呋甾垸型皂苷衍生物及其用途 技术领域

本发明涉及一种 体皂苷衍生物， 尤其涉及一种呋 烷型皂苷衍生物及其差向异 构体， 以及这些衍生物在预防和治疗抑郁症中的应用 。

龍

知母 （又名兔子油草， 穿地龙） 为百合科植物知母 （Anemarrhena asphodeloides) 的干燥根茎。 据《植物志》中记载， 其性苦寒， 有滋阴降火、 润燥滑肠、 利大小便之效。

中药材知母主要的化学成分有 体皂苷、 双苯吡喃酮类、 多糖类和木质素类等， 如： 知母皂苷 (甙) (timosaponin) A- I、 A- IK A-III、 A-IV、 B- I、 Β- Π禾口 B-III， 其 中， 知母皂苷 Α- Π、 A-IV结构尚不明。 以及知母皂苷 （amemarsaponin) A2， 即马尔考 皂 苷 元 -3-0-p-D- 吡 喃 葡 萄 糖 基 （ 1 → 2 ) -β-D- 卩比 喃 半 乳 糖 苷 B ( marlogenin-3-0-P-D-glucopyranosy ( 1 ^→ 2) -β-D-galactopyranoside B) 去半乳糖替告 阜苷 ( desgalactotigonin ) F- 脱阜苷 ( F-gitonin)禾口异菝葜阜苷 ( smilageninoside)等。 此外， 还含有知母多糖 （anemaran) A/B/C/D、 顺 -扁柏树脂酚 （cis- hinokiresinol)、 单 甲基-顺 -扁柏树脂酚 （ monomethyl-cis-hinokiresinol )、 氧化-顺 -扁柏树脂酚 （ oxy- cis-himokiresinol )、 2,6,4'-三轻基 -4-甲氧基二苯甲酮 ( 2,6,4'-trihydroxy-4-methoxy benzophenone) 对-羟苯基巴豆油酸 （p-hydroxyphenyl crotonic acid)、 二十五烷酸乙烯 月旨（pentacosyl vinyl ester) β-谷甾醇（ P.sitosterol)、芒果苷 ( mangiferin) 烟酸 (nicotinic acid)、 烟酰胺 （nicotinamide) 及泛酸 （pantothenic acid) 等。

知母皂苷 Β- Π对脑缺血造成的学习记忆障碍具有改善作用 （Neuroscience letter., 2007, 421, 147-151 知母皂苷 Α-ΠΙ主要通过抑制乙酰胆碱酯酶， 以及抑制炎症因子的 表达而对记忆缺失具有缓解作用 （Pharmacol. Biochem. Be., 2009, 93, 121-127 )。

已有诸多研究证明， 知母所含的这些物质对多种疾病具有治疗作用 ， 如： 知母总 皂苷可用于治疗心肌缺血 （CN1682873A), 以知母皂苷 Α-ΠΙ和 B- II为主要成分制成的 药剂也已经用于治疗血栓性疾病 （WO2011/026259 )。 知母皂苷 Α-ΠΙ可诱发人宫颈癌细 胞凋亡，在体内和体外实验中都证明其具有治 疗结肠和直肠癌的作用（Cancer Res., 2008, 68, 10229-10237), 以及具有抑制血管内皮细胞增殖的显著效果， 对于治疗肿瘤和类风 湿性关节炎等疾病具有治疗作用 （CN102030812A)。

近来相关研究还表明， 知母总皂在多种抑郁模型上具有抗抑郁作用， 可能与其增 强去甲肾上腺素能及 5-羟色胺能神经系统有关（中药新药与临床药� ��， 2007， 18， 29 )。 通过动物实验验证， 知母中所含有的菝葜皂苷元对小鼠实验性抑郁 有一定作用，可以影 响小鼠脑内多巴胺和单胺氧化酶的活性，而使 该类皂苷元具有抗抑郁活性（Biol. Pharm. Bull., 2006, 29, 2304-2306 )。 伊佳等人的研究发现， 知母皂苷 B- II具有抗抑郁活性， 其 作用机制可能与增强脑内 5-HT和 DA神经系统作用有关 （CN101214253A; 药学实践 杂志， 2010， 28， 283-287)。

中医认为， 抑郁症多因忧思过度， 劳伤心脾为病， 治疗应以宁心安神， 养血滋阴 为主。因此，在大部分用于中医治疗抑郁症的 处方中，知母也是一味较为常用的中药材。 临床上当前应用较为常用的抗抑郁药物有：三 环和四环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、 选择性 5-HT重吸收抑制剂 （SSRI)、 非典型抗抑郁药和锂盐等。

近年来， 临床上应用最广的 SSRI类药物一一氟西汀存在诸多不良反应， 如： 全身 或局部过敏， 胃肠道功能紊乱等 （中国现代应用药学， 2008， 25， 763-765； 中国新药 杂志， 2001， 10， 20； 实用医学杂志， 2004， 20， 318-319 )。 有研究指出， 幼儿患者服 用氟西汀后有可能增加自杀倾向，亦有报道称 服用氟西汀可能引起暴力倾向增强和先天 性心血管出生缺陷。

SSRI类药物——舍曲林 （Sertraline) 是美国处方量较大的抗抑郁品牌药， 但易引 起患者窦性心动过速和 ST-T改变等 （中国新药与临床杂志， 2002， 21， 711-713 )不良 反应，在治疗抑郁发作过程中会在一定程度上 引起躁狂发作或转躁（国外医学精神病学 分册， 2004, 31， 104)。

文拉法辛和氯米帕明虽一样易于耐受， 但约有 1/3的用药者会发生恶心反应， 特别 在开始用药的几周中较为明显。 已发现的文拉法辛所致的不良反应有恶性综合 征、诱发 躁狂、 紫癜、 幻觉、 骤停致幻觉、 戒断反应、 5-HT综合征、 胸闷、 眩晕、 低血压、 停 经和眼压升高等， 对儿童的转躁率较高 （临床精神医学杂志， 2002， 12， 382)。

据世界卫生组织专家预测， 到 2020年抑郁症的社会总负担在所有疾病负担中� �上 升为第一位，而用于治疗抑郁症活性的药物中 所含的活性分子主要依靠化学合成的方式 获取， 大都存在毒副作用大、抗抑郁谱狭窄和价格昂 贵等问题， 我们国家目前接受治疗 的抑郁症患者仅有 2%， 对家庭和社会具有潜在的极大危害。 因此， 研发安全、 有效和 价廉的抗抑郁创新药物显得尤为必要。

中药和天然药物是创新药物研究开发的重要源 头之一。 近年来， 国际和国内对贯 叶连翘等具有抗抑郁作用的天然药物研究和开 发取得了一系列成果 （中国现代中药， 2009, 11， 6-9； 中成药， 2006， 28， 713-716； 广东医学， 2005， 859-860; 南京中医 药大学学报， 2001， 17， 294-298； 解放局药学学报， 2003 , 19， 426-428 ; 药学实践杂 志， 2004， 22， 104-105； Pharm. Biol., 2006, 44, 503-510)。 但至今未见治疗抑郁症的 中药新药上市， 也鲜有这方面化学结构与药效机制关系的研究 报道。 发明内容

本发明的一个目的在于提供一种 体皂苷衍生物， 具有抗抑郁的药理作用， 可作 为活性成分用于制备治疗和预防抑郁症的药物 。

本发明的另一个目的在于提供一种呋 烷型皂苷衍生物或其差向异构体组合物， 具有抗抑郁的药理作用。

本发明的又一个目的在于提供一种由知母皂苷 Β-ΠΙ或从中药材知母中制取而得的 呋甾烷型皂苷衍生物或其差向异构体组合物， 具有抗抑郁的药理作用。

本发明的再一个目的在于提供一种组合物， 以所提供的各种 体皂苷衍生物或其 组合物为活性成分制成药物、食品和保健品， 单独或与其它物质组合用于预防和治疗抑 郁症。

本发明所称的 " 体皂苷衍生物" 是指 体皂苷衍生物以及所成的药学上可接受 的盐， 如： 但不仅限于盐酸盐、 硫酸盐、 碳酸盐、 碳酸氢盐、 乙酸盐、 钾盐、 钠盐、 钙 盐、 镁盐、 钡盐、 锰盐、 锌盐、 铁盐和季铵盐等。

