Unerwünschtes Pilzwachstum, dass z. B. in der Landwirtschaft jedes Jahr zu be- trächtlichen Schäden führt, kann durch die Verwendung von Fungiziden kontrolliert werden. Die Ansprüche an Fungizide sind dabei hinsichtlich ihrer Wirksamkeit, Kosten und vor allem ihrer Umweltverträglichkeit stetig angestiegen. Es existiert deshalb ein Bedarf an neuen Substanzen bzw. Substanzklassen, die zu leistungsfä- higen und umweltverträglichen neuen Fungiziden entwickelt werden können. Im All- gemeinen ist es üblich, in Gewächshaustests nach solchen neuen Leitstrukturen zu suchen. Solche Tests sind jedoch arbeitsintensiv und teuer. Die Anzahl der Substan- zen, die im Gewächshaus getestet werden können, ist entsprechend begrenzt. Eine Alternative zu solchen Tests ist die Verwendung von sogenannten Hochdurchsatzver- fahren (HTS = high throughput screening). Dabei werden in einem automatisierten Verfahren eine große Anzahl von Einzelsubstanzen hinsichtlich ihrer Wirkung auf Zellen, individuelle Genprodukte oder Gene getestet. Wird für bestimmte Substanzen eine Wirkung nachgewiesen, so können diese in herkömmlichen Screeningverfahren untersucht und gegebenenfalls weiter entwickelt werden.

Vorteilhafte Angriffspunkte für Fungizide werden oft in essentiellen Biosynthese- wegen gesucht. Ideale Fungizide sind weiterhin solche Stoffe, die Genprodukte hemmen, die eine entscheidende Bedeutung bei der Ausprägung der Pathogenität eines Pilzes haben. Ein Beispiel für ein solches Fungizid ist z. B : der Wirkstoff

Carpropamid, der die Melaninbiosynthese des Pilzes hemmt und so die Ausbildung intakter Appressorien (Haftorgane) verhindert. Es gibt jedoch nur sehr wenige be- kannte Genprodukte, die für Pilze eine solche Rolle spielen. Darüber hinaus sind Fungizide bekannt, die durch die Hemmung entsprechender Biosynthesewege zur Auxotrophie der Zielzellen und in der Folge zum Verlust der Pathogenität führen. So führt z. B. die Inhibition der Adenosin Deaminase bei Zugabe von Ethirimol in Blumeria graminis zu einer signifikanten Verminderung der Pathogenität (Hollomon, D. W. 1979).

Der Pilz Phanerochaete chrysosporium, der zu den Basidiomyceten zählt, kann unter Mangelbedingungen das Lignin des Holzes abbauen. Dieser Abbau erfolgt enzyma- tisch durch die Mangan-abhängigen Ligninperoxidasen (MnPs) und Ligninperoxi- dasen (LiPs). Als Substrat für diese Enzyme dient Wasserstoffperoxid (H202) (Kersten et al., 1990). Dieses wird von einer Glyoxaloxidase bereitgestellt, die die folgende Reaktion katalysiert : RCHO + 02 + H20 RC02H + H202 Dabei wird eine Aldehydfunktion unter Reduktion von elementarem Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid zur Carbonsäure oxidiert. Das Enzym weist eine große Substrat- breite auf, so dass eine Reihe von einfachen Aldehyden, oc-Dicarbonyl-und verschie- dene a-Hydroxycarbonyl-Verbindungen, wie z. B. HCHO, CH3CHO, CH20HCHO, CHOCHO, CHOCOOH, CH20HCOCH20H, CHOCHOHCH20H oder auch CH3COCHO als Substrat akzeptiert werden. Zusätzlich werden auch andere Produkte der Umsetzung von Lignin-Modellsubstaaizen durch die Lignin-Peroxidase durch die Glyoxaloxidase (Kersten et al., 1995), insbesondere jedoch Glyoxal und Methylgly- oxal als Intermediarmetabolite beim Wachstum auf den Hauptkomponenten der Ligninocellulose, umgesetzt (Kersten et al., 1993). Abgesehen von der Fähigkeit des Pilzes Phanerochaete chrysosporium mittels der Glyoxaloxidase Lignin abzubauen, ist keine andere Bedeutung des Enzyms für den Pilz bekannt geworden.

Bei der Glyoxaloxidase von Phanerochaete chrysosporium handelt es sich um ein Kupfer-Metalloenzym, das eine essentielle Komponente des Lignin-Abbauweges darstellt (Whittaker et al., (1996). Das Enzym wird sekretiert. Die Glyoxaloxidase stellt einerseits Wasserstoffperoxid für Peroxidasen zur Verfügung und setzt anderer- seits Methylglyoxal und Glyoxal, die im Medium von lignolytischen Kulturen als Sekundärmetaboliten gefunden werden, als Hauptsubstrate um (Kersten et al., 1987).

Durch spektroskopische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in Überein- stimmung mit dem pilzlichen Metalloenzym Galactose-Oxidase im aktiven Zentrum ein ungewöhnliches freies Radikal, das an das Kupfer-Ion gebunden ist, vorliegt. Ein Homologievergleich zwischen der Glyoxaloxidase aus Phanerochaete chrysospo- rium und der erfindungsgemäßen Glyoxaloxidase 1 (Glo 1) aus U. maydis (siehe Abbildung 1) bzw. der Glyoxaloxidase aus B. cinerea erlaubt eine Zuordnung des U. maydis Enzyms zu dieser Enzymklasse der so genannten Radikal-Kupfer-Oxidasen.

In dieser Enzymklasse wird das katalytische Motiv von einer Aminosäure-Seiten- kette, die das Radikal trägt und mit dem Kupferion verbunden ist, gebildet (Formel I). Tyr Hi , /His Z Cca- s-ry, SCy, Durch Sequenzvergleich zwischen der Galactoseoxidase und der Glyoxaloxidase aus Phanerochaete und anschließende site-directed Mutagenese (Whittaker et al., 1999) konnten schließlich auch die anderen katalytisch wichtigen Aminosäuren zugeordnet werden. Durch EPR-spektroskopische Untersuchungen wurden zwei Stickstoff- Liganden in einem Kupfer (II)-Komplex und durch Absorptions-und Raman-Spek-

troskopie der Tyrosin-und Tyrosin-Cystein-Dimer-Ligand im aktiven Zentrum iden- tifiziert. Bei diesen Aminosäuren handelt es sich um die folgenden Aminosäuren bzw. Positionen : Tyrosin-Ligand 1 : Tyr 178 (U. maydis) bzw. Tyr 273 (B. cinerea), Tyrosin-Ligand 2 : Tyr 452 (U. maydis) bzw. Tyr 499 (B. cinerea), Histidin-Ligand 1 : His 453 (U. maydis) bzw. His 500 (B. cinerea), Histidin-Ligand 2 : His 555 (U. : maydis) bzw. His 597 (B. cinerea), Cystein-Rest : Cys 105 (U. maydis) bzw. Cys 209 (B. cinerea).

Diese für die Cu2+-Ionenbindung charakteristischen und in allen erfindungsgemäßen Polypeptiden vorhandenen konservierten Aminosäuren sind damit ein strukturell charakteristisches Merkmal dieser Enzyme. Im Gegensatz zu anderen Radikalen- zymen, die Prozesse unter Übertragung eines Elektrons katalysieren, werden durch dieses katalytische Zentrum zwei Elektronen übertragen. Das am besten untersuchte Enzym der Klasse der Radikal-Kupfer-Oxidasen ist die Galactoseoxidase, deren Kristallstruktur auch aufgeklärt ist.

Glyoxaloxidasen aus anderen pilzlichen Organismen als Phanerochaete chrysospo- rium sind bisher noch nicht bekannt geworden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden nun vollständige cDNA Klone, und die entsprechenden Gene (genomische bzw. cDNA Sequenzen) aus Ustilago maydis und aus Botrytis cinerea kodierend für Glyoxaloxidase isoliert.

Der Brandpilz Ustilago maydis, ein Basidiomycet, befällt Maispflanzen. Die Krank- heit kommt in allen Maisanbaugebieten vor, erreicht jedoch nur in trockenen Jahren eine größere Bedeutung. Typische Symptome sind die beulenartigen, faustgroßen Anschwellungen (Brandbeulen), die an allen oberirdischen Pflanzenteilen gebildet werden. Die Beulen sind zuerst von einer weiß-grauen, derben Haut überzogen. Beim Aufreissen der Haut wird eine schwarze, zunächst schmierige, später pulvrige Brandsporenmasse frei. Weitere Arten der Gattung Ustilago sind z. B. U. nuda (ver-

ursacht Gersten-und Weizenflugbrand), U. nigra (verursacht Gerstenschwarzbrand), U. hordei (verursacht Gerstenhartbrand) und U. avenae (verursacht Haferflugbrand).

Der Pilz Botrytis cinerea, ein Ascomycet, verursacht die sogenannte"Graufäule". Es handelt sich hier um die Krankheit, die konstant sehr große Schäden in der Landwirt- schaft verursacht und deshalb auch massiv bekämpft wird. Sie kann alle Teile der Pflanze befallen, wirkt aber vor allem schädigend auf reifende Beeren. Der weltweit vorhandene Pilz ist omnivor und überdauert saprophytisch auf Holz und Pflanzen- resten sowohl als Mycel als auch als Sklerotien. Er dringt durch Wunden ein, kann aber auch nach der Blüte über Blütenreste die Pflanze infizieren. In grünen Beeren bleibt er latent und erst nach Beginn der Reifung kommt es zur explosionsartigen Entwicklung.

Mit Hilfe der oben erwähnten genomischen DNA bzw. Fragmenten davon wurden nun sowohl in U. maydis als auch in B. cinerea Knock-out Mutanten hergestellt, die überraschenderweise in beiden Fällen, d. h. bei einem Basidiomyceten als auch bei einem Ascomyceten, die beide pflanzenpathogen sind, zur Apathogenität der Pilze führten. Dabei ist zu beobachten, dass in Ustilago maydis drei verschiedene Gene, glol, glo2 und glo3, identifiziert werden können, die alle für eine Glyoxaloxidase kodieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass im Falle des Gens glol (vgl. SEQ ID NO : 1 bzw. 3) der vorstehend beschriebene Effekt erzielt wird. Ein Knock-out von glo2 zeigt dagegen keinen Einfluss auf die Pathogenität des Pilzes. glo3 wurde wie glol als Mutante in einem Screen auf Apathogenität als Pathogenitätsdeterminante identifiziert. Der Grund für diese unterschiedlichen Phänotypen kann im Expressionsmuster der verschiedenen Enzyme, in deren zellu- lärer Lokalisation oder auch in der spezifischen Aktivität der Enzyme gesucht wer- den. Offensichtlich spielt jedoch gerade Glol eine entscheidende Rolle für die Patho- genität des Pilzes.

In einem REMI-Mutageneseansatz (restriction enzyme mediated integration, siehe z. B. Kahmann und Basse 1999) konnten bereits morphologisch auffällige Mutanten

des Stammes CL13 isoliert werden (M. Bölker und R. Kahmann, nicht publiziert).

Die REMI-Mutante #5662 zeichnet sich durch einen flockigen, verfilzten Phänotyp aus. Die Mutante zeigt darüber hinaus eine auffallende Melanisierung.

Im Pathogenitätstest konnte nunmehr keine Infektion von Maispflanzen nachge- wiesen werden, d. h. die Mutante ist apathogen. Zur Gewinnung der für die Glyoxal- oxidase kodierenden Nukleinsäuren wurden so genannte"plasmid rescue"Experi- mente durchgeführt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnten nun durch ein sogenanntes"plasmid rescue"Experiment (siehe Beispiel 1) die Sequenzen reisoliert werden, die die Inser- tionsstelle flankieren. Auf diese Weise werden die für die Glyoxaloxidase kodieren- den Sequenzen, hier glol, isoliert. Dabei ergab sich nach Sequenzierung, dass die Insertion 770 bp nach dem Startkodon eines putativen ORFs stattgefunden hatte.

Dessen abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt Ähnlichkeit zur Glyoxaloxidase aus Phanerochaete chrysosporium. Das Ustilago Gen wurde glol (Glyoxaloxidasel) genannt. Da die Korrelation einer REMI-Insertion mit dem beobachteten Phänotyp der Mutanten nicht immer gelingt, wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung zusätzlich das glol-Gen in den beiden haploiden Stämmen Um518 und Um521 dele- tiert, um Phänotyp und Gen in eine eindeutige Beziehung zu setzten (siehe Beispiel 2). Zunächst wurde je ein 1151bp und ein 1249bp großes DNA-Fragment, das 5' bzw. 3'des putativen glol-ORFs lag, durch PCR amplifiziert. Anschließend wurden die Fragmente mit dem Restriktionsenzym Sf I geschnitten und so mit der tfiI ge- schnittenen HygromycinB Kassette (1884 bp Fragment aus pBS-hhn) ligiert, dass 1931 Nukleotide aus dem ORF des glol-Gens deletiert wurden (siehe Abb. 2B sowie Kämper und Schreier, 2001). Die Amplifikation dieser Knock-out Kassette erfolgte ebenfalls durch PCR (siehe Beispiel 2). Bei einer homologen Rekombination wird so der N-terminale Teil von glol durch die HygromycinB-Kassette ersetzt. Die Auswahl der Nullmutanten erfolgte durch Southernanalyse der Transformanten mit einer glol- spezifischen DNA-Sonde (s. Abbildung 2A). Dabei zeigte sich, dass acht von 10 Transformanten das erwartete Restriktionmuster in der Southernanalyse aufwiesen.

Die Stämme 518o7&num l, 518 M4 bzw. 521 Aglol&num 7 und 521 Aglol&num 9 wurden für weitere Analysen ausgewählt.

Wie in Abbildung 4 zu erkennen ist, weisen die glol-Nullmutanten einen pleiotropen Morphologiedefekt auf. So zeigt sich bei der Handhabung der glol-Nullmutanten außerdem, dass die Zellen, wenn sie auf Plattenmedien gezogen werden, im Ver- gleich zu Wildtypstämmen eine wesentlich geringere Adhäsion zueinander aufwei- sen. Um diesen Phänotyp näher zu charakterisieren, können z. B. mikroskopische Untersuchungen durchgeführt werden. Dazu werden die Zellen auf Objektträger auf- gebracht und durch differentielle Interferenzkontrastmikroskopie beobachtet (Abb.

4). Dabei zeigt sich im Vergleich zu Wildtypstämmen, dass die Zellen elongiert sind.

Zudem ist eine verstärkte Vakuolisierung zu beobachten. Mutante Zellen sind zudem in der Zytokinese beeinträchtigt und weisen eine verstärkte Septenbildung auf (siehe ebenfalls Abb. 3). Auffällig sind auch Zellen, die eine globuläre Form aufweisen und sich im Zentrum nicht separierter Zellhaufen befinden. Zusammengefasst zeigen sich bei den erfindungsgemäßen Nullmutanten alle Anzeichen eines pleiotropen Morphologiedefekts.

Bemerkenswert ist weiterhin auch, dass Mischungen kompatibler glol-Nullmutanten pathogen sind. Um den Einfluss des glol-Nullallels auf die Pathogenität zu untersu- chen, wurden so im Rahmen der vorliegenden Erfindung Pflanzeninfektionen durch- geführt. Dazu wurden je zwei unabhängige kompatible glol-Nullmutanten angezo- gen, gewaschen und gemischt. Anschließend wurden die Mischungen in junge Mais- pflanzen injiziert. Zum Vergleich wurden Maispflanzcn mit Mischungen kompatibler Wildtypstämme (Um518 und Um521) infiziert. Während nach einer Woche im Ikon- trollexperiment bereits Tumorbildung zu beobachten war, zeigten sich in der Mischung kompatibler Mutanten keinerlei Symptome. Zwei Wochen nach Infektion hatten 97 von 102 infizierten Pflanzen in der Kontrollinfektion Tumore gebildet. Drei weitere Pflanzen zeigten die für Pilzinfektionen typische Anthocyanfärbung. Damit wiesen 100 von 102 infizierten Pflanzen (98%) Pathogenitätssymptome auf (siehe Tabelle I). Bei Infektionen mit Mischungen kompatibler Mutanten konnte weder

Tumorbildung noch Anthocyanfärbung beobachtet werden (siehe Tabelle I). Daraus ergibt sich, dass kompatible Nullmutanten von glol nicht in der Lage sind Mais- pflanzen zu infizieren, d. h. sie weisen einen Pathogenitätsdefekt auf.

