"PELÍCULA PARA APLICAÇÃO TÓPICA NO TRATAMENTO DE LESÕES DA PELE E

MÉTODO PARA SUA OBTENÇÃO E APLICAÇÃO"

Domínio técnico

O presente pedido de patente divulga uma película para aplicação tópica no tratamento de lesões da pele e respetivo método de obtenção .

Antecedentes

A pele é o maior órgão do corpo humano, e confere proteção contra a desidratação, toxinas e microrganismos existentes no meio externo. A integridade da pele pode ser comprometida devido a diferentes tipos de lesões, que incluem feridas agudas (causadas por cortes ou queimaduras), feridas crónicas (úlceras de pressão ou diabéticas), desordens genéticas e intervenções cirúrgicas. Estima-se que a prevalência de feridas resultante de cirurgias afete cerca de 115 milhões de pessoas. Por outro lado, estima-se que cerca de 40 milhões de pessoas sofram de feridas crónicas. As lesões cutâneas têm normalmente associadas diversos tipos de complicações como por exemplo, infeções, distúrbios eletrolíticos e falhas respiratórias. Além disso, o indivíduo pode ainda sofrer distúrbios emocionais e psicológicos que podem ocorrer devido aos longos períodos de hospitalização e ao aspeto estético das cicatrizes .

Com o objetivo de atenuar ou eliminar todas as complicações associadas ao processo de cicatrização de feridas, têm sido desenvolvidas diferentes abordagens para proteger a ferida de contaminações bacterianas, assim como para permitir a absorção do exsudado produzido no leito da ferida.

Os biomateriais (hidrogéis, membranas, películas, etc.) que mais interesse têm captado da parte dos investigadores são aqueles que são capazes de mimetizar a estrutura da matriz extracelular, e que permitem a migração, adesão e proliferação celular. Além disso, os materiais que têm sido desenvolvidos para o tratamento de feridas devem manter a ferida húmida, uma vez que uma ferida seca promove a formação de crosta o que impede a migração celular. Por outro lado, os materiais devem ter a capacidade de absorver o exsudado, pois a sua acumulação no local da ferida pode conduzir à maceração do tecido.

O documento US2016235881 (Al) divulga um método de preparação de um hidrogel com propriedades não aderentes e sem interferência na bioatividade dos agentes contidos na dita estrutura para aplicação na regeneração de lesões. A presente invenção destaca- se desta, na medida em que é biodegradável e desta forma não é necessário proceder à remoção do produto após o tratamento da ferida. Esta propriedade da película permite reduzir a dor sentida pelo doente durante o processo de tratamento da ferida. Por outro lado, a produção do produto descrito no documento US2016235881 (Al) requer o uso de plasma de oxigénio, enquanto que o produto aqui descrito não requer técnicas complexas para a sua produção.

O documento RU2545735 (Cl) divulga um revestimento de lesões à base de um hidrogel, que contém ingredientes antimicrobianos e antioxidantes: como a montmorilonita modificada com prata e o fulerenol, de forma a melhorar o processo de regeneração e prevenir/reduzir as infeções. A presente invenção destaca-se desta, na medida em que apresenta um revestimento de origem natural produzido através de um mecanismo simples, sem requerer passos de síntese e purificação demorosos . Além do mais, o carácter antimicrobiano e antioxidante da película é conseguido através da incorporação de agentes de origem natural (óleos essenciais, extratos de plantas, e outros) não recorrendo à prata nem a compostos sintéticos.

O documento KR101429455 (BI) refere-se a um penso de hidrogel com propriedades antioxidantes para tratamento de feridas usando a auto-montagem do quitosano, bem como o seu método de produção. Mais especificamente, um penso para tratamento de feridas constituído por uma mistura de hidrogel polimérico e quitosano, que recorre a uma técnica enzimática/química para transformar quitosano insolúvel em água em moléculas de baixo peso molecular. A presente invenção destaca-se desta, na medida em que apresenta uma película de origem natural produzido através de um mecanismo simples, sem recorrer à ação de enzimas. Além do mais, a presente invenção possui propriedades antimicrobianas .