本发明所称的 "呋 烷型皂苷衍生物" 是指呋 烷型皂苷衍生物以及所成的药学 上可接受的盐， 如： 但不仅限于盐酸盐、 硫酸盐、 碳酸盐、 碳酸氢盐、 乙酸盐、 钾盐、 钠盐、 钙盐、 镁盐、 钡盐、 锰盐、 锌盐、 铁盐和季铵盐等。

本发明所称的 "从中药材知母中制取而得的呋 烷型皂苷衍生物" 是指该衍生物 与各种无机酸、无机碱、有机酸或有机碱所成 的化合物， 包括为从中药材知母中制取呋 甾烷型皂苷衍生物的过程中，呋 烷型皂苷衍生物及其生成该衍生物的直接或间 接的前 体化合物 （如： 知母皂苷 Β-ΠΙ ) 与制取所使用的各种试剂所成的药学上可接受 的盐， 如： 盐酸盐、 硫酸盐、 碳酸盐、 碳酸氢盐、 乙酸盐、 钠盐、 钾盐或季铵盐等。

本发明所称的 "中药材知母" 是指百合科植物知母 （Anemarrhena asphodeloides) 的各个部分， 如： 根、 茎、 页和果实等， 由于从该植物的根茎中能够制取最多的目标甾 体皂苷衍生物， 因此本发明优先选择其干燥的根茎。这些知母 药材的选料和炮制过程是 否符合中药材加工工艺和标准不得限定本发明 。

本发明所称的 "抑郁症（depression) "属情感性精神障碍性疾病（mood disorders), 是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的 综合征。通常所说的抑郁症是指临床上的 重症抑郁症 （major depression) (中国实验方剂学杂志， 2005， 11， 46； 药学实践杂志， 2008, 26， 282)。 抑郁症的患者常伴有焦虑症状， 焦虑又可加重抑郁的发展 （中国临床 康复， 2006， 10， 58 )。 抑郁症发作以心境低落为主， 与其处境不相称， 可以从闷闷不 乐到悲痛欲绝， 甚至发生木僵。 严重者可出现幻觉、 妄想等精神病性症状。 某些病例的 焦虑与运动性激越很显著。 其诊断标准也以心境低落为主， 并伴有至少有以下所列 4 项： （1 ) 兴趣丧失、 无愉快感； （2) 精力减退或疲乏感； （3 ) 精神运动性迟滞或激越；

( 4) 自我评价过低、 自责， 或有内疚感； （5 ) 联想困难或自觉思考能力下降； （6) 反 复出现想死的念头或有自杀、 自伤行为； （7) 睡眠障碍， 如失眠、 早醒， 或睡眠过多；

( 8 )食欲降低或体重明显减轻； 以及 （9) 性欲减退。 而社会功能受损， 给本人造成痛 苦或不良后果则属于病情发展的严重标准。就 其病程角度， 患者符合症状标准和严重标 准至少已持续 2周； 可存在某些分裂性症状， 但不符合分裂症的诊断。若同时符合分裂 症的症状标准， 在分裂症状缓解后， 满足抑郁发作标准至少 2周（中国精神障碍分类与 诊断标准 [M]， 济南： 山东科学技术出版社， 2001， 28-35 )。 本发明所称的 "抗抑郁" 是指能对抑郁症患者的症状起到治疗、 改善或治愈的目 的， 以使患者的病情得到改善以致恢复正常。

本发明所称的 "强迫游泳实验 （Forced Swimming Test, FST) "或 "强迫游泳的抑 郁症动物模型"是指通过将实验动物 （如： 小鼠） 置于一个局限的环境中 （如： 水中）， 动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱 ， 从而提供了一个无可回避的压迫环境， 一段时间的实验后， 动物即表现出典型的 "不动状态"， 实际上动物放弃逃脱的希望， 反映了一种被称之为 "行为绝望状态"， 记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态过 程中的一系列参数。该系统使用摄像头对实验 过程录像并用相应软件对图像进行跟踪分 析， 减少人为操作， 数据具有客观性。 强迫游泳的抑郁症动物模型， 是研究人类抑郁症 药理学及其发病机理、筛选观察抗抑郁药物研 究中可靠的实验模型，其主要的特点是药 物作用的高度特异性， 该实验能够很好的将抗抑郁药物与强安定和抗 焦虑药加以区别， 而且大多数抗抑郁药所产生的效应与临床效价 显著相关 （Arch. Int. Pharmacodyn. Ther., 1977, 229, 327-336； Neurosei. Biobehav. Rev., 1995, 19, 377-395 )。

本发明所称的 "悬尾实验 （Tail Suspension Test, TST) " 是一种经典而又能快速 评价抗抑郁药物药效的方法。其原理是利用小 鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱， 从而放 弃挣扎， 进入特有的抑郁不动状态， 实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态 ， 抗 抑郁药物能明显地缩短改变其状态。

本发明所称的 "生物体"、 "动物 "或"患者"是指人、野生动物和家畜（Livestocks 野生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。 家畜是为了提供食物来源而人工词养的动 物， 如： 但不仅限于狗、 猫、 鼠、 大鼠、 仓鼠、 猪、 兔、 奶牛、 水牛、 公牛、 绵羊、 山 羊、 鹅和鸡等。 给予治疗的 "患者"、 "动物"或 "生物体"优先选择哺乳动物， 尤其是 人。

本发明所称的 "预防" 是指在未被临床标准认定的疾病前， 各种用于防止疾病发 生或发展的手段或措施， 包括医学、物理或化学的方法， 以阻止和降低疾病各种症状的 发生或发展。

本发明所称的 "治疗" 是指为了阻止和降低疾病的发生或发展， 使疾病病程的发 展或加重得以抑制、 遏制、 减轻、 改善、 减缓、 停止、 延迟或反转， 所描述的保持和 / 或用药时的疾病的、紊乱的或病理学状态的各 种指标包括减轻或减少症状或并发症， 或 治愈或消除疾病、 紊乱或状况。

本发明所称的 "食品" 是指包括本发明提供的各种 体皂苷衍生物制成可食用的 单一化合物或组合物。该种单一化合物或组合 物的生产和制造应当符合相关食品安全标 准， 但是这些食品安全标准不得限定本发明。

本发明所称的 "保健品" 是指将包括本发明提供的各种 体皂苷衍生物制成可食 用的单一化合物或组合物以施于患者，起到对 疾病进行预防和治疗的目的。其属于本发 明所称的食品， 但其生产、 制造和销售还应当符合各种相关的要求、 标准和规范。

本发明所称的 "药物" 是指可以用于预防或治疗某种疾病的单一化合 物、 多种化 合物形成的组合物、中药材及其提取物，或指 以单一化合物为主要活性成分的组合物或 制剂 （formulation), 还指由多种化合物为活性成分的组合物或制剂 。 "药物"应理解为 不仅指根据一国之法律规定，通过其设立的行 政机构审批并准予生产的产品，还指在为 了获得通过审批和准予生产的过程中，所形成 的含单一化合物为活性成分的各类物质形 态。 "形成"应理解为通过化学合成、 生物转化或购买等途径获得。