Tabelle I : Mischungen kompatibler glol-Nulhnutanten E Pflanzen'Tumor Anthocyan Z Symtome Pathogenität (%) Um 518 x Um 521 102 97 3 100 98 518Aglol-1 x 52lAglol-7 101 0 0 0 0 518#glo1-4 x 521#glo1-9 106 0 0 0 0 Bemerkenswert ist weiterhin, dass glol-Nullmutanten in ihrem Paarungsverhalten eingeschränkt sind. So ist die Bildung dikaryotischer Filamente in Mischungen kom- patibler glol-Mutantenstämme nicht mehr zu beobachten. Bei der Kreuzung von Mutanten mit kompatiblen Wildtypen ist bezüglich der Dikaryonbildung eine Restaktivität bezüglich des Paarungsverhaltens zu erkennen (siehe Abbildung 4), was auf einen Zellfusionsdefekt schließen lässt.

Völlig analoge Ergebnisse ergaben sich bei der Prüfung von entsprechenden Knock-out Mutanten in B. cinerea. Auch hier konnte klar gezeigt werden, dass die Disruption des Gens, das für die Glyoxaloxidase kodiert, zu einem Pathogenitäts- defekt bei B. cinerea führt (siehe Bsp. 9 und Abb. 9 bis 12).

Aus diesen Ergebnissen konnte nunmehr geschlossen werden, dass die Glyoxaloxi- dase nicht nur für einen spezifischen Pilz, sondern für pflanzenpathogene Pilze an sich eine besondere Rolle bei der Ausbildung der Pathogenität spielt. Die Bedeutung der Glyoxaloxidase für die Pathogenität, die Lebensfähigkeit im Wirt und den Lebenszyklus der pflanzenpathogenen Pilze wurde damit erstmals erkannt und erst- mals als ein optimales Target für die Suche nach neuen, spezifischen Fungiziden identifiziert. Damit wird erstmals die Möglichkeit gegeben, mit Hilfe dieses Targets gegebenenfalls völlig neue Leitstrukturen zu identifizieren. Ausgehend von solchen

Verbindungen, die die Glyoxaloxidase inhibieren, können somit neue Fungizide zur Verfügung gestellt werden.

Weiterhin werden hier anhand der genomischen als auch der cDNA-Sequenz und der Angabe von Verfahren zu deren Gewinnung Glyoxaloxidasen aus zwei unterschied- lichen Unterabteilungen pflanzenpathogener Pilze bereitgestellt, die geeignet sind, in Verfahren zur Identifizierung von Fungiziden verwendet zu werden, wobei identifi- zierte Fungizide dann auch mit Hilfe des zugehörigen Targets, der Glyoxaloxidase, charakterisiert und weiterentwickelt werden können.

In der vorliegenden Erfindung werden damit zum ersten Mal vollständige geno- mische Sequenzen bzw. die cDNA von Glyoxaloxidasen pathogener Pilze zur Verfü- gung gestellt und deren Verwendung bzw. die Verwendung des davon kodierten Polypeptids zur Identifizierung von Inhibitoren des Enzyms sowie deren Verwen- dung als Fungizide beschrieben.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb Nukleinsäuren, die für voll- ständige pilzliche Glyoxaloxidasen kodieren, mit Ausnahme der für die Glyoxaloxi- dase kodierenden Nukleinsäuresequenzen aus Phanerochaete ehrysosporium (Kersten et al., 1995), PCGLX1G1 PRT mit 559 Aminosäuren (zugänglich bei EMBL unter der Accession No. L47286 oder bei SPTREMBL unter der Accession No. Q01772 ; (Protein ID = AAA87594. 1)), sowie PCGLX2G_1 PRT mit 559 Ami- nosäuren (zugänglich bei EMBL unter der Accession No. L47287 oder bei SPTREMBL unter der Accession No. Q01773 (Protein ID = AAA87595. 1)). Die Proteinsequenzen sind identisch, bis auf einen Aminosäure Austausch Lys 308 zu Thr 308. Die Nucleotid-Sequenzen sind zu 98 % identisch.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren konnten ebenfalls weitere für die Glyoxaloxidase kodierende Nukleinsäuresequenzen aus anderen Pilzen identifiziert werden, die zwar als Ergebnisse im Rahmen von Genomprojekten bereits öffentlich zugänglich waren, jedoch noch keiner Funktion oder biologischen Bedeutung zuge-

ordnet werden konnten. Es handelt sich dabei um Sequenzen aus Cryptococcus neoformans, einem humanpathogenen Pilz, der für Cryptococcosis (Cryptococcal meningitis) und Pneumonia verantwortlich gemacht werden kann (siehe CRYNE_cneo 001022. contig 6786 (4064 bp), Homologiebereich : 2704-1393, CRYNE cneo 001022. contig 7883 (13487 bp) ; Homologiebereiche : 916-1695,468- 2185,2100-2345, CRYNE b6fl0cnfl ; Homologiebereich : 1-564, CRYNE_4_contig 456 ; Homologiebereich : 930-19, und CRYNE_cneoO01022. contig 6828 (4546 bp) ; Homologiebereich : 4364-3840), aus dem als Brotschimmel bekannten Ascomyceten Neurospora crassa (siehe NEUCR contig 1887 (supercontig 127) ; Homolo- giebereich : 14411-15889) und aus dem pflanzenpathogenen Reisbrennerpilz Magnaporthe grisea. Es wurde damit gefunden, dass die Glyoxaloxidase auch in humanpathogenen Pilzen vorkommt. Es ist davon auszugehen, dass das Enzym auch in diesen humanpathogenen Pilzen eine nicht unerhebliche physiologische Rolle spielt und deshalb auch in diesen Pilzen ein interessantes Target für Modulatoren des Enzyms ist bzw. als Wirkort für Antimycotica eine Rolle spielt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Nukleinsäuren, die für Glyoxaloxidasen aus pflanzenpathogenen Pilzen kodieren, bevorzugt aus Pilzen der Unterabteilung der Ascomyceten und der Basidiomyceten, wobei die Gattungen Botrytis und Ustilago besonders bevorzugt sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ganz besonders bevorzugt Nukleinsäu- ren, die für Glyoxaloxidasen aus Ustilago mapvdis und Botrytis cinerea kodieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere bevorzugt die für die Glyoxaloxidasen aus Ustilago maydis kodierenden Nukleinsäuren mit der SEQ ID NO : 1 bzw. SEQ ID NO : 3 sowie SEQ ID NO : 5 und SEQ ID NO : 7 und die für Glyoxaloxidasen aus Botrytis cinerea kodierenden Nukleinsäuren mit der SEQ ID NO : 9 bzw. SEQ ID NO : 11 sowie die für die Polypeptide gemäß SEQ ID NO : 2 bzw.

SEQ ID NO : 4 sowie SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10 und SEQ ID NO : 12 oder aktive Fragmente davon kodierende Nukleinsäuren.

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzelsträngige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribo- nukleinsäuren (RNA). Bevorzugte Ausfiihrungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.

Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um DNA- Fragmente, die der cDNA phytopathogener Pilze entsprechen.

Besonders bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine Sequenz ausgewählt aus a) einer Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9 und SEQ ID NO : 11, b) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die Aminosäure- sequenz gemäß SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10 oder SEQ ID NO : 12 umfasst, c) Sequenzen, die für ein Polypeptid kodieren, welches die für die Cu2+- Koordination geeigneten Aminosäuren Tyrosin 1 und 2, Histidin 1 und 2 und Cystein gemäß Formel (I) umfasst, d) zumindest 14 Basenpaare lange Teilsequenzen der unter a) bis c) defi- nierten Sequenzen, e) Sequenzen, welche eine 50 % ige, besonders bevorzugt eine 70 % ige Identität, ganz besonders bevorzugt eine 90 % ige Identität mit den unter a) bis c) definierten Sequenzen aufweisen,

f) Sequenzen, welche zu den unter a) bis c) definierten Sequenzen komplementär sind, und g) Sequenzen, welche aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren wie die unter a) bis c) definierten Sequenzen.

Eine ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nuklein- säuren stellt ein cDNA-Molekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 bzw. 3 bzw. mit der Sequenz SEQ ID NO : 5 oder SEQ ID NO : 7 kodierend für eine Glyoxaloxi- dase aus Ustilago maydis dar.

Eine weitere ganz besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellt ein cDNA-Molekül mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 9 bzw.

11 kodierend für eine Glyoxaloxidase aus Botrytis cinerea dar.

Der Ausdruck"vollständige"Glyoxaloxidase wie er hierin verwendet wird, be- schreibt die Glyoxaloxidasen, für die eine vollständige kodierende Region einer Transkriptionseinheit beginnend mit dem ATG-Startcodon und umfassend alle informationstragenden Exonbereiche des in den Herkunftsorganismen vorliegenden, für Glyoxaloxidasen kodierenden Genes, sowie die für eine korrekte Termination der Transkription nötigen Signale vorliegen.

Der Ausdruck"aktives Fragment'wie er hierin verwendet wird, beschreibt nicht mehr vollständige Nukleinsäuren kodierend für Glyoxaloxidase, die noch für Poly- peptide mit der biologischen Aktivität einer Glyoxaloxidase kodieren, die also die Reaktion RCHO + Oz + H20 RCO2H + H202 katalysieren können. Ob diese biologische Funktion tatsächlich noch vorliegt, kann durch einen Aktivitätstest bestimmt werden, der z. B. auf dem Nachweis von H202

z. B. durch Ansäuern mit H2S04 und Zugabe von TiOS04-Lösung (die Bildung von [TiO2*aq] SO4 führt zu einer gelborangen Färbung) beruht. Eine Glyoxaloxidaseakti- vität kann auch bei bekannten Glucoseoxidasen beobachtet werden. Diese Aktivität ist im Vergleich zu Glyoxaloxidasen, deren Hauptaktivität die Katalyse der gezeigten Reaktion ist, jedoch deutlich herabgesetzt. Der Ausdruck"biologische Aktivität"soll sich deshalb nicht auf solche Polypeptide wie die Glucoseoxidase erstrecken, deren Hauptaktivität nicht die Katalyse dieser Reaktion ist. "Aktive Fragmente"sind kürzer als die oben beschriebenen vollständigen, für die Glyoxaloxidase kodierenden Nuk- leinsäuren. Dabei können sowohl an den 3'-und/oder 5'-Enden der Sequenz Nuk- leinsäuren entfernt worden sein, es können aber auch Teile der Sequenz deletiert, d. h. entfernt worden sein, die die biologische Aktivität der Glyoxaloxidase nicht ent- scheidend beeinträchtigen. Eine geringere oder gegebenenfalls auch eine erhöhte Aktivität, die aber noch die Charakterisierung bzw. Verwendung des resultierenden Glyoxaloxidasefragments gestattet, wird dabei als ausreichend im Sinne des hier verwendeten Ausdrucks verstanden. Der Ausdruck"aktives Fragment"kann sich ebenso auf die Aminosäuresequenz der Glyoxaloxidase beziehen und gilt dann analog den obigen Ausführungen für solche Polypeptide, die im Vergleich zur oben definierten vollständigen Sequenz bestimmte Teile nicht mehr enthalten, wobei die biologische Aktivität des Enzyms jedoch nicht entscheidend beeinträchtigt ist.

Die bevorzugte Länge dieser Fragmente beträgt 1200 Nukleobasen, bevorzugt 900 Nukleobasen, ganz besonders bevorzugt 300 Nukleobasen, bzw. 400 Aminosäuren, bevorzugt 300 Aminosäuren, ganz besonders bevorzugt 100 Aminosäuren.

Der Ausdruck"Gen", wie er hierin verwendet wird, ist die Bezeichnung für einen Abschnitt aus dem Genom einer Zelle, der für die Synthese einer Polypeptid-Kette verantwortlich ist.

Der Ausdruck"hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vor- gang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplemen- tären Strang eine Basenpaarung eingeht. Diese ist vor allem relevant für kurze, die

Konsensussequenzen oder andere bekannte Bereiche der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren überspannenden Bereiche, die vorteilhafterweise für die Durchfüh- rung von PCR-Experimenten zur Identifizierung weiterer für Glyoxaloxidasen kodie- rende Nukleinsäuren verwendet werden. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente von weiteren homologen Genen oder aus anderen Pilzen als Ustilago maydis oder Botrytis cinerea isoliert werden, welche für Glyoxaloxidasen kodieren, welche dieselben oder ähn- liche Eigenschaften wie die Glyoxaloxidasen mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 1 bzw. SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9 bzw. SEQ ID NO : 11 aufweisen.

Der Ausdruck"cDNA", wie er hierin verwendet wird, ist die Bezeichnung für die einzel-bzw. doppelsträngige Kopie eines RNA-Moleküls und ist deshalb als Kopie biologisch aktiver mRNA intronfrei, d. h. alle kodierenden Regionen eines Gens sind in zusammenhängender Form enthalten.

Hybridisierungsbedingungen, wie sie in erster Linie für die vorstehend genannten PCR-Verfahren zur Identifizierung von weiteren Glyoxaloxidasen aus Pilzen ver- wendet werden können, werden nach folgender Formel näherungsweise berechnet : Die Schmelztemperatur Tm = 81. 5 °C + 16.6 log [c (Na] + 0.41 (% G + C))-500/n (Lottspeich und Zorbas, 1998).

Dabei ist c die Konzentration und n die Länge des hybridisierenden Sequenz- schnitts in Basenpaaren. Für eine Sequenz >100 bp entfällt der Ausdruck 500/n. Mit höchster Stringenz wird bei einer Temperatur 5-15°C unterhalb Tm und einer Ionenstärke von 15 mM Ma+ (entspricht 0.1 x SSC) gewaschen. Wird eine RNA- Probe zur Hybridisierung verwendet, so ist der Schmelzpunkt um 10-15 °C höher.

Der Grad der Identität der Nukleinsäuren wie vorstehend beschrieben wird vorzugs- weise bestimmt mit Hilfe des Programms CLUSTALW oder des Programms BLASTX Version 2.0. 4 (Altschul et al., 1997).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und einen homologen oder heterologen Promotor umfassen.

Der Ausdruck"homologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert.

Der Ausdruck"heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert.

Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro-oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind der 35S Promoter des Blumenkohlmosaikvirus für pflanzliche Zellen, der Promoter der Alkoholdehydrogenase für Hefezellen, die T3-, T7-oder SP6-Promotoren für prokaryotische Zellen oder zellfreie Systeme.

Bevorzugt sollten pilzliche Expressionssysteme wie z. B. das Pichia pastoris-System verwendet werden, wobei hier die Transkription durch den Methanol induzierbaren AOX-Promotor angetrieben wird. Für dieses System konnte bereits für die Glyoxal- oxidase aus Phanerochaete c/'o. yponM , heterologe Expression gezeigt werden (Whittaker, M. et al., 1999).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, die eine erfindungs- gemäße Nukleinsäure, eine erfindungsgemäße regulatorische Region oder ein erfin- dungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekular-

biologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Parti- kelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.

Bevorzugte Vektoren sind pBIN (Bevan, 1984) und seine Derivate für pflanzliche Zellen, pFL61 (Minet et al., 1992) oder z. B. die p4XXprom. Vektorserie (Mumberg et al., 1995) für Hefezellen, pSPORT-Vektoren (Fa. Life Technologies) für bakte- rielle Zellen, oder die Gateway Vektoren (Fa. Life Technologies) für verschiedene Expressionssysteme in bakteriellen Zellen, Pflanzen, P. pastoris, S. cerevisiae oder Insektenzellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungs- gemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfin- dungsgemäßen Vektor enthalten.

Der Ausdruck"Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.

Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Zellen von Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastors, Insekten, Pflanzen, Froschoozyten und Zelllinien von Säugern.

Bevorzugt für die Expression werden pilzliche Zellen wie z. B. von Saccharroayces cerevisiae, Aspeigillus rzidulans und Pichia pastoris verwendet. Die Expression der Glyoxaloxidase aus Plianerochaete chrysosporium wurde z. B. in A. nidulans und P. pastoris erfolgreich durchgeführt (Kersten et al., 1995 ; Whittaker et al., 1999).

Insbesondere können auch Zellen von Ustilago maydis zur Expression der erfin- dungsgemäßen Polypeptide verwendet werden. Insbesondere sind dazu Zellen eines Stammes von U. maydis geeignet, der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorga-

nismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b in 38124 Braun- schweig unter der Nummer DSM 14 509 am 13.09. 2001 hinterlegt wurde.

