BIOTIN ENTHALTENDE GALENISCHE FORMULIERUNG Die Erfindung betrifft topisch anwendbare galenische Formulierungen, die eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harstoffderivaten enthalten und zur kosmetischen oder medizinischen Behandlung von Haut, Haaren und/oder Nägeln, wie z. B. zur Behandlung von Erkrankungen oder Funktions- störungen menschlicher oder tierischer Haut, Haare und/oder Nage) geeignet sind.

Der chemische Name für Biotin ist Hexahydro-2-oxothieno [3,4-d] imidazol- 4-valeriansaure. Seine chemische Struktur entspricht der Formel Die Wirksamkeit von Biotin bei Haut-, Haar-und Nagelerkrankungen wurde in der Vergangenheit unterschiedlich bewertet. Obwohl durch eine kontinuierliche Biotintherapie die Wirksamkeit bei weichen, brüchigen und splitternden Nägeln, unterschiedlichen Formen der Alopezie sowie ato- pischer und seborrhoischer Dermatitis nachweislich aufgezeigt werden konnte, blieb die Anwendung zurückhaltend, da diese trotz keinerlei Nebenwirkungen an die Notwendigkeit eines ausgedehnten Behand- lungszeitraums von mehreren Monaten gebunden ist (R. Bitsch et al.

(1994) Biotin. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart ; V. E. Colombo et al. (1990) Treatment of brittle fingernails and onycho- schizia with biotin : scanning electron microscopy. J. Am. Acad. Dermatol.

23 : 1127-1132 ; G. L. Floersheim (1989) Behandlung brüchiger Fingernägel mit Biotin. Z. Hautkr. 64 : 41-48 ; G. L. Floersheim (1992) Prüfung der Wirkung von Biotin auf Haarausfall und Haarqualität. Z. Hautkr. 67 : 246- 255 ; W. Gehring (1996) Der Einfluß von Biotin bei reduzierter Nagel- qualität. Eine plazebokontrollierte doppelblinde klinische Studie. Akt.

Dermatol. 22 : 20-25 ; U. Siebert et al. (1996) Zur Dosierung und Wirkung

von Biotin bei Nagel-und Haarwachstumsstörungen. Zeitschrift Hautnah 6 : 438-443).

Es ist bekannt, daß topisch applizierte biotinhaltige Formulierungen mit einem Biotingehalt von 0,25 % und 0,50 % zu einer sichtbaren Reduktion der Fältchenausprägung an der Altershaut führen (L. Gilli et al. (1995) Beeinflussung der Fältchenausprägung bei Altershaut durch topisch appliziertes Biotin. Z. Hautkr. 70 (6) : 419-425). Bei diesen Untersuchungen konnten keinerlei epitheliale und histopathologische Veränderungen der behandelten Areale aufgezeigt werden.

Ungeachtet der positiven klinischen Erfahrungen mit Biotin ist die Kenntnis über den Wirkungsmechanismus unvollständig. Der bisherige Wissens- stand weist Biotin als Coenzym einer Reihe von Carboxylasen aus, die in verschiedene lebenswichtige Stoffwechselfunktionen eingebunden sind (R. Bitsch et al. (1994) Biotin. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart). Neben seiner Funktion als Coenzym sind die eigenständigen pharmakologischen Effekte des Biotins, z. B. die Beeinflussung der Keratinstruktur, für den therapeutischen Einsatz von Interesse. Der zugrundeliegende Mechanismus des Einflusses auf das Wachstums-und Differenzierungsverhalten der Keratinozyten wird jedoch kontrovers diskutiert (A. Fritsche (1990) Biotin verändert das Zytokeratinmuster von kultivierten Keratinozyten. tnauguraidissertation, Universität Zürich ; A. Fritsche et al. (1991) Pharmakologische Wirkungen von Biotin auf Epidermiszellen. Schweiz. Arch. Tierheilk. 133 : 277-283 ; A. Limat et al.

(1996) Proliferation and differentiation of cultured human follicular keratinocytes are not influence by biotin. Arch. Dermatol. Res. 288 : 31-38).

Bedingt durch seine hydrophilen Eigenschaften ist Biotin zu den Stoffen zu zählen, für welches das Stratum corneum mit seiner Lipophile und der geringen Hydratation im Normalzustand eine Penetrationsbarriere von besonderer Dimension darstellt.

Für die topische Applikation von Biotin existieren somit besondere galenische Anforderungen.

Somit bestand die Aufgabe, topisch anwendbare galenische Formu- lierungen zur Verfügung zu stellen, die Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen enthalten und zur kosmetischen oder medizinischen Behandlung von Haut, Haaren und/oder Nägeln geeignet sind.