O documento CN103446618 (A) compreende um hidrogel com atividade antibacteriana e o seu método de preparação. O hidrogel é constituído por 0,1-5% de norfloxacina de prata, 5-30% de polímero, 0-10% de plastificante e água. Este hidrogel permite a absorção dos exsudados e a prevenção de infeções . A presente invenção destaca-se desta, na medida em que é essencialmente constituída por biomateriais de origem natural. Por outro lado, o efeito antibacteriano do produto aqui proposto advém principalmente das propriedades nativas dos produtos naturais, e não da adição de agentes como a norfloxacina de prata.

O documento CN102698312 (B) apresenta um hidrogel composto por 1.5-2% de quitosano, 45 ~ 50% de aloe e ~ 4% de β - glicerolfosfato para ser aplicado no processo de cicatrização de feridas. A presente invenção destaca-se desta, na medida em que o quitosano usado na produção do revestimento é submetido a processos de funcionalização (desacetilação e/ou modificação química com aminoácidos), de forma a potenciar as propriedades intrínsecas do polímero. Além do mais, a película possui ainda outros agentes bioativos (componentes com atividade anti- inflamatória e antioxidante), com vista a melhorar o processo de regeneração cutânea. Esta película à base de polímeros naturais permite a formação de uma película na superfície da lesão, que fornece proteção da ferida contra agentes infeciosos, garantindo também um ambiente propício à proliferação celular.

O documento CN101278896 (B) descreve a produção de um gel de quitosano contendo nanopartícuias de prata usada para o tratamento do processo inflamatório e infecioso associado às lesões cutâneas. A presente invenção distancia-se desta, uma vez que esta não recorre o uso de nanopartícuias de prata para conferir propriedades antibacterianas ao revestimento. O processo de funcionalização do quitosano com diferentes aminoácidos permite potencializar as propriedades antibacterianas do revestimento .

O documento CN104288173 (A) descreve um revestimento biológico baseado num gel antibacteriano de quitosano. O gel é composto por quitosano e gelatina medicinal. A presente invenção diferencia-se na medida em que a modificação do quitosano amplifica as suas propriedades antibacterianas podendo atuar ao nível de várias estirpes bacterianas, inclusive as estirpes multirresistentes . Adicionalmente, a incorporação do aloe vera confere propriedades de hidratação, anti-inflamatórias e regenerativas ao revestimento .

O documento CN103110976 (A) divulga a receita de um gel antibacteriano e do seu método de preparação, em que o principal componente é o complexo quitosano-iodo de forma a providenciar propriedades desinfetantes ao gel. A presente invenção destaca-se desta na medida em que a película proposta apresenta propriedades antibacterianas, que além de induzir a morte dos microrganismos, também impede o crescimento dos mesmos, durante todo o processo de cicatrização da ferida. Este revestimento possui também propriedades bastante importantes no processo de cicatrização, nomeadamente carácter anti-inflamatório e antioxidante.

O documento WO 2003068281 (Al) descreve um hidrogel à base de quitosano com um grau de desacetilação superior a 40%. A presente invenção destaca-se desta, na medida em que a película proposta apresenta além de quitosano com elevado grau de desacetilação, a funcionalização com biomoléculas o que potencializa a atividade antibacteriana e antifúngica do quitosano. Adicionalmente, a incorporação dos extratos de planta e outras moléculas bioativas na composição da película contribuem para melhorar a performance do gel no processo de cicatrização de feridas. O documento CA2712527 (C) relata uma composição farmacêutica designada para funcionar com uma película protetora na pele, composta por quitosano e agentes que conferem propriedades curativas, calmantes e hidratantes. A presente invenção destaca- se desta na medida em que, a película é composto por quitosano e aloe o que confere capacidade de hidratação e, também composta por moléculas bioativas que potencializam as propriedades antibacterianas , anti-inflamatórias e antioxidantes do revestimento, as quais também são fulcrais no tratamento de lesões cutâneas .

