por tejido fibrocartilaginoso, compuesto principalmente por fibras de colágeno de tipo I (más del 90%), que se daña con frecuencia, afectando a la estabilidad y lubricación de la rodilla. Al igual que en el cartílago, el proceso de reparación del menisco viene determinado por sus características tisulares, como su abundante matriz extracelular (entre el 60 y el 70% del peso del tejido) en la que se dispersan las células, es decir, fibrocondrocitos, fibroblastos y células de la superficie. Además, su escasa vascularización se limita al 10-30% de su porción externa o pared meniscal, que también recibe las terminaciones nerviosas y presenta la mayor celulañdad.

Las lesiones meniscales comprometen las funciones articulares, ya que esta estructura proporciona estabilidad a la rodilla y soporta los esfuerzos de compresión, así como las fuerzas de tracción y cizallamiento. El menisco también absorbe parte de la tensión mecánica que recibe la articulación y participa en la lubricación de la rodilla con la membrana sinovial. Debido a su importancia funcional en la rodilla y a su vulnerabilidad a las lesiones repetitivas a lo largo de la vida de una persona, es necesario mejorar su limitada capacidad de reparación para lograr una recuperación óptima. Así, el gel de fibrina puede aplicarse de forma coadyuvante a los procesos quirúrgicos utilizados para la reparación de las lesiones meniscales como son las meniscectomías y las suturas meniscales.

En una realización particular, el gel de fibrina de la invención se inyecta en el lugar de la lesión durante el proceso de polimerización, es decir, una vez mezclados los componentes del mismo en el exterior de la lesión, aún en forma líquida y en los momentos previos a la formación del gel. Así, la polimerización se completa en el lugar de inyección. Puesto que, como se ha indicado la formación del coágulo tras la mezcla de la composición 1 y de la composición 2 se produce en los siguientes 1 o 2 minutos, la aplicación de la composición al lugar de la lesión ha de realizarse a la mayor brevedad posible una vez que produce la mezcla de las composiciones.

El sellador se puede aplicar con una aguja, como un rociador o usando otros dispositivos.

Después de la formación del gel, deben cerrarse las incisiones efectuadas en la cápsula de la articulación y en la piel, y terminarse la artroscopia o la cirugía abierta.

En una realización particularmente preferida, el gel de fibrina para los usos médicos anteriormente indicados, se administra al mismo paciente del cual se extraen las muestras de sangre a partir de las cuáles de obtiene dicho gel de fibrina (uso autólogo).

En otra realización particular, el gel de fibrina para los usos médicos anteriormente indicados es alogénico, eso es, procede de muestras de sangre de un donante a partir de las cuales se obtiene el gel de fibrina de la invención y que se administra a otro sujeto que lo requiere.

El término “úlcera” se refiere a heridas que no cicatrizan, incluidas úlceras neuropáticas del pie diabético, heridas traumáticas, úlcera arterial y úlceras de etiología mixta (arterial-diabética, arterial-venosa). Una úlcera es una llaga en la piel o una membrana mucosa, acompañada de la desintegración del tejido. Las úlceras pueden provocar la pérdida completa de la epidermis y, a menudo, de porciones de la dermis e incluso de la grasa subcutánea. Las úlceras son más comunes en la piel de las extremidades inferiores y en el tracto gastrointestinal. Una úlcera que aparece en la piel a menudo se ve como un tejido inflamado con un área de piel enrojecida. Una úlcera en la piel a menudo es visible en caso de exposición al calor o al frío, irritación o un problema con la circulación sanguínea.

También pueden deberse a la falta de movilidad, lo que provoca una presión prolongada sobre los tejidos. Este estrés en la circulación sanguínea se transforma en una úlcera cutánea, comúnmente conocida como escaras o úlceras por decúbito. [1] Las úlceras a menudo se infectan y se forma pus. El término “úlceras vasculares” se refiere a una herida mal cicatrizada localizada en la pierna. La causa es una circulación deficiente debido a cambios patológicos de suministro arterial y/o drenaje venoso.

