Derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel con actividad antineoplasica, método para obtenerlos y sus aplicaciones

2. Sector de la técnica

1) farmacéutico-bioquímico; 2) compuestos para el análisis de la diana celular de los fármacos anticancerosos paclitaxel y docetaxel, y para la terapia anticancerosa directa o fotodmámica.

3. Estado de la técnica

Paclitaxel (o taxol, marca registrada por Brystol-Myers Squibb) , un diterpeπoide natural que se extrae de la corteza del tejo del Pacífico, Taxus brevifolia, y su análogo de síntesis docetaxel (10-desacetι!-3'-(N-desbenzoιl)-3 ^' - (N-tertbutiloxιcarbonii)paclιtaxel, o taxotere, marca registrada por Rhóne-Pouleπc) están actualmente entre las más prometedoras drogas anticancerosas debido a su capacidad para estabilizar los microtúbulos del citoesqueleto y, por consiguiente, para inhibir la división celular. Sin embargo, ambos fármacos presentan varios inconvenientes en su utilización en terapia humana, principalmente una solubilidad muy reducida en el plasma sanguíneo, asi como vanos efectos secundarios. Un buen numero de laboratorios implicados en la lucha contra el cáncer dirigen actualmente su atención a la obtención de nuevos fármacos anticancerosos por modificación química de estas dos moléculas de taxanos, así como a la aclaración de su mecanismo de acción bioquímica. Algunos de los inventores de la presente patente han descrito las estructuras de los microtúbulos formados por la acción de paclitaxel (Andreu y cois., J. Mol. Biol. 1992, 226, 169 y J. Biol. Chem. 1994, 50, 31785), el ensamblaje de GDP-tubulma en presencia de taxoides y ia relación entre la reacción de unión de paclitaxel y la de formación de microtúbulos (Díaz y cois., Biochemistry 1993, 32, 2747 y 10067). Para los investigadores que estudian los microtúbulos celulares y el mecanismo de acción de estas drogas sería de inmediata utilidad disponer de un derivado luminiscente (ya que ni paclitaxel ni docetaxel lo son) que, además,

fuese suficientemente soluble en agua. Esto permitiría: a) el estudio directo m vivo, mediante microscopía de fluorescencia, de los microtubulos diana en los cultivos celulares, y b) disponer de una poderosa herramienta para estudiar el mecanismo molecular del ensamblaje de los microtúbulos inducido por estos taxaπos, y para descubrir otras posibles dianas de las drogas dentro de la célula. Por otra parte, la observación directa, de una manera sencilla, de las ceiulas en las que el taxano ha ejercido su efecto permitiría desarrollar nuevos métodos de análisis y de diagnostico relacionados con el tratamiento de pacientes con estas drogas. Ademas, las especificas propiedades fotoquímicas de los colorantes se podrían utilizar como ruta adicional en la destrucción de la célula cancerosa.

Algunos derivados fluorescentes de ambos taxanos se han descrito ya en la bibliografía. Sin embargo, el éxito de su aplicación a los anteriores objetivos ha sido hasta ahora muy limitado. Se ha descrito un derivado de pachtaxel que posee un grupo dansilo en la posición 7, unido a través de un grupo de /3-alanιna como espaciador (Kingston, Pharmac. Ther. 1991 , 52, 1), aunque la bioactividad de este compuesto esta pendiente de demostración. También se ha dado cuenta de dos derivados fluorescentes de paclitaxel con grupos amino en su molécula: uno con un grupo m-amiπo en el benzoilo en posición 2 (Han y cois., Mol. Biol. Cell 1994, 5, 284a), pero el derivado es menos activo que la droga de la que procede, y otro con un grupo m-dimetilamino en el benzoilo en posición 3' (Sengupta y cois., Biochemistry, 1995, 34, 11889) cuya actividad biológica es similar a la de paciitaxel. La fluorescencia de estos dos aminodeπvados es baja, aunque mayor que la del propio paclitaxel, y los valores de los coeficientes de extinción molar son pequeños. Esto hace que para su detección sea necesario utilizar altas concentraciones del derivado fluorescente. Cuando esto no es posible, dicha detección no se puede realizar. Asimismo se han descrito varios derivados fluorescentes de docetaxel con un grupo 7-nιtrobenz-2-oxa-1 ,3-dιazo-4-ιlo en la posición 7, o en la 3' de su derivado 3'-NH-desacιlado, o bien con un grupo biotina en las posiciones 7, 10 o 3' (Dubois y cois., Bioorg. Med. Chem., 1995, 10, 1357). En todos estos últimos compuestos los grupos fluorescentes están unidos al esqueleto de paclitaxel a través de un grupo 6-amιnocaproιco como espaciador. Sin embargo, sus actividades biológicas en células vivas parecen

