技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测技术领域， 具体涉及基于上转换荧光标记技术、 对多种被 检液中特定目标菌浓度进行实吋定量检测的生 物检测系统。

背景技术

[0002] 上转换荧光技术是基于上转换荧光材料的标记 技术。 所谓上转换， 是指长波长 辐射通过上转换荧光材料 （Up-Converting Phosphor,以下简称 UCP) 转换成短波 长辐射， UCP是由几种稀土元素惨杂于某些晶体的晶格中 构成的， 其主要成分 包括主基质、 吸收子、 发射子， 在红外光激发下， UCP发射波长远短于激发光的 可见光。 将 UCP制备成纳米级颗粒， 标记于生物分子， 在长波长光源激发下， 发 出可见荧光， 根据荧光的有无及强弱， 可判断被检生物分子的属性和含量。

[0003] 以 UCP作为标记物的生物检测技术可对被检物进行 无损伤检测， 且具有检测灵 活、 灵敏度高、 使用安全等优点， 同吋， UCP标记物可与仪器结合对目标被检物 进行多重定量检测。 现有技术中， 已经有使用 UCP标记物与免疫层析试纸技术相 结合的检测系统， 其采用激发光源对带有多个功能带的试纸条进 行照明， 由成 像系统和图像接收器接收试纸条上荧光图像， 由图像处理系统对所接收的荧光 图像进行分析处理， 这种检测系统存在如下缺陷： 第一， 需要设计特定结构的 试纸条， 试纸条包括多个功能带， 需要对多个功能带采集信号进行处理， 试纸 条结构复杂， 制备繁琐； 第二， 由于试纸条是非透明的， 由激发光源与试纸条 之间的激发光路到试纸条与图像接收器之间的 接收光路， 二个光路之间必然存 在一个以试纸条为转折点的折射角， 且为了能够照明试纸条的多个功能带， 需 要两个夹角存在特定的数学关系， 使得激发光路和接收光路的设置受限； 第三

， 使用免疫层析试纸条， UCP与生物活性分子的结合物与被检物通过免疫 反应 固定于固相载体的表面， 需要设置专门的固相载体； 第四， 试纸条为一次性使 用产品， 不能重复使用。

技术问题 [0004] 本申请人针对现有技术中的上述缺点进行改进 ， 提供一种荧光生物检测系统， 其基于上转换荧光技术即可实现对多种被检液 中待检目标菌浓度的实吋定量检 测， 整个检测系统无需免疫层析试纸， 且激发光路和接收光路的设置更为简便 问题的解决方案

技术解决方案

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 荧光生物检测系统， 包括发光模块、 荧光接收模块和数据处理模块， 在发光模 块与荧光接收模块之间设有比色皿， 比色皿内盛放有上转换荧光材料标记的检 测试液； 所述发光模块包括红外激发光源， 所述红外激发光源发出的激发光束 通过激发光路照射于盛放有检测试液的比色皿 上， 所述检测试液发出的荧光通 过接收光路由荧光接收模块接收， 所述激发光路与所述接收光路成直线或者直 角设置； 荧光接收模块为光强传感器， 所述光强传感器的输出端连接数据处理 模块。

[0007] 其进一步技术方案为：

[0008] 所述检测试液由上转换荧光探针与病菌特异性 适配体结合物、 磁性探针与病菌 特异性适配体结合物、 待测病菌组成。

[0009] 所述上转换荧光探针由上转换荧光材料经过氨 基化和亲和素化制得， 所述上转 换荧光材料为 NaY0.78F4: Yb0.2, Er0.02纳米颗粒。

[0010] 所述磁性探针为亲和素化的磁珠， 所述磁珠以六水合氯化高铁为铁源、 1， 6- 己二胺作为氨基功能化试剂通过水热 _溶剂热方法合成。

[0011] 所述数据处理模块包括放大电路模块、 抗干扰模块、 单片机信号处理模块、 液 晶显示模块， 所述放大电路模块用于放大接收的荧光信号， 抗干扰模块用于将 所述光强传感器输出的电压信号转换为电流信 号传输， 并在线路终端又转换为 电压信号， 所述单片机信号处理模块进行数据运算处理经 将结果通过所述液晶 显示模块进行实吋显示。