O documento CN101502667 (B) descreve um hidrogel transparente composto por quitosano, ácido poliacrílico e polivinilpirrolidona com propriedades hemostáticas , elevada absorção de água e boa aplicabilidade. A presente invenção destaca-se desta, na medida em que o revestimento tem boa capacidade de absorção de água, propriedades antibacterianas, anti-inflamatórias e antioxidantes sem recorrer ao uso de polímeros sintéticos.

É também importante reforçar aspetos diferenciadores da presente invenção em relação trabalhos que encontrámos reportados na literatura.

O trabalho intitulado "Development of a new chitosan hydrogel for wound dressing" (Ribeiro et al . , 2009) descreve um hidrogel apenas composto por quitosano que necessita de mudanças periódicas durante o tempo do tratamento. A presente invenção destaca-se, na medida que o revestimento proposto é biodegradável, sendo degradado ao longo do tempo através de enzimas existentes nos fluídos biológicos. Esta propriedade evitará as mudanças periódicas do revestimento e as desvantagens associadas a este processo, como é a dor e desconforto causado para o paciente.

O trabalho intitulado "Thermoresponsive chitosan-agarose hydrogel for skin regeneration" (Miguel et al . , 2014) descreve um hidrogel termoresponsivo biocompativel e antibacteriano, capaz de promover a cicatrização de feridas. A presente invenção distancia-se deste sistema, uma vez que o quitosano usado na produção do revestimento é funcionalizado com moléculas bioativas e, desta forma as propriedades antibacterianas e cicatrizantes são incrementadas. É expectável que este sistema promova um processo de cicatrização mais rápido. Além disso, a presente invenção possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes.

O trabalho intitulado "Chitosan/arginine-chitosan polymer blends for assembly of nanofibrous membranes for wound regeneration" (Antunes et al . , 2014) reporta a produção de um penso composto por quitosano à base de nanofibras recorrendo à técnica de electrofiação . A presente invenção destaca-se desta, na medida em que o revestimento aqui apresentado é em forma de película, que tem a capacidade de proporcionar um ambiente húmido no local da lesão, o qual é favorável ao processo de regeneração da pele. Além disso, a inclusão dos extratos de aloe, óleos essenciais e outras biomoléculas permite providenciar propriedades anti- inflamatórias e antioxidantes à película.

O trabalho intitulado "Electrospun Polycaprolactone/Aloe Vera_Chitosan Nanofibrous Asymmetric Membranes Aimed for Wound Healing Applications" (Miguel et al . , 2017) descreve uma membrana assimétrica produzida através do processo de electrofiação . A presente invenção di ferencia-se desta, na medida em que o revestimento é uma película que possui uma enorme capacidade de hidratação, bem como a absorção dos exsudados . Adicionalmente, o quitosano é funcionali zado com biomoléculas , o que amplifica as propriedades intrínsecas do polímero.

O trabalho intitulado "Acceleration of wound contraction and healing with a photocrosslinkable chitosan hydrogel" (Ishihara et al . , 2001) reporta um hidrogel fotoreticulável de quitosano. A presente invenção destaca-se na medida em que o revestimento é composto por quitosano funcionali zado com aminoácidos extratos de aloe o que permite conferir à película boas propriedades hidratantes, bem como propriedades antibacterianas , anti- inflamatórias e antioxidantes. Além disso, a presente invenção não necessita de processos complicados ou morosos para que ocorra a sua reticulação. A adição de componentes espessantes permite tornar simples a aplicação da película protetora.