discrepantes, y tiñen defectuosamente los microtubulos celulares Por ultimo, existe comercialmente disponible (Molecular Probes, Holanda) un derivado de 3'- NH-desbenzoilpachtaxel fluorescente (BODIPY-FL-Taxol, marca registrada) que posee un grupo de pirrometeno BF ₂ sustituido en el grupo NH en dicha posición 3', pero cuya solubilidad en agua es baja, lo que nuevamente limita considerablemente su empleo

Una alternativa para visualizar el sistema de microtubulos celulares consiste en utilizar las bien conocidas técnicas de mmunofluorescencia, por ejemplo mediante un anticuerpo fluorescente anti-tubulina. Estas técnicas, comercialmente disponibles, son indirectas, complejas y laboriosas, y permiten observar el sistema de microtubulos solo después de que estos hayan interaccionado con el taxano Obviamente, estas técnicas de inmunofluorescencia no podrían substituir a las basadas en una molécula de paclitaxel o docetaxel fluorescente, porque en aquellas los microtubulos interaccionan con una protema (IgG o sus fragmentos), y porque tanto la posición como la forma de actuación de dicha protema y del taxano anticanceroso deben ser diferentes.

4. Descripción de la invención

4.1 La presente invención esta basada en la obtención de derivados de los agentes anticancerosos pachtaxel y docetaxel que, ademas de conservar la bioactividad, emiten fluorescencia al ser excitados con luz visible Esta propiedad permite, mediante microscopía de fluorescencia, detectar: a) las células que han reaccionado con la droga, y b) a que parte de la célula se ha unido dicha droga. Los derivados de paclitaxel y de docetaxel cuya obtención y empleo aquí se patentan permiten ademas transportar al interior de la célula mayores concentraciones de la droga anticancerosa Por otra parte, usando el mismo método de obtención, pueden unirse a la droga grupos moleculares que, al ser iluminados con luz visible, generen productos tóxicos para la célula

4.2 Mas concretamente, la invención describe la obtención y el empleo de derivados de paclitaxel o docetaxel que poseen un grupo cromoforo, unido al núcleo de la droga por la posición 7 a través de un espaciador Es bien sabido que las modificaciones en el hidroxilo en esta posición 7 en la molécula de

paciitaxel no afectan apreciablemente a la actividad biológica de la droga. Los numerosos derivados aquí patentados se obtienen básicamente por un procedimiento químico que comprende dos pasos:

Primer paso: estenficación selectiva del grupo alcohólico en la posición 7 de la molécula de paciitaxel o docetaxel con ácidos carboxilicos que poseen en su molécula al menos un grupo amino primario libre. Esta reacción puede llevarse a cabo de diferentes modos, en general en varios pasos, siempre con aminoácidos con el grupo amiπo adecuadamente protegido, y con protección química adicional de los grupos del taxaπo que también puedan esteπficarse. En la presente invención se ha usado preferentemente un procedimiento que comprende tres etapas, básicamente similares a las descritas por Mathew y cois en J. Med. Chem. 1992, 35, 145 para la esteπficacion en posición 7 de paciitaxel con L-alanma: 1) estenficación de los grupos alcohólicos en posiciones 7 y 2' de paclitaxel o docetaxel con un aminoácido con el grupo amino protegido (por ejemplo, con el grupo N-tertbutoxicarboniio); 2) desprotección de ambos grupos amino en el diéster por reacción con ácido fórmico; y 3) hidrólisis acuosa selectiva del grupo éster en posición 2'. El aminoácido que se emplea para esterificar la posición 7 puede tener el grupo amino primario separado del carboxíhco por una cadena de 1 a 18 carbonos, lineal o ramificada, o por un grupo fenileno, con o sin sustituyentes alquílicos, y puede ser cualquiera de los α-L-aminoácidos naturales conocidos, como glicina, alanina, prolina, etc, sus D-isomeros, las mezclas racémicas correspondientes, o cualquier compuesto que posea simultáneamente en su molécula los grupos ácido carboxilico y amino primario.

