La présente invention se rapporte à la préparation de compositions alimentaires capables de modifier l'équilibre entre la formation de tissu osseux et la résorption osseuse en favorisant la prolifération et la différenciation des ostéoblastes.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION

L'os est un tissu en perpétuel renouvellement grâce à l'action de deux types de cellules osseuses : les ostéoblastes et les ostéoclastes. La solidité de l'os résulte d'un équilibre subtil entre ces deux types cellulaires.

Les ostéoblastes sont responsables de la synthèse de la matrice ostéoïde et de sa minéralisation. Ils se différencient à partir de cellules ostéoprogénitrices situées dans le périoste. Une fois entièrement entourés par la matrice osseuse minéralisée, ils se transforment en ostéocytes et conservent des fonctions métaboliques dans les phénomènes d'échanges calciques.

Les ostéoclastes sont responsables de la résorption osseuse. Ils proviennent d'un progéniteur hématopoïétique et appartiennent à la famille des macrophages. Les ostéoclastes se fixent à la matrice osseuse au moyen de protéines d'adhérence, créant ainsi un compartiment étanche (ou lacune de Howship). La zone matricielle ainsi délimitée est alors dégradée par dissolution de la phase minérale par acidification du compartiment et par dégradation de la matrice protéique sous l'action d'enzymes lysosomales et de collagénases.

La production d'ostéoblastes et d'ostéoclastes fonctionnels passe par deux grandes étapes : (i) une étape de prolifération pendant laquelle les cellules progénitrices vont se multiplier et (ii) une étape de différenciation durant laquelle les cellules progénitrices vont se différencier, selon leur type, en ostéoblastes ou en ostéoclastes fonctionnels.

Un déséquilibre entre l'activité des ostéoclastes et celle des ostéoblastes peut conduire à l'apparition de diverses pathologies osseuses dont l'ostéoporose, qui est caractérisée par une activité ostéoclastique plus importante que celle des ostéoblastes. Cette pathologie se traduit donc par une fragilité excessive du squelette et un risque accru de fracture. Il existe des traitements médicamenteux préconisés dans la prévention des fractures liées à l'ostéoporose, tels que les bisphosphonates. Cependant, en raison des possibles effets secondaires, ces traitements sont, de préférence, administrés à des patients présentant un risque important de fractures, notamment de fractures vertébrales.

Un régime alimentaire adapté peut également permettre d'améliorer le statut osseux. Il est en effet reconnu qu'un apport suffisant en calcium, d'au moins 800 mg par jour, idéalement associé à un apport en vitamine D, aide à préserver la solidité osseuse. Cet apport journalier peut provenir de divers aliments à forte teneur en calcium, en particulier les produits laitiers.

Durant les dernières années, des études ont été menées afin de proposer des compositions alimentaires capables d'avoir une action bénéfique sur le statut osseux et donc de présenter un intérêt dans la prévention des troubles osseux tels que l'ostéoporose, sans pour autant entraîner d'effets secondaires pour le consommateur.

A ce jour, l'essentiel des efforts a été concentré sur l'identification de molécules capables de limiter la résorption osseuse en inhibant la prolifération, la différenciation et/ou l'activité des ostéoclastes (par exemple, la demande internationale de brevet WO 2010/028432). Il serait également extrêmement profitable d'obtenir des compositions alimentaires capables de stimuler la formation osseuse en favorisant l'activité des ostéoblastes.

RÉSUME DE L'INVENTION L'objectif de la présente invention est de fournir des compositions alimentaires, de préférence des produits laitiers, capables d'améliorer le statut osseux du consommateur en stimulant ou favorisant l'activité ostéoblastique.

La présente invention concerne donc l'utilisation d'un protéolysat d'une ou plusieurs protéines du lait pour la préparation d'une composition alimentaire pour favoriser la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse, la différenciation desdites cellules en ostéoblastes et/ou l'activité ostéoblastique.

Le protéolysat peut être un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué des caséines, notamment les caséines aSl, aS2, β et κ, la β-lactoglobuline, Γα- lactalbumine et un mélange de celles-ci. Le protéolysat peut être un protéolysat de caséines. Il peut notamment être un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la caséine aSl, la caséine aS2, la caséine β, la caséine κ, la caséine γ, et un mélange de celles-ci.