Überraschend wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe durch die Bereit- stellung von galenischen Formulierungen enthaltend a) eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und b) eine oder mehrere Verbindungen ausgewähit aus Harnstoff und Harnstoffderivaten gelöst wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin -die Verwendung von einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und von einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten zur Herstellung einer topisch anwendbaren galenischen Formulierung, -ein Verfahren zur Herstellung einer topisch anwendbaren galenischen Formulierung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch vertraglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus

Harnstoff und Harnstoffderivaten gegebenenfalls mit weiteren Wirkstoffen, Hilfs-und/oder Trägerstoffen in eine geeignete Formulierungsform bringt.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen kann sowohl am Menschen als auch an Tieren erfolgen. Die erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen können sowohl in der Kosmetik als auch in der Human-und in der Veterinärmedizin angewendet werden. Die Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen betreffen die Therapie, Prophylaxe und/oder Metaphylaxe von Hauterkrankungen, von Funktionsstörungen der Haut, von Vorgängen der Hautalterung sowie von trockenen Hautzuständen.

Weiterhin betriffl die Erfindung die Verwendung von a) einer oder mehreren Verbindungen ausgewähit aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und b) einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten zur Herstellung einer topisch anwendbaren galenischen Formulierung -zur Verbesserung der Penetration der Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch unbedenklichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen in tiefere Schichten menschlicher oder tierischer Haut, Schleimhaut und/oder Nagel, -zum Schutz, zur Erhaltung und/oder zum Wiederaufbau der normalen Funktion und Struktur menschlicher oder tierischer Haut und/oder zur Verhinderung umweltbedingter Hautschäden, wie beispielsweise UV- bedingter Hautschäden,

-zur Behandlung von Erkrankungen der Haare, Talg-und/oder Schweiß- drüsen menschlicher oder tierischer Haut und/oder -zur kosmetischen Hautbehandlung, insbesondere zur Hautpflege.

Insbesondere bedeutet z. B."Penetration von Biotin in tiefere Schichten der menschlichen Haut"im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß Biotin durch das Stratum corneum der Human-Haut penetriert. Biotin penetriert ohne einen Penetrationsenhancer nicht bzw. nicht in wirksamer Konzentration durch das Stratum corneum der Human-Haut. Es wurde jedoch z. B. gefunden, dal3 die Penetration von topisch appliziertem Biotin durch das Stratum corneum in die Human-Haut verbessert wird, wenn Biotin mit einem Penetrationsenhancer, vorzugsweise mit Harnstoff und insbesondere bevorzugt mit Harnstoff in einer Emulsion, kombiniert wird.

Es wurde gefunden, daß die Kombination von Biotin mit einem derartigen Penetrationsenhancer beispielsweise die Penetration von Biotin in einer wirksamen Konzentration in die lebende Epidermis ermöglicht.

Als Penetrationsenhancer werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Substanzen bezeichnet, die z. B. die Permeabilität erhöhen bzw. die Penetration der Wirkstoffe am Ort der Anwendung steigern.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen ermöglicht beispielsweise die Penetration von Biotin in ausreichender Konzentration von mindestens 10-5 mol/l zur Behandlung von Erkrankungen der Haare, Talg-und/oder Schweißdrüsen der Haut. Auch die Anwendung der erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen auf Hand-und/oder Fußnägel ermöglicht z. B. die Penetration von Biotin in einer Konzentration von mindestens 105mol/l in die tiefen Nagelanteile und/oder die Nagelmatrix. Üblicherweise wird z. B. etwa 10 min. bis 24 h nach topischer Applikation der erfindungsgemäßen galenischen Formulierung im Stratum spinosum und/oder im Stratum basale der Haut eine Biotinkonzentration erreicht, welche zur Stimulation der epidermalen Lipidsynthese geeignet ist und mindestens 10-5 mol/l beträgt.

Zudem wurde gefunden, daß der Einfluß von Biotin auf die Lipidsynthese konzentrationsabhängig ist. Dieses Ergebnis ist in den Abbildungen 1 bis 4 dargestellt.

Während niedrige Biotinkonzentrationen im Medium (10-mol/l) als unwirksam eingestuft werden können, ließ sich bei höheren <BR> <BR> <BR> Biotinkonzentrationen im Medium (10-"bis 10-3 mol/1) die Lipidsyntheseleistung von Keratinozyten steigern.

Steigerungen der Konzentration an den Fettsäuren Myristinsäure (MA), Palmitinsäure (PA), Stearinsäure (SA) und Olsaure (OA) unter Biotin- einwirkung konnten sowohl in der Kultur von HaCaT-Keratinozyten, als auch bei nativen humanen Keratinozyten nachgewiesen werden. Das Ausbleiben einer Steigerung der Konzentration an Linolsäure (LA) ist in Verbindung mit der Unfähigkeit der Keratinozyten, mehrfach ungesättigte Fettsäuren eigenständig zu synthetisieren, zu betrachten. In den Abbildungen 1 bis 4 sind die Ergebnisse für die Biotineinwirkung auf humane kultivierte HaCaT-Keratinozyten dargestellt.

Weiterhin wurde gefunden, daß die Penetration von Biotin in die humane Haut vehikelabhängig ist, wobei die Penetration aus den W/O-Vehikefn deutlich geringer als die Penetration aus den hydrophileren O/W-Vehikeln ist. Allerdings sind weder Standard-W/O-noch Standard-O/W-Vehikel, die keinen Penetrationshancer enthalten, dazu geeignet, ausreichend hohe epidermale Biotinkonzentrationen für eine Stimulation der Lipidsynthese zu erzielen. Die ungenügende Penetration von Biotin aus einem Standard- O/W-Vehikel, der keinen Penetrationshancer enthält, ist für das Stratum corneum in Abbildung 5 und die Epidermis in Abbildung 6 gezeigt (s.

