GAEUMANNOMYCES GRAMINIS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención divulga un consorcio bacteriano liofilizado que comprende dos cepas bacterianas endof (ticas (Acínetobacter sp y Serratia sp) y una cepa bacteriana rizosférica (Bacillus sp), el método de obtención de dicho consorcio, y el uso de dicho consorcio para inhibir el desarrollo, prevenir y/o tratar enfermedades causadas por patógenos de plantas y para promover el crecimiento de las mismas. El consorcio bacteriano liofilizado es aplicado en semillas de plantas para inhibir el desarrollo el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas, así como también para promover el crecimiento en las plantas.

PROBLEMA DE LA TÉCNICA

La enfermedad del “mal del pie” es una enfermedad causada por el hongo Gaeumannomyces graminis var. Trítici (Ggt). Este fitopatógeno afecta a las raíces de cereales como es el caso de trigo, centeno y triticale causando importantes pérdidas económicas. En el caso del trigo, que es el cereal de mayor importancia económica y cultural, las pérdidas en la producción causadas por este hongo van desde un 30% a un 50%, siendo esta una de las enfermedades más severas que afecta los cultivos a nivel mundial. Sumado a esto la capacidad del hongo de formar estructuras de sobrevivencia, como apotecios, le permiten sobrevivir en el suelo o en restos de tejidos de manera prolongada, lo que hace que el control sea extremadamente difícil y se restrinja principalmente al uso de agentes químicos para tratar esta enfermedad. Al respecto se destaca la desinfección de suelo o semilla mediante el uso de fungicidas tales como azoxistrobina, silthiofam y triticonazole. Sin embargo, el uso de los agentes químicos genera un gasto económico extra, el cual es acompañado por la correspondiente contaminación ambiental y el daño ecológico causado al ecosistema que genera su utilización.

Por otra parte, y con la finalidad de limitar la contaminación debida a agentes químicos, se han utilizados otras prácticas agrícolas o sistemas de siembra alternativos, en donde destacan las rotaciones de cultivo, las cuales apuntan a no sembrar la misma familia de plantas por períodos consecutivos. Bajo esta estrategia, mientras más años transcurran entre una siembra de determinado cultivo y la siguiente, mayor será el control que se podrá tener ante la enfermedad. Sin embargo, como este fitopatógeno afecta a otros cereales, los agricultores se ven obligados a realizar las rotaciones de cultivo descartando otras especies de gramíneas para evitar o disminuir el riesgo de infecciones subsecuentes, con lo cual sus opciones de cultivo se ven severamente restringidas.

Adicionalmente y dada la complejidad de realizar rotaciones adecuadas para el control de la enfermedad causada por Ggt, y en búsqueda de nuevas alternativas que permitan combatir este patógeno, se han desarrollado investigaciones que han evidenciado que sembrar cereales de manera consecutiva en el mismo lugar, proceso denominado monocultivo, ha llevado al desarrollo de suelos supresivos a la enfermedad. Los suelos supresivos se definen como aquellos suelos que, a pesar de la presencia del patógeno, son inmunes o presentan baja incidencia a la enfermedad debido principalmente a la presencia de microorganismos benéficos que ayudan a controlar el fitopatógeno (Duran et al., 2017. Screening and characterization of potentially suppressive soils against Gaeumannomyces graminis under extensive wheat cropping by Chilean indigenous communities). Entre dichos microorganismos, es posible destacar las bacterias promotoras de crecimiento vegetal o PGPB (Plant Growth-Promoting Bacteria) que son capaces de ayudar a las plantas a sobrevivir a factores ambientales (abióticos) o a enfermedades causadas por fitopatógenos (factores bióticos) mediante la producción de enzimas, hormonas o antibióticos.

Dentro de la producción de antibióticos está la producción de fenazina, que es exclusivamente producido por bacterias. Sin embargo, y a pesar de los numerosos estudios en relación al uso de PGPB para aplicaciones agronómicas, su uso a nivel de campo ha sido muy limitado. Esto se debe, entre otras razones, principalmente a que los microorganismos foráneos tienen a menudo una baja persistencia y permanencia en el suelo donde son introducidos debido a la ardua competencia con los microorganismos nativos. Adicionalmente, las formulaciones que se han probado en campo suelen ser muy inestables y no aseguran la actividad de los microorganismos, por lo que la formulación que contiene los microorganismos, y consecuentemente el método mediante el cual se produce, es crucial para asegurar la estabilidad, sobrevida y la actividad de las PGPB. Una posible solución a este problema es el uso de consorcios microbianos formulados con bacterias endófitas, las cuales son bacterias PGPB capaces de sobrevivir al interior de los tejidos de la planta, sin causar daño a esta, lo que trae consigo múltiples ventajas evolutivas. De ese modo, las bacterias colonizan un ambiente más benevolente al interior de la planta, lo que favorece su sobrevida y consecuentemente sus efectos positivos. Sin embargo, no existen evidencias prácticas del uso de PGPB para el control de la enfermedad del mal del pie causada por Ggt.

En consecuencia, considerando el problema técnico asociado a la enfermedad del mal del pie provocada por Ggt, sumado a que no existe una estrategia eficaz, amigable con el medio ambiente y que además permita el cultivo de especies de gramíneas de forma continua sin el riesgo de que los cultivos contraigan y propaguen a las generaciones futuras este hongo fitopatógeno, es de crucial importancia buscar nuevas estrategias y alternativas para solucionar dicho problema técnico. ESTADO DEL ARTE

Adicionalmente al control a través de agentes químicos como los fungicidas anteriormente mencionados, en un intento de controlar de manera eficaz el hongo Gaeumannomyces graminis var. Trítici (Ggt), se han desarrollado diversas estrategias con miras a desarrollar alternativas más naturales y/o amigables con el medio ambiente.