Segundo paso: unión covaleπte de un cromóforo luminiscente (fluorescente o fosforescente) a dicho grupo amino del derivado de paclitaxel o docetaxel obtenido en el primer paso, mediante reacción con una molécula de un colorante que posee un grupo con reacción selectiva con grupos ammo. El grupo específico de la molécula de colorante que reacciona con el grupo amino del derivado de pachtaxel o docetaxel puede ser cualquiera de los que se conocen por su alta afinidad reactiva frente a aminas primarias, tales como isocianatos, isotiocianatos, succmimidilésteres, ácidos carboxílicos o sus haluros y ácidos sulfónicos o sus haluros. El colorante con el anterior grupo reactivo de aminas primarias es

siempre un derivado de otro colorante, elegido entre los de las familias de los colorantes fluorescentes: xantenos (fluoresceina, Floxma, Eosina, Eπtrosina, Rosa de Bengala, etc), Hacinas (tioniπa, Azul de Metileno, Azure A, Azure B, etc), rodaminas (Rodamina B, Rodamιna 3B, Rodamina 19, Rodamina δG, Rodamma 101 , Rodamiπa 123, etc), cumaπnas, porfinnas, aminonaftalenos, hidrocarburos policichcos, polienos, y complejos de pirrometenos con trifluoruro de boro, que se unen al derivado de paclitaxel o docetaxel por el grupo amino libre existente en el sustituyente en la posición 7 de la droga.

Las únicas limitaciones de las anteriores reacciones de esteπficacion en posición 7 con un aminoácido y posterior sustitución del grupo amino del derivado de paclitaxel o docetaxel con un resto de colorante son:

1) las reacciones no deben alterar la estructura molecular del núcleo de paclitaxel o docetaxel, excepto en lo que se refiere a la esteπficacioπ de su posición 7, ni la del núcleo cromofóπco del colorante; 2) las propiedades biológicas del derivado luminiscente de paclttaxel o docetaxel deben ser idénticas, o muy similares, a las del correspondiente taxano sin sustituir;

3) las propiedades de absorción y emisión de luz del cromóforo unido a la molécula de paclitaxel deben ser muy similares a las del colorante correspondiente en estado libre;

4) las propiedades de solubilidad en agua del derivado de paclitaxel o docetaxel finalmente obtenido deben ser tales que permitan su rápido paso a través de la membrana celular, si como su fácil disolución en el medio acuoso citoplasmatico. Una interesante aplicación de todos estos derivados es el empleo como fotosensibiiizadores para la terapia fotodinamica anticancerosa, especialmente los derivados que llevan incorporados cromóforos que poseen altos rendimientos cuantieos en la generación de la especia activa oxigeno molecular singlete. Esta aplicación esta basada en la capacidad de paclitaxel y docetaxel para atravesar la membrana celular y unirse a la tubulina y a los microtubulos del citoesqueleto. La célula asi marcada puede ser irradiada con luz visible, que sena absorbida por el cromoforo unido al taxano, dando lugar a la generación de oxigeno singlete, un

fuerte oxidante que provocaría la destrucción, no solo de la célula marcada, sino también de las que se encuentren próximas

Otras aplicaciones

Algunos de los derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel descritos en esta patente poseen una propiedad excepcional ¹ traspasan con facilidad la membrana celular externa y se unen de forma permanente a los microtubulos del citoesqueleto celular conservando la intensa fluorescencia Esto hace que sea posible utilizar estos derivados específicos de pachtaxel y docetaxel en concentraciones muy bajas, por debajo de micromolares Los inventores de esta patente han descubierto que en estas condiciones los microtubulos del citoesqueleto celular y cualquier estructura celular conteniendo tubulmas (x y _t ^" 3 (cilios, flagelos, etc.) permanecen estructural y funcionalmente intactos, pese a que son perfectamente observables a través de la intensa emisión de fluorescencia del derivado de paclitaxel o docetaxel que se encuentra unido específicamente a dichas estructuras