Il peut également être un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la caséine aSl, la caséine aS2, la caséine β, la caséine κ, et un mélange de celles-ci. De manière particulière, le protéolysat est un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la caséine aSl, la caséine aS2, la β-lactoglobuline, Γ α-lactalbumine, et un mélange de celles-ci.

Le protéolysat peut être un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la β-lactoglobuline, Γ α-lactalbumine, et un mélange de celles-ci.

Il peut également être un protéolysat de caséines a, et en particulier un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la caséine aSl, la caséine aS2 et un mélange de celles-ci.

Le protéolysat peut être obtenu par digestion par une ou plusieurs enzymes ayant une activité endopeptidase et/ou exopeptidase En particulier, la ou les enzymes peuvent être choisies dans le groupe constitué des sérines-endopeptidases, des cystéines- endopeptidases, des aspartate-endopeptidases et des métallo-endopeptidases, de préférence parmi les sérines-endopeptidases. De préférence, le protéolysat est obtenu par digestion par une enzyme choisie dans le groupe constitué de la chymotrypsine et la trypsine, et un mélange de celles-ci.

Le protéolysat peut également être obtenu par fermentation microbienne.

Avant utilisation, le protéolysat peut être soumis à un fractionnement par taille, notamment par ultrafïltration par centrifugation.

Selon un mode particulier, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques ayant une masse moléculaire supérieure à 3 kDa. Selon un autre mode particulier, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques ayant une masse moléculaire supérieure à 10 kDa. Alternativement, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques ayant une masse moléculaire comprise entre 3 et 10 kDa.

Le protéolysat peut favoriser la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse. Il peut également favoriser la différenciation des cellules ostéoprogénitrices en ostéoblastes. Selon un mode préféré, le protéolysat favorise la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse et la différenciation des cellules ostéoprogénitrices en ostéoblastes. Le protéolysat peut également favoriser l'activité des ostéoblastes, notamment la minéralisation de la matrice osseuse. Optionnellement, le protéolysat est, en outre, capable d'inhiber la prolifération, la différenciation et/ou l'activité de résorption des ostéoclastes.

La composition alimentaire est, de préférence, destinée à l'alimentation humaine. Selon un mode particulier, la composition alimentaire est un aliment, un complément alimentaire ou une boisson. Selon un mode préféré, la composition alimentaire est un produit laitier. En particulier, le produit laitier peut être un lait fermenté, de préférence un yaourt, ou un fromage non affiné, de préférence un fromage frais.

La présente invention concerne également une composition alimentaire comprenant le protéolysat selon l'invention et capable de favoriser la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse, la différenciation desdites cellules en ostéoblastes et/ou l'activité ostéoblastique. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

La figure 1 représente l'effet des caséines totales (aSl, aS2, β et κ) non digérées et de protéolysats de caséines totales obtenus par digestion avec la chymotrypsine ou la trypsine, sur la prolifération des cellules osseuses (ADN : quantité d'ADN) et la différenciation des ostéoblastes (PA/ADN : ratio de l'activité de la phosphatase alcaline sur la quantité d'ADN). Les résultats sont présentés sous la forme d'un ratio des valeurs obtenues avec l'échantillon testé sur les valeurs obtenues avec le contrôle neutre (témoin BSA), c'est-à-dire avec l'albumine bovine sérique (T/C ratio). Ces ratios sont calculés pour chaque plaque de culture puis regroupés. La lactoferrine est utilisée comme témoin positif. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001.

La figure 2 représente l'effet de caséines a (aSl et aS2) non digérées et de protéolysats de caséines a (aS 1 et aS2) obtenus par digestion avec la chymotrypsine ou la trypsine, sur la prolifération des cellules osseuses (ADN) et la différenciation des ostéoblastes (PA/ADN). Les résultats sont présentés sous la forme d'un ratio des valeurs obtenues avec l'échantillon testé sur les valeurs obtenues avec le contrôle neutre (témoin BSA) (T/C ratio). Ces ratios sont calculés pour chaque plaque de culture puis regroupés. La lactoferrine est utilisée comme témoin positif. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001.

La figure 3 représente l'effet de protéines sériques non digérées et de protéolysats de protéines sériques obtenus par digestion avec la chymotrypsine ou la trypsine, sur la prolifération des cellules osseuses (ADN) et la différenciation des ostéoblastes (PA/ADN). Les résultats sont présentés sous la forme d'un ratio des valeurs obtenues avec l'échantillon testé sur les valeurs obtenues avec le contrôle neutre (témoin BSA) (T/C ratio). Ces ratios sont calculés pour chaque plaque de culture puis regroupés. La lactoferrine est utilisée comme témoin positif. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001.