De este modo, en la actualidad existen tratamientos donde se demuestra el uso de recubrimientos de semillas para promover la salud y crecimiento de una planta. Así, por ejemplo, la solicitud de patente US 20170245494, divulga una película multicapa bioactiva y biodegradable. La película multicapa incluye uno o más compuestos bioactivos o microorganismos para promover el crecimiento y la salud de una planta, los cuales están contenidos entre las capas de la película, en donde cada una de las capas comprende aproximadamente 60% a aproximadamente 75% (m/m) de polihidroxialcanoato. Los compuestos bioactivos o microorganismos pueden incluir cualquiera de, o una combinación de: un metabolite, un compuesto antimicrobiano, una enzima, un microorganismo vivo, un fertilizante, una hormona de crecimiento vegetal, un conservante, un pesticida o un herbicida. La liberación de uno o más compuestos bioactivos se puede lograr de una manera controlada y programada. Cabe destacar que el documento US 20170245494 no divulga un consorcio bacteriano liofilizado como el divulgado en la presente solicitud. Adicionalmente, la presente invención se diferencia del documento US 20170245494, en que los microorganismos utilizados por los inventores son bacterias aisladas desde suelos con características supresivas, las cuales son capaces de producir antibióticos del tipo fenazinas, y además son capaces de promover el crecimiento de las plantas al producir enzimas que solubilizan fósforo (como por ejemplo fosfatasas y f itasas) , que lo dejan disponible para la nutrición de la planta. Junto con lo anterior, las bacterias del consorcio de la presente invención además producen sideróforos (como por ejemplo hidroxamatos), los cuales son capaces de quelar el hierro y dejarlo disponible para la planta, lo que de manera indirecta evita que se encuentre disponible para la nutrición del fitopatógeno. Por lo tanto, la presente invención reúne varios elementos técnicos que el documento US 20170245494 no divulga ni sugiere y que, por tanto, la diferencian sustancialmente con dicho documento.

Por otro lado, se han utilizado consorcios microbianos aislados con la capacidad de generar moléculas capaces de promover el crecimiento de las plantas, así como la resistencia a enfermedades. En este ámbito el documento CN 106244490 divulga un compuesto fertilizante microbiano para prevenir y tratar enfermedades de plantas, particularmente de trigo, y un método de preparación del compuesto fertilizante microbiano. El compuesto fertilizante microbiano consiste en las siguientes cepas: Streptomyces catenulae, Streptomyces albolongus, Bacillus flexus, Bacillus aryabhattai y Tríchoderma brevicom pactum. Las cepas en el documento inducen a la planta de trigo a generar resistencia a enfermedades en virtud de la producción de metabolites secundarios y de diversos antibióticos, tales como proceomicina, neomicina E, catenulina, diparomomicina y similares, que inhiben los microorganismos patógenos de la enfermedad del trigo. Las cinco cepas seleccionadas en el documento CN 106244490 fueron directamente aisladas del suelo y tienen un efecto promotor del crecimiento de la rizosfera. Además, pueden promover la reproducción y el crecimiento en las superficies de cultivo o en las plantas o el suelo. Adicionalmente el documento CN 106244490 divulga que las cepas pueden tener un efecto sobre la fijación de nitrógeno y pueden promover la secreción direccional de algunos metabolites secundarios de la rizosfera de la planta.

Asimismo, también se ha reportado el uso de cepas bacterianas individuales para tratar el mal del pie de trigo. Así, por ejemplo, el documento CN 103074271 , divulga un inoculo microbiano pulverizado, elaborado mediante la preparación en aerosol seco de una solución de fermentación de la cepa de Bacillus subtilis YB-05. De acuerdo al documento, la cepa YB- 05 y su inoculante tendrían las ventajas de contar con un amplio espectro antibacteriano, buen efecto antimicrobiano y fuertes efectos de inhibición sobre la enfermedad del trigo (mal del pie), de la Botrytis cinérea en el tomate, los hongos del tizón de la vaina del trigo, Phytophthora melonis y similares. Además, el inoculante tendría las ventajas de alta eficiencia, no toxicidad, uso simple y sin contaminación ambiental.

Es importante destacar que los documentos CN 106244490 y CN 103074271 antes citados, no divulgan un consorcio bacteriano liofilizado como el divulgado en la presente solicitud. Además, a diferencia de los microorganismos divulgados en dichos documentos, el consorcio bacteriano liofilizado de la presente invención fue aislado de suelos supresivos. De este modo, por ejemplo, Serratia sp corresponde a un microorganismo aislado de los tejidos de plantas que fueron crecidas en suelos supresivos (cepa endofítica), Bacillus sp. corresponde a un microorganismo aislado desde suelo en contacto con las raíces de las plantas (cepa rizosférica), y por último Acinetobacter sp. fue también aislada desde el interior de las raíces de trigo (cepa endofítica). En este contexto, cabe señalar que se ha demostrado que la utilización de microorganismos endofíticos proporciona una ventaja comparativa debido principalmente a que los microorganismos crecidos en estos ambientes son microorganismos que han evolucionado para generar una asociación entre los microorganismos y la planta. Esta ventaja evolutiva ayuda a promover un efecto benéfico, reflejado en una protección frente a factores abióticos (sequía, salinidad, pH, nutrientes, etc.) y bióticos (como competencia con otros microorganismos). Por tanto, microorganismos aislados de suelos supresivos, como los de la presente invención, son significativamente distintos a los microorganismos de los documentos CN 106244490 y CN 10307427. Junto con las diferencias antes mencionadas, si bien ambos documentos describen que las cepas producirían antibióticos, no se describe que esas cepas produzcan fenazinas, antibióticos sí producidos por el consorcio de la presente invención. Adicionalmente, las bacterias utilizadas en la presente invención producen también sideróforos, como por ejemplo hidroxamatos, los cuales son capaces de quelar el hierro y dejarlo disponible para la planta, lo que de manera indirecta evita que se encuentre disponible para la nutrición del fitopatógeno. Dicha característica técnica asociada a la producción de sideróforos no fue descrita ni sugerida en ninguno de los documentos CN 106244490 y CN 10307427. Por lo tanto, la presente invención reúne vahos elementos técnicos que la diferencian sustancialmente con dichos documentos de origen chino.