Diese hinterlegten Zellen wurden wie in Beispiel 3 beschrieben erhalten und können z. B. anhand des in Beispiel 4 dargestellten Assays von Wildtyp-Zellen des Ausgangsstammes unterschieden werden. Der Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 14 509 ist in der Lage, die erfindungsgemäße Glyoxaloxidase aus U. maydis in ausreichender Menge und Aktivität zu exprimieren, damit eine Glyoxaloxidase- Aktivität nachgewiesen und der Stamm in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann.

Der Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 14 509 ist Gegenstand der vorlie- genden Erfindung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Polypeptide mit der biolo- gischen Aktivität von Glyoxaloxidasen, die von den erfindungsgemäßen Nuklein- säuren kodiert werden.

Bevorzugt umfassen die erfindungsgemäßen Polypeptide eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10 und SEQ ID NO : 12, b) Sequenzen, die die für die Cu2+ oordination geeigneten Aminosäuren Tyrosin 1, Tyrosin 2, Histidin 1, Histidin 2 und Cystein gemäß Formel (I) umfassen, c) zumindest 15 Aminosäuren lange Teilsequenzen der unter a) und b) defi- nierten Sequenzen

d) Sequenzen, welche eine zumindest 20% ige, bevorzugt eine 25% ige, besonders bevorzugt eine 40% ige, ganz besonders bevorzugt eine 60% ige und am meisten bevorzugt eine 75% ige Identität mit den unter a) und b) definierten Sequenzen haben, und e) Sequenzen, welche die gleiche biologische Aktivität aufweisen wie die unter a) bis d) definierten Sequenzen.

Der Ausdruck"Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natür- liche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfah- ren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acy- lierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid- Derivaten oder Phosphatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierun- gen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylie- rungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können in der Fonn"reifer"Proteine oder als Teile größerer Proteine, z. B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezernierungs-oder"Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisierende Epitope aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide, insbesondere die Polypeptide gemäß SEQ ID NO : 2,4, 6 8,10 und 12 müssen nicht vollständige pilzliche Glyoxaloxidasen dar- stellen, sondern können auch nur Fragmente davon sein, solange sie zumindest noch die biologische Aktivität der vollständigen pilzlichen Glyoxaloxidasen aufweisen.

Polypeptide, die eine gleichartige biologische Aktivität wie eine Glyoxaloxidase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2,4, 6,8 oder SEQ ID NO : 10 und 12 ausüben, werden noch als erfindungsgemäß betrachtet. Dabei müssen die erfindungs- gemäßen Polypeptide nicht von Glyoxaloxidasen aus Ustilago maydis oder Botrytis cinerea oder aus phytopathogenen Pilzen ableitbar sein, sondern können z. B. aufgrund der Verwandtschaft zwischen den Glyoxaloxidasen aus verschiedenen Organismen wie aus humanpathogenen Pilzen und auch aus Pflanzen stammen (siehe auch Abb. 8). Als erfindungsgemäß werden vor allem auch solche Polypeptide betrachtet, die Glyoxaloxidasen beispielsweise der folgenden Pilze entsprechen oder Fragmenten davon, die noch deren biologische Aktivität haben : Plasmodiophoromycetes, Oomycetes, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes und Deuteromycetes, z. B.

Pythium-Arten, wie beispielsweise Pythium ultimum, Phytophthora-Arten, wie beispielsweise PhytopAthora infestans, Pseudoperonospora-Arten, wie beispielsweise Pseudoperonospora humuli oder Pseudoperonospora cubensis, Plasmopara-Arten, wie beispielsweise Plasnapara viticola, Bremia-Arten, wie beispielsweise Bremia lactucae, Peronospora-Arten, wie beispielsweise Peronospora pisa oder P. brassicae, Erysiphe-Arten, wie beispielsweise Erysiphe graminis, Sphaerotheca-Arten, wie beispielsweise Sçhaerotheca fulginea, Podosphaera-Arten9 wie beispielsweise Podosphaera leucotricha, Venturia-Arten, wie beispielsweise Venturia inaequalis, Pyrenophora-Arten, wie beispielsweise Pyrenophora teres oder P. graminea (Konidienform : Drechslera, Syn : Helminthosporium), Cochliobolus-Arten, wie beispielsweise Cochliobolus sativus (Konidienform : Drechslera, Syn : Helminthospo- rium), Uromyces-Arten, wie beispielsweise Uromyces appendiculatus, Puccinia-Arten, wie beispielsweise Puccinia recondita, Sclerotinia-Arten, wie beispielsweise

Sclerotinia sclerotiorum, Tilletia-Arten, wie beispielsweise Tilletia caries ; Ustilago- Arten, wie beispielsweise Ustilago nuda oder Ustilago avenae, Pellicularia-Arten, wie beispielsweise Pellicularia sasakii, Pyricularia-Arten, wie beispielsweise Pyricularia oryzae, Fusarium-Arten, wie beispielsweise Fusarium culmorum, Botrytis-Arten, Septoria-Arten, wie beispielsweise Septoria nodorum, Leptosphaeria-Arten, wie beispielsweise Leptosphaeria nodorum, Cercospora-Arten, wie beispielsweise Cercospora canescens, Alternaria-Arten, wie beispielsweise Alternaria brassicae oder Pseudocercosporella-Arten, wie beispielsweise Pseudocercosporella herpotrichoides.

Von besonderem Interesse sind z. B. auch Magnaporthe grisea, Cochliobulus heterostrophus, Nectria hematococca und Phytophthora Spezies.

Wie bereits vorstehend erörtert, können die erfindungsgemäßen Polypeptide auch als ein Wirkort für Antimycotica und damit zur Bekämpfung von human-bzw. tier- pathogenen Pilzen verwendet werden. Dabei sind z. B. die folgenden humanpatho- genen Pilze von besonderem Interesse, die die genannten Krankheitsbilder hervor- rufen können : Dermatophyten, wie z. B. Trichophyton spec., Microsporum spec., Epidermophyton floccosum oder Keratomyces ajelloi, die z. B. Fußmykosen (Tinea pedis) hervorrufen, Hefen, wie z. B. Candida albicans, der z. B. Soor-Ösophagitis und Dermatitis hervor- ruft, Candida glabrata, Candida krusei oder Cryptococcus neoformans, die z. B. pulmonale Cryptococcose und auch Torulose hervorrufen können, Schimmelpilze, wie z. B. Aspergillusfutnigatus, A. flavus, A. niger, die z. B. bronco- puhnonale Aspergillose oder Pilzsepsis hervorrufen, Mucor spec., Absidia spec., oder Rhizopus spec., die z. B. Zygomykosen (intravasale Mykosen) hervorrufen, Rhinosporidium seeberi, der z. B. chron. granulomatöse Pharyngitis und Tracheitis hervorruft, Madurella mycetomatis, der z. B. subkutane Myzetome hervorruft,

Histoplasma capsulatum, der z. B. retikuloendotheliale Zytomykose und M. Darling hervorruft, Coccidioides immitis, der z. B. pulmonale Coccidioidomykose und Sepsis hervorruft, Paracoccidioides brasiliensis, der z. B. brasilianische Blastomykose her- vorruft, Blastomyces dermatitidis, der z. B. Gilchrist-Krankheit und nordamerika- nische Blastomykose hervorruft, Loboa loboi, der z. B. Keloid-Blastomykose und Lobo's Krankheit hervorruft, und Sporothrix schenckii, der z. B. Sporotrichose (granulomatöse Hautmykose) hervorruft.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können im Vergleich zu der entsprechenden Region von natürlich vorkommenden Glyoxaloxidasen Deletionen oder Aminosäure- substitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Glyoxaloxidase ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt.

Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird : 1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste : Ala, Ser, Thr, Pro und Gly ; 2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide : Asp, Asn, Glu und Gln ; 3. Polare, positiv geladene Reste : His, Arg und Lys ; 4. Große aliphatische, nicht-polare Reste : Met, Leu, Ile, Val und Cys ; und 5. Aromatische Reste : Phe, Tyr und Trp.

Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen : Ursprünglicher Rest Substitution Ala Gly, Ser Arg Lys Asn Gln, His Asp Glu Cys Ser Ursprünglicher Rest Substitution Gln Asn Glu Asp Gly Ala, Pro His Asn, Gln Ile Leu, Val, Met Leu Ile, Val, Met Lys Arg Met Leu, Ile Phe Met, Leu, Tyr, Ile, Trp Pro Gly Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp, Phe Val Ile, Leu

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch Polypeptide, welche zumin- dest die biochemische Reaktion der Bildung von Wasserstoffperoxid durch Reduk- tion von Sauerstoff bei der Umsetzung von Glyoxal oder Methylglyoxal oder deren Derivate so wie die Glyoxaloxidase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 20% ige Identität, vorzugsweise 25% ige Identität, besonders bevorzugt 40% ige Identität, ganz besonders bevorzugt 60% ige, am meisten bevor- zugt eine 75% ige Identität und schließlich absolut bevorzugt eine 90 % ige Identität mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 2 bzw. 4 oder SEQ ID NO : 6 oder 8 sowie SEQ ID NO : 10 bzw. 12 über eine Länge von 100 Aminosäuren, bevorzugt 250 Amino- säuren und besonders bevorzugt über deren Gesamtlänge aufweist.

Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms BLASTP + BEAUTY (Altschul et al., 1997).

Eine besonders bevorzugte Ausfiihrungsform der erfindungsgemäßen Polypeptide sind Glyoxaloxidasen mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2,4, 6 und 8 sowie SEQ ID NO : 10 und 12.

Besonders bevorzugt erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf solche erfindungs- gemäßen Polypeptide, die die vorstehend genannten, zur Ausbildung einer Cru2+_ Koordinationsstelle geeigneten Aminosäuren umfassen : Tyrosin-Ligand 1 : (z. B. Tyr 178 (U. maydis) bzw. Tyr 273 (B. cinerea)), Tyrosin-Ligand 2 : (z. B. Tyr 452 (U. maydis) bzw. Tyr 499 (B. cinerea)), Histidin-Ligand 1 : (z. B. His 453 (U. maydis) bzw. His 500 (B. cinerea)), Histidin-Ligand 2 : (z. B. His 555 (U. maydis) bzw. His597 (B. cinerea)), und Cystein-Rest : (z. B. Cys 105 (U. maydis) bzw. Cys 209 (B. cinerea)).

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nukleinsäuremoleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch kurze Stücke der erfindungsgemäßen Nuklein- säuren chemisch synthetisieren und solche Oligonukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können auch verwendet werden, um ausgehend von Pilz-mRNA hergestellte cDNA-Banken zu durchsuchen. Klone, mit denen die markierten Oliogonukleotide hybridisieren, wer- den zur Isolierung der betreffenden DNA-Fragmente ausgewählt. Nach der Charakte- risierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch mittels PCR-Verfahren unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.

Der Ausdruck"Oligonukleotid (e) ", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet DNA- Moleküle, die aus 10 oder mehr Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden,

bestehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet wer- den.

Dem Fachmann ist bekannt, dass die Polypeptide der vorliegenden Erfindung auf verschiedenem Wege gewonnen werden können, z. B. durch chemische Methoden wie der Festphasenmethode. Zur Gewinnung größerer Proteinmengen empfiehlt sich die Verwendung rekombinanter Methoden. Die Expression eines klonierten Glyoxal- oxidase-Gens oder Fragmenten davon kann in einer Reihe von passenden Wirtszellen erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Zu diesem Zweck wird ein Glyoxaloxi- dase-Gen mit Hilfe bekannter Methoden in eine Wirtszelle eingeführt.

Die Integration des klonierten Glyoxaloxidase-Gens in das Chromosom der Wirts- zelle liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise wird das Gen oder Fragmente davon in ein Plasmid eingebracht, und die kodierenden Regionen des Glyoxaloxidase-Gens oder von Fragmenten davon mit einem konstitutiven oder induzierbaren Promotor funktionell verknüpft. Besonders geeignet für die Expression ist z. B. das Pichia pastors Expressions-System der Firma Invitrogen. Als geeignete Vektoren dienen hier z. B. pPICZ und dessen Derivate. Die Expression kann hierbei mittels des AOX-Promotors durch Methanolzugabe induziert werden. Geeignet wäre drüber hinaus auch die Expression im U. maydis System. Dabei würde die Expres- sion der Glyoxaloxidase-Gene oder von Fragmenten davon z. B. durch den induzier- baren crgl-Promotor oder den konstitutiven otef-Promotor erfolgen (Bottin et al., 1996, Spelling et al., 1994).

Die grundlegenden Schritte zur Herstellung rekombinanter Glyoxaloxidasen sind : l. Gewinnung einer natürlichen, synthetischen oder semi-synthetischen DNA, die für eine Glyoxaloxidase kodiert.

2. Einbringen dieser DNA in einen Expressionsvektor, der geeignet ist Glyoxal- oxidasen zu exprimieren, entweder alleine oder als Fusionsprotein.

3. Transformation einer passenden, vorzugsweise eukaryontischen Wirtszelle mit diesem Expressionsvektor.

4. Anzucht dieser transformierten Wirtszelle in einer Weise, die geeignet ist, Glyoxaloxidasen zu exprimieren.

5. Ernte der Zellen und gegebenengfalls Aufreinigung der Glyoxaloxidasen durch geeignete, bekannte Methoden.

Die kodierende Region der Glyoxaloxidasen kann dabei mit den üblichen Methoden in E. coli exprimiert werden. Geeignete Expressionssysteme für E. coli sind kommerziell erhältlich, so die Expressionsvektoren der pET-Serie, z. B. pET3a, pET23a, pET28a mit His-Tag oder pET32a mit His-Tag zur einfachen Aufreinigung und Thioredoxinfusion zur Erhöhung der Löslichkeit des exprimierten Enzyms, sowie pGEX mit Glutathionsynthetase-Fusion, sowie die pSPORT Vektoren. Die Expressionsvektoren werden in X DE3-lysogene E. coli-Stämme, z. B. BL21 (DE3), HMS 174 (DE3) oder AD494 (DE3) transformiert. Nach dem Anwachsen der Zellen unter dem Fachmann geläufigen Standardbedingungen wird die Expression mit IPTG induziert. Nach Induktion der Zellen wird für 3 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 4 bis 37°C inkubiert.

Die Zellen werden durch Sonifikation in Aufschlusspuffer (10 bis 200 mM Natrium- phosphat, 100 bis 500 mM NaCl, pH 5 bis 8) aufgeschlossen. Das exprimierte Pro- tein kann über chromatographische Methoden gereinigt werden, im Fall von mit His- Tag exprimiertem Protein durch Chromatographie an einer Ni-NTA-Säule.

Die Expression des Proteins in Insektenzellkulturen (z. B. Sf9-Zellen) stellt einen anderen günstigen Ansatz dar.

Alternativ können die Proteine auch in Pflanzen exprimiert werden. So existieren z.

B. auch in Arabidopsis thaliana nündestens 3 Glyoxaloxidase Homologe (siehe Abb.

8), was die Möglichkeit einer Expression in Pflanzen unterstreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden und deren Eigenschaften verändern. So stellen Modulatoren, die die Aktivität des Enzyms beeinflussen, neue fungizide Wirkstoffe dar, die in der Lage sind, die Pathogenität der Pilze zu kontrollieren. Modulatoren können Agonisten oder Antagonisten bzw.

Aktivatoren oder Inhibitoren sein. Von besonderem Interesse sind im Falle der Gly- oxaloxidase Inhibitoren dieses Enzyms, die durch das Ausschalten des Enzyms die Pathogenität der Pilze unterbinden können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher insbesondere auch die Verwendung von Glyoxaloxidasen aus Pilzen als Angriffspunkte für Fungizide und ihre Verwen- dung in Verfahren zum Auffinden von Modulatoren dieser Polypeptide. In solchen Verfahren können Glyoxaloxidasen direkt in einer Wirtszelle, in Extrakten oder aufgereinigt eingesetzt werden, oder mittelbar über die Expression der dafür kodie- renden DNA entstehen. Für diese Verwendung sind ebenso die erfindungsgemäßen Polypeptide geeignet, die vorstehend beschrieben wurden (Glo 2 und Glo 3 gemäß SEQ ID NO : 6 und SEQ ID NO : 8). Diese besitzen unabhängig von ihrer unmittelba- ren Bedeutung für die Pathogenität des Pilzes eine ausreichende Homologie zu Glol, um ebenfalls in Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren des Enzyms verwen- det zu werden, die dann als Fungizid wirksam werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die Verwendung von für erfindungsgemäße Glyoxaloxidasen kodierenden Nukleinsäuren, von DNA-Kon- strukten die diese enthalten, von Wirtszellen, die diese enthalten oder von an die erfindungsgemäßen Glyoxaloxidasen bindenden Antikörpern in Verfahren zum Auf- finden von Modulatoren der Glyoxaloxidase.