[0012] 所述数据处理模块包括通信模块， 所述通信模块用于单片机与上位机之间的远 程通信。 [0013] 所述红外激发光源采用 980nm近红外光。

发明的有益效果

有益效果

[0014] 本发明的技术效果：

[0015] 相较于现有的采用免疫层析试纸条的检测系统 ， 本发明采用比色皿盛放检测试 液， 通过比色皿来实现液相光谱检测， 一方面， 由于比色皿为透明的， 且比色 皿不存在免疫层析试纸的多个功能带需要照明 的要求， 相较于传统非透明试纸 条的检测系统中激光光路与接收光路特定夹角 的限制条件， 本发明中红外光激 发光路与荧光接收光路二者之间不再受到光学 检测上的限制， 本发明所述检测 系统中， 所述激发光路与接收光路采用 180°直线设置或者直角设置， 在同样光学 检测功能的前提下， 使得整个检测系统中的红外激发光源、 比色皿、 荧光接收 模块三者的设置更为简便； 第二， 现有的免疫层析试纸检测系统需要设计特定 结构的试纸条， 试纸条包括多个功能带， 需要对多个功能带采集信号进行处理 ， 试纸条结构复杂， 制备繁琐， 且 UCP结合物与被检物通过免疫反应固定于固相 载体的表面， 需要设置专门的固相载体， 本发明采用比色皿省却了结构复杂、 制作繁琐的免疫层析试纸， 整个检测系统结构简单， 制作更为简便； 第三， 传 统免疫层析试纸条为一次性使用产品， 重复检测需要不断更换及安装新的试纸 条， 而本发明使用比色皿， 对比色皿清洗之后， 即可进行重复使用。

[0016] 本发明所述检测系统与传统平板菌落计数法相 比， 对被测试液中待检目标菌浓 度的定量检测， 更为快速、 可靠， 且稳定性好。

对附图的简要说明

附图说明

[0017] 图 1为本发明实施例一的原理示意图。

[0018] 图 2为本发明实施例二的原理示意图。

[0019] 图 3为沙门氏菌检测荧光强度一浓度标准回归曲� �。

[0020] 图 4为金黄色葡萄球菌检测荧光强度一浓度标准� �归曲线。

[0021] 其中： 1、 发光模块； 2、 荧光接收模块； 3、 数据处理模块； 4、 比色皿。 本发明的实施方式

[0022] 下面结合附图， 说明本发明的具体实施方式。

[0023] 见图 1、 图 2， 本发明包括发光模块 1、 荧光接收模块 2和数据处理模块 3， 在发 光模块 1与荧光接收模块 2之间设有比色皿 4， 比色皿 4内盛放有上转换荧光材料 标记的检测试液； 发光模块 1包括红外激发光源， 所述红外激发光源发出的激发 光束通过激发光路照射于盛放有检测试液的比 色皿 4上， 所述检测试液发出的荧 光通过接收光路由荧光接收模块 2接收， 所述激发光路与所述接收光路成直线或 者直角设置； 荧光接收模块 2为光强传感器， 所述光强传感器的输出端连接数据 处理模块 3。

[0024] 具体地， 所述数据处理模块 3包括放大电路模块、 抗干扰模块、 单片机信号处 理模块、 液晶显示模块， 所述放大电路模块用于放大接收的荧光信号， 所述抗 干扰模块用于将光强传感器输出的电压信号转 换为电流信号传输， 并在线路终 端又转换为电压信号输出， 所述单片机信号处理模块进行数据运算处理经 将结 果通过液晶显示模块进行实吋显示。

[0025] 进一步地， 所述数据处理模块 3包括通信模块， 所述通信模块用于单片机与上 位机之间的远程通信。

[0026] 检测吋， 将盛放有上转换荧光材料标记的检测试液的比 色皿 4安置好后， 通过 红外光源激发， 比色皿 4中检测试液产生与待测病菌浓度呈一定函数� �系的荧光 ， 所述荧光被荧光接收模块 2检测接收转换成电信号， 然后通过所述放大电路模 块进行所述电信号的放大处理， 同吋考虑线路干扰， 放大的电信号经过数抗干 扰模块传输， 配合所述光强传感器自身的 A/D转换， 转换的数字信号进入到所述 单片机信号处理模块， 进行数据的函数映射、 算数、 逻辑部分处理， 由单片机 将处理输出的结果通过所述液晶显示模块实吋 显示出待测病菌的菌类浓度， 进 一步地， 本发明设有专门的 RS232接口， 可与 32位上位机相连， 通过远程通信技 术， 能够远程实吋监测数据结果， 并作终端数据分析。