Por otro lado, en el estado del arte se encuentra divulgada la utilización de microorganismos, como cepas individuales, en conjunto con antibióticos tipo fenazinas para tratar enfermedades de plantas. En este contexto por ejemplo el documento CN 107306999, divulga una composición bactericida basada en ácido fenazina-1 -carboxílico y una bacteria que la contiene, donde los componentes activos de la composición bactericida son ácido fenazina-1 -carboxílico y Bacillus cereus, que se encuentran en una relación en peso de ácido fenazina-1 -carboxílico al Bacillus cereus de 1 :100-100:1 , en donde el contenido de Bacillus cereus por gramo de composición bactericida es de 10 ⁶ - 10 ¹¹ /g, y el bactericida contiene 1 - 90% en peso de la composición bactericida. En contraste con este documento, la presente invención se basa en un consorcio bacteriano y no en una cepa individual, en donde tal como se destacó anteriormente, el consorcio bacteriano está constituido por bacterias aisladas desde suelos supresivos, con todas las ventajas que estas conllevan. Asimismo, en el documento de origen chino, utilizan una combinación del microorganismo Bacillus cereus con un tipo de fenazina, particularmente ácido fenazina-1 -carboxílico, el cual según la solicitud es producido por Pseudomonas fluorescens, por lo que no se ensaya el efecto del microorganismo y de los metabolites que el mismo produce. Del mismo modo, no se describe ni sugiere que la cepa de Bacillus cereus produzca enzimas capaces de solubilizar fósforo, ni sideróforos. Adicionalmente, no se describe el uso particular para inhibir el desarrollo del patógeno o controlar la enfermedad del “mal del pie” de trigo causada por Ggt.

Por tanto, la presente invención se diferencia de los documentos citados, en que divulga un consorcio bacteriano liofilizado no descrito en el arte previo, que además de producir el antibiótico fenazina, también aporta factores trascendentales para la nutrición y la salud vegetal a través, por ejemplo, de la solubilización de fósforo y la producción de sideróforos. En este contexto, la invención de la presente solicitud de patente se basa particularmente en un consorcio bacteriano liofilizado que consiste en dos bacterias aisladas de suelos supresivos, Bacillus sp. (depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), bajo el número de acceso: RGM 2948, con fecha 28 de enero de 2020) y Serratia sp. (depositada en la CChRGM , bajo el número de acceso: RGM 2949, con fecha 28 de enero de 2020) y una bacteria denominada Acinetobacter sp. aislada de estudios preliminares (Duran et al., 2014, Endophytic bacteria from selenium-supplemented wheat plants could be useful for plant-growth promotion, biofortification and Gaeumannomyces graminis biocontrol in wheat production; depositada en la CChRGM, bajo el número de acceso: RGM 3033, con fecha 11 de agosto de 2020). La utilización de estas bacterias evolucionadas en suelos supresivos aseguran un control sobre patógenos de plantas, así como también ayudan a promover el crecimiento y salud de las mismas.

En consecuencia, a partir de los documentos del estado de la técnica es posible concluir que a la fecha no existe un consorcio bacteriano liofilizado como el divulgado en la presente invención que solucione el problema de la técnica, correspondiente a tratar enfermedades causadas por patógenos de plantas (como por ejemplo trigo, centeno, triticale, hortalizas y cultivos), más particularmente la enfermedad del “mal del pie” causada por el hongo fitopatógeno Gaeumannomyces graminis (Ggt), sin afectar, o incluso también promoviendo, el crecimiento en las plantas. Por lo tanto, específicamente, el arte previo no divulga ni sugiere el consorcio bacteriano liofilizado de la presente solicitud, capaz de no solo disminuir el porcentaje de infección del patógeno Gaeumannomyces graminis causante del mal del pie en cereales, sino además promover la salud de la planta a través de la solubilización de fósforo y producción de sideróforos. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1 : Esta figura muestra la fotografía de un gel de agarosa donde se observa una amplificación de PCR donde se advierte el tamaño esperado para el gen que codifica para fenazina (790 pb). Nomenclatura del gel de agarosa al 1%, MP: marcador de peso molecular; E6.2: Acinetobacter sp. E6.2 (N° de acceso: RGM 3033); 188.3: Serratia sp. 188.3 (N° de acceso: RGM 2949); 4B: Bacillus sp. 4B (N° de acceso: RGM 2948); C(-): control negativo.

Figura 2: Esta figura muestra un gráfico donde se compara el porcentaje de infección en plantas de trigo, crecidas desde semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liof ilizado (consorcio), o sin el consorcio bacteriano liofilizado (control), sembradas en suelos en presencia del hongo Gaeumannomyces graminis var. Tritici(Ggt) (+Ggt) o en ausencia de Ggt (-Ggt).

Figura 3: Esta figura muestra un gráfico donde se compara la biomasa obtenida de plantas de trigo crecidas desde semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado (consorcio), o sin el consorcio bacteriano liofilizado (control), sembradas en suelos en presencia del hongo Ggt (+Ggt) o en ausencia de Ggt (-Ggt).

Figura 4: Esta figura muestra un gráfico donde se compara el porcentaje de infección en plantas de trigo, en relación a las raíces necróticas de plantas de trigo infectadas (+Ggt), crecidas desde semillas no inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado (Control); crecidas desde semillas inoculadas con cada una de las cepas bacterianas por separado que forman parte del consorcio, es decir, Serratia sp. 188.3 (Serratia); Bacillus sp. 4B (Bacillus); y Acinetobacter sp. E6.2 (Acinetobacter); y crecidas desde semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado (Consorcio);. Las letras indican diferencias estadísticas (las letras fueron obtenidas a través del test de Tukey)., en donde diferentes letras indican diferencias estadísticas a p<0,05. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención divulga un consorcio bacteriano liofilizado, que comprende dos cepas de bacterias endofíticas (Acinetobacter sp. y Serratia sp.) y una cepa bacteriana rizosférica (Bacillus sp), el método de obtención del consorcio bacteriano liofilizado, y su uso en la inhibición del desarrollo, el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por patógenos de plantas, así como también, en la promoción del crecimiento de dichas plantas. Asimismo, se divulga un método para inhibir el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promover el crecimiento de las mismas, que comprende aplicar el consorcio bacteriano liofilizado a semillas desde las que crecen dichas plantas.