本发明所称的 "制剂" 是指含有本发明异黄酮类化合物的有利于给药 （drug delivery) 的剂型， 如： 但不仅限于， 水溶液注射剂、 粉针剂、 丸剂、 散剂、 片剂、 贴 剂、 栓剂、 乳剂、 霜剂、 凝胶剂、 颗粒剂、 胶囊剂、 气雾剂、 喷雾剂、 粉雾剂、 缓释剂 和控释剂等。这些药用辅料既可以是各种制剂 中常规使用的， 如： 但不仅限于，等渗剂、 缓冲液、 矫味剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 崩解剂和润滑剂等； 也可以是为了与所述 物质相适应而选择使用的， 如： 乳化剂、 增溶剂、 抑菌剂、 止痛剂和抗氧剂等， 这类辅 料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶 解性或改变化合物的释放速率和吸收速 率等， 从而改善本发明化合物在生物体内的代谢， 进而增强给药效果。 此外， 还可以为 实现特定的给药目的或方式， 如： 缓释给药、 控释给药和脉冲给药等， 而使用的辅料， 如： 但不仅限于， 明胶、 白蛋白、 壳聚糖、 聚醚和聚酯类高分子材料， 如： 但不仅限于， 聚乙二醇、 聚氨酯、 聚碳酸酯及其共聚物等。 所称的 "有利于给药"的主要表现有： 但 不仅限于提高治疗效果、 提高生物利用度、 降低毒副作用和提高患者顺应性等。

本发明所称的 "有效治疗剂量" 指能减缓各种病理学意义上的症状而使用本发 明 化合物作为活性成分的量， 所给的量一般根据生物体的体重确定， 如： 每天给予总量 0.05mg/kg-50mg/kg _o 根据生物体及其病情的实际情况， 所用的量和所用的次数亦可以 调整，如：每天 2次以上给予总量 0.05-0.5mg/kg、 0.6_lmg/kg、 l_10mg/kg、 l l_25mg/kg、 26_40mg/kg或 41_50mg/kg。 根据药物的剂型的不同， 所给的要亦会发生变化， 如： 普 通片剂需要给予 10mg/kg， 而采用缓控释制剂则所需的量更低。本发明 体皂苷衍生物 的特定剂量需要根据具体的情况加以确定， 如： 给药的方式、 给药途径、 给药时患者的 状态以及在治疗时的病理学状况等。

本发明所称的 "基础化合物" 是以 "氢" 代替化合物结构式上所有可变的取代基 而获得的化合物。 举例而言， 将 "氢" 同时代替如下式 I所示结构中的取代基 F 、 R ₂ 和 获得的化合物， 即为基础化合物。

本发明所称的 "取代基" 是指取代基础化合物上特定位置氢原子的一种 或几种无 机或有机基团的统称。

本发明所称的 "卤素" 包括氟、 氯、 溴和碘， 并以 _F、 -Cl、 -Br和 -I的集合方式 作为取代基应用于基础化合物。

本发明所称的 "氧代基" 在化合物结构式上以 " =0 " 表示， 并与基础化合物上的 原子共价连接。 举例而言， 氧代基与 C原子共价连接而成羰基 （C=0)。

本发明所称的 "硫酸酯基" 为 _OS0 ₃ H、 _OS0 ₃ Na、 _OS0 ₃ K禾口 _OS0 ₃ NH ₄ 。

本发明所称的 "磷酸酯基" 为 -OPO(HO) ₂ ， 以及其上氢被取代所成的药学上可接 受的盐。

本发明所称的 "三氟乙酸基" 为 _OCOCF ₃ 。

本发明所称的 "取代的氨基" 为氨基上氢被 C1-C3饱和烷烃部分或全部取代的氨 基， 如： 但不仅限于甲氨基和二甲氨基。

本发明所称的 " C1-C3饱和烷烃"为碳原子数 1-3的烷烃。 其中， 字母 C表示碳原 子， 其后数字为正整数， 如： 1、 2或 3， 表示基团所含的碳原子个数， 如： 甲烷、 乙烷和 丙烷等。

本发明所称的 "糖"， 亦称 "糖类"， 为化学或生物化学中一类基本的有机物， 是 以 C、 H和 0元素组成的多羟基 （大于 2个） 醛、 多羟基酮 （大于 2个） 以及能水解 而生成多羟基醛或多羟基酮的有机化合物。按 其分子结构可分为 "单糖"、 "二糖 "和"多 糖"。 由若干个单糖分子经由糖苷键缩合而成的有机 化合物， 亦称 "糖链"。 本发明优先 选择单糖或二糖作为取代基应用于基础化合物 。

本发明所称的 "单糖 （monosaccharide) " 是指以 C、 H和 0元素组成的一种有机 化合物，也是构成其它糖类物质的基本单元， 一般是含有 3-6个碳原子的多羟基醛或多 羟基酮的有机物。优先选择碳原子为 5或 6的多羟基醛或多羟基酮有机物，也称"戊糖" 和 "已糖"如： 但不仅限于核糖、 木糖、 阿拉伯糖、 葡萄糖、 甘露糖、 半乳糖、 阿洛酮 糖、 果糖、 山梨糖、 塔格糖、 古洛糖、 伊杜糖、 塔罗糖、 阿洛糖和阿卓糖等。 本发明单 糖结构中， 0元素可为 S元素部分或全部替代。

本发明所称的 "二糖（disaccharide) "是指以 C、 H和 0元素组成一种有机化合物， 一般是由 2个单糖分子通过缩合和失水而成糖苷键的方� �连接而成，熟知的二糖如： 蔗 糖、 乳糖、 纤维二糖、 海藻糖和麦芽糖等。 单糖分子之间所成的糖苷键如： 但不仅限于 α-1,1-、 α-1,2-、 α-1,3-、 α-1,4-、 β-1,4-和 α-1,6-等几种糖苷键形式。 本发明二糖结构中，

0元素可为 S元素部分或全部替代。

本发明所称的 "多糖 （polysaccharide) "也包括寡糖 （oligosaccharide) , 是指以 C、

H和 0元素组成一种有机化合物， 一般是由 3个以上单糖分子通过缩合和失水而成糖 苷键的方式连接而成的线性或分支的聚合物。 优先选择 3-15个单糖分子由糖苷键连接 而成的线性或分支的聚合物， 熟知的多糖如： 龙胆三糖、松三糖、洋槐三糖、毛蕊花糖、 水苏糖和棉籽糖等。 单糖分子之间所成的糖苷键如： 但不仅限于 α-1 ,4-、 β-1,4-和 α-1,6- 等几种糖苷键形式。 本发明多糖结构中， 0元素可为 S元素部分或全部替代。

本发明所称的 " C1-C6的醇"为一个或多个羟基取代的直链或支链 的饱和或不饱和 烃。 其中， 字母 C表示碳原子， 其后数字为正整数， 如： 1、 2、 3、 4或 5等， 表示基团所 含的碳原子个数， 如： 甲醇、 乙醇、 丙醇、 异丙醇和正丁醇等。

本发明提供的一种 体皂苷衍生物， 为呋 烷型皂苷衍生物， 其结构如式 I所示， 其中 表示一种取代基， 选自于 -OH、 -SH、 卤素、 氧代基、 硫酸酯基、 通过 0-糖苷 键连接的糖、 通过 S-糖苷键连接的糖、 C1-C3饱和烷烃取代的氨基之一种基团； R ₂ 表 示一种取代基，选自于 -0H、 -SH和卤素之一种基团； R ₃ 表示一种取代基，选自于 -0H、 -SH、 卤素、 氧代基、硫酸酯基、 磷酸酯基、 三氟乙酸基、 C1-C3饱和烷烃取代的氨基、 通过 0-糖苷键连接的 基团。 式 I

本发明提供的另一种 体皂苷衍生物， 为呋 烷型皂苷衍生物， 结构如式 I所示， 其中 表示一种取代基， 选自于 -OH、 -SH、 卤素、 C1-C3饱和烷烃取代的氨基之一 种基团； R ₂ 表示一种取代基， 选自于 -OH、 -SH和卤素之一种基团； R ₃ 表示一种取代 基， 选自于 -OH、 -SH、 卤素、 氧代基、 硫酸酯基、 磷酸酯基、 三氟乙酸基、 C1-C3饱 和烷烃取代的氨基、 0-糖苷键连接的单糖和通过 S-糖苷键连接的单糖之一种基团。 式 I