Der Ausdruck"Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das die Aktivität der Glyoxaloxidase beschleunigt oder verstärkt.

Der Ausdruck"Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Mole- kül, das die Aktivität der Glyoxaloxidase verlangsamt oder verhindert.

Der Ausdruck"Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität beeinflusst. Modulatoren können natürliche Substrate und Liganden darstellen oder strukturelle oder funktionelle Mimetika davon. Der Ausdruck"Modulator"umfasst jedoch nicht die natürlichen Substrate der Glyoxaloxidase wie z. B. Sauerstoff, Glyoxal und Methylglyoxal.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.

Die Bindung der Modulatoren an die erfindungsgemäßen Glyoxaloxidasen kann die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern, die zur Apathogenität oder zum Absterben des damit behandelten Pilzes führt.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. Polypeptide in einem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht das Auffinden von Verbindungen, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Diese können dann als Fungizide, z. B. bei Pflanzen oder als antimycotische Wirkstoffe bei Menschen und Tieren angewandt wer- den. Beispielsweise werden Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ent- halten und die entsprechenden Polypeptide exprimieren oder die Genprodukte selbst mit einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen unter Bedingungen in

Kontakt gebracht, die die Wechselwirkung zumindest einer Verbindung mit den Wirts- zellen, den Rezeptoren oder den einzelnen Polypeptiden erlauben.

Insbesondere ist ein Verfahren Gegenstand der vorliegenden Erfindung, dass zur Identi- fizierung von fungiziden Wirkstoffen geeignet ist, die an Polypeptide aus Pilzen mit der biologischen Aktivität einer Glyoxaloxidase binden, bevorzugt an Glyoxaloxidasen aus phytopathogenen Pilzen, besonders bevorzugt an Glyoxaloxidasen aus Ustilago oder Botrytis und ganz besonders bevorzugt an Glyoxaloxidasen aus U. maydis und B. cinerea und dazu homologe Polypeptide, die die vorstehend genannte Konsensussequenz aufweisen. Die Verfahren können jedoch auch mit einem zu den erfindungsgemäßen Glyoxaloxidasen homologen Polypeptid aus einer anderen als den hier genannten Spezies durchgeführt werden. Verfahren, die andere als die erfindungsgemäße Glyoxaloxidase verwenden, sind von der vorlie- genden Erfindung umfasst.

Viele Testsysteme, die die Prüfung von Verbindungen und natürlichen Extrakten zum Ziel haben, sind auf hohe Durchsatzzahlen ausgerichtet, um die Zahl der unter- suchten Substanzen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zellfreiem Arbeiten beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein.

Sie sind geeignet für eine"erste"Prüfung, die in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluss einer Substanz auf das Zielprotein zu detektieren. Es können jedoch auch Testsysteme verwendet werden, die auf ganzen Zellen basieren, die das betreffende Polypeptid in ausreichender Menge produzieren. Im vorliegenden Fall gelingt die Messung der Enzymenaktivität auch mit ganzen, die Glyoxaloxidase überproduzierenden Zellen, z. B. Ustilago ynaydis Zellen in Analogie zum Aktivitäts- test gemäß Beispiel 4.

Effekte wie Zelltoxizität werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme überprüfen dabei sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann

durch konzentrationsabhängige Testreihe überprüft werden. Kontrollansätze ohne Testsubstanzen können zur Bewertung der Effekte herangezogen werden.

Um Modulatoren aufzufinden, kann ein synthetischer Reaktionsmix (z. B. Produkte der in vitro-Translation) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Extrakt oder irgend- eine andere Präparation, die das Polypeptid enthält, zusammen mit einem markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandi- datenmoleküls, das ein Agonist oder Antagonist sein kann, inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls, die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu erhöhen oder zu hemmen, wird erkennbar an einer erhöhten oder verringerten Bindung des markierten Liganden oder an einer erhöhten oder verringerten Umset- zung des markierten Substrates. Moleküle, die gut binden und zu einer erhöhten Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide führen, sind Agonisten. Moleküle, die gut binden, aber der biologischen Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide ent- gegen wirken, sind wahrscheinlich gute Antagonisten.

Modulatoren des erfindungsgemäßen Polypeptids können auch über enzymatische Tests aufgefunden werden. Es kann entweder die Änderung der Enzymaktivität durch entsprechende Modulatoren direkt oder in einem gekoppelten Enzymtest indirekt gemessen werden. Die Messung kann z. B. über Absorptionsänderung durch die Ab- oder Zunahme einer optisch aktiven Verbindung durchgeführt werden. So kann z. B. die Freisetzung bzw. der Verbrauch von Wasserstoffperoxid durch Entfärbung einer Phenolrot-Lösung in Gegenwart von Meerrettich-Peroxidase nachgewiesen werden (siehe Bsp. 4, 10 und 11).

Eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Substanzen, die die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide modulieren, ist der sogenannten"Scintillation Pro- ximity Assay" (SPA), siehe EP 015 473. Dieses Testsystem nutzt die Interaktion eines Polypeptids (z. B. Glyoxaloxidase aus U. maydis oder B. cinerea) mit einem radiomarkierten Liganden (z. B. ein kleines organisches Molekül oder ein zweites, radioaktiv markiertes Proteinmolekül). Das Polypeptid ist dabei an kleine Kügelchen

("Microspheres") oder Perlen ("Beads") gebunden, die mit szintillierenden Molekü- len versehen sind. Im Verlauf des Abfalls der Radioaktivität wird die szintillierende Substanz im Kügelchen durch die subatomaren Partikel des radioaktiven Markers angeregt und ein detektierbares Photon emittiert. Die Testbedingungen werden so optimiert, dass nur jene vom Liganden ausgehenden Partikel zu einem Signal führen, die von einem an das erfindungsgemäße Polypeptid gebundenen Liganden ausgehen.

In einer möglichen Ausführungsform ist Glyoxaloxidase z. B. aus U. maydis an die Beads gebunden, entweder zusammen oder ohne interagierende bzw. bindende Test- substanz. Verwendet werden könnten dabei auch Fragmente des erfindungsgemäßen Polypeptids. Bei der Bindung eines Liganden an die immobilisierte Glyoxaloxidase, müsste dieser Ligand eine bestehende Interaktion zwischen der immobilisiertem Glyoxaloxidase und dem markierten Liganden inhibieren oder aufheben, um selbst in den Bereich der Kontaktfläche zu gelangen. Eine erfolgte Bindung an die immobili- sierte Glyoxaloxidase kann dann anhand eines Lichtblitzes detektiert werden. Ent- sprechend wird ein bestehender Komplex zwischen einem immobilisierten und einem freien, markierten Liganden durch die Bindung einer Testsubstanz zerstört, was zu einem Abfall der detektierten Lichtblitzintensität führt. Das Testsystem entspricht dann einem komplementären Inhibitions-System.

Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsge- mäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfin- dungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat-oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt.

Der Ausdruck"Kompetitor"wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Eigen- schaft der Verbindungen, mit anderen, gegebenenfalls noch zu identifizierenden Ver- bindungen um die Bindung an der Glyoxaloxidase zu kompetitieren und diese vom Enzym zu verdrängen bzw. von dieser verdrängt zu werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind damit auch Modulatoren, vorzugsweise Inhibitoren der enzymatischen Aktivität der erfindungsgemäßen Glyoxaloxidasen, die mit Hilfe eines der hierin beschriebenen Verfahren zum Identifizieren von Modulatoren des Glyoxaloxidase Proteins oder eines dazu homologen Polypeptids gefunden wurden.

Bislang ist nicht bekannt geworden, dass Glyoxaloxidasen aus pflanzenpathogenen Pilzen ein neues Target für Fungizide darstellen und dass mit Hilfe dieser Glyoxal- oxidasen Verbindungen gefunden und entwickelt werden können, die als Fungizide eingesetzt werden können. In der vorliegenden Anmeldung wird diese Möglichkeit zum ersten Mal beschrieben und belegt. Weiter werden hier die dazu nötigen Glyoxaloxidasen sowie Verfahren zu deren Gewinnung und zur Identifizierung von Inhibitoren des Enzyms zur Verfügung gestellt.

Gegenstand der Erfindung ist daher weiterhin die Verwendung von Modulatoren der Glyoxaloxidase als Fungizide.

Fungizide Wirkstoffe, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Polypeptide gefunden werden, können auch mit Glyoxaloxidasen aus humanpathogenen Pilzspezies inter- gieren, wobei die Interaktion mit den unterschiedlichen in diesen Pilzen vorkom- menden Glyoxaloxidasen nicht immer gleich stark sein muss.

Gegenstand der vorliegenden Erfindungen ist deshalb auch die Verwendung von Inhibitoren von Polypeptiden mit der Funktion einer Glyoxaloxidase zum Herstellen von Mitteln zur Behandlung von durch tier-bzw. humanpathogene Pilze hervorge- rufenen Erkrankungen.

Die Begriffe"Fungizid"bzw. "fungizid", wie sie hierin verwendet werden, umfassen im erfindungsgemäßen Sinne auch die Begriffe"Antimycoticum"bzw."antimy- cotisch".

Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung Verfahren zum Auffinden von chemischen Verbindungen, welche die Expression der erfindungsgemäßen Polype- tide verändern. Auch solche"Expressionsmodulatoren"können neue fungizide Wirk- stoffe darstellen. Expressionsmodulatoren können kleine organisch-chemische Mole- küle, Peptide oder Antikörper sein, die an die regulatorischen Regionen der für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierenden Nukleinsäuren binden. Weiterhin können Expressionsmodulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an regulatorische Regionen der für die erfindungsgemäßen Polypeptide codierenden Nukleinsäuren bindet, und dadurch deren Expression beeinflusst. Expressionsmodulatoren können auch Antisense-Moleküle sein.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Expressionsmodulatoren von Glyoxaloxidasen, die mit Hilfe eines vorstehend beschriebenen Verfahrens zum Identifizieren von Expressionsmodulatoren der Glyoxaloxidase Proteine oder dazu homologer Polypeptide gefunden werden.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Expressionsmodulatoren der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren als Fungizide.

Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen Hochdurchsatz-Screening (high throughput screening ; HTS) ein. Dafür können sowohl Wirtszellen als auch zellfreie Präparationen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Antikörper, die spezifisch an die erfin- dungsgemäßen Polypeptide oder Fragmente davon binden. Die Herstellung solcher Antikörper erfolgt auf die übliche Weise. Beispielsweise können solche Antikörper produziert werden durch die Injektion eines substantiell immunkompetenten Wirts mit einer für die Antikörperproduktion effektiven Menge eines erfindungsgemäßen

Polypeptids oder eines Fragments davon und durch nachfolgende Gewinnung dieses Antikörpers. Weiterhin lässt sich in an sich bekannter Weise eine immortalisierte Zelllinie erhalten, die monoklonale Antikörper produziert. Die Antikörper können gegebenenfalls mit einem Nachweisreagenz markiert sein. Bevorzugte Beispiele für ein solches Nachweisreagenz sind Enzyme, radioaktiv markierte Elemente, fluores- zierende Chemikalien oder Biotin. Anstelle des vollständigen Antikörpers können auch Fragmente eingesetzt werden, die die gewünschten spezifischen Bindungseigen- schaften zeigen.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können ebenfalls zur Herstellung transgener Organismen wie Bakterien, Pflanzen oder Pilze, bevorzugt zur Herstellung trans- gener Pflanzen und Pilze und besonders bevorzugt zur Herstellung transgener Pilze verwendet werden. Diese können z. B. in Testsystemen eingesetzt werden, die auf einer vom Wildtyp abweichenden Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide oder Varianten davon basieren. Ferner fallen hierunter sämtliche transgenen Pflanzen oder Pilze, bei denen durch die Modifikation anderer Gene als der vorstehend beschriebenen oder die Modifikation von Genkontrollsequenzen (z. B. Promotor) eine Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide oder deren Varian- ten eintritt.

Die transgenen Organismen sind auch zur (Über) produktion des erfindungsgemäßen Polypeptids für kommerzielle bzw. gewerbliche Zwecke von Interesse, wobei z. B.

Pilze (z. B. Hefe oder Ustilago mardis), die im Vergleich zur ihrer natürlichen Form das erfindungsgemäße Polypeptid vermehrt exprimieren, sich besonders zum Einsatz in Verfahren (gerade auch HTS-Verfahren) zum Identifizieren von Modulatoren des Polypeptids eignen.

Von besonderem Interesse ist in diesem Zusammenhang auch die Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Pilze in der Papierproduktion, wobei eine Kopplung mit den bekannten Ligninperoxidasen, d. h. die Nutzung von Pilzen, die beide

Enzyme mit gegebenenfalls erhöhter Aktivität oder in größeren Mengen exprimieren, für den Abbau von Lignin besonders interessant ist.

Eine Verwendung der mit den erfindungsgemäßen Verfahren identifzierten Inhibi- toren von Polypeptiden mit der biologischen Funktion einer Glyoxaloxidase ist um- gekehrt auch für den Materialschutz von Interesse. Pilze sind gerade bei der Erhal- tung von Hölzern ein großes Problem. Da die Glyoxaloxidasen Wasserstoffperoxid für die Ligninperoxidase zur Verfügung stellen, werden mit ihrer Hilfe auch die inertesten Bestandteile von Holz abgebaut. Die Inhibition der Glyoxaloxidase mit erfindungsgemäßen Inhibitoren inhibiert in der Folge jedoch auch die Ligninperoxi- dasen, wodurch die Zersetzung von Hölzern im Innen-und Außenbereich vermindert oder aufgehalten werden kann.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen transgenen Organismen, also Pilze, aber z. B. auch Algen oder andere Mikroorganismen, z. B. Bakterien, zur Entgiftung von Medien verwendet werden, z. B. in Abwässern, belasteten Gewässern, Kläranlagen etc. Dabei kann die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide und der entspre- chenden transgenen Organismen genutzt werden, abhängig vom Substratspektrum Aldehyde zu oxidieren und in weniger reaktive und weniger umweltbelastende Säuren zu überführen. Die Glyoxaloxidase selbst, die z. B. aus transgenen Überpro- duzenten gewonnen werden kann, ist jedoch auch zur Entgiftung des menschlichen oder tierischen Körpers bzw. des Blutes von Methylglyoxal von Interesse (Thornalley, 1996 ; Thomalley et al., 2001). Die Fähigkeit von Zellen, die z. B. mit Glol transformiert wurden, verschiedene unerwünschte Substanzen abzubauen, wird in Beispiel 11 und Abb. 13 demonstriert.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch zur Herstellung von transgenen Pflanzen verwendet werden, die sich durch eine verstärkte Resistenz gegenüber Pathogenen oder Umweltstress auszeichnen. Viele Feldfrüchte, wie z. B. Sonnenblu- men, Canola, Alfalfa, Sojabohnen, Erdnuss, Mais, Sorghum, Weizen oder Reis sowie zahlreiche Blumen, Bäume und Gemüse-oder Obstpflanzen, wie z. B. Wein, Tomate,

Apfel oder Erdbeere sind empfindlich gegenüber Pilzen wie z. B. Botrytis cinerea oder anderen Pilzarten, die sich durch die Expression von Wasserstoffperoxid aus- zeichnen, was einen Weg für den Pilz darstellt, sich Zugang zur betreffenden Pflanze zu verschaffen. Ein Enzym, dass Wasserstoffperoxid liefert, ist die erfindungsgemäße Glyoxaloxidase. In vielen Pflanzen löst die Infektion einer Pflanze durch ein Patho- gen die Aktivierung verschiedener Abwehrmechanismen aus, die von einer so genannten hypersensitiven Antwort (HR nach der englischen Bezeichnung) begleitet sein können und/oder vom Absterben des Wirtsgewebes am Ort des Eindringens des Pathogens. Dadurch kann die Ausbreitung des Pathogens im Wirt verhindert werden.