[0027] 本发明采用比色皿 4盛放经过上转换荧光材料标记的检测试液， 本发明只需制 备好上转换荧光探针、 磁性探针， 通过待测病菌悬液、 上转换荧光探针、 磁性 探针三者进行混合及常温孵育， 形成三明治夹心复合物， 通过与未结合的上转 换荧光探针进行磁分离， 倒掉上清液， 用沉淀用 BB (lOmM Tris-HCl, pH 7.4,100mM KClfPlmM MgCl ₂ ) 缓冲液重悬后， 将重悬后的所述三明治夹心复合 物试液置于比色皿 4中， 通过红外光源激发红外光对比色皿 4照明， 对所述三明 治夹心复合物试液进行荧光强度测定， 从而绘制待测病菌的荧光强度一浓度 标准回归曲线， 设置该标准回归曲线于本发明所述检测系统中 ， 既能够进行未 知浓度的样品的目标菌浓度测定， 并同吋与经典平板菌落计数法检测结果进行 检测验证。 相较于现有的采用免疫层析试纸条的检测系统 ， 本发明采用比色皿 盛放检测试液， 通过比色皿来实现液相色谱检测， 一方面， 由于比色皿为透明 的， 且比色皿不存在免疫层析试纸的多个功能带需 要照明的要求， 相较于传统 非透明试纸条的检测系统中激光光路与接收光 路特定夹角的限制条件， 本发明 中红外光激发光路与荧光接收光路二者之间不 再受到光学检测上的限制， 根据 比色皿的方形常用形状， 本发明所述检测系统中， 所述激发光路与接收光路采 用 180°直线设置或者直角设置， 图 1中所述检测系统为激发光路与接收光路成 180 。设置， 图 2中所述检测系统为激发光路与接收光路成直� �设置， 优选 180°直线设 置， 使得整个检测系统中的红外激发光源、 比色皿、 荧光接收模块三者的设置 更为简便； 第二， 现有的免疫层析试纸检测系统需要设计特定结 构的试纸条， 试纸条包括多个功能带， 需要对多个功能带采集信号进行处理， 试纸条结构复 杂， 制备繁琐， 且 UCP结合物与被检物通过免疫反应固定于固相载 体的表面， 需 要设置专门的固相载体， 本发明采用比色皿省却了结构复杂、 制作繁琐的免疫 层析试纸， 整个检测系统结构简单， 制作更为简便； 第三， 传统免疫层析试纸 条为一次性使用产品， 重复检测需要不断更换及安装新的试纸条， 而本发明使 用比色皿， 对比色皿清洗之后， 即可进行重复使用。

[0028] 本发明所述红外激发光源采用 980nm近红外激发光， 其光化学稳定， 环境适应 性强， 穿透力强且无伤害， 成本相对低廉。

[0029] 具体地， 所述检测试液由上转换荧光探针与病菌特异性 适配体结合物、 磁性探 针与病菌特异性适配体结合物、 待测病菌组成。 所述上转换荧光探针由上转换 荧光材料经过氨基化和亲和素化制得， 所述上转换荧光材料为 NaY ₀ , ₈ F ₄ ： Yb 0.2, Er。.。 ₂ 纳米颗粒； 所述磁性探针为亲和素化的磁珠， 所述磁珠以六水合氯化高铁 为铁源、 1， 6 -己二胺作为氨基功能化试剂通过水热一溶剂� �方法合成。 以 下对所述上转换荧光探针和所述磁性探针的具 体制备进行说明。

[0030] 所述上转换荧光探针的制备过程如下：

[0031] 第一步， 采用水热一溶剂热方法合成 NaY o. ₇₈ F ₄ ： Yb。. ₂ , Er。.。 ₂ 上转换纳米颗粒

(以下简称为 UCNPs) ： 取 Y ₂ 0 ₃ 、 Yb ₂ 0 ₃ 、 Er ₂ 0 ₃ (Ln=Y:Yb:Er=78:0.2:0.02) ， 将三者混合物加入适量硝酸中加热溶解， 并挥发掉多余硝酸， 得到稀土元素 的硝酸盐粉末； 将稀土元素的硝酸盐粉末溶解在 8 mL去离子水中， 再加入 2.1273 g EDTA (乙二胺四乙酸， 其与 RE ³ +的摩尔比为 1:1) 并调节 pH至弱碱性， 形成 澄清透明的 EDTA-Ln ³⁺ 溶液； 取 25 mL乙二醇， 力口入 0.4 g CTAB (十六烷基三甲 基溴化铵） 和前述所得的 EDTA-Ln 3+溶液， 快速搅拌下逐滴加入 HF (氢氟酸） 约 3 mL， 得到白色乳状胶体； 最后， 在前述所得的白色乳状胶体中加入 5.5 mL 浓硝酸， 搅拌均匀后， 转移到 50 mL带聚四氟乙烯内衬的反应釜中， 195 °C 反应 24小吋。 反应结束后， 让其在空气中自然冷却至室温， 弃上层液体， 釜底 的固体用热水冲洗到烧杯中， 超声 10分钟， 然后静置数分钟， 待固体沉淀至烧 杯底部后， 弃上层液体， 再加热水超声， 重复操作 3次后， 在烧杯中加入乙醇超 声分散， 最后离心所得的固体置于 70 °C烘箱干燥 10小吋， NaY。. ₇₈ F _4: Yb。. ₂ , E _r 。.。 ₂ 上转换纳米颗粒 （UCNPs) 固体粉末并储存备用；