Una úlcera venosa es una complicación de una insuficiencia venosa crónica que proviene generalmente de cambios secundarios a una tromboflebitis profunda o varicosa de las venas superficiales, perforantes y/o profundas. El sistema venoso se compone de venas superficiales y profundas. Las venas superficiales están situadas entre la piel y los músculos, las venas profundas entre los músculos y ambos tipos se conectan entre sí mediante las venas perforantes. Todas estas venas tienen válvulas que normalmente aseguran que la sangre fluya de las venas superficiales al sistema profundo. Si las válvulas son incompetentes (venas varicosas) o están dañadas (p. ej., síndrome posflebítico), se puede producir una insuficiencia venosa dejando que la sangre retorne y se estanque (se acumule) en las venas de las piernas. Esto a su vez aumenta la presión sanguínea en las piernas y causa una fuga de líquido de las venas hacia el tejido con su correspondiente edema tisular. La región cutánea edematosa puede romperse y en ocasiones se puede desarrollar una úlcera visible en la piel.

En otro aspecto de la invención, la polimerización del gel se produce en el lugar que requiere de tratamiento, por ejemplo en la lesión o úlcera, esto es, se añaden las composiciones primera y segunda por separado en el lugar a tratar y se produce la polimerización directamente en el lugar a tratar.

Por ello, la invención también se refiere a un método idéntico al método del primer aspecto de la invención, en donde la etapa f) de mezclado se realiza ¡n vivo en vez de in vitro.

Asimismo, la invención también se refiere a una combinación de una primera composición y una segunda composición tal y como se definieron en el primer aspecto de la invención, para su uso en los usos médicos indicados anteriormente, en particular en donde el uso comprende mezclar ¡n vivo, en particular en el cuerpo del paciente, más particularmente sobre o en el lugar que requiere de tratamiento, por ejemplo la lesión o úlcera que se ha de tratar, la primera y la segunda composición preferiblemente a una temperatura de entre 30°C y 44°C para formar un gel de fibrina. En este caso, se entiende que el término combinación se refiere al conjunto de la primera y segunda composición previo a su mezclado, ya que este último tiene lugar posteriormente ¡n vivo, como ya se explicó.

La obtención de las composiciones primera y segunda es idéntica en todas sus realizaciones a la descrita en el primer aspecto de la invención.

Alternativamente la invención se refiere a un método de tratamiento o prevención de lesiones o úlceras, en particular lesiones osteocondrales, lesiones meniscales o úlceras, en particular úlceras vasculares, en donde el método comprende la administración, a un paciente con necesidad de dicho tratamiento, de una primera composición y una segunda composición tal y como se definieron en el primer aspecto de la invención, en donde el método comprende mezclar, sobre o en la lesión o úlcera, la primera y la segunda composición preferiblemente a una temperatura de entre 30°C y 44°C para formar un gel de fibrina.

Asimismo, de manera alternativa, la invención se refiere al uso de una primera composición y una segunda composición tal y como se definieron en el primer aspecto de la invención en la preparación de un medicamento para los usos médicos indicados anteriormente, en particular para el tratamiento de lesiones osteocondrales, lesiones meniscales o úlceras, en particular úlceras vasculares, en donde el tratamiento comprende mezclar, sobre o en la lesión o úlcera, la primera y la segunda composición preferiblemente a una temperatura de entre 30°C y 44°C para formar un gel de fibrina.

Asimismo, de manera alternativa, la invención se refiere a un kit que comprende una primera composición y una segunda composición tal y como se definieron en el primer aspecto de la invención, e instrucciones para el mezclado de la primera y la segunda composición preferiblemente a una temperatura de entre 30°C y 44°C para formar un gel de fibrina.