Las cepas bacterianas utilizadas en la presente invención han sido aisladas y seleccionadas desde suelos supresivos, a partir de sus características de promoción del crecimiento vegetal (en base a una correlación dependiente de su capacidad de solubilización de fósforo y producción de sideróforos), a la producción de antibióticos del tipo fenazinas (mediante la identificación del gen que codifica para fenazina por PCR usando partidores específicos) y principalmente a la capacidad de inhibir el crecimiento del hongo Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggt) in vitro.

Las cepas del consorcio bacteriano de la presente invención fueron depositadas en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), en su calidad de Autoridad Internacional de Depósito (IDA). La cepa de Acinetobacter sp. (E6.2) fue depositada en la CChRGM bajo el número de acceso: RGM 3033, con fecha 1 1 de agosto de 2020. La cepa de Serratia sp. (188.3) fue depositada en la CChRGM, bajo el número de acceso: RGM 2949, con fecha 28 de enero de 2020. La cepa de Bacillus sp. (4B) fue depositada en la CChRGM, bajo el número de acceso: RGM 2948, con fecha 28 de enero de 2020. Las cepas del consorcio bacteriano de la invención presentan una o más de las siguientes características: capacidad para solubilización de fósforo, producción de sideróforos, producción de fenazinas e inhibición de Ggt in vitro.

En términos generales, la cepa Acinetobacter sp. E6.2 (N° de acceso: RGM 3033) tiene la capacidad de producir fenazinas y de inhibir significativamente el desarrollo de Ggt in vitro. Por otra parte, las cepas de Bacillus sp. 4B (N° de acceso: RGM 2948) y Serratia sp. 188.3 (N° de acceso: RGM 2949) tienen la capacidad de solubilizar fósforo, producir sideróforos e inhibir parcialmente el desarrollo de Ggt in vitro.

La presente invención divulga un consorcio bacteriano liofilizado que comprende la cepa de Acinetobacter sp. E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), la cepa de Bacillus sp. 4B (N° de acceso: RGM 2948) y la cepa de Serratia sp. 188.3 (N° de acceso: RGM 2949).

El consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la presente invención tiene 1 x10 ¹⁴ a 4x10 ¹⁶ UFC por gramo de consorcio bacteriano liofilizado.

El consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la invención puede ser utilizado para tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas causadas por patógenos de plantas y para promover el crecimiento de las mismas. Asimismo, el consorcio bacteriano liofilizado se puede aplicar a semillas, en un método para inhibir el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promover el crecimiento de las mismas.

Preferentemente, pero sin estar limitado a, el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado para tratar y/o prevenir enfermedades de plantas causadas por el hongo Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggt).

Preferentemente, pero sin estar limitado a, el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado para tratar enfermedades, preferentemente de gramíneas, más preferentemente de trigo, centeno y triticale. Asimismo, la presente invención divulga métodos de preparación del consorcio bacteriano liofilizado.

En una realización, el método de preparación del consorcio bacteriano liofilizado comprende las siguientes etapas: i), inocular un medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Acinetobacter sp., con una cepa bacteriana de Bacillus sp., y con una cepa bacteriana de Serratia sp. en las proporciones 37%, 27% y 36%, respectivamente, e incubar por 24 a 36 horas, con agitación entre 50-150 rpm, a una temperatura de 28°C, para obtener un caldo bacteriano;

¡i), centrifugar el caldo bacteriano obtenido en la etapa (i) a entre 4000-6000 rpm, por 10- 15 minutos, para obtener un pellet bacteriano; iii). lavar el pellet bacteriano obtenido en la etapa (¡i) al menos 3 veces con una solución de lavado; iv). congelar el pellet bacteriano obtenido en la etapa (iii) por 12 a 16 horas, a -50 a -80 ^e C, utilizando un medio que contenga un compuesto que evite el daño celular; y v). liofilizar el pellet de la etapa (iv) en un liofilizador para obtener el consorcio bacteriano liofilizado.

En otra realización, el método de preparación del consorcio bacteriano liofilizado puede realizarse mediante la producción y liofilización de las cepas bacterianas por separado, y posterior mezcla de las mismas para obtener el consorcio bacteriano liofilizado. En dicha realización, el método de preparación del consorcio bacteriano liofilizado comprende las siguientes etapas: i), inocular un primer medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Acinetobacter sp., un segundo medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Bacillus sp., y un tercer medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Serratia sp., e incubar por 24 a 36 horas, con agitación entre 50-150 rpm, a una temperatura de 28°C, para obtener un primer, un segundo y un tercer caldo bacteriano, respectivamente;

¡i), centrifugar el primer, el segundo y el tercer caldo bacteriano obtenidos en la etapa (i), respectivamente, a entre 4000-6000 rpm, por 10-15 minutos, para obtener un primer, un segundo y un tercer pellet bacteriano, respectivamente; iii). lavar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos en la etapa (¡i), respectivamente, al menos 3 veces con una solución de lavado; iv). congelar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos en la etapa (iii), respectivamente, por 12 a 16 horas, a -50 a -80 ^e C, utilizando un medio que contenga un compuesto que evite el daño celular; v). liofilizar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos de la etapa (iv), respectivamente, en un liofilizador para obtener un primer, un segundo y un tercer liofilizado bacteriano, en donde el primer liofilizado comprende la cepa bacteriana de Acinetobacter sp., el segundo liofilizado comprende la cepa bacteriana de Bacillus sp., y el tercer liofilizado comprende la cepa bacteriana de Serratia sp. y vi), mezclar el primer, el segundo y el tercer liofilizado en las proporciones 37%, 27% y

36%, respectivamente, para obtener el consorcio bacteriano liofilizado.

En esta segunda realización, la única diferencia se encuentra en el momento en el cual se combinan las cepas bacterianas para formar el consorcio bacteriano, siendo en la etapa (i) del método de la primera realización antes descrita, y en la etapa vi) en el método de la segunda realización antes descrita. Sin embargo, el entendido en la materia comprenderá que cualquiera sea el método que se utilice, el resultado en relación con el consorcio bacteriano liofilizado será el mismo.