O trabalho intitulado "Carboxyl-modified poly(vinyl alcohol)- crosslinked chitosan hydrogel films for potential wound dressing" (Zhang et al . , 2015) descreve um hidrogel à base de polímeros sintéticos e as propriedades antibacterianas são imputáveis à incorporação de um antibiótico ( gentamicina) . A presente invenção diferencia-se do produto apresentado nesta publicação uma vez que o revestimento proposto é composto apenas por componentes de origem natural biodegradáveis e produzido de forma simples. As propriedades antibacterianas são conseguidas através da funcionalização do quitosano, sem necessitar da incorporação de antibióticos. Por outro lado, os extratos e aloe e óleos essenciais permitem conferir propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes à película.

O trabalho intitulado "Hydrogel sheets of chitosan, honey and gelatin as burn wound dressings" (Wang et al . , 2012) descreve um hidrogel composto por quitosano, mel e gelatina. A presente invenção destaca-se deste trabalho, na medida em que esta película é composta por extratos de aloe e outro tipo de biomoléculas que conferem propriedades anti-inflamatórias , antioxidantes e analgésicas à película.

O trabalho intitulado "A green fabrication approach of gelatin/CM-chitosan hybrid hydrogel for wound healing" (Yang et al . , 2010) apresenta um hidrogel composto por N,0- quitosano carboximetilado e gelatina, o qual foi reticulado por ação da radiação gama. A presente invenção diferencia-se na medida em que, o processo de formulação adotado na produção da película é bastante simples, não requerendo o uso de processos químicos, morosos e caros. Além disso, a película possui propriedades antimicrobianas , anti-inflamatórias , antioxidantes e regenerativas mediadas pelos seus constituintes.

O trabalho intitulado "The use of physical hydrogels of chitosan for skin regeneration following third-degree burns" (Boucard et al . , 2007) descreve um hidrogel de quitosano de dupla camada. A preparação da formulação implica a precipitação em amónia e o hidrogel não permite um revestimento que seja possível aplicar a qualquer forma de lesão. A película da presente invenção destaca- se deste, na medida em que, a preparação da sua formulação é bastante simples, permite uma aplicação "in situ", permitindo uma adaptação eficaz à forma da lesão. Além disso a película é dotada de propriedades antimicrobianas , anti-inflamatórias , antioxidantes e regenerativas devido aos seus constituintes, maioritariamente de origem natural.

Sumário

O presente pedido de patente divulga uma película para aplicação tópica no tratamento de lesões da pele e respetivo método de obtenção .

Numa forma de realização a película compreende os seguintes elementos :

- quitosano desacetilado numa concentração final entre 15% e 60%;

- quitosano-arginina numa concentração final entre 15% e 60%;

- ácido láctico numa concentração final entre 0,5% e 1% (p/v);

- extrato de Aloe numa concentração final entre 9% e 34%;

- ácido acetilsalicílico numa concentração final entre 0,01% e 0,5%;

- óleos essenciais numa concentração final entre 0,01% e 5%; agentes espessantes numa concentração final entre 0,05% e 0,20%;

- agentes preservativos numa percentagem de volume final entre 0,05% e 0,10%;

Numa forma de realização o quitosano desacetilado tem um grau de desacetilação entre 55% e 99,99%.

Numa forma de realização os óleos essenciais são o óleo de soja, óleo de lavanda ou combinação destes. Numa forma de realização o agente espessante é etileno de glicol, manitol, xilitol, butil tetraol ou uma combinação destes.

Numa forma de realização o agente preservativo é ácido benzóico, benzoato de sódio, gluconato de cálcio, metilparabeno, ácido sórbico, álcool benzilico ou uma combinação destes.