本发明提供的另一种 体皂苷衍生物， 为呋 烷型皂苷衍生物， 其结构如式 II所 示， 其中 表示一种取代基， 选自于 -OH、 -SH、 卤素、 C1-C3饱和烷烃取代的氨基 之一种基团； R ₃ 表示一种取代基， 选自于 -OH、 -SH、 卤素、 氧代基、 硫酸酯基、 磷酸 酯基、 三氟乙酸基、 C1-C3饱和烷烃取代的氨基、 通过 0-糖苷键连接的单糖和通过 S- 糖苷键连接的单糖之一种基团。 式 II

本发明提供的另一种 体皂苷衍生物， 为呋 烷型皂苷衍生物， 其结构如式 III所 示， 其中 R ₃ 表示一种取代基， 选自于 -OH、 -SH、 卤素、 氧代基、 硫酸酯基、 磷酸酯 基、 三氟乙酸基、 C1-C3饱和烷烃取代的氨基、 通过 0-糖苷键连接的单糖和通过 S-糖 苷键连接的单糖之一种基团。 式 III

本发明提供的另一种 体皂苷衍生物， 为呋 烷型皂苷衍生物， 结构如式 IV所示,

式 IV

本发明提供的另一种 体皂苷衍生物， 为呋 烷型皂苷衍生物， 其结构分别如式 和式 ν-π所示。

式 V-I

本发明提供的另一种 体皂苷衍生物， 由式 V - I和式 ν - π所示的呋 烷型皂苷 衍生物差向异构体组成。

本发明提供的各种 体皂苷衍生物， 可采用多种方式制取而得， 如将知母皂苷 Β- III、 知母皂苷 Β-ΠΙ皂苷元或知母皂苷 Α- Ι皂苷元溶于溶剂， 加入各种必要试剂后， 在惰 性气体 （如： 但不仅限于氮气、 氢气或氦气） 保护下反应， 反应结束后， 采用三甲胺、 三乙胺、碳酸氢钠或硫代硫酸钠等淬灭剂终止 反应。所得产物采用填料为硅胶、氧化铝、 ODS或大孔树脂等的柱层析分离， 分离所用的溶剂如： 但不仅限于四氢呋喃、 石油醚、 乙酸乙酯、 DMF、 吡啶、 二氯甲烷、 乙醇、 甲醇或水之一种或几种。

本发明提供的一种获取本发明 V - I和式 V - Π所示 体皂苷衍生物较为直接方 法， 如： 按知母皂苷 Β-ΠΙ重量份数与溶剂 （溶剂可为 10v/ _V %-100W _V %Cl-C6醇的水溶 液以及其它常见有机溶剂的水溶液， 或水中加入助溶剂， 如： 表面活性剂） 体积比 1： 0.2-10, 将知母皂苷 Β-ΠΙ溶解于容器中， 按知母皂苷 Β-ΠΙ重量份数与无机酸 （如： 盐酸 和硫酸等）体积比 1： 1-4加入无机酸， 于 60°C -100°C反应 1-10小时， 之后停止反应， 反 应液中加入适量碱液 （如： 碳酸氢钠或氢氧化钠等） 中和至 pH6_8， 按知母皂苷 Β-ΠΙ重 量份数与正丁醇体积比 1： 1-10萃取 1-3次， 合并正丁醇萃取部分， 减压回收溶剂， 得固 体物。 固体物用常用有机溶剂 （如： 乙腈或甲醇等）溶解， 经分析型、 半制备型或制备 型 HPLC或开放 ODS柱分离并收集主要色谱峰， 含有本发明目标产物的溶液经回收溶剂 后， 得到微黄色或白色产物， 即为本发明呋 烷型皂苷衍生物。

多种直接或间接的方法可以获得本发明所提供 的各种 体皂苷衍生物、 药学上可 接受的盐或其组合物。本领域技术人员可以预 见，从知母或其提取物中先提取知母皂苷 B-III (如： CN101307090A) , 再经上述公开的酸水解方法即可间接制取本发 明提供的 各种呋 烷型皂苷衍生物， 如： 将从中药材知母中获取的知母皂苷 Β-ΠΙ进行酸水解后， 经分离制得式 V - I或式 V - Π所示的呋 烷型皂苷衍生物及其任意比例的组合物。 此 外， 通过知母皂苷 Β-ΠΙ皂苷元、 知母皂苷 Α- Ι或知母皂苷 Α- Ι皂苷元也可获得本发明目 标衍生物， 以及其它诸如： 有机合成、 从生物体代谢产物中提取、 分离和纯化、 化学全 合成和生物催化和转化等方式同样也能获得这 些衍生物。本发明所列举的各种制备方法 应当理解为对实施本发明技术方案进行的必要 公开。本领域技术人员可以根据教科书和 实验手册的教导， 以及通过必要的实验获得本发明提供的 体皂苷衍生物，这些所记载 的获得 体皂苷衍生物的方法不得作为对本发明的限定 。

本发明提供的各种 体皂苷衍生物可以作为唯一的或主要的活性成 分用于制备预 防或治疗病毒性疾病的药物，或与其它一种或 多种具有抗抑郁作用的化学物质或药物一 并给予生物体。 这些化学物质如： 但不仅限于知母提取物、 知母总皂苷及其水解物、 知 母皂苷 Β- Π及其水解物、 知母皂苷 Β-ΠΙ及其水解物、 知母皂苷 Β-ΠΙ皂苷元、 知母皂苷 A- I及其水解产物、知母皂苷 A- I皂苷元、三环和四环类抗抑郁药、单胺氧化� �抑制剂、 选择性 5-ΗΤ重吸收抑制剂 （SSRI)、 非典型抗抑郁药和锂盐等。 所称的 "一并给予生 物体"是指本发明各种 体皂苷衍生物单独或与其它一种或多种具有抗 抑郁作用的化合 物或药物混合后经单一的给药途径， 如： 但不仅限于， 口服（Oral)、鼻腔（Nasal)、（面） 颊（ Buccal )、透皮（ Transdermal )、肺部（ Pulmonal )、阴道（ Vaginal )、皮下（ Subcutaneous ) 或静脉 （Intravenous)给予生物体； 或与其它一种或多种具有抗抑郁作用的化学物 质或 药物分别经多种的给药途径给予生物体，如： 但不仅限于速释的口服制剂与缓控释的埋 植制剂配合。

经强迫游泳实验和悬尾实验证明，将有效治疗 剂量的本发明提供的各种 体皂苷衍 生物（如： 式 II、式 III或其组合物）给予生物体， 能使生物体抑郁症状得到改善或消除。 由此表明， 本发明提供的呋 烷型皂苷衍生物具有显著的抗抑郁活性， 以其为活性成分 制成药物、 食品和保健品， 应用于抑郁症的预防和治疗。

本发明提供的一种药物组合物， 以所提供的各种 体皂苷衍生物或其组合物为活 性成分用于预防和治疗抑郁症。

本发明提供的一种食品， 以所提供的各种 体皂苷衍生物或其组合物为活性成分 用于预防和治疗抑郁症。

本发明提供的一种保健品， 以所提供的各种 体皂苷衍生物或其组合物为活性成 分用于预防和治疗抑郁症。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的一种 体皂苷衍生物， 具体为式 I所示的呋 烷型皂苷衍生物， 尤 其是如式 II、 式 III、 式 IV、 式 V- I和式 V-Π所示结构的呋甾烷型皂苷衍生物， 具有显 著的抗抑郁药理活性， 可作为活性成分制成药物、 食品和保健品， 单独或与其它物质组 合用于抑郁症的预防和治疗。 附图说明

图 1为式 V - I 1H NMR if (400MHz, Pyr-t ₅ );

图 2为式 V- I ¹³ C-NMR谱和 DEPT135谱 （lOOMHz, Pyr-t ₅ );

图 3为式 V- I HMBC谱 (Pyr-d ₅ );

图 4为式 V- I ROESY谱 （Pyr-t ₅ );

图 5为式 V- I HMBC相关图， 图中 代表氢碳远程相关关系；

图 6为式 V- I ROESY相关图， 图中 "一→"代表氢氢 NOE相关关系； 图 7为式 V - II 1H NMR谱 ( 400MHz, Vyr-d ₅ )；