Zum Teil entwickelt die Pflanze dadurch auch eine systemische Resistenz ("systemic aquired resistance", SAR) gegen die Infektion von Pathogenen, die taxonomisch vom ursprünglichen infizierenden Pathogen weit entfernt sind. Eine der ersten Antwort auf Pathogenbefall, die beobachtet werden kann, ist die verstärkte Anreicherung von Superoxidanionen, 02-, und/oder Wasserstoffperoxid, H202. H202-Anreicherung kann die verstärkte Resistenzantwort auf verschiedenem Wege auslösen : 1. über eine direkte antimikrobielle Wirkung, 2. indem HzOz als Substrat für Peroxidasen zur Verfügung steht, die zur Ligninpolymerisation beitragen, und so die Zellwandver- stärkung unterstützen, 3. indem sie in einem noch zu klärenden Mechanismus als Signal zur Aktivierung der Expression von Genen dienen, die bei der pflanzen- eigenen Abwehr von Infektionen eine Rolle spielen, z. B. bei der Stimulation der Anreicherung von Salicylsäure. Salicylsäure wird wiederum als ein endogener Auslöser für die Expression von Genen betrachtet, die für mehrere mit der Pathogenese in Verbindung stehende Proteine (PRPs, nach der englischen Be- zeichnung) kodieren, z. B. für Glucanasen oder Chitinasen. Darüber hinaus kann Salicylsäure auch den oxidativen"Burst"verstärken und so in einer Art Rückkopplung seine eigene Synthese beschleunigen. Salicylsäure kann weiterhin eine Rolle beim hypersensitiven Zelltod spielen, indem es als Inhibitor der Katalase wirkt, einem Enzym das HzOz abbaut. Schließlich kann H202 auch die Synthese zusätzlicher Verbindungen auslösen, die zur Verteidigung geeignet sind, so z. B. von Phytoalexinen oder niedermolekularen antimikronbiellen Verbindungen.

Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Glyoxaloxidasen sind deshalb geeignet, Pflanzen eine signifikante Resistenz gegenüber pathogenem Befall zu verleihen. Die transgenen Pflanzen sind durch die Aktivität der Glyoxaloxidase zur Expression von PRP Genen und zur Anreicherung von Salicylsäure fähig. Die zur Transformation der Pflanzen verwendeten DNA-Konstrukte können z. B. einen konstitutiven Promotor enthalten, sowie die daran funktionell verknüpfte kodierende Sequenz und ein Markergen, das die Selektion der Transformanden erlaubt. Weitere Elemente, die verwendet werden können, sind Terminatoren, Polyadenylierungs- sequenzen und Nukleinsäuresequenzen, die für Signalpeptide kodieren, die die Lokalisation innerhalb einer Pflanzenzelle oder die Sekretion des Proteins aus dieser Zelle steuern.

Eine Vielzahl von Verfahren zur Transformation von Pflanzen ist bereits bekannt geworden (siehe z. B. auch Miki et al. (1993), Gruber und Grosby (1993) und Bevan et al., 1983). Für die Herstellung transgener Pflanzen ist das am weitesten ent- wickelte Vektorsystem ein Plasmid aus dem Bakterium Agrobacterium tumefaciens (Bevan, 1984). In der Natur infiziert A. tumefaciens Pflanzen und erzeugt Tumoren, die man als Wurzelhalsgallen bezeichnet. Diese Tumoren werden durch das Ti-Plas- mid (tumor-inducing) von A. tumefaciens hervorgerufen. Das Ti-Plasmid baut ein Stück seiner DNA, das als T-DNA bezeichnet wird, in die chromosomale DNA der Wirtspflanze ein. Es wurde eine Möglichkeit entwickelt, die tumorinduzierenden Bereiche aus der DNA des Plasmids zu entfernen, aber seine Eigenschaft, genetisches Material in die Pflanzen einzubringen, beizubehalten. Mit Hilfe üblicher rekombinanter DNA-Techniken kann ein fremdes Gen, z. B. eine der erfindungsge- mäßen Nukleinsäuren, in das Ti-Plasmid eingebaut werden. Das rekombinante Plasmid wird dann in A. tumefaciens zurücktransformiert. Der Stamm kann dann benutzt werden, um eine Pflanzenzellkultur zu infizieren. Man kann das Plasmid aber auch direkt in die Pflanzen einführen. Durch Regeneration solcher Zellen zu intakten Organismen kann man Pflanzen erhalten, die das Fremdgen enthalten und dieses auch exprimieren, d. h. das erwünschte Genprodukt produzieren.

A. tumefaciens infiziert dikotyle Pflanzen zwar leicht, aber für die Transformation von monokotylen Pflanzen, zu denen viele landwirtschaftlich wichtige Kulturpflan- zen gehören, wie Mais, Weizen, Reis, ist es als Vektor von beschränktem Nutzen, da es diese nicht ohne weiteres infiziert. Für die Transformation solcher Pflanzen stehen andere Techniken zur Verfügung, wie z. B."DNA-Kanonen", das so genannte "particle gun"Verfahren. Bei diesem werden kleinste Kügelchen aus Titan oder Gold in Empfängerzellen oder-gewebe geschossen, entweder durch eine Gasentladung oder durch eine Pulverexplosion. Die Kügelchen sind mit DNA der interessierenden Gene beschichtet, wodurch diese in die Zellen gelangen, dort allmählich abgelöst und in das Genom der Wirtszellen eingebaut werden.

Nur wenige der Zellen, die dem fremden Erbmaterial ausgesetzt werden, sind in der Lage, dieses stabil in ihr eigenes Erbgut einzugliedern. In einem Gewebe, das für den Gentransfer verwendet wird, sind die nicht transgenen Zellen in der Überzahl. Wäh- rend der Regeneration zur ganzen Pflanze ist es deshalb nötig, eine Selektion anzu- wenden, welche die transgenen Zellen bevorteilt. In der Praxis verwendet man dafür Markergene, die in die Pflanzenzellen übertragen werden. Die Produkte dieser Gene inaktivieren, z. B. einen Hemmstoff, etwa ein Antibiotikum oder Herbizid, und ermöglichen so den transgenen Zellen das Wachstum auf dem mit dem Hemmstoff versetzten Nährmedium.

Bei der Transformation mit A. tumefaciens können anstelle von Blattstückchen auch Protoplasten (isolierte Zellen ohne Zellwand, die in Kultur bei Anwesenheit bestimmter Chemikalien oder auch durch Elektroporation Fremdfl A auiehmen) benutzt werden. Man hält sie solange in Gewebekultur, bis sie eine neue Zellwand gebildet haben (z. B. bei Tabak etwa 2 Tage). Dann gibt man Agrobakterien zu und setzt die Gewebekultur fort. Eine einfache Methode zur transienten Transformation von Protoplasten mit einem DNA-Konstrukt ist die Inkubation in Gegenwart von Polyethylenglykol (PEG 4000).

Das Einbringen von DNA in Zellen ist auch durch Elektroporation möglich. Dies ist eine physikalische Methode zur Steigerung der DNA-Aufnahme in lebende Zellen.

Durch elektrische Impulse lässt sich die Durchlässigkeit einer Biomembran kurz- fristig erhöhen, ohne dass die Membran zerstört wird.

Das Einbringen von DNA ist ebenfalls durch Mikroinjektion möglich. Mit Hilfe von Glaskapillaren wird DNA in die Nähe des Zellkerns einer Zelle injiziert. Dieses ist bei pflanzlichen Zellen, die eine feste Zellwand und eine große Vakuole besitzen, allerdings schwierig.

Eine weitere Möglichkeit beruht auf der Nutzung von Ultraschall : Beschallt man Zellen mit Schallwellen oberhalb des menschlichen Hörbereichs (über 20 kHz), so wird ebenfalls vorübergehende Durchlässigkeit der Membranen beobachtet. Bei dieser Methode muss die Amplitude der Schallwellen sehr fein justiert werden, da die beschallten Zellen sonst platzen und zerstört werden.

Verfahren zum Herstellen transgener Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung bzw. geeignete Konstrukte umfassend z. B. Signalsequenzen zur Steuerung der Expression oder geeignete Promotoren sind unter anderem auch für transgene Pflan- zen beschrieben worden, die die vorstehend beschriebene Glucoseoxidase (z. B. aus A. niger) exprimieren (CN 12 29 139, US 5,516, 671, WO 95/21924, WO 99/04012, WO 95/14784). Entsprechende Verfahren können auch verwendet werden, um die transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung zu erhalten.

Pilze lassen sich auf unterschiedlichste Art transformieren. Neben der Protoplasten- transformation (siehe Bsp. 2 und Schulz et al., 1990) stehen hierfür weitere gängige Methoden zur Verfügung. Für Hefen wird gerne die Li-Acetat Methode verwendet (Gietz et al., 1997). Dabei werden die Hefezellen für die DNA Aufnahme chemisch kompetent gemacht. Bei der Elektroporation wird die geladene DNA durch einen Stromimpuls in die Zellen eingebracht. Eine weitere Methode ist die Transformation durch Agrobacterium tumefaciens. Dieses Bakterium kann DNA ausgehend von

Plasmiden in Fremdorganismen einschleusen. Werden heterologe Sequenzen auf dieses Plasmid eingebracht, so erfolgt die Transformation der Zielzelle.

Gegenstand der Erfindung sind somit auch transgene Pflanzen oder Pilze, die zumin- dest eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, vorzugsweise transgene Pflanzen wie Arabidopsis Spezies oder transgene Pilze wie Hefe Spezies oder Ustilago Spezies sowie deren transgene Nachkommen. Davon umfasst sind auch die Pflanzenteile, Protoplasten, Pflanzengewebe oder Pflanzenvermehrungsmaterialien der transgenen Pflanzen bzw. Einzelzellen, Pilzgewebe, Fruchtkörper, Myzele und Sporen der transgenen Pilze, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten.

Vorzugsweise enthalten die transgenen Pflanzen oder Pilze die erfindungsgemäßen Gene bzw. Polypeptide in einer vom Wildtyp abweichenden Form. Als erfindungs- gemäß werden jedoch auch solche transgenen Pflanzen oder Pilze betrachtet, die natürlicherweise durch eine nur sehr geringe oder keine Expression des erfindungs- gemäßen Polypeptids gekennzeichnet sind.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach ebenfalls transgene Pflanzen und Pilze, in denen Veränderungen an der für Polypeptide mit der Aktivität einer Glyoxaloxidase kodierenden Sequenz vorgenommen wurden und die dann mit Blick auf die Eignung zur Herstellung des erfindungsgemäßen Polypeptids und/oder eine durch Mutagenese erzielte Erhöhung oder Verminderung der biologischen Aktivität oder der Menge des in den Pflanzen oder Pilzen vorliegenden erfindungsgemäßen Polypeptids selektioniert wurden.

Der Ausdruck"Mutagenese"wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Methode zur Erhöhung der spontanen Mutationsrate und damit zur Isolierung von Mutanten. Dabei können Mutanten mit Hilfe von Mutagenen iii vivo erzeugt werden, z. B. mit chemischen Verbindungen oder physikalischen Einflüssen, die geeignet sind, Muta- tionen auszulösen (z. B. Basenanaloga, UV-Strahlen etc. ). Die gewünschten Mutanten können durch Selektion auf einen bestimmten Phänotyp hin erhalten werden. Die Position der Mutationen auf den Chromosomen kann relativ zu anderen, bekannten

Mutationen durch Rekombinationsanalysen bestimmt werden. Das betreffende Gen kann durch Komplementationsversuche mit einer Genbank identifiziert werden.

Mutationen können auch gezielt in chromosomale oder extrachromosomale DNA eingebracht werden (in vitro-Mutagenese, site-directed Mutagense oder error-prone- PCR etc.).

Der Ausdruck"Mutante", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen Organis- mus, der ein verändertes (mutiertes) Gen trägt. Eine Mutante ist definiert durch den Vergleich mit dem Wildtyp, der das unveränderte Gen trägt.

Der Begriff"Resistenz"wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf unterschied- lichsten Mechanismen beruhende Formen der"Widerstandsfähigkeit". Formen "aktiver Resistenz"sind die"Immunität" (= Resistenz nicht anfälliger Pflanzen) und die"Toleranz" (= Resistenz der gegenüber dem Pathogen anfälligen Pflanzen). Eine Zwischenform stellt die"Translokationsresistenz"dar, bei der das Pathogen in einzelnen Zellen, Zellkomplexen oder Pflanzenorganen lokal bleibt. Zwischen den drei Resistenztypen gibt es Übergangsformen.

Der Begriff"Pathogen"bzw. "Pathogenbefall", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Organismen, insbesondere Pilze, die in der Lage sind eine Pflanze zu befallen und zu schädigen oder abzutöten. Die Schädigung kann dabei auf verschie- densten Merkmalen beruhen, wie z. B. Verfärbungen, Nekrosen, Wachstumsinhi- bition oder das Absterben von Teilen der Pflanze. Als Pathogen werden auch solche Organismen bezeichnet, die zwar nicht zum Absterben einer Pflanze oder eines Pflanzenteils führen, jedoch den Wert dieser Pflanze durch die Ausprägung bestimm- ter Merkmale (z. B. Verfärbungen, Nekrosen) mindern.

Neben der Herstellung transgener Pflanzen kann auf Basis der vorliegenden Erfindung ein anderer Weg beschritten werden, um die Resistenz von Pflanzen gegen Pathogenbefall zu erhöhen.

So wurde gefunden, dass Mutanten von z. B. Botrytis cinerea in welchen das für Glyoxaloxidase kodierende Gen (vgl. SEQ BD NO : 9 und 11) inaktiviert oder deletiert wurde (vgl. Bsp. 9, Herstellung von B. cinerea BcGlyoxl Knock-out Mutanten), nicht mehr in der Lage sind, die für diesen Pilz typischen Schädigungen bei Pflanzen hervorzurufen (vgl. Bsp. 9 und Abb. 9 bis 12). Bei Pflanzen, die mit Konidien dieser Mutante inokuliert worden waren, lösten die Mutanten eine wie vorstehend beschriebene Antwort auf die Anwesenheit des Pilzes aus, die zum entstehen einer lokalen und systemischen Resistenz führte. Das Entstehen einer Resistenz kann leicht dadurch geprüft werden, dass eine unbehandelte und eine mit einem zur Expression von Glyoxaloxidase nicht mehr befähigten Pilz behandelte Pflanze mit einem Pathogen in Kontakt gebracht werden (vgl. Bsp. 9) und die Schädigung der Pflanze über einen bestimmten Zeitraum beobachtet wird. Die erworbene Resistenz der Pflanze ist dabei unspezifisch, d. h. sie richtet sich nicht nur gegen den zur Induktion oder Erhöhung der Resistenz verwendeten Pilz, sondern induziert einen gegen den Befall durch verschiedenste Pathogene gerichteten Abwehrmechanismus.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch ein Verfahren zur Induktion oder Erhöhung der Resistenz einer Pflanze gegen Pathogenbefall, indem man eine Pflanze mit einem Pilz, dessen Wildtyp vorzugsweise zu den pflanzenpathogenen Pilzen gezählt wird, in Kontakt bringt, der zur Expression von Glyoxaloxidase nicht mehr befähigt ist. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Pilze, in denen das oder die für Glyoxaloxidase kodierende (n) Gen (e) inaktiviert oder deletiert wurden. Verfahren zum Deletieren oder Inaktivieren eines Gens sind dem Fachmann geläufig (vgl. auch Bsp. 9). Vorzugsweise werden Knock-out Mutanten des betreffenden Pilzes verwendet. Neben dem vorstehend genannten Pilz o CM 'ea bzw. dessen Mutanten sind auch andere Pilze mit einer entsprechenden Deletion oder Inaktive- rung des Glyoxaloxidase-Gens zur Behandlung von Pflanzen geeignet, z. B. U. maydis Mutanten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die Verwendung von Pilzen, vorzugsweise von pflanzenpathogenen Pilzen, die zur Expression von

Glyoxaloxidase nicht mehr befähigt sind, als Pflanzenbehandlungsmittel zur Erhöhung oder Induktion einer Resistenz der behandelten Pflanze gegen Pathogenbefall. Besonders bevorzugt wird dazu die erfindungsgemäße Mutante BcGlyoxl von B. cinerea verwendet.

Die nachfolgenden Beispiele zeigen nun, dass die erfindungsgemäßen Polypeptide überraschenderweise ein für die Pathogenität essentielles Enzym in Pilzen darstellen, und zeigen weiter, dass das Enzym ein geeignetes Zielprotein für die Identifizierung von Fungiziden ist, in Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbin- dungen verwendet werden kann und dass die in entsprechenden Verfahren identifi- zierten Modulatoren der Glyoxaloxidase als Fungizide verwendet werden können.

Weiterhin wird beispielhaft ein Verfahren zur Messung der enzymatischen Aktivität von Glyoxaloxidasen beschrieben, das in Verfahren zum Identifizieren von Modula- toren des Enzyms verwendet werden kann (Beispiel 10 und 22), wobei die erfin- dungsgemäßen Verfahren zum Identifizieren von Fungiziden nicht auf das angege- bene Verfahren beschränkt sind.

Die folgenden Beispiele sind ebenfalls nicht beschränkt auf Ustilago maydis oder Botrytis cinerea. Analoge Verfahren und Ergebnisse werden auch in Zusammenhang mit anderen Pilzen erhalten.