Numa forma de realização o método de produção da película para aplicação tópica compreende os seguintes passos:

Dissolver uma mistura de quitosano desacetilado (a uma percentagem de 15% e 60%) e quitosano modificado (a uma percentagem de 15% e 60%) com aminoácidos em 100 mL de uma solução diluída de ácido lático a uma percentagem de 0,5% a 1% (p/v) ;

Adicionar o extrato de aloe à mistura de quitosano e homogeneizar, com uma concentração final que pode variar de 9, 24-33, 90%;

Dissolver ácido acetilsalicílico, na mistura anterior até ficar uma concentração entre 0,01-0,5%;

- Adicionar óleos essenciais com uma concentração final que pode variar de 0,01-5%;

- Adicionar agentes espessantes a uma percentagem de 0,05%- 0,20% do volume final;

- Adicionar agentes preservativos numa percentagem que pode variar entre 0,05% - 0,10% do volume final;

- Homogeneizar a mistura;

- Remover o ar incorporado na mistura, através de ciclos de sonicação e/ou vácuo;

- Ajustar o pH para valores entre 5,0 e 7,4. Numa forma de realização a película para aplicação tópica é usada no tratamento de lesões na pele.

Descrição geral

O presente pedido de patente baseia-se no desenvolvimento de uma película à base de hidrogel baseado em componentes de origem natural para revestir feridas. Esta película tem a capacidade de conferir um ambiente húmido à ferida, de forma a que ocorra o natural desbridamento autolítico. O filme também incorporará agentes bioativos (p.ex. ácido acetilsalicílico, óleos essenciais, extratos de plantas e outros) que conferem propriedades antibacterianas , antifúngicas, anti-inflamatórias , antioxidantes e regenerativas. As diferentes estratégias de aplicação (p.ex. através de embalagens individuais, ampolas ou seringas) são também exploradas de forma a simplificar a vida dos pacientes, e a minimizar a dor e o desconforto sentidos por estes, aquando do tratamento efetuado ao nível dos cuidados primários .

A forma preferencial de aplicação da película do presente pedido de patente é através de uma formulação administrada em forma de gel no local da ferida, de forma a facilitar a aplicação tópica e proteger o local da lesão contra agentes externos.

Esta formulação destaca-se das existentes no mercado por ter uma constituição qualitativa à base de produtos naturais e/ou modificados, incluindo misturas de agentes bioativos. O gel terá na sua constituição quitosano, extratos de plantas e/ou mistura de extratos de plantas que podem pertencer ao género da Aloe, Matricaria, Lavandula L., entre outros, e/ou agentes antibacterianos e outras substâncias ativas .

Esta tecnologia foi desenvolvida no sentido de apresentar uma composição qualitativa compatível com a aplicação tópica que, por sua vez assume inovação adicional visto que poderemos aplicar sob a forma de embalagens individuais, ampolas, seringas e outros, o que permitirá a aplicação do revestimento de forma simples, sem causar dor, desconforto e constrangimento ao paciente.

Para efeitos do presente pedido de patente, entende-se por película a película definida de acordo com as formas de realização aqui descritas, na sua forma sólida, líquida ou em gel .

Descrição de formas de realização

O presente pedido de patente diz respeito ao desenvolvimento de uma película de hidrogel baseado em componentes de origem natural para revestir feridas, obtido de acordo com seguintes passos:

Processo de desacetilação do quitosano

O quitosano com um peso molecular de 1 a 375 KDa (500 mg) é dissolvido em 10 mL de hidróxido de sódio (1M), durante 3-4 horas, a 50 °C. Posteriormente, a solução é extensivamente lavada com água miliQ, e o pH da solução é ajustado a 7. O quitosano com grau de desacetilação de 55 a 99,999%, usado posteriormente. Um elevado grau de desacetilação do quitosano permite aumentar a quantidade de grupos com carga positiva na superfície do quitosano, melhorando assim as suas propriedades biológicas, nomeadamente propriedades bioadesivas, antimicrobianas e a hidrofilicidade do material.