图 8为式 V- II ¹³ C-NMR谱和 DEPT135谱 ( 100MHz, Pyr-t ₅ );

图 9为式 V-Π HMBC谱 (Pyr-d ₅ );

图 10为式 V- II ROESY谱 (Pyr-t ₅ );

图 11为式 V-IIHMBC相关图， 图中 代表氢碳远程相关关系；

图 12为式 V-IIROESY相关图， 图中 "一→"代表氢氢 NOE相关关系。 具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。 本发明实施例仅用以说明本发明的技 术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发 明进行了详细说明，本领域的普通技术人 员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改 或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案 的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未明确指明， 则均购自于西格玛一奥德里奇 （Sigma— Aldrich)。

以知母皂苷 Β-ΠΙ为反应起始物制取呋甾烷型皂苷单糖衍� �物， 具体步骤如下：

( 1 )将 0.05mol知母皂苷 Β-ΠΙ溶于 300mL体积比为 10v/v%的甲醇溶液（水或 30v/v% 乙醇溶液或 lw/v%吐温溶液） 中， 加入 0.5mL_lmL浓硫酸， 80°C _150°C反应 1小时 _6小 时。

( 2) 将上述反应液用氢氧化钠调节至 pH6_7。

( 3 ) 用 900mL-1200mL正丁醇分 3次萃取步骤 （2) 中和后所得溶液， 萃取液减压 浓缩至蒸干得呋 烷型皂苷单糖衍生物 2 (NMR: 详见表 1 )。

( 4) 用水将所得的呋 烷型皂苷单糖衍生物 2固体溶解， 并使吸附于 ODS柱后， 用 50v/ _V %-70W _V %的乙腈水溶液洗脱， 先后收集 S构型的衍生物 2- 1和 R构型的衍生物 2-2 的洗脱液。

( 5 ) 将溶液减压回收， 蒸干即分别制得呋 烷型皂苷单糖衍生物 2-1和 2-2。

实施例 2 呋 烷型皂苷单糖衍生物的制取

R=OH (S构型） R=OH (R构型) 以知母皂苷 Β-ΠΙ为反应起始物制取呋甾烷型皂苷单糖衍� �物， 具体步骤如下：

( 1 )将 0.05mol知母皂苷 Β-ΠΙ溶于 300ml体积比为 10v/v%的甲醇溶液（水或 30v/v% 乙醇溶液或 lw/v%吐温溶液） 中， 加入 2m卜 4ml浓盐酸， 80°C -150°C反应 1小时 _6小时。

( 2) 将上述反应液用氢氧化钠调节至 pH6_7。

( 3 ) 用 900ml-1200ml正丁醇分 3次萃取步骤 （2) 中和后所得溶液， 萃取液减压浓 缩至蒸干得呋 烷型皂苷单糖衍生物 2 (NMR: 详见表 1 )。

( 4) 用水将所得的呋 烷型皂苷单糖衍生物 2固体溶解， 并使皂苷吸附于 ODS柱 后， 用 40v/ _V %-60W _V %的甲醇洗脱， 先后收集 S构型的衍生物 2-1和 R构型的衍生物 2-2洗 脱液。

( 5 ) 将溶液减压回收， 蒸干分别制得呋 烷型皂苷单糖衍生物 2-1和 2-2。

以知母皂苷 A I为反应起始物制取呋 烷型皂苷单糖衍生物的制取， 步骤如下：

(1) 将 0.05mol知母皂苷 A I的皂苷元 3和 0.06mol-0.1mol叔丁基二甲基氯硅烷溶解于 200ml-250ml DMF中， 在 60°C-90°C反应 8小时 -10小时； 加入 600m 800ml石油醚于反应液 中， 再用 900ml水洗两次， 600mlNaCl水溶液洗一次。 分出有机相， 用无水硫酸钠干燥。 过 滤， 对滤液减压蒸除溶剂 。

(2) 将步骤 （1) 所得产物和 0.8mo l. lmolNaHC0 ₃ 溶解于 700ml比例为 1： 1： 1的二 氯甲烷， 丙酮， lmmol/L Na ₂ EDTA的混合溶液中； 将溶有 0.2mol过氧硫酸氢钾复合盐的 1 mmol/L-3mmol/L Na ₂ EDTA溶液加到反应溶液中， 20°C -30 °C反应 10小时- 16小时。 减压旋 出有机相， 加入二氯甲烷溶解沉淀； 水洗有机相， 再用无水硫酸钠干燥。 减压蒸出溶剂。 用 20 : 1的石油醚、 乙酸乙酯展开剂分离化合物 4， 将同一化合物合并回收。

(3) 将步骤 （2) 所得产物 4和 0.05mol-0.07mol T1溶于 300ml二氯甲烷中， 降低体系 温度至 0°C--30°C， 并用氮气保护， 加入 4.7mmo卜 5.5mmol CF ₃ S0 ₃ Si(CH ₃ ) ₃ ， 反应 40分钟 _1 小时， 用三乙胺淬灭反应， 减压旋干溶剂。 用 20 : 1-10： 1的石油醚、 乙酸乙酯展开剂分离 化合物 5， 将同一化合物合并回收。

(4) 将步骤三所得化合物 5溶于 200m卜 300ml乙醇中， 加入 0.01mo 0.015mol NaBH ₄ ， 加热到 60°C-75°C， 反应 3小时。

(5) 旋干溶液， 将沉淀加入到 200mLCH ₂ Cl ₂ -MeOH (2： 1, v/v) 溶液中， 再加入 lmol/L-1.4mol/L的甲醇钠甲醇溶液 50ml， 反应 3小时 _5小时， 得呋甾烷型皂苷单糖衍生 物 2。 ( 6)真空旋干溶剂，用水将呋 烷型皂苷单糖衍生物 2固体溶解，并使吸附于 ODS 柱后， 用 50v/ _V %-70W _V %的乙腈水溶液洗脱， 先后收集 S构型的衍生物 2-1和 R构型的衍 生物 2-2洗脱液。

( 7) 将溶液减压回收， 蒸干得到呋 烷型皂苷单糖衍生物固体 2-1和 2-2。

实施例 4 呋 烷型皂苷单糖衍生物的制取

R=OH (S构型） _R =OH (R构型）

6 Tl 2

以知母皂苷 B-III为反应起始物先制取皂苷苷元化合物 6，然后加入试剂 T1制得呋甾 烷型皂苷单糖衍生物 2， 具体步骤如下：

( 1 ) 将 O.lmol知母皂苷 Β- ΠΙ溶于 600ml体积比为 10%的甲醇溶液中， 加入 3 OmL-5 OmL浓盐酸， 80°C - 100°C反应 2小时。

( 2) 用氢氧化钠调节至 pH=6_7。

( 3 )用 1.8L-2.4L正丁醇分 3次萃取步骤 （2 ) 中和后所得溶液， 萃取液减压浓缩至 蒸干。

( 4 ) 用水将上述固体溶解， 并使皂苷吸附于 ODS柱后， 用 60v/ _V %-80W _V %的乙腈 水溶液洗脱收集化合物 6的洗脱液。

( 5 )将溶液减压回收， 蒸干即得皂苷苷元化合物 6 (NMR: 30.47(1-C); 27.12(2-C); 66.06(3-C); 36.95(4-C); 40.00(5-C); 26.58(6-C); 28.59(7-C); 35.37(8-C);36.98(9-C); 35.42(10-C); 21.00(11-C); 40.39(12-C); 44.49(13-C); 53.73(14-C); 34.32(15-C); 75.93(16-C); 63.39(17-C); 13.65(18-C); 24.20(19-C); 49.34(20-C); 16.78(21-C); 214.86(22-C); 40.21(23-C); 26.88(24-C); 35.47(25-C); 67.87(26-C); 17.16(27-C) )。