La figure 4 représente les photographies d'observations microscopiques à l'objectif x4 de puits de cultures cellulaires colorés au rouge d'alizarine pour les cultures en présence de 0,01 mg/mL de BSA, de 0,01 mg/mL de lactoferrine et 0,01 mg/mL de la fraction CR10.

La figure 5 représente la quantification par colorimétrie de la solution obtenue par dissolution des nodules de minéralisation colorés au rouge d'alizarine. Les résultats sont présentés sous la forme d'un ratio des valeurs obtenues avec la lactoferrine ou la fraction CR10 sur les valeurs obtenues avec le contrôle neutre (témoin BSA) (T/C ratio). * P<0,05.

La figure 6 représente l'effet de la fraction CR10, avec et sans traitement thermique (96°C pendant 4 min), sur la prolifération des cellules osseuses et la différenciation des ostéoblastes. Les résultats sont présentés sous la forme d'un ratio des valeurs obtenues avec l'échantillon testé sur les valeurs obtenues avec le contrôle neutre (témoin BSA) (T/C ratio). La lactoferrine est utilisée comme témoin positif. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION

Les inventeurs ont démontré de manière surprenante que des protéolysats des protéines de lait, c'est-à-dire des protéolysats de caséines et de protéines sériques, ont un effet positif sur la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse, sur la différenciation des ostéoblastes et/ou sur l'activité ostéoblastique. La présente invention concerne donc l'utilisation d'un protéolysat d'une ou plusieurs protéines du lait pour la préparation d'une composition alimentaire pour favoriser la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse, la différenciation desdites cellules en ostéoblastes et/ou l'activité ostéoblastique.

Le lait contient essentiellement deux groupes de protéines : les caséines qui représentent 80 % des protéines totales du lait, et les protéines sériques que l'on retrouve dans le lactosérum.

Les caséines sont au nombre de cinq : la caséine aSl, la caséine aS2, la caséine β, la caséine κ et la caséine γ. La caséine aSl représente entre 34 et 40% des caséines et a une masse moléculaire de 24 kDa. La caséine aS2 représente environ 10% des caséines et a une masse moléculaire de 25 kDa. La caséine β représente environ 34% des caséines et a une masse moléculaire de 24 kDa. La caséine κ représente 8 à 15% des caséines et a une masse moléculaire de 19 kDa. La caséine γ, issue d'une protéolyse de la caséine β, représente environ 7%> des caséines et a une masse moléculaire de 23 kDa.

Les protéines sériques sont composées essentiellement de β-lactoglobuline et d'a-lactalbumine. La β-lactoglobuline représente 65%> des protéines du lactosérum et a une masse moléculaire de 18 kDa. L'a-lactalbumine représente 25%> des protéines du lactosérum et a une masse moléculaire d'environ 14 kDa (Pierre Jouan, Lactoprotéines et lactopeptides : propriétés biologiques, Paris : INRA, 2002).

Ainsi, le terme « protéine du lait », tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une protéine naturellement présente dans le lait, de préférence une protéine choisie dans le groupe constitué des caséines et des protéines sériques, et en particulier dans le groupe constitué de la caséine aSl, la caséine aS2, la caséine β, la caséine κ, la caséine γ, la β-lactoglobuline et Γ a-lactalbumine.

Les protéines de lait peuvent être contenues dans du lait ou dans une préparation obtenue à partir du lait. En particulier, elles peuvent être totalement ou partiellement purifiées. Tel qu'utilisé dans ce document, le terme « totalement purifié » signifie que le produit d'intérêt est indemne de tout contaminant détectable.

De préférence, le lait est du lait de mammifère. De manière plus particulièrement préférée, le mammifère est une vache, une brebis, une chèvre, une bufflonne, une chamelle ou une jument, de préférence une vache.

Tel qu'utilisé dans ce document, le terme « protéolysat » se réfère à un produit obtenu par la digestion de protéines au moyen d'une ou de plusieurs enzymes ou protéases. En particulier, le protéolysat peut être obtenu par digestion avec une ou plusieurs enzymes ayant une activité endopeptidase et/ou exopeptidase.