En relación con las realizaciones antes descritas, preferentemente la cepa bacteriana de Acinetobacter sp. es la cepa E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), la cepa bacteriana de Bacillus sp. es la cepa 4B (N° de acceso: RGM 2948) y la cepa bacteriana de Serratia sp. es la cepa 188.3 (N° de acceso: RGM 2949).

Si las cepas bacterianas están almacenadas y no disponibles en cultivo fresco previo a la realización del método, se realiza una etapa previa a la etapa (i) antes descrita, en la cual se reactivan dichas cepas bacterianas a través de la realización de un preinóculo en un medio que permite una adecuada recuperación de las cepas bacterianas.

Las cepas bacterianas pueden estar almacenadas a través de cualquier técnica convencional. Preferentemente, pero sin limitación, las cepas bacterianas almacenadas se encuentran en una solución de 20% glicerol y 80% medio de cultivo. Preferentemente, pero sin limitación, el medio de cultivo es medio de cultivo LB.

Preferentemente, pero sin limitación, el preinóculo de las cepas bacterias se realiza en el medio que permite una adecuada recuperación de las cepas bacterianas, diluyendo las cepas bacterianas de 50 a 100 veces en dicho medio de cultivo. El medio de cultivo que permite una adecuada recuperación de las cepas bacterianas se selecciona de cualquier medio general apto para el crecimiento bacteriano. Preferentemente, pero sin limitación, el medio general apto para el crecimiento bacteriano se selecciona del grupo que comprende: caldo nutritivo, extracto de malta, medio MRS, medio TSA y medio LB. Más preferentemente, el medio de cultivo que permite una adecuada recuperación de las cepas bacterianas es medio LB. Para la reactivación, preferentemente, el preinóculo se incuba por 24 a 36 horas, con agitación entre 50-150 revoluciones por minuto (rpm) a una temperatura de 28°C.

En la etapa (i) de los métodos, el medio de cultivo estéril es un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las cepas bacterianas, que se selecciona de cualquier medio general apto para el crecimiento bacteriano. Preferentemente, pero sin limitación, dicho medio general apto para el crecimiento bacteriano se selecciona del grupo que comprende: caldo nutritivo, extracto de malta, medio MRS, medio TSA y medio LB. Más preferentemente, el medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las cepas bacterianas, es decir el medio de cultivo estéril, es medio LB.

La etapa (¡i) de centrifugación de los métodos, preferentemente, se realiza a temperatura ambiente.

La solución de lavado que se utiliza en la etapa (iii) de los métodos, puede ser agua destilada o una solución salina, en donde la solución salina es preparada con sales seleccionadas del grupo que comprende: NaOH y KOH. Preferentemente, la solución salina es NaOH al 0,5-1 % (p/v).

El compuesto utilizado en la etapa iv) de los métodos, para evitar el daño celular, se selecciona desde el grupo que comprende leche descremada, leche semidescremada, leche entera, suero bovino, caseína, polisorbato 20, polisorbato 80 y tritón. Preferentemente, el compuesto que evita el daño celular se encuentra a una concentración entre 10-20 % p/v.

La liofilización de la etapa (v) de los métodos, preferentemente, pero sin limitación, se lleva a cabo por dos días a una temperatura de entre -40 ^e C y -50 ^e C y a una presión de entre 0,080 a 0,2 mBar (8-200 Pa). El tiempo de liofilización dependerá de las condiciones operacionales. Preferentemente, pero sin limitación, el tiempo de liofilización es de 1 -3 días. Una vez obtenido el consorcio bacteriano liofilizado, la carga microbiana se determina mediante cualquier método convencional. Preferentemente, la carga microbiana se determina mediante el conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) del material liofilizado en medio de cultivo LB, considerando para ello las diluciones y el peso inicial del polvo.

La presente solicitud también se refiere al uso del consorcio bacteriano liofilizado para inhibir el desarrollo, prevenir y/o tratar enfermedades causadas por patógenos de plantas y para promover el crecimiento de las mismas. Preferentemente, el uso del consorcio bacteriano liofilizado sirve para prevenir la enfermedad del “mal del pie” (Ggt). Más preferentemente, el uso del consorcio bacteriano liofilizado sirve para prevenir la enfermedad del “mal del pie” (Ggt) en plantas cereales. Aún más preferentemente, el uso del consorcio bacteriano liofilizado sirve para inhibir el desarrollo del patógeno o prevenir la enfermedad del “mal del pie” (Ggt) en plantas de cereales, tales como, pero sin estar limitados a, trigo, centeno, triticale.

La presente solicitud, además divulga un método para inhibir el desarrollo de enfermedades infecciosas causadas por patógenos de plantas y promover el crecimiento de las mismas, que comprende aplicar el consorcio bacteriano liofilizado a semillas desde las que crecen dichas plantas, para producir semillas inoculadas con el consorcio bacteriano, en donde la aplicación del consorcio bacteriano liofilizado en las semillas comprende las etapas de:

(a) desinfectar las semillas con un método de desinfección superficial;

(b) mezclar las semillas obtenidas de la etapa (a) con 10 - 20 % en peso de una mezcla de magnesio/calcio (tal como magnecal®), 15 % en peso de agua y 0,2 % en peso de una mezcla de pegamento adhesivo líquido y agua (proporción 1 :9); (c) agregar una carga de 1 x10 ⁹ a 1x10 ¹¹ UFC del consorcio bacteriano liofilizado, obtenido a partir de cualquiera de los métodos de preparación del consorcio bacteriano liofilizado antes descritos, a la mezcla de la etapa (b);

(d) combinar y homogenizar la mezcla resultante de la etapa (c) a una velocidad de entre 50 y 100 rpm, por un período de 5 a 15 minutos a temperatura ambiente; y

(e) secar las semillas obtenidas en la etapa (d) a una temperatura entre 15 a 25°C por al menos 3 horas, para obtener semillas inoculadas con el consorcio bacteriano.