Beispiele Beispiel 1 Isolierung der für Glyoxaloxidase aus U. maydis kodierenden Nukleinsäure ("plasmid rescue") Der so genannte"plasmid rescue"wurde wie in Bölker et al., 1995 beschrieben durchgeführt. Die genomische DNA aus U maydis wurde mit MluI geschnitten, reli- giert und durch Elektroporation in den E. coli Stamm DH5a transformiert.

Kultivierung von lT. maydis Die Stämme wurden bei 28°C in PD-Medium oder YEPS-Medium (Tsukada et al., 1988) angezogen. Die Bildung dikaryotischer Filamente wurde nach dem Auftropfen von Stämmen auf PD-Plattenmedien, die 1% Charcoal enthielten, beobachtet (Holliday, 1974). Pathogenitätstests wurden wie beschrieben durchgeführt (Gillessen et al., 1992). Übernachtkulturen der Stämme wurden in einer Konzentration von 4x107 Zellen resuspendiert und jungen Maispflanzen (Gaspar Flint) injiziert. Für jeden Stamm bzw. jede Stammkombination wurden mindestens 80 Pflanzen infiziert und auf Anthocyanbildung und Tumorbildung nach 7 bis 21 Tagen untersucht.

BildverarbeiEaxng Die Morphologie einzelner Zellen von Ustilago map is wurde unter Verwendung eines Zeiss Axioskop durch das so genannte"Differential Interferenz Kontrast Ver- fahren"analysiert. Die Zellen wurden durch das Mikroskop fotografiert (Kodak T-64, Vergrößerungsfaktor 1000).

Beispiel 2 Herstellung von glol und glo2 Knock-out Mutanten in U. maydis Herstellung der Knock-out Kassette Molekularbiologische Standardmethoden wurden nach Sambrook et al., 1989 durch- geführt. Um glol-Nulhnutanten herzustellen, wurde die 5'und die 3'Flanke des glol-Gens mittels PCR amplifiziert. Als Template diente geonomische DNA des Stammes UM518. Für die 5'Flanke (1151bp) wurden die Primer LB2 mit der Sequenz 5'-cacggcctgagtggccggtgtgtaaacgatcctttctggaag-3'und LB1 mit der Sequenz 5'-cctccaagtttcgagatatcgacc-3'eingesetzt. Für die 3'-Flanke (1249bp) wurden die Primer RB1 (5'-gtgggccatctaggccgtcaacagcaccaaattcacagcc-3') und RB2 (5'-atcgtagctcgagtgtatgcttcc-3') verwendet. Mit den Primern LB2 und RB1 wurden die Schnittstellen Sfi I (a) und Sfi 1 (b) eingeführt. Die Amplikons wurden mit Sfi I restringiert und mit dem aus dem Vektor pBS-isolierten 1884 bp großen Sfi I- Fragment (HygromycinB-Kassette) ligiert. Durch eine PCR mit den Primern LB1 und RB2 wurde die 4300 bp große glol-Knock-out Kasette amplifiziert (Kämper und Schreier, 2001).

Herstellung von Protoplasten von U. ma 50 ml einer Kultur in YEPS Medium wurden bei 28°C bis zu einer Zelldichte von ca.

5xlO7/ml (OD 0.6 bis 1.0) angezogen und dann für 7 min. bei 2500g (Hereaus, 3500 rpm) in 50 ml Falconröhrchen abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 25 ml SCS- Puffer (20 mM NaCitrat pH 5. 8, 1.0 M Sorbit, (20 mM NaCitrat/1. 0 M Sorbit und 20 mM Zitronensäure/1. 0 M Sorbit mischen und mit pH-Meter auf pH 5. 8 einstellen)) resuspendiert, erneut 7 min. bei 2500 g (3500 lpm) zentrifugiert und das Pellet in 2 ml SCS-Puffer, pH 5, 8, mit 2,5 mg/ml Novozym 234 resuspendiert. Die Protoplastie- rung erfolgte bei Raumtemperatur und wurde mikroskopisch alle 5 min. verfolgt. Die Protoplasten wurden dann mit 10 ml SCS-Puffer gemischt und bei 1100 g (2300 rpm) 10 min. zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde vor- sichtig in 10 ml SCS Puffer resuspendiert und erneut zentrifugiert. Der Waschvor-

gang mit SCS-Puffer wurde zweimal wiederholt, das Pellet wurde in 10 ml STC- Puffer gewaschen. Schließlich wurde das Pellet in 500 1ll kaltem STC-Puffer (10 mM Tris/HCl pH 7.5, 1.0 M Sorbit, 100 mM CaCl2) resuspendiert und auf Eis gehalten.

Aliquots können mehrere Monate bei-80°C gelagert werden.

Transformation von U. maydis Die Transformation von U. maydis erfolgte nach Schulz et al., 1990. Die Isolierung genomischer U. maydis DNA erfolgte wie bei Hofmann und Winston 1987 beschrieben.

Dazu wurden max. 10 ul DNA (optimal 3-5 p. g) in ein 2 ml Eppendorfröhrchen übertragen, 1 p1 Heparin (15 ug/pl) (SIGMA H3125) zugegeben und dann 50 ul Protoplasten zugesetzt und 10 min. auf Eis inkubiert. 500 ul 40% (w/w) PEG3350 (SIGMA P3640) in STC (steril filtriert) wurden zugesetzt, vorsichtig mit der Pro- toplastensuspension gemischt und 15 min. auf Eis inkubiert. Das Ausplattieren erfolgte auf Gradienten-Platten (unterer Agar : 10 ml YEPS-1,5% Agar-1M Sorbitol mit Antibiotikum ; kurz vor dem Ausplattieren wurde die untere Agarschicht mit 10 ml YEPS-1,5% Agar-1M Sorbitol überschichtet, die Protoplasten ausgestrichen und die Platten für 3-4 Tage bei 28°C inkubiert.

Für die Southernanlyse wurde die DNA mit EcoRI und XhoI restringiert. Die Detek- tion erfolgte mit einem 1249 bp langen PCR-Fragment (RB1/RB2) als DNA-Sonde, das Digoxigenin (Roche) markiert war.

Beispiel 3 Überproduktion von Glol Für die Überproduktion von Glol wurde ein 3400 bp Fragment, welches das glol- Gen enthielt, mit den Primern 5'glol (5'-cccgggatgacgaggcacctctcctcatc-3') und 3'glolNot (5'-gcggccgcgaattggtcagacgaatccg-3') amplifiziert. Das Amplikon wurde in den Vektor pCR-Topo2.1 (Invitrogen) kloniert. Das glol Fragment wurde durch die Restriktion mit Smal und NotI reisoliert und in die entsprechenden Schnittstellen von pCA123 kloniert. pCA123 ist ein aus dem Plasmid potef-SG (Spellig et al., 1996) gewonnenes Plasmid, wobei aus potef-SG der otef promotor als 890 bp langes PvuIl/NcoI-Fragment isoliert und in den PvuIVNcoI geschnittenen Vektor pTEF-SG (Spellig et al., 1996) ligiert wurde. Im resultierenden Plasmid wurde das SGFP Gen durch eine Restriktion mit NcoVNotI herausgeschnitten und durch das NcoIlNotI geschnittenes EGFP-Allel aus pEGFP-Nl (Fa. Clontech) ersetzt. Das resultierende Plasmid heißt pCA123. Das schließlich aus pCA 123 resultierende Plasmid pCA929 wurde mit SspI linearisiert und in U. maydis transformiert. Der verwendete U. maydis Stamm ist in der öffentlichen Sammlung der Deutschen Sammlung von Mikroorga- nismen und Zellkulturen in Braunschweig unter der Stamm-Nummer UM 521 zugänglich. Die Transformanden wurden mit dem Konstrukt glol-1 transformiert und auf cbx-Resistenz selektioniert (Keon et al., 1991).

Der so erhaltene Stamm Ustilago maydis BAY-CA95 kann zur Überproduktion des erfindungsgemäßen Polypeptids Glol genutzt werden. Er wurde unter der Nummer DSM 14 509 bei der DSMZ in Braunschweig hinterlegt.

Beispiel 4 Zellaufschluss und Fraktionierung des Extraktes und Testen der Enzymaktivi- tät Die Glyoxaloxidase Aktivität wurde in ganzen Zellen, in Zellextrakten und Mem- branfraktionen bestimmt.

Zellen des unter der Hinterlegungsnummer DSM 14 509 hinterlegten Stammes von Ustilago maydis, die Glyoxaloxidase exprimieren, wurden in Minimal Medium oder PD-Medium bis zu einer OD 600nm von 0,6 bis 3 gezogen, abzentrifugiert und durch Resuspendieren auf eine OD 600nm von 20 eingestellt. Zellextrakte wurden durch Mörsern in flüssigem Stickstoff gewonnen. Alle folgenden Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Durch fraktionierte Zentrifugation bei 5000 rpm und 8000 rpm wurden Zellreste und Zelltrümmer abgetrennt. Membranen wurden durch Zentrifugieren bei 13000 rpm für 45 min isoliert. Der Membranniederschlag wurde in 50 mM Tris/HCl- Puffer pH 8 mit 0,5 % Tween-20 resuspendiert.

Die Messung der Aktivität von Glol kann durch die Kopplung der enzymatischen Reaktion mit Phenolrot und Peroxidase erfolgen. Die Glyoxaloxidase-Aktivität wurde durch die Kopplung an eine Meerrettich Peroxidase (HRP) Reaktion mit Phe- nolrot als Substrat nachgewiesen. Das Assayvolumen von 50 ul besteht dabei aus 10 1 Probe, 15 y1 50mM Kalium-Phosphat-Puffer pH 6, Spur einer 100 mM Methylgly- oxal-Lösung, 5 . l HRP (190 U/ml) und 5 Ml einer 56 mM Phenolrot-Lösung (Kersten und Kirk 1987). Nach einer 4 stündigen Inkubation bei 28°C, wurde NaOH bis zu einer Konzentration von 0,5 M zugegeben. Die Absorption AssOnm wurde in einem "Tecan plus reader"bestimmt. Aktives Enzym wird anhand der Entfärbung von Phe- nolrot identifiziert.

Substanzen oder Substanzgemische, die die Aktivität des Enzyms beeinflussen, können durch einen Vergleich der Aktivität des Enzyms bei An-und Abwesenheit dieser Probensubstanz unter Einbeziehung entsprechender Kontrollen identifizieren werden.

Im vorstehend beschriebenen Verfahren, in dem das Substrat Methylglyoxal verwendet wurde, können auch andere Substrate der Glyoxaloxidase verwendet werden. Neben ganzen Zellen können wiederum Zellmembranfraktionen eingesetzt werden. Zu den nutzbaren Substraten gehören beispielsweise auch Formaldehyd, Acetaldehyd, Glycolaldehyd, Glyoxal, Glyoxalat, Glycerinaldehyd, Dihydroxy- aceton, Hydroxyaceton und Glutaraldehyd, wobei die Menge des entstehenden H202 bei ansonsten gleichen Bedingungen nicht unbedingt gleich sein muss.

Beispiel 5 Isolierung der für Glyoxaloxidase aus B. einerea kodierenden Nukleinsäure Verwendete Stämme Der Wildtypstamm B05. 10 wurde zur Analyse, Transformation und als Wildtyp-Ver- gleichsstamm verwendet. B05. 10 ist ein Derivat des Stammes SAS56 (van der Vlugt- Bergmans et al, 1993).

Anzucht auf Agar-Platten B. cinerea wurde bei 20°C bei Dunkelheit auf Platten angezogen, die Malz Agar von Oxoid oder Czapek-Dox Agar von Oxoid (Sucrose 30.00 g, hTaN03 3. 00 g, MgSO4 x 7 H20 0.50 g, KC1 0.50 g, FeS04 x 7 H2Ü 0. 01 g, I22HPO4 1.00 g, Agar 13.00 g, H20 dest. 1000.00 ml ; pH-Wert auf 7.2 einstellen), angereichert mit verschiedenen Kohlenstoffquellen, enthielten.

Isolierung der Konidien Zum Isolieren der Konidien (ungeschlechtliche oder asexuelle Sporen von höheren Pilzen) wurden Platten verwendet, die vollständig mit einem Myzel bewachsen waren. Um die Sporulation auf diesen Platten zu induzieren, wurden diese für 16 Stunden UV-Licht (270 nm-370 nm) ausgesetzt. Die Konidien wurden von Platten, auf denen die Pilze sporulierten, 7 bis 14 Tage nach der Induktion mit 5 ml sterilem Wasser abgespült, das 0,05% (v/v) Tween 80 enthielt. Die Suspension wurde durch Glaswolle filtriert, einmal durch Zentrifugation (5') bei 114xg gewaschen und in sterilem Wasser resuspendiert.

Aufbewahrung von B. cinerea Stämmen und von Knock-out Mutanten Konidien des Wildtyps sowie von Mutanten von B. cinerea wurden bei-80°C in 75% (v/v) Glycerin enthaltend 12 mM NaCl eingefroren.

Isolierung des Glyoxaloxidase Gens bcglyoxl Eine genomische Bibliothek von B. cinerea, Stamm SAS56, in lambda EMBL3 (van der Vlugt-Bergmans et al., 1997) wurde nach Anwesenheit eines Glyoxaloxidase- Gens durchsucht. Als Sonde wurde ein 385 Basenpaare langes cDNA Fragment des Stamms T4 verwendet, das als möglicherweise homolog zur Glyoxaloxidase aus Phanerochaete chrysosporium identifiziert worden war. Das Fragment ist in der EMBL-Datenbank unter der Accession No. AL113811 hinterlegt. Verschiedene hybridisierende Phagen wurden gereinigt und die Phagen-DNA wurde isoliert. Von einem der Phagen wurde ein hybridisierendes 4. 1 kbp BamHI Restriktionsfragment in ein pBluescript@SKII (-) Phagemid von Stratagene kloniert und anschließend sequenziert. Die Charakteristika des klonierten Fragments sind in Abbildung 5 wiedergegeben.

Beispiel 6 Southern Blot Analyse der genomischen DNA Isolieren der genomischen DNA Das Myzel einer Flüssigkultur wurde durch Filtration über Miracloth (Calbiochem) geerntet und gefriergetrocknet. Das getrocknete Myzel wurde in flüssigem Stickstoff homogenisiert. 3 ml TES (100mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA and 2% (w/v) SDS) und 601 Proteinase K (20gg/gl) wurden zugegeben und die Suspension für eine Stunde bei 60°C inkubiert. Anschließend wurden 840gel 5M NaCl und 130gel 10% (w/v) N-Cetyl-N, N, N-trimethylammoniumbromid (CTAB) zugegeben und die Inkubation für 20 Minuten bei 65°C fortgesetzt. Die Suspension wurde dann durch Zugabe von 4,2 ml Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1), gefolgt von kurzem Mixen und 30 Minuten Inkubation auf Eis sowie einer anschließenden Zentrifugation für 5 Minuten bei 18 000xg weiter bearbeitet. Die obere wässrige Phase wurde abgenom- men und 1350go 17, 5 M NH4Acetat zugegeben, für eine Stunde auf Eis inkubiert und für 15 Minuten bei 18 000xg zentrifugiert. Um die DNA zu präzipitieren, wurden 0,7 Volumina Isopropanol zugegeben. Die DNA wurde mittels eines Glasstabs entnom- men und in 70% (v/v) Ethanol gewaschen und getrocknet. Die genomische DNA wurde schließlich in 1 ml TE (10 mM Tris-HCl pH 7.5 und 0.1 mM EDTA, 2. 5U Rnase A) gelöst, für 30 Minuten bei 50°C inkubiert und mit Ethanol gefällt.

Southern Blot Analyse 1 p. g genomische DNA wurden in einem Gesamtvolumen von 100 Ml vollständig mit dem gewünschten Restriktionsenzym geschnitten. DNA Fragmente wurden auf einem 0, 8% igen (w/v) Agarosegel aufgetrennt und anschließend gemäß Protokoll für einen alkalischen Blot auf Hybond-Membranen von Amersham geblotted.

Dazu wurde das DNA enthaltende Gel zuerst in 0,25 M HCl gelegt bis die Farbstoffe ihre Farbe geändert hatten. Nach Waschen des Gels in destilliertem Wasser wurde gemäß Sambrook et al. (1989), ein Kapillar-Blot durchgeführt, wobei 0,4 M NaOH

als Blotting-Lösung verwendet wurde. Nach dem Transfer der DNA wurde die Membran kurz in 2xSSC (0,3 M NaCl and 0,03 M Natriumcitrat, pH 7) gewaschen und getrocknet. Die DNA wurde durch UV-Behandlung mit der Membran vernetzt (312 nm, 0, 6 J/cm2).