Selon un mode de réalisation, le protéolysat est obtenu par digestion avec une ou plusieurs enzymes ayant une activité endopeptidase. Ces enzymes peuvent être par exemple choisies dans le groupe constitué par les sérine-endopeptidases (EC 3.4.21), les cystéine-endopeptidases (EC 3.4.22), les aspartate-endopeptidases (EC 3.4.23) et les métallo-endopeptidases (EC 3.4.24).

De préférence, la ou les enzymes utilisées sont autorisées par la législation française dans la fabrication de denrées alimentaires. Ces enzymes peuvent être par exemple, sans y être limitées, la chymotrypsine extraite de pancréas de bœuf, la trypsine, la chymosine d'Aspergillus niger variété Awamori renfermant un gène de prochymosine B de veau, la chymosine issue d'une souche d'Aspergillus niger variété Awamori porteuse d'un gène codant la chymosine de dromadaire domestique, la chymosine de Kluyveromyces lactis renfermant un gène de prochymosine B de veau, la chymosine d'Escherichia coli K-12 renfermant un gène de prochymosine A de veau, la chymosine extraite de la caillette de veau, la papaïne de Carica papaya, la pepsine bovine, la pepsine porcine, la protéase à résidu sérine issue de la souche génétiquement modifiée de Fusarium venenatum contenant le gène codant la protéase de Fusarium oxysporum, les protéases d'Aspergillus oryzae, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Aspergillus niger GEP-44, Geobacillus caldoproteolyticus Rokko AZ 3173s non transformé, Rhizomucor miehei, Micrococcus caseolyticus, Bacillus subtilis, Aspergillus wentii, Endothia parasitica et Mucor pusillus lindt, les aminopeptidases d'Aspergillus niger EPD-4 et Aspergillus oryzae, l'aspartyl-protéase d'Aspergillus oryzae contenant le gène codant pour la protéase de Rhizomucor miehei ou la carboxypeptidase de type sérine ossue d'une souche d'Aspergillus niger modifiée génétiquement PEG-1A contenant un gène codant la carboxypeptidase d'Aspergillus niger.

De préférence, la ou les enzymes utilisées appartiennent à la famille des sérine- endopeptidases. De manière particulièrement préférée, les enzymes utilisées comprennent, ou consistent en, la trypsine (EC 3.4.21.4) et/ou la chymotrypsine (EC 3.4.21.1). Selon un mode de réalisation, le protéolysat est obtenu par digestion des protéines par la trypsine. Selon un autre mode de réalisation, le protéolysat est obtenu par digestion des protéines par la chymotrypsine.

Le protéolysat peut être obtenu par digestion avec des enzymes totalement ou partiellement purifiées.

Il peut également être obtenu par fermentation microbienne. Les protéines de lait à digérer sont dans ce cas mises en contact avec une ou plusieurs souches microbiennes, de préférence des bactéries et/ou des levures, qui expriment la ou les enzymes d'intérêt. Les bactéries peuvent être par exemple choisies dans le groupe constitué des bactéries appartenant aux genres Arthrobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Enterobacter, Enter ococcus, Hafnia, Halomonas, Kocuria, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Oenococcus, Pediococcus, Propionibacterium, Staphylococcus et Streptococcus. Les levures peuvent être par exemple choisies dans le groupe constitué des levures appartenant aux genres Candida, Debaryomyces, Geotrichum, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces et Williopsis.

Selon un mode de réalisation, le protéolysat est un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué des caséines et des protéines sériques, et un mélange de celles-ci. De préférence, le protéolysat est un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la caséine aSl, la caséine aS2, la caséine β, la caséine κ, la β- lactoglobuline et Γ -lactalbumine, et un mélange de celles-ci.

Selon un autre mode de réalisation, le protéolysat est un protéolysat de caséines, de préférence d'une caséine choisie dans le groupe constitué de la caséine aSl, la caséine aS2, la caséine β, la caséine κ, et un mélange de celles-ci.

Selon encore un autre mode de réalisation, le protéolysat est un protéolysat d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la caséine aSl, la caséine aS2, la β- lactoglobuline, Γα-lactalbumine, et un mélange de celles-ci.

Selon un mode de réalisation particulier, le protéolysat est un protéolysat de caséines a, c'est-à-dire d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la caséine aSl et la caséine aS2, et un mélange de celles-ci.

