La présente invention concerne une composition d'additif alimentaire destiné au traitement préventif de la coccidiose. La présente invention concerne également une composition nutritionnelle contenant cet additif et qui permet de traiter à titre préventif la coccidiose.

La coccidiose est une maladie des intestins dont les agents pathogènes sont des protozoaires qui envahissent peu à peu l'épithélium intestinal, empêchant l'absorption des nutriments et entraînant une perte de poids chez l'individu contaminé pouvant même aboutir, à terme, à son décès.

Les coccidioses atteignent aussi bien les mammifères, tels que le bétail ou l'homme, que les oiseaux chez lesquels, avec certaines espèces très pathogènes, elles peuvent entraîner la mort. Chez I'homme, elle peut également s'avérer dangereuse en particulier en cas d'affaiblissement du système immunitaire.

On utilise couramment pour traiter la coccidiose des antibiotiques de synthèse, des composés ionophores et d'autres produits de synthèse non antibiotiques.

En plus de leur prix de revient, ces traitements génèrent des effets secondaires ainsi que l'apparition d'une résistance du protozoaire, notamment dans le cas des non antibiotiques de synthèse. En particulier, le traitement par antibiotiques du bétail destiné à la boucherie s'avère extrêmement gênant du fait de l'accumulation des antibiotiques dans l'organisme de l'animal. En effet, plusieurs cas de décès chez l'humain ont été recensés et attribués à des prises d'antibiotiques sur une trop longue période qui pourraient être causées, non pas par un quelconque traitement thérapeutique, mais bien par l'ingestion de viandes contenant de fortes doses d'antibiotiques.

En remplacement des traitements précités et à des fins préventives, le document WO 96/13175 préconise dans le cas de la volaille, I'utilisation d'un additif alimentaire contenant un mélange de crésols, gaïacol, thymol, anéthol, eugénol, capsaïne et tanin en combinaison avec un agent émulsifiant. Ce mélange ne présente pas d'effet microbicide sur les oocystes sporules de coccidie mais bloque en revanche la réinfestation après le premier passage de coccidies dans le tractus digestif de la volaille.

Cette composition d'additif alimentaire à base d'huiles essentielles naturelles facilement assimilables ou dégradables par l'organisme présente peu ou pas d'effets secondaires et surtout ne cause aucune accumulation de substances actives dans les tissus.

Cependant, d'un point de vue économique, le coût de fabrication d'un tel additif est relativement élevé, du fait notamment de la diversité de ses composants.

Le but de la présente invention est donc de proposer une composition d'additif alimentaire en vue d'un traitement préventif de la coccidiose dont la fabrication soit économiquement intéressante.

Ce but est atteint au moyen d'une composition d'additif alimentaire destiné au traitement préventif de la coccidiose, qui de manière caractéristique selon l'invention contient exclusivement un tanin ou d'un mélange de tanins à titre d'ingrédient actif. Selon l'invention, I'additif alimentaire contient donc comme seul ingrédient actif un ou des tanins, à l'exclusion notamment des huiles essentielles.

C'est donc le mérite de la Demanderesse que d'avoir mis en évidence que le tanin s'avère être à lui seul particulièrement actif dans le traitement préventif de la coccidiose. En effet, les compositions alimentaires connues destinées au traitement de la coccidiose contiennent toutes des huiles essentielles. Outre le document WO 96/13175 précité, on peut citer notamment le document WO 97/01348 qui préconise pour le traitement de la coccidiose du poulet, l'utilisation d'une préparation pharmaceutique à base d'huiles essentielles contenant entre 55% et 70% en masse de thymol et de carvacrol, la proportion carvacol/

thymol étant d'au moins 10. Cette composition ne contient donc pas de tanin. Ce même document préconise l'ajout de tanin uniquement dans le cas du traitement de diarrhées provoquées par des bactéries telles que Salmonella, staphylococcus, Pasteurelia et Escheria Coli ; le tanin étant connu pour ses effets bénéfiques sur la diarrhée. Tous les documents de I'art antérieur indiquent donc que les huiles essentielles sont les ingrédients actifs et donc indispensables d'une composition destinée au traitement de la coccidiose. C'est donc le mérite de la Demanderesse que d'avoir vaincu ce préjugé en utilisant un tanin ou un mélange de tanin en tant qu'ingrédient actif, à l'exclusion de tout autre ingrédient et notamment d'huiles essentielles pour la fabrication d'une composition d'additif alimentaire destiné au traitement préventif de la coccidiose.