Mit Hilfe des"Random Primers DNA Labeling System" (Life Technologies) wurden radioaktiv markierte Sonden hergestellt. Dazu wurden 20 ng der DNA Fragmente ("Sonde", siehe Abb. 5) gemäß dem Protokoll des Herstellers markiert. Die markier- ten DNA Fragmente wurden über eine Sephadex G50 Säule gereinigt.

Die Hybridisierung erfolgte gemäß Church and Gilbert (1984). Dazu wurde der Blot für 30 Minuten bei 65°C in Hybridisierungspuffer (0,25 M Phosphat Puffer, pH 7,2, 1 mM EDTA, 1% (w/v) BSA and 7% (w/v) SDS) prähybridisiert. Dann wurde der Blot mit Hybridisierungspuffer, der die markierte Sonde enthielt, für 40 Stunden bei 65°C hybridisiert. Die Blots wurden drei Mal gewaschen (30 Minuten, 65°C in 2xSSC und 0,1% (w/v) SDS). Autoradiographie erfolgte mit Kodak X-OMAT AR Film.

Die Ergebnisse der Hybridisierung sind in Abbildung 6 gezeigt. Mit der Sonde konn- ten Einzelbanden in allen drei Restriktionsansätzen identifiziert werden (SalI, BamHI und EcoRI). Das BamHI-Fragment, das hybridisierte, hatte eine Größe von 4 kbp.

Beispiel Eloxlierullg der eDNA Vollständige cDNA-Fragmente wurden mittels des Superscript One-Step RT-PCR Systems von Life Technologies erhalten. Dazu wurden 0, 1 ug der Gesamt-RNA, die gemäß TRIzol-Protokoll unter Verwendung des TRIzof Reagenz (TRIzol Reagen-

zien sind monophasische Lösungen aus Phenol und Guanidiniumthiocyanat ; nach der Zugabe von Chloroform und anschließender Zentrifugation wird die RNA aus der wässrigen Phase mit Isopropanol gefällt) aus B. cinerea, Stamm B05. 10, isoliert wurde, revers transkribiert und mit Hilfe von genspezifischen Primern amplifiziert.

Die cDNA wurde direkt in den Vektor pCR@4-TOPOX (Invitrogen) kloniert und vollständig sequenziert.

Die cDNA Sequenz bestätigt die Existenz eines Introns zwischen den Sequenzen, die für die Chitin bindende Domäne und die Glyoxaloxidase-Domäne kodieren.

Beispiel Expression von BcGlyoxl Die Expression von BcGlyoxl wurde anhand des zeitlichen Verlaufs der Infektion auf Tomatenblättern untersucht. Die Konidien des B. cinerea Stamms B05. 10 wurden für 2 Stunden in B5 Medium, ergänzt mit 10 mM Glucose und 10 mM (NH4) H2PO4, vorinkubiert, um die Keimung zu stimulieren. Die Blätter von Tomaten (Lycopersicon esculentum cultivar Moneymaker Genotyp Cf4) wurden durch Besprü- hen mit dem Medium das 106 Sporen pro ml enthält, inokuliert. Die Blätter wurden bei 20°C und >95% Luftfeuchtigkeit inkubiert und anschließend in regelmäßigen Abständen nach der Inokulation geerntet und bei-80°C aufbewahrt.

Die RNA wurde aus dem gefriergetrockneten und in flüssigem Stickstoff homogeni- sierten Myzel extrahiert, indem das Blattgewebe im Mörser zu Pulver zermahlen wurde. Pro Gramm des Materials wurden 2 ml Guanidinium-Puffer pH 7,0 zugege- ben. Der Puffer bestand aus 8. 0 M Guanidiniumhydrochlorid, 20 mM 2- [N-morpho- lino]-ethansulfonsäure (MES), 20 mM EDTA und 50 mM ß-Mercaptoethanol, pH 7,0. Die Suspension wurde zweimal extrahiert, einmal mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (IAA) (25 : 24 : 1 v/v/v) und einmal mit Chloro- form/IAA (24 : 1 v/v). Nach Zentrifugation für 45 Minuten bei 12000xg bei 4°C

wurde ein Drittel des Volumens 8 M LiCl zur wässrigen Phase zugegeben. Anschlie- ßend wurde die Suspension über Nacht auf Eis inkubiert und für 15 Minuten bei 12000xg zentrifugiert. Der Niederschlag wurde einmal mit 2 M LiCl und zweimal mit 70% (v/v) Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in 1 ml TE gelöst. Die Konzentration der RNA wurde spektrophotometrisch bei 260 nm bestimmt. Alterna- tiv wurde auch das TRIzole Reagenz (Life Technologies) entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet, um die RNA aus dem gefriergetrockneten Material zu gewinnen.

Zur Gelelektrophorese der Gesamt-RNA wurden die Proben wie folgt denaturiert. Zu 10 llg der Gesamt-RNA in 3,7 gel Lösung wurden 3,6 µl 6 M deionisiertes Glyoxal, 10, 7 ul Dimethylsulfoxid und 2,0 1 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7 zugegeben.

Die Probe wurde für 60 Minuten bei 50°C inkubiert, kurz zentrifugiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und auf Eis wieder aufgetaut. Die Probe wurde auf einem 1,4 % igen (w/v) Agarosegel aufgetrennt. Gel und Laufpuffer enthielten 0,01 M Na- Phosphatpuffer, pH 7,0. Nach dem Gellauf wurden die aufgetrennten RNA-Frag- mente mittels Kapillar-Blotting (Sambrook et al., 1989) auf eine HybondTM-N'-- Membran (Amersham) transferiert, wobei eine Blotting-Lösung mit 0,025 M Na- Phosphatpuffer, pH 7 verwendet wurde. Nach dem Transfer der RNA wurde die Membran getrocknet und die RNA durch UV-Behandlung (312 nm, 0,6 J/cm2) mit der Membran vernetzt. Das Protokoll für die Hybridisierung entspricht dem für die DNA-Hybridisierung angegebenen.

Beispiel 9 Herotellung von B. cinerea BcGlyox1 Knock-out Mutanten Vektorkonstruktion Die Transformation von B. cinerea wurde mit einem Vektor zur homologen Rekom- bination, der das BCGlyoxl-Gen, in dem ein NruI-HindIII Fragment deletiert und

durch eine Hygromycin-Resistenz-Kassette ersetzt worden war, enthielt, durchge- führt (pHyGLYOXl, siehe Abbildung 8).

Herstellung von Protoplasten Um Protoplasten zur Transformation zu erhalten, wurde 1 Liter 1 % (w/v) Malz Extrakt (Oxoid) mit 2 x 108 B. cinerea Konidien (Stamm B05. 10) inokuliert. Nach 2 Stunden wurden die keimenden Konidien bei 20°C in einem Rotor-Schüttler bei 180 rpm für 24 Stunden inkubiert. Das Myzel wurde mittels eines 22, 4 µm Siebes geern- tet und in 50 ml KC-Lösung inkubiert, die 0,6 M KC1 und 50 mM CaCl2 enthielt, wobei 5 mg/ml Glucanex (thermostabile Beta-Glucanase zur Hydrolyse von Beta- Glucan-Polysacchariden) zugesetzt wurde. Nachdem die Protoplasten so hergestellt worden waren, wurde die Suspension durch einen 22,4 Rm und einen 10 µm Sieb filtriert. Die Protoplasten wurden gewaschen und zu einer Konzentration von 107 Protoplasten pro 100 u. l resuspendiert.

Transformation und Selektion von Transformanten 2 pg des Transformationsvektors pHyGLYOXl, der mit EcoRI geschnitten und mit Phenol extrahiert worden war, wurden in 95 gel KC verdünnt und 2 ul 5 mM Spermi- din zugegeben. Nach Inkubation auf Eis für 5 Minuten wurden 100 gl der Pro- toplastensuspension zur DNA gegeben und alles für weitere 5 Minuten auf Eis inku- biert. 100 ul Polyethylenglycol (PEG) Lösung, enthaltend 25% (v/v) PEG 3350 in 10 mM Tris-HCI, pH 7,4, und 50 mM CaCk wurden zugegeben und die Suspension gemischt. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden 500 ul PEG zugegeben und die Gefäße für weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Schließlich wurden 200 µl KC-Lösung zugegeben.

Der Transformationsansatz mit den transformierten Protoplasten wurde mit 200 ml SH-Agar gemischt und sofort auf 20 Petrischalen verteilt. SH-Agar enthält 0,6 M Saccharose, 5 mM HEPES pH 6,5, 1,2 % (w/v) gereinigten Agar und 1 mM NH4 (II2P04). Nach 24 Stunden Inkubation bei 20 °C wurde ein gleiches Volumen SH-Agar enthaltend 50 µg/ml Hygromycin zugegeben. Einzelne auftauchende Kolo-

nien wurden zur weiteren Selektion auf Malz Agar Platten transferiert, die 100 llg/ml Hygromycin enthielten. Wachsende Kolonien wurden dann auf Malz Agar Platten überführt, die kein Hygromycin enthielten, und die Sporulation durch Behandlung mit UV-Licht (nahes UV) ausgelöst. Um Monosporen-Isolate zu erhalten, wurden Konidien isoliert, verdünnt und auf Malz Agar Platten mit 100 ug/ml Hygromycin ausgestrichen. Die von diesen Platten erhaltenen Kolonien wurden isoliert und zur weiteren Analyse verwendet.

Southern Analyse der Transformanten Transformanten wurden einer Southern Analyse unterworfen. Die DNA wurde iso- liert und mit EcoRV geschnitten, elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einer Sonde hybridisiert (siehe vorne). Bei Knock-out-Transformanten sollte eine solche Hybridisierung ein 300 bp großes Fragment ergeben. Alle Transformanten mit einem langsamen Wachstumsphänotyp wiesen das 300 bp Fragment auf.

Wachstumsanalyse der Transformanten Alle Transformanten, die auf Platten mit hohem Hygromycin-Gehalt gewachsen waren, wuchsen auch normal auf Malz Agar Platten ohne Hygromycin. Wenn die Transformanten auf synthetischen Agarmedien angezogen wurden, die einfache Zucker als Kohlenstoffquelle enthielten, wuchsen die Transformanden langsam oder überhaupt nicht mehr. Die getesteten Zucker waren z. B. Hexosen, Pentosen und Triosen. Sowohl die Keimung als auch die Entwicklung der Hyphen waren beein- trächtigt oder völlig unterbunden. Der Wachstumsdefekt kann durch Zugabe von z. B. Trypton oder Pepton ausgeglichen werden. Die Wachstumsinhibition kann durch die Zugabe von Arginin zum Medium vollständig beseitigt werden. Konzentrationen von 100 RM Arginin und höher können das Wachstum des Pilzes, auf Medien die einfache Zucker enthalten, vollständig wiederherstellen.

Bioassays Ein Bioassay wurde durchgeführt, um die Virulenz von BcGlyoxl-Mutanten mit der von Wildtyp-B. cinerea (Stamm B05. 10) zu vergleichen.

Abgeschnittene Blätter und Früchte von Tomaten (Lycopersicon esculentum) und Äpfel (Alkmene und Cox Orange) wurden mit einer Suspension von Konidien (Benito et al., 1998 ; ten Have et al., 1998) inokuliert. Auf die abgeschnittenen Blüten von Rosen und Gerbera-Hybriden wurden trockene Konidien aufgestäubt (van Kan et al., 1997). Das inokulierte Wirtsgewebe wurde bei 15°C bei Dunkelheit inkubiert (Tomatenblätter und-früchte, Rosen und Gerbera) oder bei 20°C und bei Licht inku- biert (Äpfel).

In allen Ansätzen waren die BcGlyoxl-Mutanten, die getestet wurden, nicht in der Lage, primäre nekrotische Läsionen hervorzurufen, während der Wildtyp primäre Läsionen hervorrief, die sich teilweise in das Nachbargewebe ausbreiteten (siehe Abbildungen 9 bis 12).

Da die BcGlyoxl-Mutanten nicht wie der Wildtyp in B5-Medium bei Anwesenheit einfacher Zucker keimen (Standard-Medium), wurde die Keimung stimuliert, indem die Konidien in einem 1 % igen Malzextrakt für 2 Stunden bei Raumtemperatur vorinkubiert wurden. Dies führte zu einer effizienten Keimung von Wildtyp und Mutante. Diese präinkubierten Suspensionen wurden ebenfalls zur Inokulation ver- wendet, um auszuschließen, dass die Virulenz der Mutante nicht aufgrund anderer Defekte oder Mängel ausbleibt. Es zeigte sich jedoch auch in diesen Versuchen, dass die Mutanten die Testgewebe nicht infizieren können (Abb. 9 bis 12).

Schließlich wurde der Inokulationssuspension auch noch Arginin zugesetzt, um die Probleme der Mutanten mit der Nutzung einfacher Zucker auszuräumen. Die Inoku- lation von Äpfeln mit einer Verletzung mit Arginin-enthaltenden Suspensionen von Konidien der Mutante und des Wildtyps ergaben, dass sich in beiden Fällen nekro- tisches Gewebe bildete. Die Läsionen des Wildtyps breiteten sich für einige Tage weiter aus, bis das Gewebe schließlich völlig verrottet war. Die Läsionen, die durch die Mutante hervorgerufen worden waren, breiteten sich für 2 bis 3 Tage weiter aus und kamen dann vollständig zum Erliegen.

Beispiel 10 Nachweis der Expression und enzymatischen Aktivität der Glyoxaloxidase Die Aktivität der Glyoxaloxidase in vitro sowie in vivo, z. B. in den nach Beispiel 3 hergestellten erfindungsgemäßen U. maydis-Zellen (CA95) kann durch die Um- setzung des Substrats Methylglyoxal nachgewiesen werden, wobei folgende Reaktion genutzt wird : Schritt 1 : Methylglyoxal + 02-3 Pyruvat + H202 Schritt 2 : H202 + 10-Acetyl-3, 7-dihydroxyphenoxazin (Amplex Red)-> ResoruBn + H20 Amplex Red@ reagiert in einer 1 : 1 Stöchiometrie mit H202, wobei das stark fluores- zierende Resorufin (7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-on, , Natriumsalz) entsteht. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt bei einer Anregungswellenlänge von 550 nm und einer Emission von 595 nm. Im Test wurde eine Substratkonzentration von 10 mM Methylglyoxal eingesetzt. Bei der Verwendung ganzer Zellen ist für Dauer der Reaktion zu beachten, dass die Glyoxaloxidase Konzentration gering ist und die Reaktion deshalb länger laufen muss. So wurden z. B. sehr gute Messergebnisse nach einer Inkubation von 9 Stunden erzielt. Bei einer Konzentration von ImM Methylglyoxal konnte keine Reaktion im gegebenen Zeitfenster beobachtet werden.

Durch Zugabe von 100 mM Methylglyoxal wurde nur eine geringe Steigerung des Umsatzes erreicht, während die Steigerung der Umsatzrate von 2mM auf 10 mM Methylglyoxal im linearen Bereich der Kinetik liegt (Abbildung 13).

Beispiel 11 Enzymtest zum Identifizieren von Inhibitoren Der Enzymtest wurde in einem Gesamtvolumen von 50 1 durchgeführt. Dazu wurden die zu testenden Substanzen in 10 u. l Substratlösung (50 mM Methylglyoxal, 2,5 % (v/v) DMSO) in einer 384-Mikrotiterplatte vorgelegt. Vorab war der KM-Wert der Glyoxaloxidase für Methylglyoxal bestimmt worden (vgl. Abb. 14). Die Konzen- tration der auf eine inhibitorische Wirkung zu testenden Kandidatenverbindungen wurde so bemessen, dass die Endkonzentration der Substanzen im durchgeführten Test 10 pLM betrug. Im nächsten Schritt wurden 20 vil Zell-Lösung (Zellen des Überproduzenten-Stammes Bay-CA95 (OD 6oo=5) ; 0,2 M 2, 2-Dimethylsuccinat- Puffer, pH 5, gekühlt bei 4°C) zugegeben. Zu diesem Ansatz wurden 20 Ill Detek- tionslösung (125 uM Amplex Red@-Reagens (20 mM Stammlösung in 100 % DMSO), 2,5 u/ml Horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase), 62,5 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,4) zugegeben. Der Ansatz wurde 9 h bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde die Zunahme der Fluoreszenz bei == 550 nm (Extinktion) und ==595 nm (Emission) gemessen, wobei die Ergebnisse einer Messung in Anwesenheit von Bay-CA95-Zellen mit den Ergebnissen einer Messung in Anwesenheit der Wildtyp Umaydis 518-Zellen verglichen wurden (siehe auch Abbildung 15). Die im Test verwendeten Substanzen lagen in folgenden Endkonzentrationen vor : c (2, 2-Dimethylsuccinat/NaOH) = 40 mM, c (Amplex Red (Molecular Probes)) = 50 p. M, c (Horseradish Peroxidase) = 0, 001 u/, ul, c (Methylglyoxal) = 10 mM, OD (Bay-CA95) = 1, c (Natriumphosphat-Puffer) = 25 mM. Die inhibitorische Wirkung einer Kandidatenverbindung konnte an der Abnahme der relativen Fluoreszenz festgestellt, und Inhibitoren identifiziert werden.