Selon un autre mode de réalisation particulier, le protéolysat est un protéolysat de protéines sériques, de préférence d'une protéine choisie dans le groupe constitué de la β-lactoglobuline et Γα-lactalbumine, et un mélange de celles-ci. Les conditions de digestion enzymatique sont, de préférence, adaptées pour obtenir une digestion de la quasi-totalité des protéines de lait présentes dans le milieu réactionnel. Selon un mode de réalisation particulier, le protéolysat obtenu comprend moins de 20 % en poids de protéines non digérées, de préférence moins de 10 % en poids de protéines non digérées, et de manière plus particulièrement préférée, moins de 5 % en poids de protéines non digérées. Tel qu'utilisé dans le présent document, le terme « protéine non digérée » se réfère à une protéine n'ayant subi aucune hydrolyse enzymatique. L'efficacité de la digestion enzymatique peut être aisément évaluée par l'homme du métier au moyen de techniques de routine telle que des techniques d'électrophorèse.

Après digestion, le protéolysat peut être soumis à un procédé de fractionnement pour séparer les peptides selon leurs propriétés physico-chimiques. En particulier, les peptides contenus dans le protéolysat peuvent être fractionnés selon leurs tailles, par exemple par f ltration sur gel ou par ultrafiltration par centrifugation, ou leurs charges, par exemple par chromatographie échangeuse d'ions. Les différentes techniques de fractionnement des protéines sont bien connues de l'homme du métier.

Selon un mode de réalisation, le protéolysat est soumis à un fractionnement par taille, de préférence par ultrafiltration par centrifugation.

Selon un mode particulier de réalisation, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques ayant une masse moléculaire supérieure à 3 kDa.

Selon un autre mode particulier de réalisation, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques ayant une masse moléculaire supérieure à 10 kDa.

Selon encore un autre mode particulier de réalisation, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques ayant une masse moléculaire entre 3 et 10 kDa.

Selon un mode de réalisation particulier, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques dont la masse moléculaire est supérieure à 3 kDa, et qui sont obtenus par digestion de caséines, de préférence des caséines a, par la chymotrypsine ou la trypsine.

Selon un autre mode de réalisation particulier, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques dont la masse moléculaire est supérieure à 10 kDa, et qui sont obtenus par digestion de caséines, de préférence des caséines a, par la chymotrypsine ou la trypsine.

Selon un autre mode de réalisation particulier, le protéolysat est obtenu à partir de digestion de caséines a par la trypsine ou la chymotrypsine et comprend essentiellement des fragments peptidiques d'une masse moléculaire est supérieure à 3 kDa, de préférence supérieure à 10 kDa.

Selon encore un autre mode de réalisation particulier, le protéolysat comprend essentiellement des fragments peptidiques dont la masse moléculaire est supérieure à 10 kDa, et qui sont obtenus par digestion de protéines sériques, de préférence la β- lactoglobuline et/ou Γα-lactalbumine, par la chymotrypsine ou la trypsine, de préférence par la chymotrypsine.

Avant utilisation, le protéolysat peut également être lyophilisé, séché, ou soumis à des étapes de dialyse.

Les inventeurs ont démontré que le protéolysat décrit ci-dessous était capable de favoriser la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse, la différenciation des cellules ostéoprogénitrices en ostéoblastes et/ou l'activité ostéoblastique.

Le terme « cellules progénitrices de la moelle osseuse », tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à des cellules souches multipotentes qui peuvent se différencier en différents types cellulaires. Les cellules progénitrices de la moelle osseuse comprennent notamment les cellules souches mésenchymateuses (ou cellules ostéoprogénitrices) capables de se différencier en ostéoblastes puis en ostéocytes, et les cellules souches hématopoïétiques capables de se différencier en ostéoclastes.

Selon un mode de réalisation, le protéolysat favorise la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse. De préférence, le protéolysat favorise la prolifération des cellules souches mésenchymateuses (ou cellules ostéoprogénitrices) capables de se différencier en ostéoblastes. L'activité du protéolysat sur la prolifération cellulaire peut être évaluée au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par quantification de l'ADN total dans une culture contenant des cellules progénitrices de la moelle osseuse réalisée en présence du protéolysat. La quantité d'ADN total est ensuite comparée à la quantité obtenue dans une culture identique réalisée sans ajout du protéolysat et en présence d'albumine bovine sérique (témoin neutre). Selon un autre mode de réalisation, le protéolysat favorise la différenciation des cellules ostéoprogénitrices en ostéoblastes. L'activité du protéolysat sur la différenciation des cellules ostéoprogénitrices en ostéoblaste peut être évaluée au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par mesure de l'activité phosphatase alcaline dans une culture contenant des cellules progénitrices de la moelle osseuse et/ou des cellules ostéoprogénitrices, réalisée en présence du protéolysat. En effet, la phosphatase alcaline n'est produite que par les ostéoblastes différenciés ou en cours de différenciation (P. Marie. Med Sci (Paris) 17 12 (2001) 1252-1259).