La présente invention concerne également une composition d'additif alimentaire destiné au traitement préventif de la coccidiose qui de manière caractéristique contient exclusivement un tanin ou d'un mélange de tanins à titre d'ingrédient actif choisis parmi les tanins de chêne et de châtaignier. La Demanderesse a également mis en évidence que ces deux tanins s'avèrent être particulièrement stables notamment à la chaleur et à la lumière. L'utilisation des deux tanins précités, seuls ou en mélange permet d'obtenir un additif alimentaire particulièrement stable quelles que soient la durée et les conditions de son stockage. Les compositions contenant des huiles essentielles sont en effet particulièrement sensibles à la lumière et à la chaleur ce qui limite leur durée de stockage ou impose des conditions de stockage difficiles à réaliser ou à maintenir notamment sur des sites d'exploitation tels que par exemple, les sites d'exploitations avicoles.

Par ailleurs, la Demanderesse a également mis en évidence que ces deux tanins forment des liaisons avec les protéines qui sont facilement hydrolysables au pH régnant dans le tube digestif des animaux et notamment du poulet. De fait, l'utilisation des deux tanins particuliers précités permet donc d'obtenir une composition d'additif alimentaire dont t'activité préventive sur la coccidiose est stable quelles que soient la durée et les conditions de stockage de la composition et qui, de plus, ne

WO 00/72858 PCT/FR00/01419 bloque pas la digestion des protéines. C'est donc le mérite de la Demanderesse que d'avoir choisi les deux tanins particuliers précités qui présentent à la fois une bonne stabilité et ne bloquent pas I'assimilation des protéines.

L'origine du tanin ou des tanins du mélange de tanins n'est pas limitée selon l'invention. Ces tanins peuvent être synthétiques ou naturels. Avantageusement, le tanin ou les tanins du mélange sont obtenus par lixiviation du bois, de préférence de chêne ou de châtaignier.

La forme sous laquelle est utilisé le tanin n'est limitative de l'invention. II est possible, par exemple, d'utiliser une solution notamment aqueuse contenant le ou les tanins. De préférence, le ou les tanins sont utilisés sous forme de poudre sèche ce qui facilite leur mélange pour l'obtention d'une composition nutritionnelle.

La présente invention concerne également une composition nutritionnelle destinée au traitement préventif de la coccidiose, qui de manière caractéristique, contient à titre d'unique ingrédient actif la composition d'additif alimentaire de l'invention.

De préférence, la composition nutritionnelle de l'invention contient au moins 0,1 % en masse de tanin (s) apporté (s) par l'additif alimentaire de l'invention. La Demanderesse a en effet mis en évidence que ce pourcentage assurait une réelle efficacité de la composition nutritionnelle sur le traitement préventif de la coccidiose.

De préférence, la composition nutritionnelle de l'invention contient au moins 0,150 % en masse tanin (s) apporté (s) par I'additif alimentaire de l'invention.

De préférence, la composition nutritionnelle de l'invention contient entre 0,1 % et 1 % en masse tanin (s) apporté (s) par I'additif alimentaire de l'invention.

De préférence, la composition nutritionnelle de l'invention contient entre 0,150% et 1% en masse tanin (s) apporté (s) par I'additif alimentaire de l'invention.

De telles quantités de tanins confèrent une activité satisfaisante à la composition alimentaire de l'invention ; de plus, leurs liaisons avec les

protéines restent facilement hydrolysables dans le tube digestif et donc n'empêchent pas I'assimilation des protéines.

La présente invention sera mieux comprise et ses caractéristiques et avantages apparaîtront mieux à la lecture de l'exemple qui suit présenté à titre d'exemple non limitatif.

En vue de déterminer faction des tanins sur le protozoaire Eimeria sp. responsable de la coccidiose chez le poulet, la Demanderesse a tout d'abord effectué des expérimentations visant à déterminer l'influence du tanin sur la prise de poids des poulets. Ensuite, des expérimentations ont été effectuées pour déterminer l'effet préventif du tanin sur la prolifération des coccidies chez le poulet.

Le tanin utilisé dans les exemples particuliers qui suivent est un tanin ou un mélange de tanins extrait (s) du bois de châtaignier.

Préparation du tanin Le tanin utilisé est obtenu par lixiviation à la vapeur de copeaux de bois de châtaignier. La solution est ensuite évaporée et atomisée pour obtenir un extrait sec qui représente 95% (+-1 %) en masse de la solution aqueuse initiale. Cet extrait sec contient 77% en masse de tanin (s) de châtaignier. Les 23% restants de 1'extrait sec sont constitués d'eau (5%), de cendres et de sucres précurseurs des tanins (18%).