( 6)将 0.05mol皂苷苷元化合物 6和 0.05mol-0.07mol试剂 Tl用二氯甲烷溶解， 在氮 气保护下降温到 -20°C -0°C，加入 0.91 ml- 1.4ml CF ₃ S0 ₃ Si(CH ₃ ) ₃ , 反应 40分钟 _ 1小时后停 止。

( 7) 加入三乙胺淬灭反应， 减压旋干溶剂。

( 8 )沉淀加入到 200ml CH ₂ Cl ₂ -MeOH ( 2： 1 , v/v)溶液中， 再加入 lmol/L_1.5mol/L 的甲醇钠甲醇溶液 50ml， 反应 3-5小时， 得呋甾烷型皂苷单糖衍生物 2， 蒸干反应液。

( 9 ) 用水将上述固体溶解， 并吸附于 ODS柱后， 用 50v/ _V %-70W _V %的乙腈水溶液

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10

以实施例 4制得的皂苷苷元化合物 6为反应起始物，制取呋 烷型皂苷溴代衍生物 10， 具体步骤如下：

( 1 )将 0.05mol实施例 4中第（5 )步得到的皂苷苷元化合物 6溶于 250ml CH ₂ C1 ₂ 中， 加入 50m卜 70ml三氟化硼-乙醚络合试剂 （CAS: 109-63-7) , 滴加醋酸酐 0.1moH).2mol， 20°C -60°C反应 30分钟 -1小时， 用 1L 饱和 NaCl水溶液洗反应液， 再用 750ml_lL水洗反 应液， 分出有机相， 用 Na ₂ S0 ₄ 干燥； 将有机相过滤， 旋干滤液， 用硅胶柱层析纯化产 物， 展开剂为体积比 6： 1的石油醚与乙酸乙酯。

( 2 ) 将步骤 （1 ) 所得产物溶解于 250ml-300ml四氢呋喃溶液中， 加入 0.05mol -0.1mol NBS和0.005mo卜0.01mol (Ph) ₃ P， 常温反应 5小时 _7小时。

( 3 ) 过滤反应液， 减压旋蒸干溶剂， 加入 200ml CH ₂ Cl ₂ -MeOH ( 2： l , v/v) 溶液 萃取， 加入 1 mol/L- 1.5mol/L的甲醇钠甲醇溶液 50ml- 100ml, 20°C _50°C反应 5小时 _8小 时。

( 4) 减压蒸馏， 浓缩反应， 用乙醇和乙酸乙酯混合液重结晶， 得到呋 烷型皂苷 溴代衍生物 10 ( NMR : 30.47(1-C); 27.12(2-C); 66.06(3-C); 36.95(4-C); 40.00(5-C); 26.58(6-C); 28.59(7-C); 35.37(8-C); 36.98(9-C); 35.42(10-C); 21.00(11-C); 40.39(12-C); 44.49(13-C); 53.73(14-C); 29.78(15-C); 39.98(16-C); 55.89(17-C); 12.61(18-C); 24.20(19-C); 49.34(20-C); 16.78(21-C); 214.86(22-C); 38.89(23-C); 27.92(24-C); 33.56(25-C); 67.23(26-C); 17.04(27-C))。

( 5 ) 用水将呋甾烷型皂苷溴代衍生物 10 固体溶解， 并吸附于 ODS 柱后， 用 50W _V %-70W _V %的乙腈水溶液洗脱， 先后收集化合物 S构型的衍生物 10-1和 R构型的 衍生物 10-2的洗脱液。

( 6) 将溶液减压回收， 蒸干即分别制得呋 烷型溴代衍生物 10-1和 10-2。 实施例 7 呋 烷型皂苷磷酸酯基衍生物的制取

R=OH (S构 =OH (R构； ¹ fJ)

6 11 以实施例 4制得的皂苷苷元化合物 6为反应起始物，制取呋 烷型皂苷磷酸酯基衍 生物 11， 具体步骤如下：

( 1 ) 将实施例 4中第 （5 ) 步得到的皂苷苷元 0.05mol溶于 200mL四氢呋喃中降 温至 -50°C--20°C， 向其中缓缓加入 0.25mo 0.3mol的焦磷酰氯， 保持温度不变， 反应 1小 时 -3小时。

(2) 用水稀释反应液， 升温到 40°C-60°C左右， 向其中加入一定量 Na ₂ C0 ₃ 至无气泡 放出， 在 25°C-35°C搅拌反应 0.5小时 -1.5小时， 过滤， 分层， 下层水溶液在 50°C下旋蒸至 无明显气泡。 向其中加入盐酸， 调节 pH=l_2， 析出白色沉淀。

( 3 ) 过滤沉淀， 用盐酸酸洗涤沉淀三遍， 得到呋 烷型皂苷磷酸酯基衍生物 11 ( NMR ： 30.47(1-C); 27.12(2-C); 66.06(3-C); 36.95(4-C); 40.00(5-C); 26.58(6-C);

28.59(7-C); 35.37(8-C); 36.98(9-C); 35.42(10-C); 21.00(11-C); 40.39(12-C); 44.49(13-C); 53.73(14-C); 34.32(15-C); 75.93(16-C); 63.39(17-C); 13.65(18-C); 24.20(19-C); 49.34(20-C); 16.78(21-C); 214.86(22-C);38.79(23-C); 27.61(24-C); 32.43(25-C); 71.23(26-C); 16.71(27-C) ) o

(4) 用水将， 得到呋 烷型皂苷磷酸酯基衍生物 11 固体溶解， 并使皂苷吸附于 ODS柱后， 用 20v/ _V %-40W _V %的乙腈水溶液洗脱， 先后收集 S构型的衍生物 11-1和 R 构型的衍生物 11-2的洗脱液。

( 5 )将溶液减压回收，蒸干即分别制得呋 烷型皂苷磷酸酯基衍生物 11-1和 11-2。

酯基衍生物的制取

R=OH (S构 ¾) =OH (R构型）

6 12

以实施例 4制得的皂苷苷元化合物 6为反应起始物，制取呋 烷型皂苷硫酸酯基衍 yat ' asi-- aoi-丟^ ¾ ' ψ ^ζ ο¾3ΐ^ο^^¾εΐί#^φ (ι) m^ (乙）

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5t ^ 0.075mo卜 O. lmol三氟乙酰三氟甲磺酸酯 （TFAT)， 反应 2小时 _4小时。

( 3 ) 反应结束， 加入碳酸氢钠淬灭反应， 继续搅拌 30分钟 -1小时， 升高温度至 20 °C -30 °C , 继续搅拌 30分钟 -1小时， 得呋甾烷型皂苷三氟乙酸基衍生物 14 ( NMR: 30.47(1-C); 27.12(2-C); 66.06(3-C); 36.95(4-C); 40.00(5-C); 26.58(6-C); 28.59(7-C); 35.37(8-C); 36.98(9-C); 35.42(10-C); 21.00(11-C); 40.39(12-C); 44.49(13-C); 53.73(14-C); 34.32(15-C); 75.93(16-C); 63.39(17-C); 13.65(18-C); 24.20(19-C); 49.34(20-C); 16.78(21-C); 214.86(22-C); 38.89(23-C); 27.92(24-C); 33.56(25-C); 68.97(26-C); 17.21(27-C); 159.23(28-C); 116.32(29-C))。

( 4)真空旋干溶剂， 用水将呋 烷型皂苷三氟乙酸基衍生物 14固体溶解， 并吸附 于 ODS柱后， 用 40v/ _V %-70W _V %的乙腈水溶液洗脱， 先后收集 S构型的衍生物 14-1和 R构 型的衍生物 14-2的洗脱液。

( 5 ) 将溶液减压回收， 蒸干即分别制得到 S构型的衍生物 14-1和 R构型的衍生物

14-2。

以实施例 4制得的皂苷苷元化合物 6为反应起始物，制取呋 烷型皂苷烷氨基衍生 物， 具体步骤如下：

( 1 )将 0.05mol实施例 4中第（5 )步得到的皂苷苷元化合物 6溶于 300ml四氢呋 喃中， 将温度降至 -30°C-(TC _; 将 O. lmo卜 0.2mol二甲胺、 0.15mo卜 0.2mol偶氮二羧酸二 乙酯、 0.12mo 0.22mol PPh ₃ 加入溶液， 通入氮气保护， 反应 2小时 _3小时。