Esto hace posible que la célula o el organismo celular siga ^" esarrollan ^' o todas sus funciones biológicas sin alteración (crecimiento, reproducción, metabolismo, movilidad, etc ) Como, simultáneamente, la parte fluorescente del derivado mantiene la intensa luminosidad, este método permite observar y caracterizar la célula u organismo mediante técnicas de detección y visualizacion de la intensidad de la luz emitida. En esta forma, los derivados fluorescentes citados de paclitaxel y docetaxel se pueden utilizar como nuevos colorantes específicos celulares de fluorescencia. de uso simple y directo, apropiados para la tinción de una gran variedad de células y organismos sin alterar su viabilidad

A titulo ilustrativo, y sin que sea considerado como limitación al alcance de la presente patente, se indica que se ha aplicado el derivado paclitaxel-alanina- fluoresceina en la tinción fluorescente de microtubulos en células vivas, epiteliales y de tejido nervioso, asi como en la tinción de organismos unicelulares vivos,

como el Trypanosoma cruα. Hay que destacar que actualmente no existe ningún método comercialmente disponible para la tinción fluorescente de los microtubulos del citoesqueleto que permita observar las células u organismos in vivo, es decir, sin alterar sus funciones vitales.

Esta novedosa y excepcional propiedad de los derivados fluorescentes de paclitaxel y docetaxel es el fundamento de las siguientes aplicaciones:

a) nuevos métodos de análisis y diagnostico de enfermedades relacionadas con organismos celulares dotados de cilios y/o flagelos, fácilmente identificares a través de la observación y detección de sus sistemas característicos de microtubulos y de su evolución temporal, b) nuevos métodos, de análisis y diagnostico de enfermedades en las que se producen alteraciones o destrucción del sistema y tejidos nerviosos, fácilmente identificables a través de la observación y detección de los sistemas característicos de microtubulos; c) nuevos métodos de estudio, clasificación, observación y seguimiento de cualquier célula u organismo celular que contenga microtúbulos o tubulinas α y β.

5. Descripción del esquema

El esquema muestra las estructuras moleculares de paclitaxel y docetaxel, las correspondientes moléculas conteniendo el espaciador -CO-R'-NH ₂ en la posición 7, y la estructura resultante de unir un colorante genérico, R ² -colorante, por reacción con el grupo NH ₂ del espaciador, asi como los posibles grupos R ² con reacción selectiva con grupos aminos primarios. La parte inferior del esquema muestra las estructuras de los tres derivados de paclitaxel que sirven de ejemplo en esta invención, con el cromoforo de una cumaπna, una rodamma o fluoresceina en la molécula.

paclitaxet (taxol) docetaxel (taxotere) fórmula abreviada r-OH fórmula abreviada i T-OH

fórmula abreviada de los taxanos pachtaxel y docetaxel h-OH

R2. colorante

|-OCO-<Rl )-NH2 ]IθCO-(R ¹ >-NH-CO-l colorante taxano-espaciador taxanc-espaciador-coiorante

R ¹ = cadena carbonada lineal o ramificada, saturada o insaturada, de 1 a 18 carbonos, o grupo fenileno. libre o sustituido

ico o tiocianato o sus haluros o sus haluros (X = 0) (X=halógeno) (X=halógeno)

fórmula abreviada de un resto de colorante colorante

T-

paclrtaxel-alanina-cumaπna

paclrtaxel-alanina-rodamina paclrtaxel-alanma-nuoresceina

6. Ejemplos de realización

A título ilustrativo, y sin que sea considerado como limitación al alcance de la presente patente, a continuación se ilustran ejemplos de la unión química de tres colorantes, una cumaπna, una rodamina y un xanteno, a ia posición 7 de la molécula de paclitaxel, a través de un espaciador de L-alanma, asi como un ejemplo practico del empleo de uno de ellos, el derivado con el grupo fluoresceíπa, para la visualización de los microtubulos celulares. Se han elegido estos tres fluoroforos porque muestran propiedades químicas, espectroscopicas y fotofísicas que son óptimas para los fines perseguidos en la presente invención: altos coeficientes de absorción a longitudes de onda alejadas de la absorción intrínseca de las proteínas, y próximas a los máximos de emisión de los láseres

comerciales disponibles, asi como altos rendimientos en la emisión de fluorescencia, y valor elevado de la polarización de la emisión (anisotropia). Ejemplo 1 Obtención de paclitaxel-alanina-cumaπna (ver formula)