In Tabelle II werden beispielhaft Verbindungen gezeigt, die als Inhibitoren der Glyoxaloxidase wirksam sind. In Tabell II werden auch pI50-Werte angegeben, die für die einzelnen Verbindungen bestimmt wurden. Der pI50-Wert ist der negative dekadische Logarithmus des so genannten IC50-Werts, der die molare Konzentration einer Substanz angibt, die zur 50 % igen Hemmung des Enzyms führt. Ein pI50-Wert

von 8 entspricht z. B. einer halbmaximalen Hemmung des Enzyms bei einer Konzentration von 10 nM. In Abbildung 15 wird beispielhaft der Einfluss einer Verbindung (Tab. II, Bsp. 3) auf die Aktivität der Glyoxaloxidase gezeigt.

Tabelle II , p rukturfrmel, 4, "Yi zu 5, YIN ou \ N 5, 39 N 3 0 5, 25 N i rBeispiel 12 Nachweis der fungiziden Wirkung der identifizierten Inhibitoren der Glyoxaloxidase Die Wirkung der Verbindungen gegen Pilze (protektive Wirkung) wurde unter anderem am Beispiel von Venturia inaequalis getestet. Dieser Pilz verursacht den so genannten Apfelschorf, der zu schwarzgrün gefleckten Blättern bei Kernobstbäumen führt. Die Flecken vergrößern sich und fließen zusammen. Blätter, die stark befallen sind, sterben ab, was bis zur Verkahlung der Bäume im Sommer führen kann. Eine Infektion wirkt sich auch negativ auf den Fruchtansatz aus. Schorf an Früchten äußert sich in grauen Flecken auf der Fruchthaut mit verkokten Stellen und deformierten Früchten.

Zur Herstellung einer zweckmäßigen Wirkstoffzubereitung vermischt man 1 Gewichtsteil Wirkstoff mit z. B. 24,5 Gewichtsteilen Aceton und 24,5 Gewichtsteilen

Dimethylformamid und 1,0 Gewichtsteilen Alkyl-Aryl-Polyglykolether als Emul- gator und verdünnt das Konzentrat mit Wasser auf die gewünschte Konzentration.

Zur Prüfung auf protektive Wirksamkeit werden junge Pflanzen mit der Wirkstoff- zubereitung in der angegebenen Aufwandmenge besprüht. Nach Antrocknen des Spritzbelages werden die Pflanzen mit einer wässrigen Konidiensuspension des Apfelschorferregers Venturia inaequalis inokuliert und verbleiben dann 1 Tag bei ca.

20°C und 100 % relativer Luftfeuchtigkeit in einer Inkubationskabine.

Die Pflanzen werden dann im Gewächshaus bei ca. 21°C und einer relativen Luft- feuchtigkeit von ca. 90 % aufgestellt.

1 bis 12 Tage nach der Inokulation erfolgt die Auswertung. Dabei bedeutet 0 % ein Wirkungsgrad, der demjenigen der Kontrolle entspricht, während ein Wirkungsgrad von 100 % bedeutet, dass kein Befall beobachtet wird.

Bei einer Konzentration von 250 ppm zeigte die Verbindung gemäß Bsp. 4 (Tab. I) einen Wirkungsgrad von 45 %.

Abbildungen und Sequenzprotokoll Abbildung 1 Bestimmung der Homologie zwischen den erfindungsgemäßen Glyoxaloxidasen Glol, Glo2 und Glo3 aus U. maydis gemäß SEQ ID NO : 1 bzw. SEQ ID NO : 3, der Gyloxaloxidase aus B. cinerea und der bekannten Gyloxaloxidase aus Phanerochaete chrysosporium (BESTFIT). Die Ähnlichkeit von Glol aus U. maydis und der Gyloxaloxidase aus P. chrysosporium beträgt 44 %, die Identität 38 %. Die konser- vierten Positionen, die für die Koordinierung des Kupferions von Bedeutung sind, sind grau unterlegt.

Abbildung 2 (A) Southernanalyse zur Identifizierung von glol-Nullmutanten. Je 1 llg genomische DNA der jeweils angegebenen Ustilago-Stämme wurde mit Eco RI und XhoI geschnitten, auf einem 1%-igen Agarosegel getrennt und geblottet. Die Hybridisierung erfolgte mit einer Digoxigenin markierten DNA-Sonde (1200 bp ; PCR-Fragment mit den Primern RB1/RB2, wie angegeben in Abb. 2B). Die in den einzelnen Spuren aufgetragene DNA wurde aus folgenden Stämmen isoliert : Spur 2 : Wildtyp Um 518 ; Spur 3 : WildtypUm521 ; Spur 4-8 : Transformanten von Um 518 (518#0, 518#1, 518#4, 518#6, 518#8) ; Spur 9-13 : Transformanten von Um 521 (521#1, 521#5, 521#7, 521#8, 521#9). Als Größenstandard diente der 1 kb plus DNA-Marker in Spur 1.

(B) Sehematisehe Darsteihmg der homologen Rekombination sur Generierung von $10l Hullmutanten. Die Primer B 1 und RB2 definieren das PCR-Produkt, das für die Hybridisierung als DNA-Sonde eingesetzt wurde (siehe auch Kämper und Schreier (2001)).

Abbildung 3 glol-Nullmutanten zeigen einen pleiotropen Morphologiedefekt. Die jeweiligen Kulturen wurden bis zu einer OD600 von 0,8 in PD-Medium hochgezogen, in Ha0 gewaschen und anschließend in einer 0,2% Kelzan (Bayer-AG)-Lösung resuspen- diert. Großbuchstaben kennzeichnen Nulhnutanten, Kleinbuchstaben Wildtyp. A, b, c, F, G, J und K sind Um518 Stämme bzw deren Derivate ; c, d, e, H, J, L und M sind Um521-Stämme und deren Derivate.

- 1 : Budnecks in Wildtypzellen ; + : zusätzliche Septen ; : Y-Verbindungen, keine Zytokinese ; _ : Zellen mit runder Morphologie. Auffällig ist des weiteren die starke Vakuolisierung, die Elongation und Deformation der Mutantenzellen. Der angegebene Größenstandard entspricht 3 um.

Abbildung 4 Phenotyp der (Delta) giol Stämme. Das (Delta) glol-Allel wurde in die U. maydis Stämme Um521 (albl) und Um518 (a2B2) eingebracht. Alle Stämme wurde entwe- der allein oder in den angegebenen Kombinationen auf PD-Charcoal Plattenmedien getropft. Nach 48 h Inkubation kann eine erfolgreiche Paarung am Auftreten des weißen Luftmycels erkannt werden.

Abbildung 5 Die Hauptcharakteristika der BeGlyoxl Sequenz aus B. cillera. Die Protein- sequenz von BcGLYOXl enthält eine putative Signalpeptid-Spaltstelle, gefolgt von einer kurzen Sequenz mit einer Homologie mit einer Polysaccharid-Bindungs- domäne, die in Pflanzenproteinen gefunden werden kann (z. B. in Typ I Chitinasen, Lektinen). Diese Domäne geht der katalytischen Domäne voran, die eine Homologie zum P. chrysosporitim Gen kodierend für die Glyoxaloxidase sowie zum Gen kodie- rend für Galactoseoxidasen (aus Dactylium dendroides) aufweist. Das BcGlyoxl Gen enthält auch die ungewöhnliche Cu2+-Bindungsstelle, die für die Glyoxaloxidase aus P. chrysosporium typisch ist. Die Schnittstellen, die bei der Isolierung des Gens ver- wendet wurden, sind ebenfalls angegeben. Ein aufgefundenes Intron wurde ebenso

markiert wie die Position des bei der Isolierung verwendeten Fragments aus B. cine- rea und der für die Southernanalyse verwendeten DNA-Sonde.

Abbildung 6 Southern Blot mit genomischer DNA von B. cinerea (Stamm B05. 10), geschnitten mit drei unterschiedlichen Restriktionsenzymen wie in der Abbildung angegeben.

Die restringierte DNA wurde mit einem radioaktiv markierten 385 bp langen Frag- ment aus B. cinerea hybridisiert.

Abbildung 7 Herstellung des für die Generierung von Knock-out Mutanten verwendeten Vektors pHyGLYOX1 enthaltend eine Hygromycin-Resistenz-Kassette, die ein NruI-HindIII Fragment des Ausgangsvektors ersetzt.

Abbildung 8 Sequenzvergleich (Alignment) zwischen den für Glyoxaloxidase kodierenden Sequenzen bzw. Sequenzfragmenten aus Ustilago maydis (Ustmay), Botrytis cinerea (botcinglox), Phanerochaete chrysosporium (PCGLX2G 1) sowie verschiedener putativer ORFs (kodierende für Glyoxaloxidase) aus Arabidopsis thaliana (ATF5K20. 25-putative, ATF15B8_19putative, ATAC2130_11, AC012188_20).

Interessante konservierte Aminosäuren sind beispielhaft grau unterlegt.

Abbildung 9 Apathogenität der Knock-out Mutanten.

Abgeschnittene Äpfel (Alkmene und Cox Orange) wurden mit einer Suspension von B. cinerea Konidien (siehe Beispiel 9) inokuliert. Das inokulierte Wirtsgewebe wurde bei 20°C und Licht inkubiert. Die BcGlyoxl-Mutanten (Knock-out Mutanten), die getestet wurden, waren nicht in der Lage, primäre nekrotische Läsionen hervorzu- rufen (Abb. 9, A4a und R3a), während der Wildtyp primäre Läsionen hervorrief (Abb. 9, B05. 10), die sich teilweise in das Nachbargewebe ausbreiteten. Bei den mit

Malzextrakt präinkubierten Suspensionen (vgl. Bsp. 9) zeigte sich ebenfalls, dass die Mutanten die Testgewebe nicht infizieren können.

Abbildung 10 Apathogenität der Knock-out Mutanten.

Abgeschnittene Tomaten (Lycopericon esculentum) wurden mit einer Suspension von B. cinerea Konidien (siehe Bsp. 9) inokuliert. Das inokulierte Wirtsgewebe wurde bei 15°C bei Dunkelheit inkubiert. Die BcGlyoxl-Mutanten (Knock-out Mutanten), die getestet wurden, waren nicht in der Lage, primäre nekrotische Läsio- nen hervorzurufen (Abb. 10, Tomate links, A4a, und in der Mitte, R3a), während der Wildtyp B05.10 primäre Läsionen hervorrief (Abb. 12, rechte Tomate), die sich teil- weise in das Nachbargewebe ausbreiteten.

Abbildung 11 Apathogenität der Knock-out Mutanten.

Ein abgeschnittenes Blatt von Tomaten (Lycopericon esculentum) wurde auf jeweils einer Seite mit einer Suspension von B. cinerea Konidien (siehe Bsp. 9) inokuliert.

Das inokulierte Wirtsgewebe wurde bei 15°C bei Dunkelheit inkubiert. Die BcGlyox1-Mutanten (Knock-out Mutanten), die getestet wurden, waren nicht in der Lage, primäre nekrotische Läsionen hervorzurufen (Abb. 11, rechte Blatthälfte), während der Wildtyp primäre Läsionen hervorrief (Abb. 11, linke Blatthälfte), die sich in das Nachbargewebe ausbreiteten.

Abbildung 12 kLpathogellität der ECoct-out Mutant-e.

Auf die abgeschnittenen Blüten von Gerbera-Hybriden wurden trockene B. cinerea Konidien aufgestäubt (siehe Bsp. 9). Das inokulierte Wirtsgewebe wurde bei 15°C bei Dunkelheit inkubiert. In allen Ansätzen waren die BcGlyoxl-Mutanten, die getestet wurden, nicht in der Lage, primäre nekrotische Läsionen hervorzurufen (Abb. 12A), während der Wildtyp primäre Läsionen hervorrief, die sich teilweise in das Nachbargewebe ausbreiteten (Abb. 12B).

Abbildung 13 Vergleich des Umsatzes von Methylglyoxal durch die Glyoxaloxidase in Abhängigkeit von verschiedenen Substratkonzentrationen.

In CA95-Zellen (U. maydis Stamm BAY-CA95, vgl. Bsp. 3), in denen es zur Über- produktion von Glol kommt, konnte die Expression von Glol an ganzen Zellen durch die enzymatische Umsetzung von Methylglyoxal (MG) nachgewiesen werden (vgl. Bsp. 10). Im Test wird eine Substratkonzentration von 10 mM Methylglyoxal eingesetzt. Bei einer Konzentration von 1mM Methylglyoxal konnte keine Reaktion im gegebenen Zeitfenster beobachtet werden. Durch Zugabe von 100 mM Methyl- glyoxal wurde nur eine geringe Steigerung des Umsatzes erreicht, während die Steigerung der Umsatzrate von 2mM auf 10 mM Methylglyoxal im linearen Bereich der Kinetik liegt. Der Test wurde sowohl mit ganzen Zellen als auch mit Zell- fragmenten (Membranfraktion) durchgeführt.

Abbildung 14 Lineweaver-Burk-Diagramm zur KM-Wert-Bestimmung der Glyoxaloxidase für Methylglyoxal.

Der Test wurde kontinuierlich durchgeführt, durch Kopplung der Reaktion mit Meerrettich-Peroxidase (vgl. Bsp. 10). Die Umsetzung von Amplex Rede (Molecular Probes) wurde fluorimetrisch verfolgt (X (exc) =550 nm ; B (em) =595 nm). Das Reaktionsvolumen betrug 50 Ill. Die Geschwindigkeit der Umsetzung wurde nach ca.

180 min Inkubationszeit (Lag-Phase) und nach Abzug des Blindwertes bestimmt.

Abbildung 15 Inhibition von Glol durch Zusatz eines erfindungsgemäßen Inhibitors.

Die Glol-Aktivität wurde mittels eines gekoppelten Testsystems mit dem Nachweisreagens Amplex Red wie in Bsp. 10 beschrieben durchgeführt. Als

Kontrolle wurden anstelle von Bay-CA95-Zellen (CA95) U. maydis Wildtyp 518 Zellen verwendet. Eine der im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbin- dungen (Tab. II, Bsp. 3) (Inhibitor) wurde in zwei verschiedenen Konzentrationen 10 u. M und 100 uM eingesetzt.

SEQ ID NO : 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Glyoxaloxidase Glol aus U. maydis (cDNA).

SEQ ID NO : 2 Aminosäuresequenz der von der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 kodierten Glyoxal- oxidase Glol aus U. maydis.

SEQ ID NO : 3 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Glyoxaloxidase Glol aus U. maydis (geno- mische DNA).

SEQ ID NO : 4 Aminosäuresequenz der von der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 3 kodierten Glyoxal- oxidase Glol aus U. maydis.

SEQ ID NO : 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Glyoxaloxidase Glo2 aus U. maydis (cDNA).

SEQIDNO : 6 Aminosäuresequenz der von der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 5 kodierten Glyoxal- oxidase Glo2 aus U. maydis.

SEQ ID NO : 7 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Glyoxaloxidase Glo3 aus U. maydis (cDNA).

SEQ ID NO : 8

Aminosäuresequenz der von der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 7 kodierten Glyoxal- oxidase Glo3 aus U. maydis.

SEQ ID N0 : 9 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Glyoxaloxidase aus B. cinerea (cDNA).

SEQ ID NO : 10 Aminosäuresequenz der von der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 9 kodierten Glyoxal- oxidase aus B. cinerea.

SEQ ID NO : 11 Nukleinsäuresequenz kodierend für die Glyoxaloxidase aus B. cinerea (genomische DNA enthaltend zwei Exons, Exon 1 und Exon 2, sowie ein Intron).

SEQ ID NO:12 Aminosäuresequenz der von der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 11 kodierten Glyoxal- oxidase aus B. cinerea (die Exons 1 und 2 wurden hier zusammengefügt).

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