Cet extrait de bois de châtaignier est mélangé à la nourriture des poulets en sorte d'obtenir un mélange contenant 0,2% en masse d'extrait de bois de châtaignier à 77 % de tanin (s) soit un pourcentage de 0,154% en masse de tanin (s) de châtaignier.

I Etude de l'influence du tanin sur la prise de poids chez le poulet Chaque traitement a été effectué sur trois groupes de 30 poulets de batterie, mâles et femelles de la race"Ross 208", âgés de 360 jours.

Les poulets ont été nourris avec les compositions nutritionnelles indiquées dans le tableau 1, dans des conditions de température, d'éclairement et de ventilation standard. La période de départ s'étend de 0 à deux semaines après le début de l'expérience tandis que la période

d'engraissement s'étend de 2 à 6 semaines après le début de l'expérience.

Les poulets ont par ailleurs, été vaccinés contre le virus Newcasttle (par spray Hitchner) et contre la bronchite (par spray H120). La nourriture et l'eau ont été fournies à volonté.

Les compositions nutritionnelles comprennent de plus des agents prévenant la prolifération des coccidies contenus dans le mélange « Prémix ».

Le tableau 2 regroupe les quatre groupes et le pourcentage d'extrait de châtaignier qui a été respectivement intégré dans les compositions nutritionnelles.

Le tableau 3 fournit une analyse statistique des résultats.

Ces résultats statistiques prouvent qu'une nourriture contenant une proportion de tanin (s) de châtaignier inférieure ou égale à 0,154% en poids n'empêche pas la prise de poids du poulet ce qui prouve qu'une dose de tanin de châtaignier inférieure ou égale à 0,154% en poids n'a aucun effet toxique sur le poulet.

II Etude de l'influence tanin tanin sur la prolifération des coccidies Animaux utilisés Des oiseaux de type Leghorn ont été obtenus à partir d'oeufs couvés Lohmann exempts de tout germe pathogène.

Des examens sanguins du sang des poussins ont confirmé qu'ils n'étaient pas contaminés notamment par Salmonella.

Conditions expérimentâtes Les animaux sont isolés durant toute l'expérimentation. Les cages sont ventilées et la pression est régulée de manière adaptée à l'âge des poussins. La nourriture est disposée dans des mangeoires et l'eau est disponible à volonté.

Nourriture La nourriture est une nourriture pour poulets âgés de 8 semaines ne contenant aucun agent de croissance et à base principalement de froment, de manioc, de fèves de soja, de tourteau de soja et de graisses animales. Cette nourriture est, dans un cas, mélangée avec de l'extrait de

bois de châtaignier pour obtenir un mélange contenant 0,154% de tanin (s) et utilisée telle quelle dans I'autre cas.

Recherche et groupes expérimentaux 192 poussins éclos d'oeufs exempts de germes pathogènes ont été élevés dans les conditions les préservant de toute contamination bactérienne, sur des copeaux de bois mélangés avec de la litière conventionnelle exempte de toute colonisation par Salmonella.

Les poussins ont été divisés en quatre groupes principaux. Chacun de ces groupes principaux a ensuite été divisé en deux sous groupes de 24 poussins (respectivement 1 CS, 1 TS, 2CS, 2TS, 3CC, 3TC, 4CC, 4TC) ce qui permet de combiner des sous-groupes de poussins ayant reçu de l'extrait de châtaignier dans la même cage mais dans des compartiments séparés. Cette stratégie permet de déterminer l'influence des conditions environnementales sur les analyses statistiques des résultats obtenus.

Les animaux des groupes 1TS, 2TS, 3TC et 4TC ont été nourris avec une nourriture contenant 0,2% en poids d'extrait de châtaignier. Les animaux des groupes 1CS, 2CS, 3CC et 4CC ont été nourris avec la même nourriture mais ne contenant pas 1'extrait de châtaignier.

Mode de contamination par Eimeria sp Afin de réaliser une colonisation naturelle et rapide par Eimeria sp, on mélange aux copeaux de bois non contaminés par Salmonella, de la litière contenant des oeufs d'Eimeria sp, le premier jour après l'éclosion, (environ 10g de litière contaminée pour 500 g de copeaux de bois). Les 29ème et 36sème jours après l'éclosion, on mélange à la nourriture, de la litière contenant des oeufs d'Eimeria sp (environ 1 g de litière contaminée pour 1 kg de nourriture ; la quantité totale de nourriture étant de 5 kg).

Les déjections des poussins sont recueillies tous les cinq jours sur du papier placé sous les cages.