El método de desinfección superficial de las semillas de la etapa (a), puede ser cualquier método que no altere la posterior germinación de las semillas. Preferentemente, la desinfección superficial se realiza utilizando una solución al 15%-20% de etanol más 1%-2% de hipoclorito de sodio, por 2-5 min, la cual es posteriormente enjuagada.

La etapa (d) de combinación y homogenización de la mezcla se realiza a una baja velocidad para que las semillas se impregnen con la mezcla y para evitar que se peguen.

Las semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado obtenidas a partir del método antes descrito pueden ser utilizadas para ser plantadas directamente en el suelo o almacenadas por un período prologado, a temperatura ambiente, evitando humedad. Preferentemente, las semillas se pueden almacenar por un período de entre 1 a 3 años.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no representan de modo alguno una limitación de la presente invención. Ejemplo 1 : Caracterización de las cepas bacterianas del consorcio bacteriano

Inicialmente se caracterizaron las cepas del consorcio bacteriano de acuerdo con la presente invención, es decir, la cepa de Acinetobacter sp. E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), la cepa de Bacillus sp. 4B (N° de acceso: RGM 2948) y la cepa de Serratia sp. 188.3 (N° de acceso: RGM 2949).

La caracterización se realizó analizando específicamente su capacidad de inhibición del desarrollo del hongo Ggt in vitro y los rasgos de estas cepas que se podrían asociar a características propias de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPB).

Para evaluar los rasgos tipo PGPB, se analizó la capacidad de solubilización de fósforo y la capacidad de producción de sideróforos de las distintas cepas.

La capacidad de solubilización de fósforo en agar fue verificada de acuerdo a la formación de un halo en medio NBRIP (National Botanical Research Institute’ phosphate) suplementado con fosfato tricálcico (Ca3[PO4]2). Este medio contiene (en g/L): Glucosa, 10; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.1 ; KCI, 0.2; MgSO ₄ x7H2O, 0.25; MgCI ₂ x6H2O, 5; Agar, 14; pH: 7 enriquecido con fosfato tricálcico, Ca3PO4, al 0.5% como fuente de fosfato inorgánico e insoluble. Además se probaron con medio PSM (phytase screening medium) el cual contiene fitato de sodio (C6H ₆ Nai ₂ O ₂ 4P ₆ xH2O) como única fuente de fósforo (5 g/L) y se compone de los siguientes componentes por L, 10 g sucrosa, 2 g (NH ₄ )2SO ₄ , 3 g triptona, 2 g extracto de levadura, 0.5 g KCI, 0.5 g MgSO ₄ , 0.01 g MnSO ₄ -5H ₂ O, 0.01 g PeSO ₄ , 1 g Triton X-100 y 15 g agar, pH: 7.0 La producción de sideróforos fue evaluada en placas de agar con medio suplementado con chrome azurol S (CAS).

Por otra parte, para evaluar la capacidad de producción de antibióticos, se analizó la expresión del gen que codifica fenazinas, realizando un ensayo de PCR mediante el uso de partidores específicos para el gen que codifica el antibiótico fenazina (PHZ1 ,5'- GGCGACATGGTCAACGG-3' y PHZ2, 5'-CGGCTGGCGGCGTATTC-3'), en donde dicho antibiótico fue identificado en la banda que amplifica una región de 790 pares de bases (bp). (Figura 1 ).

Finalmente se analizó el porcentaje de inhibición del desarrollo de Ggt que tenía cada una de las cepas in vitro. Para lo anterior, se cultivó Ggt en placas de agar PDA a 25 °C durante 1 semana. Discos de agar (4 mm de diámetro) que contenían Ggt se incisaron asépticamente y se transfirieron al centro de placas de agar que contenían medio LB/PDA (1 :1). Luego, se tomaron dos gotas (5 pL) de cada suspensión de bacterias y se colocaron en dos posiciones diamétricas a 2 cm del disco de agar que contenía el inoculo de Ggt. Se midió el crecimiento de micelios fúngicos después de la incubación durante 2, 5 y 7 días a 25°C en oscuridad. El porcentaje de inhibición se calculó en base al crecimiento del hongo sin presencia bacteriana (control).

A modo de resumen, la tabla 1 , muestra los rasgos tipo PGPB, es decir, solubilización de fósforo y producción de sideróforos, así como también, la capacidad de producir fenazinas y la capacidad de inhibición del patógeno Ggt in vitro, por parte de cada una de las cepas bacterianas utilizadas en la presente invención de manera independiente.

Tabla 1. Caracterización individual de las cepas que conforman el consorcio bacteriano

Cepa Solubilización Producción de Producción % inhibición de de fósforo sideróforos de fenazinas Ggt in vitro

Bacillus sp. 4B +++ Positivo positivo 40

Serratia sp. 188.3 + Positivo positivo 20

Acinetobacter sp. E6.2 negativo Negativo positivo 100

Tal como se muestra en la Tabla 1 , en relación con los rasgos PGPB, que podrían estar asociados a la promoción del crecimiento vegetal, la cepa de Acinetobacter sp. E6.2 no exhibió características propias de las PGPB, es decir, solubilización de fósforo y producción de sideróforos, sino que sólo fue positiva para la producción de antibióticos del tipo fenazinas. A través del ensayo de PCR se determinó además que las cepas de Bacillus sp. 4B y Serratia sp. 188.3 también eran capaces de producir el antibiótico fenazina, ya que, así como la cepa de Acinetobacter sp. E6.2, también mostraron una banda que amplificaba una región de 790 bp consistente con la amplificación del gen que codifica dicho antibiótico (Figura 1 ).

Adicionalmente, las cepas de Bacillus sp. 4B y Serratia sp. 188.3 fueron capaces de solubilizar fósforo y producir sideróforos, características que tal como se mencionó anteriormente, se podrían correlacionar con la capacidad de esas cepas de promover el crecimiento vegetal.