En una realización, el mezclado de las composiciones primera y segunda sobre o en la lesión o úlcera, preferiblemente en la úlcera, comprende combinar las composiciones primera y segunda fuera del cuerpo humano, inmediatamente después, mientras esa mezcla inicial sigue poseyendo una consistencia líquida, aplicar esa mezcla líquida a la úlcera, en donde completará posteriormente el proceso de polimerización (es decir, de formación del gel). Así, la polimerización se completa en el lugar de la lesión adaptándose a la misma. Puesto que, como se ha indicado, la formación del coágulo tras la mezcla de la composición primera y de la composición segunda se produce en los siguientes 1 o 2 minutos, la aplicación de la composición al lugar de la lesión o úlcera ha de realizarse a la mayor brevedad posible una vez se combinan las composiciones.

El sellador se puede aplicar con una aguja, como un rociador o usando otros dispositivos.

Después de la formación del gel, pueden aplicarse métodos convencionales para la protección de úlceras como las gasas y los apósitos.

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La invención se describirá a través de los siguientes ejemplos que deben considerarse meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Para desarrollar este producto se ha seguido el siguiente proceso:

Se realizó una extracción de sangre del paciente utilizando tubos para extracción de volumen de 9 mL con citrato sódico al 3,8% como anticoagulante. El número de tubos depende del volumen de producto que se quiera obtener (por ejemplo 10 tubos para obtener un volumen de producto final de 3-5mL).

El 80% de los tubos (ej. 8 de 10) se empleó para la concentración del fibrinógeno, es decir para producir la primera composición según a invención. Para ello:

1- Se centrifugaron los tubos a 1500g durante 15 minutos para obtener la fracción plasmática de la sangre (sin glóbulos rojos, ni glóbulos blancos, ni plaquetas).

2- Una vez separadas las fracciones plasmáticas y recogidas en tubos de 9mL se añadió un volumen del 10% (0,9 mL) de Etanol 96% v/v (Reag. USP, Ph. Eur), se mezcló bien y se enfrió en baño de hielo (2-8°C) durante 30 minutos.

3- Pasados los 30 minutos, los tubos se centrifugaron a 580 g durante 8 minutos.

4- Tras esta centrifugación se decantó el sobrenadante preservando el pellet/precipitado formado. 5- Los tubos con los pellets/precipitados se sometieron a una temperatura de 37°C para su disolución.

6- Una vez disueltos se unificaron en un mismo tubo y se conservaron a 37°C hasta su uso.

El 20% de los tubos (ej 2 de 10) se emplearon para la obtención de la solución plasmática de trombina y factores de crecimiento, es decir para producir la segunda composición según a invención. Para ello:

1- Se centrifugaron los tubos a 580g durante 8 minutos para separar la sangre en sus diferentes fracciones.

2- Se recogió toda la fracción plasmática sin incluir ni los glóbulos blancos ni los glóbulos rojos, obteniendo un plasma rico en plaquetas (PRP) con una concentración plaquetaria similar a la sangre, tipo 11-00-11 o 22-00-11 de acuerdo con la clasificación descrito en Kon E et al., 2020, (Expert Opin Biol Ther; 20(12):1447-1460).

3- Se unificaron los PRP de los tubos en un tubo de 9 mL y se añadió cloruro cálcico al 10% (2 pL por cada mL de PRP) para activar las plaquetas y desencadenar el proceso de coagulación.

4- Una vez formado y retraído el coágulo se recogió el suero generado y se almacenó a 37° hasta su uso.

Una vez obtenidos las dos composiciones (concentrado de fibhnógeno y solución plasmática de trombina y factores de crecimiento), se mezclaron en una proporción v:v de 1 :1.

Durante los siguientes 1-2 minutos tras la mezcla se formó progresivamente el gel de fibrina.

Análisis técnico del producto obtenido

Concentración de fibrinógeno

En los ensayos realizados se ha conseguido una concentración de fibhnógeno mediante el método descrito de entre 6 y 9 veces más respecto a la concentración en plasma.