[0032] 第二步， 氨基化： 取 20mgUCNPs溶解于 60mL异丙醇中， 超声 40分钟， 然后加 入 2.5mL氨水和 20mL水， 在 35°C下充分搅拌， 然后一个小吋内逐滴滴入溶有 50u L

TEOS (正硅酸乙酯） 的 20mL异丙醇， 反应 3个小吋形成悬浮液， 再将溶有 200u L APTES (3-氨丙基三乙氧基硅烷） 的 30mL异丙醇逐滴加入前述所得悬浮液中 ， 反应一个小吋； 反应结束后在室温下熟化 2小吋， 通过离心分离得到沉淀固体 ， 对沉淀所得固体用乙醇洗三次， 并在 60。C下干燥 12小吋， 则最终得到氨基化的 上转换纳米材料；

[0033] 第三步， 亲和素化： 根据戊二醛法， 使第二步所得的氨基化的上转换纳米材料 与亲和素相连， 形成亲和素化的上转换纳米材料； [0034] 第四步， 将第三步所得的亲和素化的上转换纳米材料， 与相应病菌特异性适配 体结合得到上转换荧光探针；

[0035] 将第四步所得上转换荧光探针溶于 5ml PBS (磷酸盐缓冲液） 溶液， 静置 6小吋

， 在 4°C下保存待用。

[0036] 所述磁性探针的制备过程如下：

[0037] 第一步， 采用水热 溶剂热方法合成磁珠： 以六水合氯化高铁为铁源， 以 1 ， 6—己二胺作为氨基功能化试剂， 称取 1， 6 己二胺 6.5g， 无水醋酸钠 2.0g、 F eC13*6H20 l.Og溶于 30mL乙二醇， 加入 lOOmL圆底烧瓶中， 50°C剧烈搅拌 0.5小 吋左右至溶液较为透明， 将溶液转移至带聚四氟乙烯内衬的高压反应釜 中， 放 置在 198°C高温反应 6小吋， 反应结束后取出自然冷却至室温， 将反应釜中液体倒 在烧杯中， 用无水乙醇和纯水交替清洗三次， 将反应釜底部的黑色固体在 50。C条 件下干燥过夜， 得到氨基化的磁性纳米粒子， 即氨基化的磁珠；