Por otra parte, con respecto a la capacidad de inhibir el crecimiento de Ggt in vitro, en la tabla 1 se observa que la cepa de Acinetobacter sp. E6.2 inhibió el 100% del crecimiento del micelio de Ggt in vitro, la cepa de Bacillus sp. 4B inhibió el crecimiento del micelio de Ggt in vitro en un 40% y la cepa de Serratia sp. 188.3 inhibió el crecimiento del micelio de Ggt in vitro en un 20%. En base a dichos resultados, los inventores consideraron que la mezcla de las cepas bacterianas aisladas, antes caracterizadas, mostraba una gran potencialidad para el control de Ggt y la promoción del crecimiento de plantas.

Ejemplo 2: Preparación del consorcio bacteriano

En primer lugar, se realizaron pruebas de compatibilidad entre las cepas, para verificar que se podía generar un consorcio en donde las tres cepas bacterianas de la invención estuvieran activas. Para ello, se realizó un crecimiento confrontacional, midiendo por densidad óptica (a 600nm) la misma cantidad bacteriana de los tres aislados que conforman el consorcio y sembrando de manera estriada en placa de Petri con medio LB sólido estas tres cepas de la invención, es decir, Acinetobacter sp. E6.2, Bacillus sp. 4B, y Serratia sp. 188.3. en distintas combinaciones. Particularmente, se utilizaron las siguientes combinaciones: Acinetobacter sp.x Bacillus sp., Acinetobacter sp. Serratia sp. Bacillus sp. X Serratia sp. y Acinetobacter sp.x Bacillus sp. x Serratia sp., para evidenciar crecimiento óptimo de las tres cepas. A partir de este ensayo, se determinó el crecimiento óptimo y se encontró que las cepas de la invención efectivamente pueden crecer en consorcio sin inhibir el crecimiento entre sí.

Con ese antecedente, para la preparación del consorcio se utilizaron muestras de cada una de las cepas bacterianas previamente almacenadas en un stock de glicerol (20% g licerol + 80% medio de cultivo LB).

Para reactivar las cepas bacterianas de la invención, es decir bacterias de la cepa de Acinetobacter sp E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), de Serratia sp 188.3 (N° de acceso: RGM 2949) y de Bacillus sp 4B (N° de acceso: RGM 2948), se realizó la preparación de un preinóculo, en donde se tomaron 50 pL de cada microorganismo, y se agregaron en un tubo con 5 mL de medio LB. Este preinóculo se incubó por 24 horas a 100 rpm y 28°C.

A partir del preinóculo antes descrito, se preparó un inoculo agregando las cepas de Acinetobacter sp., Bacillus sp. y Serratia sp., en una proporción de 37%, 27% y 36%, respectivamente, a un frasco que contenía un litro de medio LB, con la finalidad de usar la misma proporción de microorganismos, lo cual se calculó en base al crecimiento óptimo antes determinado. Este cultivo se incubó por 24 horas, a 100 rpm y 28°C.

Posteriormente, las bacterias fueron centrifugadas a 5000 rpm, por 10 minutos, a temperatura ambiente. El pellet bacteriano obtenido fue lavado tres veces con una solución salina de NaOH al 0,85 % p/v.

Una vez lavado, el pellet bacteriano fue congelado a -80°C en una solución 10% de leche descremada por una noche. Posteriormente, el proceso de liofilización se llevó a cabo por dos días a una temperatura de -52°C. Una vez obtenido el consorcio bacteriano liofi lizado , se realizó un conteo del liof ilizado , tras el cual el valor obtenido correspondió a 3,3x10 ¹⁶ UFC por gramo de liofilizado.

Ejemplo 3: Preparación de semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado.

El consorcio bacteriano liofilizado obtenido anteriormente fue utilizado para ser aplicado a semillas de trigo.

Para esto primero se desinfectaron 1000 g de semillas de trigo con una solución al 20% de etanol más 1% de hipoclorito de sodio por 5 min. Las semillas se enjuagaron con agua corriente para luego ser mezcladas con 100 g de magnecal®, 150 mL de agua y 20 mL de una mezcla de pegamento adhesivo líquido (cola fría) y agua (proporción 1 :9).

Utilizando el valor del conteo del liofilizado del ejemplo 2, se estimó que por cada kilogramo de semilla se debía agregar 0,5 gramos de liofilizado bacteriano, para llegar a una carga microbiana de 1x10 ¹¹ UFC.

En base a ello, se agregó a la mezcla de las semillas, 0,05 g del consorcio bacteriano liofilizado para obtener una carga de 1 x10 ¹⁰ UFC. Luego, se homogenize la mezcla anterior a una velocidad de 20 rpm, por un período 10 minutos, a temperatura ambiente, para que las semillas se impregnaran con la mezcla. Finalmente, las semillas inoculadas con el consorcio bacteriano fueron secadas a temperatura ambiente por al menos 3 horas.

Se llevó a cabo el mismo procedimiento utilizando cada una de las cepas del consorcio bacteriano de manera independiente (en lugar del consorcio), de modo de producir semillas inoculadas con solo una de las cepas para verificar el comportamiento particular de cada una de ellas en la inhibición del crecimiento de Ggt en el ejemplo 4. Ejemplo 4: Efecto del consorcio bacteriano liof ilizado en el crecimiento de trigo y en la inhibición del desarrollo de Ggt en trigo.

Para realizar los ensayos, en primer lugar, el hongo Gaeumannomyces graminis var. Trítici (Ggt) se hizo crecer por 7 días en medio agar de papa y dextrosa (PDA) a 25 ^e C de temperatura por 5 a 7 días. Posteriormente, el hongo se inoculó en avena estéril como sustrato, la cual había sido esterilizada en autoclave a 121 ^e C por tres días consecutivos. Después de 20 días se colectó la avena con el patógeno, se molió y se utilizó como inoculo de infección del suelo. Para ello, el suelo fue inoculado al 1% (1 gramo de inoculo de infección por 100 gramos de suelo), en donde esta concentración es igual o superior a la que se encuentra de manera natural en suelos infectados.