Tiempo de coagulación La formación se produce en los dos primeros minutos desde que se produce la mezcla de la primera y segunda composición, teniendo una mezcla fácilmente aplicable que se adhiere al tejido y se mantiene de forma consistente.

Retracción

No se produce retracción de PRP a Io largo del tiempo en comparación con un coágulo de fibrina convencional (Figura 1A). La falta de retracción también se observó en las fibras de fibrina observadas en la microscopía electrónica (Figura 1 B).

Esta falta de retracción permite una adaptación óptima y completa al defecto o lesión a lo largo del tiempo.

Adherencia

Los estudios mecánicos de adherencia dieron un valor de fuerza de adhesión por superficie de 402,2 ± 183,38 mN/cm ² tras cinco minutos de contacto con las superficies. Dicha adherencia se traslada al tejido real (Figura 2), permitiendo la permanencia del producto durante tiempo prologando y sin peligro de desprendimiento.

Estudios biológicos

Los estudios de viabilidad in vitro con calceina/ethidium muestran que el scaffold desarrollado no es tóxico para las células tras los experimentos en cultivos celulares (Figura 3).

Estudios biomecánicos

En los ensayos biomecánicos, el scaffold desarrollado en comparación con el scaffold convencional presenta un menor módulo de Young (menos rígido) y que además tiene una mayor capacidad para absorber energía En los experimentos de swelling, ambas formulaciones mostraron un ratio sin diferencias significativas (convencional: 1 ,49 ± 1 ,90 vs. nueva: 1 ,37 ± 0,26).

Porcentaje de coagulación

El porcentaje de coagulación en la formación del gel de la invención observado tras la mezcla de las composiciones primera y segunda fue del 77,03% ± 9,55 (p<0.0033), significativamente más alto que con otras formulaciones similares.

La aplicación de calor es importante para obtener este valor ya que la elaboración del gel de fibrina aplicando calor (37°C) genera un porcentaje significativamente mayor de coagulación que sin calor (54.42% ± 14.32) (p<0.0022).

Por lo tanto, el método de la invención permite una mejor manipulación del producto y una mayor eficacia de la coagulación (Figura 4).

Efecto de la presencia o ausencia de plaquetas en el gel

Según la centrifugación empleada en la sangre para la obtención del concentrado de fibrinógeno, este puede presentar una gran concentración de plaquetas o no.

Según el proceso descrito en este protocolo, se realiza una centrifugación de la sangre a 1500g durante 15 minutos para eliminar las plaquetas lo máximo posible, a diferencia de los protocolos que parten de una centrifugación para obtener un PRP. Así las diferentes concentraciones de plaquetas según los diferentes métodos y momentos del protocolo sería la siguiente:

Unidades de concentración plaquetaría: x10 ³ Plt/pL

La presencia excesiva de plaquetas en el proceso da como resultado un concentrado de fibrinógeno heterogéneo y con presencia de coágulos debido a la agregación plaquetaria, lo que perjudica el proceso de formación y aplicación del gel de fibrina. Por el contrario, en el concentrado de fibrinógeno una concentración similar o menor a la concentración plaquetaria en sangre da lugar a un concentrado de fibrinógeno uniforme y homogéneo que permite un proceso de elaboración y aplicación óptimo (Figura 5).

Esta inclusión de plaquetas en la formulación también afecta a otras propiedades antes mencionadas como la adhesión, la cual es significativamente menor cuando hay un exceso de plaquetas en la formulación (Figura 6). Los datos obtenidos fueron los siguientes.

En resumen, los principales problemas que se resuelven eliminando la concentración excesiva de plaquetas es la formación de coágulos en el concentrado de fibrinógeno, la cual dificulta la formación del producto final y genera un scaffold heterogéneo. Por otra parte, esta formación de coágulos debido a la presencia de plaquetas parece afectar a la capacidad de adhesión tal y como sugieren los datos de fuerza de adhesión, la cual es significativamente mayor en el scaffold sin plaquetas.