Méthodes micro-bioloqiques utilisées L'action de l'extrait de châtaignier sur l'éjection d'Eimeria sp. a été étudiée sur les déjections de poussins prélevées à cinq jours d'intervalles.

Les déjections sont ensuite analysées quantitativement par flottation afin de déterminer le nombre d'oeufs d'Eimeria sp qu'elles contiennent.

Détection d'Eimeria sp dans les déjections des poulets Des échantillons de 2g de déjections sont placés dans des Béchers de 1000ml. On ajoute ensuite 60ml d'une solution de sucrose saturée en sel, préparée en dissolvant 333g de chlorure de sodium et 200g de sucrose dans 1 litre d'eau distillée. Le mélange est homogénéisé et filtré trois fois sur une passoire à thé afin d'ôter les débris les plus grossiers.

Le filtrat est homogénéisé par transvasements successifs dans un autre Bêcher (répété 10 fois) et introduit dans une chambre McMaster à I'aide d'une pipette pasteur.

La chambre est laissée au repos durant 2 minutes puis placée sous un microscope. Le grossissement utilisé est de 100x. Les oeufs d'Eimeria sp sont alors comptés Le nombre total d'oeufs d'Eimeria sp. est obtenu en multipliant par 50 le nombre total d'oeufs d'Eimeria sp. déterminé dans la chambre. La sensibilité du test est de 50.

Résultats Le tableau 4 représente les subdivisions au sein de chaque sous- groupe ; les poussins sont placés dans des boites de quatre compartiments contenant chacun 6 oiseaux.

Les groupes 1 et 2 ont de plus été contaminés par injection de 104 cfu/poussin de Salmonella Enteridis PT4 (NIDO 76Sa88) par gavage à l'âge de 6 jours.

27 jours après l'inoculation de Salmonella Enteridis, tous les groupes de poulets ont été contaminés par Eimeria sp., ce qui se traduit par la présence d'oeufs d'Eimeria sp. dans les déjections des poussins.

Le graphe 1 représente le nombre total d'oeufs d'Eimeria sp recueillis respectivement pour le groupe de contrôle et les groupes traités avec du tanin.

On remarque qu'à 41 jours après la naissance des poussins les groupes ayant ingéré du tanin sont moins infectés par les Eimeria sp.

Le graphe 2 représente le nombre d'oeufs d'Eimeria sp recueillis dans les déjections des poussins contaminés par la Salmonelle. On

remarque que dans ce cas, les poussins ayant ingéré du tanin sont moins contaminés par Eimeria sp que les poussins qui n'ont pas ingéré de tanin.

Le tableau 5 regroupe le nombre d'oeufs recueillis dans les déjections de chacun des groupes définis dans le tableau 4.

TABLEAU 5 GROUPE 2 7 12 17 22 34 41 JOURS JOURS JOURS JOURS JOURS JOURS JOURS 1 TS 0 ° 0-° 0 2 650 18 750 2 TS 0 0 0 0 41 650 10 300 266 250 0000114500475001CS0 2 CS 0 0 0 0 2 100 29 400 1 954 700 3 TC 0 300 0 0 0 50 73 900 4 TC 0 0 0 100 0 550 800 000070016503CC0 4 CC 0 0 0 0 0 0 978 600 Le graphe 3 montre bien que les deux groupes ayant absorbé du tanin qu'ils soient ou non contaminés par Salmonella sont moins infectés par Eimeria sp.

Une analyse statistique du nombre d'oeufs d'Eimeria sp. détectés (en utilisant une régression de Poisson) a revête une différence significative (P< 0,05) entre les groupes de poussins dont la nourriture contient des tanins et les groupes de poussins dont la nourriture est exempte de tanins. (confère graphe 2) En conclusion, la présence de tanins dans la nourriture réduit de manière significative t'excrétion d'oeufs d'Eimeria sp. chez le poussin ce qui prouve faction des tanins sur ce protozoaire.

Le graphe 4 représente la prise de poids des différents groupes de poussins âgés de 55 jours. On remarque que les groupes CS et TS qui ont absorbés du tanin ont une prise de poids moyenne plus importante que les groupe n'ayant pas été traités avec du tanin. II semblerait donc que, même dans le cas d'une contamination par Salmonella, l'ingestion de tanin favorise la prise de poids des individus sans néanmoins avoir d'influence directe sur la Salmonelle elle-même.