Para evaluar el efecto del consorcio bacteriano liofilizado en el crecimiento de trigo y en la inhibición del desarrollo de Ggt en trigo, se analizaron cuatro condiciones experimentales. En la primera de ellas, se sembraron semillas de trigo, no inoculadas, en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Control+Ggt). En la segunda, semillas de trigo inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Consorcio+Ggt). En la tercera, se sembraron semillas de trigo, no inoculadas, en macetas usando el suelo no infectado (Control -Ggt). Finalmente, en la cuarta, semillas de trigo inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando suelo no infectado (Consorcio -Ggt).

Después de 60 días en condiciones de invernadero, se determinó el porcentaje de infección mediante la medición de la necrosis radical (raíces negras en relación a las raíces sanas), resultados que se exponen la Figura 2 y en la Tabla 2 a continuación: Tabla 2. Efecto del consorcio bacteriano liofilizado en el porcentaje de infección de Ggt en plantas de trigo

Condición Infección (%) Error estándar

Control+Ggt 11 ,8342008 1 ,35173522

Consorcio+Ggt 2,0424333 0,75375549

Control -Ggt 0,30737705 0,27492639

Consorcio-Ggt 0,28195489 0,25218812

Tal como se muestra en la Tabla 2 y en la Figura 2 se puede observar que las plantas provenientes de semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado disminuyeron en un 80% la infección del fitopatógeno (Consorcio+Ggt) en relación con el control de las plantas provenientes de semillas no inoculadas (Control+Ggt). Además, se puede observar que los tratamientos en los cuales no se ha aplicado el fitopatógeno (“Control- Ggt” y “Consorcio-Ggt”) también presentan un pequeño porcentaje de necrosis que podría ser asociado a cualquier factor de estrés. En consecuencia, a partir de los resultados de la Figura 2, es posible concluir que el consorcio bacteriano liofilizado de la presente invención tiene la capacidad de inhibir el desarrollo del hongo Gaeumannomyces graminis var. Trítici (Ggt) en plantas de trigo.

Adicionalmente, para evaluar el crecimiento de las plantas de trigo se pesó la biomasa de la raíz y la de las hojas (parte aérea) y se calculó el crecimiento a través de la razón biomasa raíz / biomasa parte aérea, utilizando las mismas condiciones antes descritas, es decir, utilizando semillas inoculadas o no inoculadas con el consorcio y crecidas en presencia o ausencia del patógeno Ggt. Los resultados se exponen en la Figura 3 y en la Tabla 3 a continuación: Tabla 3: Efecto del consorcio bacteriano liofilizado en el crecimiento de plantas de trigo.

Condición Razón de biomasa (raíz/parte aérea) Error estándar

Control+Ggt 0,26508572 0,02797187

Consorcio+Ggt 0,41825243 0,06268516

Control -Ggt 0,55301984 0,08012779

Consorcio-Ggt 0,74831961 0,09044248

Sorprendentemente, los inventores encontraron que el consorcio no solo inhibe el desarrollo de Ggt, sino que también, observaron que el consorcio bacteriano liofilizado es capaz de aumentar la biomasa en más de un 37% en el caso de las plantas infectadas con el patógeno provenientes de semillas inoculadas con el consorcio (Consorcio+Ggt) en relación con las plantas infectadas con el patógeno provenientes de semillas no inoculadas (Control+Ggt). Asimismo, el consorcio bacteriano liofilizado aumentó la biomasa en más de un 27% en el caso de las plantas crecidas sin presencia del patógeno provenientes desde semillas inoculadas con el consorcio (Consorcio-Ggt) en relación con las plantas control provenientes desde semillas no inoculadas (Control-Ggt), demostrando así que el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la presente invención exhibiría propiedades de promoción del crecimiento vegetal (Figura 3).

A partir de los resultados antes descritos, se demuestra que el consorcio bacteriano liofilizado propuesto permite disminuir la incidencia del patógeno Ggt y aumentar la productividad, en términos de la biomasa producida, de plantas de cereales, como en el ejemplo, de las semillas tratadas de trigo. El experto podrá notar que la elección de las plantas de trigo se realizó únicamente a modo de ejemplo, ya que el método podría ser aplicable en otras plantas de cereales. Finalmente, para evaluar el efecto de cada una de las cepas del consorcio bacteriano de manera independiente, en comparación con el efecto del consorcio bacteriano liofilizado, en la inhibición del desarrollo de Ggt en plantas de trigo, se analizaron cinco condiciones experimentales adicionales. En la primera de ellas, se sembraron semillas de trigo no inoculadas, en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Control+Ggt). En la segunda, semillas de trigo inoculadas con la cepa bacteriana de Serratia sp 188.3 (N° de acceso: RGM 2949) obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Serratia+Ggt). En la tercera, semillas de trigo inoculadas con la cepa bacteriana de Bacillus sp 4B (N° de acceso: RGM 2948), obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Bacillus+Ggt). En la cuarta, semillas de trigo inoculadas con la cepa bacteriana de Acinetobacter sp E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Acinetobacter+Ggt). Por último, en la quinta, semillas de trigo inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Consorcio+Ggt). Los resultados se exponen en la Figura 4 y en la Tabla 4, que se muestra a continuación:

Tabla 4. Efecto del consorcio bacteriano liofilizado y de cada una de las cepas bacterianas que lo conforman en el porcentaje de infección de Ggt en plantas de trigo

Condición Infección (%) Error estándar

Control+Ggt 11 ,83420076 1 ,351735221

Serratia+Ggt 6,021807354 2,236201839

Bacillus+Ggt 4,390924461 0,75531769

Acinetobacter+Ggt 4,130536695 0,78456296

Consorcio+Ggt 2,042433299 0,753755489 partir de dichos resultados, resulta evidente que el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la invención tiene un mayor efecto inhibidor del desarrollo del hongo Ggt, es decir, tiene un porcentaje de infección significativamente menor, al menos un 50% menor, que cada una de las cepas por sí solas, evidenciando un efecto cooperativo entre las cepas bacterianas. Consecuentemente, es posible notar que el consorcio, debido a su composición de las tres cepas bacterianas específicas utilizadas, otorga a la invención una ventaja técnica en términos de una alta capacidad de inhibición del desarrollo del patógeno Ggt en cultivos en campo.

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