Modificação do quitosano com aminoácidos (arginina)

O quitosano previamente desacetilado é funcionalizado com arginina. A L-arginina é acoplada à cadeia polimérica do quitosano através da reação de amidação dos grupos amina primários presentes nas unidades glucosaminas do quitosano, recorrendo à reação química do l-etil-3-(3- dimetilaminopropil ) carbodiimida (EDC) /N-hidroxissuccinimida (NHS) . Esta funcionali zação do quitosano com L-arginina, melhora as propriedades biológicas do quitosano, nomeadamente as suas propriedades antimicrobianas. O quitosano desacetilado (1-2%) é dissolvido em ácido acético (1-3% (v/v)) à temperatura ambiente. Posteriormente, NHS e EDC são adicionados à solução separadamente, sob intensa agitação magnética. Por fim, a arginina é adicionada à mistura e a reação de acoplamento ocorre durante 24h. O quitosano funcionalizado com o aminoácido é então purificado através do processo de diálise durante 5 dias, com água desionizada. O polímero é depois recuperado através do processo de liofilização . Outros aminoácidos podem ser acoplados à cadeia polimérica do quitosano de forma a melhorar as propriedades intrínsecas do polímero (lisina, histidina, entre outros ) .

Preparação do extrato de aloe Uma planta do género da aloe com idade compreendida entre 6-10 anos é selecionada. Depois de lavada com água destilada é esterilizada sob radiação ultravioleta, durante cerca de 30-45 minutos. Posteriormente, as folhas da planta são separadas do extrato da planta com o auxilio de um bisturi. O extrato da planta é homogeneizado usando um ultra-homogenei zador, durante 15-25 minutos. Posteriormente, uma centrifugação é realizada de forma a purificar o extrato de aloe. O aloe é um polissacarideo composto essencialmente por manose (60,73%), galactose (16,42%) e glicose (9,16%) . O extrato de aloe tem ótimas propriedades anti- inflamatórias , antissépticas e analgésicas.

Incorporação de agentes preservativos, espessantes e óleos essenciais

Os agentes preservativos (ácido benzóico, benzoato de sódio, gluconato de cálcio, metilparabeno, ácido sórbico, álcool benzilico) são adicionados numa percentagem que pode variar entre 0,05% - 0,10%; os agentes espessantes (etileno de glicol, manitol, xilitol, butil tetraol, entre outros) são também incorporados na mistura, de forma a garantir a fluidez do gel, numa percentagem que pode variar entre 0,05%-0,20%.

Os óleos essenciais e/ou mistura de óleos essenciais como óleo soja, óleo de lavanda, e/ou outros agentes aromatizantes são adicionados com uma concentração final que pode variar de 0-5%

A preparação da película compreende os seguintes passos: Dissolver uma mistura de quitosano desacetilado (a uma percentagem de 15% e 60%) e quitosano modificado (a uma percentagem de 15% e 60%) com aminoácidos em 100 mL de uma solução diluída de ácido lático a uma percentagem de 0,5% a 1% (p/v) ;

Adicionar o extrato de aloe à mistura de quitosano e homogeneizar, com uma concentração final que pode variar de 9, 24-33, 90%;

Dissolver ácido acetilsalicílico, na mistura anterior até ficar uma concentração entre 0,01-0,5%;

- Adicionar óleos essenciais com uma concentração final que pode variar de 0,01-5%;

- Adicionar agentes espessantes a uma percentagem de 0,05%- 0,20% do volume final;

- Adicionar agentes preservativos numa percentagem que pode variar entre 0,05% - 0,10% do volume final;

- Homogeneizar a mistura;

- Remover o ar incorporado na mistura, através de ciclos de sonicação e/ou vácuo;

- Ajustar o pH para valores entre 5,0 e 7,4;

- O gel está pronto a ser aplicada na área lesada.

- A película é formada após aplicação na área lesada.

Numa forma de realização o óleo essencial é óleo de soja, óleo de lavanda ou combinação destes.