Selon encore un autre mode de réalisation, le protéolysat favorise l'activité ostéoblastique. Les inventeurs ont en effet démontré l'action stimulante du protéolysat sur l'activité ostéoblastique, et en particulier sur l'activité de minéralisation des ostéoblastes (figures 4 et 5). L'activité du protéolysat sur la minéralisation peut être suivie par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier par coloration des nodules de minéralisation au rouge d'alizarine dans une culture contenant des ostéoblastes et réalisée en présence du protéolysat.

Selon un mode de réalisation préféré, le protéolysat favorise à la fois la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse, en particulier des cellules ostéoprogénitrices, et la différenciation desdites cellules en ostéoblastes.

Selon un mode de réalisation tout particulièrement préféré, le protéolysat favorise la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse, en particulier des cellules ostéoprogénitrices, la différenciation desdites cellules en ostéoblastes et l'activité ostéoblastique, en particulier sur la minéralisation de l'ostéoïde.

Optionnellement, le protéolysat peut également inhiber la prolifération, la différenciation et/ou l'activité de résorption des ostéoclastes. La différenciation des ostéoclastes peut être évaluée au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par marquage TRAP (Tartrate Résistant Alcalin Phosphatase ; Ballanti et al, Osteoporos Int. 1997;7(l):39-43). L'activité de résorption des ostéoclastes peut également être évaluée au moyen de techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple en cultivant les cellules sur des plaques de dentine et en mesurant la taille des zones de résorption.

Le protéolysat selon l'invention est utilisé pour la préparation d'une composition alimentaire. La composition alimentaire peut être destinée à l'alimentation animale ou humaine, de préférence à l'alimentation humaine.

La composition alimentaire peut être, en particulier, un aliment, une boisson ou un complément alimentaire. Le terme « aliment » tel qu'utilisé dans le présent document se réfère à une substance ou produit destiné à être ingéré dans un but nutritionnel ou énergétique. Le terme « complément alimentaire » tel qu'utilisé ici, se réfère à une substance ou produit destiné à être ingéré afin de fournir un complément à un régime alimentaire.

Selon un mode de réalisation, la composition est un complément alimentaire. Selon un autre mode de réalisation, la composition est un aliment.

Selon un mode de réalisation particulier, la composition est une boisson.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition alimentaire est un produit laitier, en particulier un lait fermenté ou un fromage non affiné. Selon un mode de réalisation particulier, la composition alimentaire est un lait fermenté, de préférence un yaourt. Selon un autre mode de réalisation particulier, la composition alimentaire est un fromage non affiné, de préférence un fromage frais.

La composition alimentaire peut être consommée de manière occasionnelle ou régulière. Selon un mode de réalisation, la composition est destinée à être consommée de manière régulière, de préférence une ou plusieurs fois par semaine, et de manière plus particulièrement préférée tous les jours ou tous les deux jours.

Le protéolysat peut être présent dans la composition alimentaire à raison d'une concentration de 0,1 g/100g à 10 g/100g de produit fini, de préférence de 0,1 g/100g à 6 g/100g de produit fini.

La présente invention concerne également une composition alimentaire, telle que définie ci-dessus, comprenant le protéolysat selon l'invention et capable de favoriser la prolifération des cellules progénitrices de la moelle osseuse, la différenciation desdites cellules en ostéoblastes et/ou l'activité ostéoblastique. Tous les modes de réalisation concernant le protéolysat décrit ci-dessus sont également inclus dans cet aspect de l'invention.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif. EXEMPLES

Exemple 1 : Effets des protéolysats de protéines du lait sur la prolifération des cellules osseuses et la différenciation des ostéoblastes