(2) 反应结束后， 过滤， 将滤液旋干， 得呋 烷型皂苷烷氨基衍生物 15 (NMR: 33.37(1-C); 24.59(2-C); 71.65(3-C); 30.46(4-C); 44.65(5-C); 26.58(6-C); 28.59(7-C); 35.37(8-C); 36.98(9-C); 35.42(10-C); 21.00(11-C); 40.39(12-C); 44.49(13-C); 53.73(14-C); 34.32(15-C); 75.93(16-C); 63.39(17-C); 13.65(18-C); 24.20(19-C); 49.34(20-C); 16.78(21-C); 214.86(22-C); 39.84(23-C); 29.46(24-C); 31.26(25-C); 67.82(26-C); 18.25(27-C); 42.31(3-N-CH ₃ ); 48.23(26-N-C¾))。

(3 )真空旋干溶剂，用水将呋 烷型皂苷烷氨基衍生物 15固体溶解，并吸附于 ODS 柱后， 用 5(^ %_7(^ %的乙腈水溶液洗脱， 先后收集 S构型的衍生物 15-1和 R构型的衍 生物 15-2的洗脱液。

( 4) 将溶液减压回收， 蒸干即分别制得呋 烷型皂苷烷氨基衍生物 15-1和 15-2。 实施例 11 结构确认 将实施例 1或实施例 2所得的呋甾烷型皂苷单糖衍生物， 经 Molish反应和 Liebermann-Burchard反应检测均呈阳性，其核磁共� �谱图（Nuclear Magnetic Resonance, NMR)数据如表 1。 再综合 HMBC、 ROESY和 MS等多种图谱结果分析如式 V _ I和式 V - II所示衍生物。

式 V - I衍生物， 外观为白色无定形粉末， 易溶于吡啶， 可溶于丙酮 -水、 乙腈 -水和 水溶液。 Liebermann-Burchard和 Molish反应呈阳性， 证明该化合物为甾体皂苷。

HR-ESI-MS (正离子模式） 显示 [M+Na]+w/z 619.3798 (计为 C ₃₃ H ₅₆ 0 ₉ Na: 619.3817), 确定其分子式为 C ₃₃ H ₅₆ 0 ₉ 。

核磁共振谱提示结构中含有一分子葡萄糖， 氢谱 ^H-MNR, 见图 1 ) 显示 δ 4.88 (d， J= 7.7 Hz)为葡萄糖的端基质子信号，说明该葡萄糖为 ?构型。综合分析 ¹³ C-NMR谱和 DEPT 谱 （见图 2)， 确定 26个苷元上的碳信号中有 4个是甲基碳信号， 12个是亚甲基碳信号， 14个 次甲基碳信号和 3个季碳信号。 该化合物苷元部分的碳谱和氢谱数据均与知母 皂苷 Β-ΠΙ相 似， 说明它与知母皂苷 Β-ΠΙ具有相似的母核。 与知母皂苷 Β-ΠΙ苷元部分的碳谱相比， 双键 的信号消失， 在 214.63出现了一个羰基信号。 在 HMBC谱（见图 3 ) 中， H-20 ( 2.84)， H-21 ( 1.49)以及 H-23 ( 2.76)与 214.63 存在远程相关，而 H-17 ( 2.23 )与 ^75.22 存在远程相关， 说明羰基位于 C-22位上， 而羟基位于 C-16位上。 4.88 (Η-Γ) 的葡萄糖端 基质子与 75.01 (C-26)存在 HMBC远程相关确定糖苷化的位置， 即葡萄糖与 26-OH相连 成苷。 相对立体构型由 ROESY谱 （见图 4) 确定， 具体为 H-5和 H-19存在 NOE相关， 说明苷 元 A环和 B环是顺式构型。 3 0.76 (11-18)和3 4.09 (H-16) 存在 NOE相关， 说明 16-OH是 ^构 型。 其它 NMR数据及相关关系见表 1、 图 5和图 6。 该化合物未见文献报道， 为新化合物， 命 名为 timosaponin BlII-1 (或简称: ΒΠΙ-1 )。

式 ν - π衍生物， 外观为白色无定形粉末， 易溶于吡啶， 可溶于丙酮 -水、 乙腈 -水和 水溶液。 Liebermann-Burchard和 Molish反应呈阳性， 提示该化合物为甾体皂苷。 [a] ² _D ^e = -46.0 (c 0.05mg/ml, pyridine)。

HR-ESI-MS (正离子模式) 显示 [M+Na] ⁺ w/z 619.3816 (计为 C ₃₃ H ₅₆ 0 ₉ Na: 619.3817), 确定其分子式为 C ₃₃ H ₅₆ 0 ₉ 。

核磁共振谱提示结构中含有一分子葡萄糖， 氢谱 （1H-MNR, 见图 7) 中 3 4.85 (d， J = 7.7 Hz) 为葡萄糖端基质子信号， 确定为 构型。 综合分析 ¹³ C-NMR谱和 DEPT谱 （见图 8)， 确定 26个苷元上的碳信号中有 4个是甲基碳信号， 12个是亚甲基碳信号， 14个次甲基碳信号 和 3个季碳信号。该化合物苷元部分的碳谱和氢� �数据均与知母皂苷 B3相似， 说明它与知母 皂苷 B3具有相似的母核。与知母皂苷 B3苷元部分的碳谱相比，双键的信号消失，在 214.86 出现了一个羰基的信号。 在 HMBC谱 （见图 9) 中， H-20 (¾ 2.80), H-21 (¾ 1.23 ) 以及 H-23 ( 2.93, 2.75 ) 与 214.86 存在远程相关， 顧 -17 ( 1.90) 与 75.93存在远程 相关， 说明羰基位于 C-22位上， 而羟基位于 C-16位上。 另外， 4.85 (Η-Γ) 葡萄端基质 子与 75.19 (C-26)存在远程相关， 确定糖苷化的位置， 即葡萄糖与 26-OH相连成苷。 相 对立体构型由 ROESY谱 （见图 10) 确定， 即 3 0.71 (H-18) 质子与 3 4.29 (H-16) 质子存在 NOE相关， 确定 16-OH是 o(构型。 另夕卜 H-5质子和 H-19质子存在相关， 确定 A环和 B环为顺式 构型。其它 NMR数据及相关关系见表 1、图 11和图 12。该化合物未见文献报道， 为新化合物， 命名为 timosaponin BlII-2 (或简称： ΒΠΙ-2)。

表 1 V - I和式 V - II所示衍生物的 NMR数据

式 V - I 式 V - II

No.