A una disolución de 7-(L-alanιl)paclιtaxel sin purificar (10 mg, 10.8 mmol) (obtenido a partir de paclitaxel, con un rendimiento total del 70 %, siguiendo básicamente el procedimiento descrito por Mathew y cois., J. Med. Chem. 1992, 35, 145), y tπetilamiπa (15 μL, 108 μmol) en dioxano (1 mL) se añade otra de 7-dιmetιiamιnocumaπn-4-acetato de succimmidilo comercial (5.6 mg, 16.2 μmol) en dioxano (0.5 mL). Tras agitar durante 24 horas a temperatura ambiente en la oscuridad, el disolvente se elimina a vacio. El producto crudo paclitaxel-alanina- cumaπna se purifica por cromatografía en capa fina preparativa (gel de sílice, acetato de etilo-diclorometaπo 1 -1 como eluyente). Rendimiento: 9 5 mg (77 %). Punto de fusión: 182-185 ^S C. Pureza por cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) > 96 % (columna C-4, desde el 20 al 80 % de acetonitnlo en agua como eluyente) . Solubilidad en agua: 1 μM. El producto se identifica por espectrometría de masas con bombardeo de átomo pesado (MS-FAB ^* ) y por resonancia magnética nuclear de protón Ejemplo 2. Obtención de paclitaxel-alanina-rodamma (ver formula)

A una disolución de 7-(L-alanyl)paclιtaxel sin purificar (10 mg, 10.8 mmol) (obtenido como se dice antes) en una mezcla de dimetilformamida (1 mL) y tampon acuoso de pH 9 (carbonato/bicarbonato) (1 mL) se añade otra disolución de tetrametιlrodamιna-4'-carboxιlato de succimmidilo comercial (8.6 mg , 16.2 mmol) en la misma mezcla de disolventes (1 mL). Tras agitar 2 horas, se separa el disolvente a vacio, y el producto crudo paclitaxel-alanma-rodamina se purifica por cromatografía en capa fina preparativa (gel de sílice, acetato de etilo- diclorometano 1 :4). Rendimiento: 7.9 mg (55 %). Pureza (por HPLC, condiciones como antes) > 92 % El producto se identifica como antes. Ejemplo 3: Obtención de paclitaxel-alanina-flυoresceina (ver fórmula)

Siguiendo las mismas condiciones, proporciones y método de purificación que en el caso de ia obtención del derivado paclitaxel-alaπina-rodamina, se obtienen 8.0 mg (60 %) de producto Punto de fusión > 300 ^g C. Pureza (HPLC) > 92 %. Solubilidad en agua 300 μM (solubilidad de paclitaxel en et mismo medio:

5 μM, según Nicolaou y cois , Nature 1993, 364, 464). El producto se identifica como antes.

Ejemplo 4 Observación mediante microscopía de fluorescencia de los microtubulos celulares con ayuda del colorante vital paclitaxel-alanma- fluorescema

Células PtK2 se tratan con el derivado paclitaxel-alanina-fluorescema (1 μM), se lavan con disolución salina de tampon de fosfato, se montan sin fijación en una disolución de tampon de glicina 0.13 M de pH 8.6, cloruro sódico 0.20 M y gliceππa al 70% (de acuerdo con lo descrito por Inés y cois., Cáncer Res. 1994, 54, 75), y se observan con un microscopio de epi-fluorescencia Los microtubulos citoplasmicos son perfectamente visibles, asi como los husos en las células en proceso de división La calidad de la imagen es al menos semejante a la que se obtiene mediante procedimientos habituales de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos anti-tubulma sobre células fijadas, distinguiéndose microtubulos individuales.