TABLEAU 1 : COMPOSITIONS NUTRITIONNELLES COMPOSITION COMPOSITION 1 COMPOSITION 2 PERIODE DE DEPART PERIODE 0-2 Semaines D'ENGRAISSEMENT % 2-6 Semaines % COMPOSITION NUTRITIONNELLE en % par masse : * blé 40,00 46,79 # maïs jaune 21,16 10,00 bâtiment à base 24,06 21,28 d'huile de soja # huile de soja 2,00 2,09 pois--5,00 aliment à base de 3,00 poisson # aliment à base de 5,00 7,00 viande # graisse animale 1,86 5,00 phosphate#Di-Ca # Ca carbonate 0,79 0,59 # Na Cl 0,76 0,78 # Na bicarbonate 0,04 0,09 # DL-methionine 0,10 0,09 L-lys. HCI 0,16 0,19 Premix 0,07 0,10 1,00 1,00 TOTAL 100,00 100,00 VALEUR NUTRITIONNELLE: # Energie 12,03 12,60 métabolisable, MJ/kg 'Protéïne% 23,29 22,18 Lys. % 1,30 1,24 # Met. % 0,56 0,53 # Met. & Cys. % 0,94 0,89 # Ca % 0,96 0,91 # Pav. % 0,44 0,40 %0,130,12#Na # C18 : 2 % 2, 01 2,31

(*) Le Premix fournit 100 mg de monensine (pour la période de 0-2 semaines), 1 mg de diclazuril (-Clinacox) (pour la période de 2-6 semaines) et 15 mg de virginiamycine par kg de nourriture.

TABLEAU 2 TRAITEMENT % EXTRAIT DE % DE TANIN DE CHATAIGNIER CHATAIGNIER 1 0 0 2 0,05 0,0385 3 0,10 0,077 4 0, 200, 154 TABLEAU 3 : Poids Période Période du de de poulet à 15-35 0-35 35 jours jours jours masse gain de Efficacité masse gain de Efficacité journalière poids nutrition-journalière poids nutrition- de journalier nelle de journalier nelle nourriture (g/animal (g/g) nourriture (g/animal (g/g) absorbée/jour) absorbée/jour) (g/animal (g/animal /jour)/jour) ANOVA (1) A-CT (n=4) 0,2 3,8 2,5 0,8 0,5 2,1 0,5 B-Sexe (n=2) 114, 5' 222,9*** 801,0*** 19,7*** 172,6*** 334,5*** 12,5** A*B 1, 1 0,5 0,5 0,1 2,0 0,1 0,8 méthode LSD test mr (2) A-CT 1 1668 a 108,6a 62,4a 1,744a 77,3a 46,5a 1,668a 2 1667 a 108,7a 62,3a 1,748a 77,2a 46,4a 1,664a 3 1642 a 107,5a 61,6a 1,749a 76,3a 45,7a 1,669a 4 1657 a 109,4a 61,9a 1,771 a 77,6a 46,2a 1,684a LSD (P : 0.05) 74 3,4 3,0 0,041 2,4 2,1 0,039 B-Sexe 1-males 1789 a 116,9a 67,8a 1,724a 82,3a 49,9a 1,649a 2-femelles 1528 b 100,2a 56,3b 1,782b 71,9b 42,5b 1,639a LSD (P : 0.05) 52 2,4b 2,1 0,029 1,7 1,5 0,027 *** significativement différent à 0.001 ** significativement différent à 0.01 Tableau 4 GROUPE SOUS-GROUPE SUBDIVISIONS 1 ics 1 CS A (n=6) 1 CS C (n=6) (contaminé par 1 CS B (n=6) 1 CS D (n=6) Salmoneila) 1 TS (0,154% de tanins) 1 TS A (n=6) 1 TS C (n=6) 1 TS B (n=6) 1 TS D (n=6) 2 2CS 2 CS A (n=6) 2 CS C (n=6) (contaminé par 1 CS B (n=6) 1 CS D (n=6) Salmonella) 2TS (0,154 % de tanins) 2 TS A (n=6) 2 TS C (n=6) 2 TS B (n=6) 2 TS D (n=6) 3 3 CC 3 CC A (n=6) 3 TC C (n=6) 3 CC B (n=6) 3 TC D (n=6) 3 TC 3 TC A (n=6) 3 TC C (n=6) (0,154 % de tanins) 3 TC B (n=6) 3 TC D (n=6) 4 4 CC 4 CC A (n=6) 4 TC C (n=6) 4 CC B (n=6) 4 TC D (n=6) 4 TC 4 TC A (n=6) 4 TC C (n=6) (0,154 % de tanins) 4 TC B (n=6) 4 TC D (n=6)