Numa forma de realização o agente espessante é etileno de glicol, manitol, xilitol, butil tetraol ou uma combinação destes. Numa forma de realização o agente preservativo é ácido benzóico, benzoato de sódio, gluconato de cálcio, metilparabeno, ácido sórbico, álcool benzilico ou uma combinação destes.

Numa forma de realização o pH é ajustado utilizando uma solução de hidróxido de sódio ou uma solução de ácido orgânico.

Numa forma de realização, a película para aplicação tópica da presente tecnologia compreende os seguintes elementos:

- quitosano desacetilado numa concentração final entre 15% e 60%;

- quitosano-arginina numa concentração final entre 15% e 60%;

- ácido láctico numa concentração final entre 0,5% e 1%;

- extrato de Aloe numa concentração final entre 9% e 34%;

- ácido acetilsalicílico numa concentração final entre 0,01% e 0,5%;

- óleos essenciais numa concentração final entre 0,01% e 5%; agentes espessantes numa concentração final entre 0,05% e 0,20%;

- agentes preservativos numa percentagem de volume final entre 0,05% e 0,10% .

As seguintes tabelas apresentam diferentes formulações que podem ser produzidas.

Exemplo 1

Exemplo 2

Exemplo 3

Exemplo 4

Exemplo 5

Exemplo 6

Quitosano 28,99% desacetilado 4,0 g

Quitosano-arginina 4,0 g 28,99%

Ácido láctico pH 5, 5 0, 5%-l%

Aloe 4,0 g 28,99%

Ácido

acetilsalicilico 0, 8-1, 00 g 5, 78%—7, 25%

Óleos essenciais 0, 01-0, 5 g 0, 07%-3, 62%

Agentes espessantes 0,05-0,2 g 0, 36%-l, 45%

Agentes preservativos 0, 05-0, 1 g 0, 36%-0, 72%

Exemplo 7

Exemplo 8

Exemplo 9

Dados de caracterização dos polímeros

Exemplos de aplicação

A tecnologia descrita no presente pedido destina-se ao tratamento ou melhoria de sintomas dermatológicos, devido a diferentes tipos de lesões, que incluem as feridas agudas (causadas por cortes ou queimaduras), feridas crónicas (úlceras de pressão ou diabéticas), desordens genéticas e intervenções cirúrgicas.

Referências

Ribeiro, Maximiano P., et al . "Development of a new chitosan hydrogel for wound dressing." Wound repair and regeneration 17.6 (2009) : 817-824.

Miguel, Sónia P., et al . "Thermoresponsive chitosan-agarose hydrogel for skin regeneration." Carbohydrate polymers 111 (2014) : 366-373. Antunes, B. P., et al . "Chitosan/arginine-chitosan polymer blends for assembly of nanofibrous membranes for wound regeneration. " Carbohydrate polymersl30 (2015): 104-112.

Miguel, Sónia P., et al . "Electrospun Polycaprolactone/Aloe Vera_Chitosan Nanofibrous Asymmetric Membranes Aimed for Wound Healing Applications." Polymers 9.5 (2017) : 183.

Ishihara, Masayuki, et al . "Acceleration of wound contraction and healing with a photocrosslinkable chitosan hydrogel." Wound repair and regeneration 9.6 (2001) : 513-521.

Zhang, Di, et al . "Carboxyl-modified poly (vinyl alcohol)- crosslinked chitosan hydrogel films for potential wound dressing." Carbohydrate polymers 125 (2015) : 189-199.

Wang, Tao, et al . "Hydrogel sheets of chitosan, honey and gelatin as burn wound dressings." Carbohydrate polymers 88.1 (2012) : 75- 83.

Yang, Chao, et al . "A green fabrication approach of gelatin/CM- chitosan hybrid hydrogel for wound healing." Carbohydrate polymers 82.4 (2010): 1297-1305.

Boucard, Nadège, et al . "The use of physical hydrogels of chitosan for skin regeneration following third-degree burns." Biomaterials 28.24 (2007) : 3478-3488.