Matériel et méthodes Obtention des fractions peptidiques et des protéolysats

Trois fractions de protéines de lait comprenant a) les caséines totales (aSl, aS2, β et K) (C5890, Sigma), b) les caséines aSl et aS2 (C6780, Sigma) et c) les protéines sériques (Prolacta 90, Lactalis Ingrédients), ont été soumises à une digestion enzymatique à l'aide de trypsine (T0303, Sigma) ou de chymotrypsine (C4129, Sigma) en proportion 1 :50, durant 1 heure à 37°C dans un tampon adéquate. Les fractions ainsi digérées ont ensuite été soumises à une ultrafîltration avec un seuil de coupure à lOkDa (Filtre UFC801096, Amicon Ultra). Les ultrafiltrats ont été de nouveau ultrafiltrés avec un seuil de coupure à 3kDa (Filtre UFC800396, Amicon Ultra). Les rétentats obtenus par les ultrafïltrations à 10 et 3 kDa ont ensuite été lyophilisés pour éliminer le tampon (Lyovac GT2, Finn-Aqua).

Culture cellulaire

L'efficacité des fractions de protéines non digérées et des protéolysats a été testée sur des cultures primaires de cellules osseuses.

Après sacrifice d'une souris C3H (Harlan), les tibias et fémurs ont été prélevés, broyés puis filtrés stérilement. Les cellules osseuses contenues dans le filtrat ont été ensemencées dans des plaques de 48 puits (3548, Costar) dans un milieu de culture a- MEM (a-Minimum Essential Médium BE02-002F, Lonza) contenant 10% de sérum de veau fœtal (DE14-801F, Lonza) et 10 ^"8 M de 1,25-dihydroxyvitamine D3 (D1530, Sigma). Les cellules ont été conservées dans un incubateur à 37°C et 5% de C0 ₂ . Le milieu a été changé deux fois par semaine après agitation pour évacuer les cellules flottantes. L'observation microscopique de ces broyats après coloration Giemsa, a montré qu'ils comprennent environ 90% d'ostéoblastes et 10%> d'ostéoclastes.

Après 6 jours de culture, les cellules ont été mises en contact avec les fractions peptidiques à 0,1 mg/mL. L'albumine bovine sérique (BSA, A4503, Sigma) a été utilisée comme témoin neutre. La lactoferrine (Fonterra), une protéine du lait connue pour avoir un effet positif à la fois sur la prolifération et sur la différenciation des ostéoblastes (Biais et al. Am J Physiol Endocrinol Metab, Vol. 296, No. 6, (Jun 2009), pp. E1281-1288) a été utilisée comme témoin positif.

La culture cellulaire a été poursuivie durant 14 jours en présence des fractions peptidiques ou des protéines témoins. Deux paramètres ont ensuite été mesurés dans les cultures : la quantité d'ADN et l'activité phosphatase alcaline. La quantité d'ADN reflète le nombre de cellules présentes dans chaque puits et est donc un indicateur de prolifération. Elle a été mesurée par fluorimétrie selon les instructions du fabriquant (Fluoreporter Kit F2962, Invitrogen). La phosphatase alcaline est une enzyme qui n'est produite que par les ostéoblastes différenciés ou en cours de différenciation. Son activité est donc un marqueur de la différenciation. Elle a été mesurée par colorimétrie selon les instructions du fabriquant (Kit ALP/PAL R5A655A, IDS). L'activité de la phosphatase alcaline a été corrigée par le nombre de cellules présentes dans le puits (mesuré par l'ADN). L'activité de la phosphatase alcaline est donc exprimée par le rapport de la mesure de phosphatase alcaline par la mesure d'ADN.

Les résultats sont présentés sous la forme d'un ratio des valeurs obtenues avec l'échantillon testé sur les valeurs obtenues avec le contrôle neutre, c'est-à-dire avec l'albumine bovine sérique (T/C ratio). Ces ratios sont calculés pour chaque plaque de culture puis regroupés. Un test statistique de Student permet de déterminer si le T/C ratio de chaque traitement est différent de celui du témoin neutre (égal à 1). La différence est considérée comme significative si la statistique p du test de Student est inférieure à 0.05,

Résultats Effets des caséines totales non digérées et des protéolvsats de caséines totales Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 1.

Ces résultats démontrent que les caséines totales non digérées ont un effet positif sur la prolifération des cellules osseuses. Elles n'ont en revanche pas d'effet sur la différenciation des ostéoblastes.

En revanche, les protéolysats obtenus par digestion des caséines totales avec la trypsine ou la chymotrypsine, et comprenant des peptides ayant un poids moléculaire supérieur à lOkDa ont un effet positif à la fois sur la prolifération des cellules osseuses et sur la différenciation des ostéoblastes.