[0038] 第二步， 亲和素化： 根据戊二醛法， 使第二步所得的氨基化的磁珠与亲和素相 连， 形成亲和素化的磁珠；

[0039] 第三步， 将第三步所得的亲和素化的磁珠， 与相应病菌特异性适配体结合得到 磁性探针；

[0040] 将第三步所得磁性探针溶于 lOmL O.Olmol/L的 PBS (磷酸盐缓冲液， pH7.4) 溶 液中， 4°C保存备用。

[0041] 实施例一沙门氏菌的检测

[0042] 沙门氏菌经富集培养后， 离心去除培养基， 用平板法测定其浓度后， 将其梯度 稀释成不同标准浓度 （cfu/ml) 的菌悬液； 分别取 5μί沙门氏菌适配体， 加入 lm L浓度均为 lmg/mL的亲和素化的磁珠和亲和素化的上转换纳 米材料， 摇床反应 1 2小吋， 最后加入 2% BSA (牛血清白蛋白） 封闭液， 得到磁性探针和上转换荧 光探针； 等体积的梯度沙门氏菌标准浓度菌悬液分别加 入 200μ1上转换荧光探针 和 80μ1磁性探针， 37°C孵育 40分钟后， 形成三明治夹心复合物， 通过与未结合的 上转换荧光探针进行磁分离， 倒掉上清液， 用沉淀用 BB缓冲液重悬后， 将重悬 后的所述三明治夹心复合物试液置于比色皿 4中， 通过红外光源激发红外光对比 色皿 4照明， 对所述三明治夹心复合物试液进行荧光强度测 定， 从而绘制被测试 液中沙门氏菌的荧光强度一浓度标准回归曲线 见图 3， 图 3中， 横轴表示沙门 氏菌菌悬液的浓度， 数轴表示比色皿中所述三明治夹心复合物检测 试液的荧光 强度， 从该回归曲线可见， 比色皿中检测试液的荧光强度与沙门氏菌的浓 度呈 一定线性函数关系， 且经统计拟合的荧光强度一浓度标准回归曲线 的表达式 为： Y=169.66X-35.2， 拟合系数的平方为 0.9964， 检出限为 5cfu/ml; 另一方面， 通过该统计拟合的函数关系式， 即能够使用本发明所述检测系统对未知浓度样 品中的沙门氏菌浓度进行测定， 并同吋与经典平板法检测结果进行检测验证。 其中， 沙门氏菌适配体采用生工生物工程 （上海） 股份有限公司合成的沙门氏 菌适配体： 5' - biotin-C6-TAT GGC GGC GTC ACC CGA CGG GGA CTT ATG GAC ATT ACA G-3'。

[0043] 对湖水、 河水、 小沟水分别取样， 分别通过传统的平板菌落计数法和本发明所 述检测系统检测其中沙门氏菌的浓度， 二者检测结果比对如下表 1 :

[0044] 表 1 平板菌落计数法与本发明所述检测系统对沙门 氏菌检测的检测结果对比

[]

[0045] 根据上述表 1实验数据比对可见， 本发明所述检测系统与经典平板菌落计数法 的检测结果基本吻合。

[0046] 实施例二金黄色葡萄球菌的检测

[0047] 金黄色葡萄球菌经富集培养后， 离心去除培养基， 用平板法测定其浓度后， 将 其梯度稀释成不同标准浓度 （cfu/ml) 的菌悬液； 分别取 5μί金黄色葡萄球菌适 配体， 加入 ImL浓度均为 Img/mL的亲和素化的磁珠和亲和素化的上转换纳 米材 料， 摇床反应 12小吋， 最后加入 2%BSA (牛血清白蛋白） 封闭液， 得到磁性探 针和上转换荧光探针； 等体积的梯度金黄色葡萄球菌标准浓度菌悬液 分别加入 2 ΟΟμΙ上转换荧光探针和 ΙΟΟμΙ磁性探针， 37。C孵育 40分钟后， 形成三明治夹心复 合物， 通过与未结合的上转换荧光探针进行磁分离， 倒掉上清液， 用沉淀用 BB 缓冲液重悬后， 将重悬后的所述三明治夹心复合物试液置于比 色皿 4中， 通过红 外光源激发红外光对比色皿 4照明， 对所述三明治夹心复合物试液进行荧光强度 测定， 从而绘制金黄色葡萄球菌的荧光强度一浓度标 准回归曲线， 绘制的金 黄色葡萄球菌的荧光强度一浓度标准回归曲线 见图 4， 图 4中， 横轴表示金黄 色葡萄球菌菌悬液的浓度， 数轴表示比色皿中所述三明治夹心复合物检测 试液 的荧光强度， 从该回归曲线可见， 比色皿中检测试液的荧光强度与被测试液中 金黄色葡萄球菌的浓度呈一定线性函数关系， 且经统计拟合的荧光强度一浓 度标准回归曲线的表达式为： Y=118.5X+15.6， 拟合系数的平方为 0.9936， 检出 限为 8cfu/ml _; 另一方面， 通过该统计拟合的函数关系式， 即能够使用本发明所 述检测系统对未知浓度样品中的金黄色葡萄球 菌浓度进行测定， 并同吋与经典 平板法检测结果进行检测验证.。 其中， 金黄色葡萄球菌适配体采用生工生物工 程 （上海） 股份有限公司合成的金黄色葡萄球菌适配体： 5'-biotin-C6-GCA ATG

[0048] 对湖水、 河水、 小沟水分别取样， 分别通过传统的平板菌落计数法和本发明所 述检测系统检测其中金黄色葡萄球菌的浓度， 二者检测结果比对如下表 2:

[0049] 表 1平板计数法与本发明所述检测系统对金黄色� �萄球菌检测结果对比

[]

样品 平板计数法 便携式上转换荧光检

^s-s . - ¾■ 乙 _L_ a 2ii土 'ό , 2 河水 75土 2. 8

4、询水 239 ± . 3 226土 3. 2 根据上述表 2实验数据比对可见， 本发明所述检测系统与经典平板菌落计数法 的检测结果基本吻合。