¾ (J in Hz) <5H (J in Hz)

1 1.52 (m),1.88 (m) 30.52 1.58 (m),1.93 (m) 30.47

2 1.92 (m), 1.19 (m) 27.19 1.91 (m),1.33 (m) 27.12

3 4.41 (m) 66.07 4.42 (m) 66.06

4 1.92 (m),1.75 (m) 37.54 1.84 (m)， 1.67 (m) 36.95

5 2.17 (m) 37.08 1.71 (m) 37.00

6 1.39 (m),1.19 (m) 26.65 1.32 (m), 1.18 (m) 26.58

7 1.78 (m),1.62 (m) 28.61 1.75 (m),1.63 (m) 28.59

8 1.38 (m) 35.45 1.36 (m) 35.37

9 1.39 (m) 40.08 1.84 (m) 40.00

10 - 35.49 - 35.42

11 1.35 (m)，U5 (m) 20.97 1.39 (m),1.23 (m) 21.00

12 1.58 (m),1.30 (m) 39.59 1.38 (m)1.30 (m) 40.39

13 - 44.01 - 44.49

14 1.62 (m) 53.36 1.55 (m) 53.71

15 2.0 (m),1.60 (m) 34.37 2.01 (m)，1.56 (m) 34.32

16 4.09 (m) 75.22 4.29 (m) 75.93

17 2.23 (dd,6.4, 10.4) 62.17 1.90 (d, 3.2) 63.39

18 0.76 (s) 14.93 0.71 (s) 13.65

19 1.0 l(s) 24.24 1.03 (s) 24.19

20 2.84 (dq, 6.6， 10.4) 47.09 2.80 (m) 49.34

21 1.49 (d, 6.95) 17.28 1.23 (d, 6.7) 16.78

22 - 214.63 - 214.86

23 2.76 (m) 38.91 2.93 (m),2.75 (m) 38.89

24 2.06 (m),1.92 (m) 27.92 2.06 (m), 1.91 (m) 27.92

25 2.01 (m) 33.56 2.01 (m) 33.56

26 4.33 (m),3.56 (dd,6.3, 9.5) 75.01 4.07 (m, 6.5),3.52 (dd, 9.4) 75.19

27 1.04 (d,6.6) 17.41 1.02 (d, 7.4) 17.44

Γ 4.88 (d, 7.75) 105.10 4.85 (d, 7.7) 105.02

2' 4.09(m) 74.95 4.06 (m) 75.21

3' 4.29(m) 78.58 4.28 (m) 78.50

4' 4.28(m) 71.70 4.27 (m) 71.64

5' 4.0 l(m) 78.63 3.98 (m) 78.58

6' 4.61(brd,11.6),4.44(m) 62.86 4.59 (m),4.42 (m) 62.75 以上述相同的方法， 即可对实施例 5-实施例 10所制得的衍生物进行结构确认。

实施例 12 抗抑郁活性验证

FST和 TST两种行为绝望模型对绝大多数抗抑郁药敏感 ， 操作简单、 快捷， 被广泛 用于该类药物的筛选，本实施例也以此模型对 实施例 1-实施例 10所制得的各种衍生物的 抗抑郁药理作用进行验证。 实验选用雄性 ICR小鼠， 体重 （20 ±2 ) g， 购自中科院上海药物所实验动物中心， 自由摄食饮水， 室温 （23 ± 2) V , 自然光照。 所有小鼠随机分组为 10只 /笼， 于词养环 境中适应 3天后开始实验， 实验前禁食 12小时， 饮水自由。 具体给药方法为： 空白对照 组一组， 给等体积的生理盐水。

FST验证实验

1 ) 具体操作： 连续给药 6天， 末次给药后 1小时进行测试。 首先利用开野法测定小 鼠的自主活动， 即将小鼠单独置于圆柱型玻璃缸内， 计时 4分钟， 记录后 2分钟内的抬臂 次数。然后将小鼠单独放入高 20厘米、直径 14厘米的圆柱型玻璃缸中，缸内水深 10厘米， 水温 23 °C -25 °C。 从小鼠入水后计时 6分钟， 记录后 4分钟内的累计不动时间 （判定不动 标准：小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态， 仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面）。 各组小鼠平行操作。

2) 实验数据处理： 实验结果以均值士标准误 （x± SE) 表示。 采用 t检验进行统计 分析， 判断是否具有显著性意义。 首先对其自主活动指标进行 t检验， 其1> > 0.05说明小 鼠的自主后动没有影响， 以避免中枢兴奋药的干扰。 然后对强迫游泳实验指标进行 t检 验， 判断是否具有抗抑郁作用。

TST验证实验

1 ) 具体操作： 连续给药 6天， 末次给药后 1小时进行测试。 首先利用开野法测定小 鼠的自主活动， 即将小鼠单独置于圆柱型玻璃缸内， 计时 4分钟， 记录后 2分钟内的抬臂 次数。 然后用胶带将小鼠尾在距尾尖 2厘米处粘在横杠上， 四周以板隔离动物视线， 横 杠距地面约 25厘米， 使小鼠距地面约 10厘米， 计时 6min， 记录后 4分钟内累计不动时间， 各组小鼠平行操作。

2) 实验数据处理： 实验结果以均值士标准误 （x± SE) 表示。 采用 t检验进行统计 分析， 判断是否具有显著性意义。 首先对其自主活动指标进行 t检验， 其1> > 0.05说明小 鼠的自主后动没有影响， 以避免中枢兴奋药的干扰。 然后对悬尾实验指标进行 t检验， 判断是否具有抗抑郁作用。

通过动物实验验证本发明制取的衍生物对抗抑 郁的作用， 结果和数据见表 2和表 3。

表 2 腹腔给药对 ICR小鼠强迫游泳不动时间的影响

不动时间±85 (平 化合物 给药剂量（mg/Kg) 动物数 （只）

均值， 秒） 生理盐水 0.1ml/10g 10 182.20±6.82 实施例 1(2-1) 10 10 100.50±6.59* 实施例 1(2-2) 10 10 37.10±5.42** 实施例 2(2-1) 10 10 109.38±11.35* 实施例 2(2-2) 10 10 37.68±11.46* 实施例 3(2-1) 10 10 109.38±11.35* 实施例 3(2-2) 10 10 39.36±12.23* 实施例 4(2-1) 10 10 109.38±11.35* 实施例 4(2-2) 10 10 40.12±9.68* 实施例 5(7-1) 10 10 104.56±9.67* 实施例 5(7-2) 10 10 109.42±10.34* 实施例 6(10-1) 10 10 111.38±7.96* 实施例 6(10-2) 10 10 118.47±9.89* 实施例 7(11-1) 10 10 103.35±9.81* 实施例 7(11-2) 10 10 112.21±8.97* 实施例 8(12-1) 10 10 104.64±9.82* 实施例 8(12-2) 10 10 114.15±9.73* 实施例 9(14-1) 10 10 116.28±10.31* 实施例 9(14-2) 10 10 109.82±11.48* 实施例 10(15-1) 10 10 105.56±9.98*

10 10 109.75±10.31*

" *" 表示 P<0.05 ; " ** ^: " 表示 P<0.01。

表 3 腹腔给药对 ICR小鼠悬尾不动时间的影响 化合物 给麵量 _{( mg} /K _{g )} 动碰 （只） ^{( Ψ} 生理盐水 0.1ml/10g 10 119.90±5.65 实施例 1(2-1) 10 10 59.00±6.33** 实施例 1(2-2) 10 10 33.90±5.71* 实施例 2(2-1) 10 10 73.68±10.61* 实施例 2(2-2) 10 10 75.69±11.36* 实施例 3(2-1) 10 10 69.38±12.35* 实施例 3(2-2) 10 10 66.53±12.57* 实施例 4(2-1) 10 10 69.67±13.62* 实施例 4(2-2) 10 10 71.52±12.61* 实施例 5(7-1) 10 10 74.38±10.79* 实施例 5(7-2) 10 10 78.34±12.47* 实施例 6(10-1) 10 10 72.15±10.46* 实施例 6(10-2) 10 10 68.23±10.82* 实施例 7(11-1) 10 10 69.47±10.37* 实施例 7(11-2) 10 10 72.11±9.95* 实施例 8(12-1) 10 10 78.32±10.85* 实施例 8(12-2) 10 10 79.46±12.27* 实施例 9(14-1) 10 10 71.48±11.38* 实施例 9(14-2) 10 10 62.11±12.45* 实施例 10(15-1) 10 10 69.37±9.96* 实施例 10(15-2) 10 10 73.39±10.34*

" *，， 表示 P<0.05 ; " **，， 表示 P<0.01。

腹腔注射分别给予小鼠 10mg/Kg上述化合物， 另设空白对照组（生理盐水）。对小鼠自 主活动的指标进行 t检验， 无显著差异， 说明这些化合物都对小鼠的自主活动无影响。 分别 对小鼠强迫游泳和悬尾试验的不动时间进行 t检验， 结果表明， 上述呋 烷型皂苷衍生物均 能明显缩短小鼠强迫游泳和悬尾的不动时间， 提示它们具有显著的抗抑郁活性。