Effets des caséines a (aSl et aS2) non digérées et des protéolysats de caséines a

Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 2.

Ces résultats démontrent que les caséines aSl et aS2 non digérées n'ont aucun effet sur la prolifération des cellules osseuses ou la différenciation des ostéoblastes.

En revanche, les protéolysats obtenus par digestion des caséines a avec la trypsine ou la chymotrypsine, et comprenant des peptides ayant un poids moléculaire supérieur à 10 kDa ou compris entre 3 et 10 kDa, ont un effet positif sur la différenciation des ostéoblastes. Les protéolysats comprenant des peptides ayant un poids moléculaire supérieur à 10 kDa, ont en outre un effet positif sur la prolifération des cellules osseuses.

Effets des protéines sériques non digérées et des protéolysats de protéines sériques

Les résultats obtenus sont présentés dans la Figure 3.

Ces résultats démontrent que les protéines sériques non digérées n'ont aucun effet sur la prolifération des cellules osseuses ou la différenciation des ostéoblastes.

En revanche, les protéolysats obtenus par digestion des protéines sériques avec la trypsine ou la chymotrypsine, et comprenant des peptides ayant un poids moléculaire supérieur à 10 kDa ont un effet positif sur la différenciation des ostéoblastes ou la prolifération des cellules osseuses.

Exemple 2 : Effets des protéolysats de protéines du lait sur la minéralisation de la matrice osseuse

Matériels et méthodes

Obtention du protéolvsat Une fraction de protéines de lait contenant des caséines (aSl, aS2, β et κ)

(C5890, Sigma) a été soumise à une digestion enzymatique à l'aide de chymotrypsine (C4129, Sigma) en proportion 1 :50, durant 1 heure à 37°C dans un tampon adéquate. La fraction ainsi digérée a ensuite été soumise à une ultrafîltration avec un seuil de coupure à lOkDa (Filtre UFC801096, Amicon Ultra). Le rétentat obtenu a ensuite été lyophilisé pour éliminer le tampon (Lyovac GT2, Finn-Aqua). Le protéolysat ainsi obtenu est nommé ci-après CR10. Culture cellulaire

Trois rats Sprague-Dawley mâles, âgés de 4 semaines, ont été sacrifiés. La moelle des tibias et fémurs a été collectée et les cellules de la moelle ont été isolées par centrifugation. Les cellules ont ensuite été ensemencées dans des plaques 6 puits et cultivées 4 jours dans du milieu DMEM (Lonza) avec 10% sérum de veau fœtal (Hyclone) pour sélectionner les cellules souches mésenchymateuses (tri par adhérence).

Les cellules souches mésenchymateuses ont été mises en culture en présence de 0,01 mg/mL de BSA (témoin neutre), de 0,01 mg/mL de lactoferrine (témoin positif) ou de 0,01 mg/mL de CR10. Chaque condition a été réalisée en triplicatas.

Après 4 jours de culture, 50 μg/mL d'acide ascorbique et 10 mM de β- glycérophosphate ont été ajoutés dans chaque puits afin de stimuler la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en ostéoblastes.

Après 4 autres jours de culture en présence de ces facteurs de différenciation, les cultures ont été colorées au rouge d'alizarine pour mettre en évidence des nodules de minéralisation (le rouge d'alizarine se fixe sur les dépôts calcique des ostéoblastes). Les nodules ont ensuite été dissous et l'intensité de la coloration dans la solution ainsi obtenue a été mesurée par spectrophotométrie (lecteur de microplaque Sunrise-Basic, Tecan).

Résultats

Les résultats présentés sur les figures 4 et 5 montrent que la fraction CR10 qui est un protéolysat de caséines comprenant essentiellement des peptides de plus de 10 kDa, a un effet positif sur la minéralisation de la matrice osseuse, c'est-à-dire sur l'activité ostéoblastique. Exemple 3 : Stabilité des protéolysats

Le protéolysat CR10 obtenu selon le protocole détaillé dans l'exemple 2 a été soumis à un traitement thermique (96°C pendant 4 min) avant l'étape de lyophilisation. Son activité sur la prolifération des cellules osseuses et sur la différenciation des ostéoblastes a ensuite été évaluée selon le protocole détaillé dans l'exemple 1.

Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 6.

Ces résultats montrent que le traitement thermique n'altère pas l'activité de stimulation du protéolysat sur la prolifération des cellules osseuses et sur la différenciation des ostéoblastes.