Werte für ST O/W in den Abbildungen 5 und 6).

Eine Vehikeloptimierung wurde erfindungsgemäß durch die Zugabe von Harnstoff in die Standardvehikel erreicht. Durch die Einarbeitung von Harnstoff in die Standardvehikel resultieren erfindungsgemäße Formu- lierungen, die eine gesteigerte Penetration von Biotin in die humane Haut bewirken. Die Penetrationssteigerung ist im Ausmaß von dem verwen- deten Vehikel abhängig.

Beispielsweise führt die Verwendung einer erfindungsgemäßen O/W- Emulsion mit 10 % Harnstoff bereits nach einer kurzen Einwirkdauer von 30 min. zu einer effektiven epidermalen Biotinkonzentration. Der Effekt war auch nach einer prolongonierten Applikationsdauer von 300 min. nachweisbar. Diese Ergebnisse sind ebenfalls in den Abbildungen 5 und 6 dargestellt (s. Werte für U O/W in den Abbildungen 5 und 6).

Der Vergleich der Biotinkonzentration in der Dermis nach Penetration von Biotin aus einem Standard-O/W-Vehikel (s. Werte für ST O/W) und nach Penetration von Biotin aus einem entsprechenden 10 Gew.-% Harnstoff enthaltenden Vehikel (s. Werte für U O/W) in die humane Haut ex vivo ist in Abbildung 7 dargestellt.

Die Biotinkonzentration in der Dermis nach Penetration von Biotin aus dem 10 Gew. % Harnstoff enthaltenden Vehikel in die humane Haut ex vivo liegt sowohl nach 30 min. als auch nach 300 min. deutlich unter 0,01 nmol/mm3. Die Konzentration von 0,01 nmol/mm3 entspricht der wirksamen Biotinkonzentration von 10-5 mol/I aus Abbildung 2. Dies zeigt, daß durch die topische Applikation von erfindungsgemäßen Formulierungen, die Harnstoff enthalten, die Penetration von Biotin durch das Stratum corneum in vorteilhafter Weise so gesteuert werden kann, daß die wirksame Biotinkonzentration in der Epidermis überschritten wird, aber in der Dermis unterschritten bleibt (s. Abbildungen 6 und 7).

In der US 5,166,168 werden topisch anwendbare Formulierungen beschrieben, die Biotin oder ein pharmazeutisch unbedenkliches Salz von Biotin enthalten und zur Behandlung von Nagelkrankheiten geeignet sind.

Diese Formulierungen können Penetrationsenhancer in einer effektiven Menge enthalten, beispielsweise Menthol, Propylenglykol, Dimethyl- sulfoxid, Dimethylacetamid, Dimethylformamid und Azon. Es gibt jedoch keinen Hinweis auf Harnstoff oder Harnstoffderivate als Penetrationsenhancer.

Die Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser

Verbindungen können in den galenischen Zubereitungen z. B. als optische Isomere, Diastereomere oder Racemate vorliegen.

Die Biotinester sind durch folgende generische Strukturformel gekenn- zeichnet : Erfindungsgemäß bedeutet R eine verzweigte oder unverzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 18 C-Atomen oder eine verzweigte oder unverzweigte Alkenylgruppe mit 1 bis 18 C-Atomen. Bevorzugte Biotinester sind diejenigen, in denen R Methyl oder Ethyl darstellt.

Unter den Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträg- lichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen ist Biotin bevorzugt, insbesondere D-cis-Hexahydro- 2-oxothieno [3,4-d] imidazol-4-valeriansäure der Formel Biotin kann in der Form jedes bekannten pharmazeutisch unbedenklichen Salzes in den erfindungsgemäßen Formulierungen verwendet werden.

Bevorzugte physiologisch verträgliche Salze von Biotin sind beispielsweise Alkali-, Erdalkali-oder Ammoniumsalze, wie Na-, K-, Mg-oder Ca-Salze, sowie Salze abgeleitet von organischen Basen wie z. B. Ethylamin, Triethylamin, Ethanolamin, Diethylaminoethanol, Ethylendiamin, Piperidin, Morpholin, 2-Piperidinoethanol, Benzylamin und Procain.

Geeignete Harnstoffderivate sind beispielsweise solche, die nach Spaltung Harnstoff freisetzen. Unter den Harnstoffderivaten ist Allantoin bevorzugt.

Unter den Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und den Harnstoff- derivaten ist Harnstoff bevorzugt.

Unter den erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen sind somit diejenigen bevorzugt, die Biotin und/oder Harnstoff enthalten.

Die Verbindungen ausgewähit aus Harnstoff und Harnstoffderivaten können in unterschiedlichen galenischen Formulierungen, wie z. B. in O/W- oder W/O-Emulsionen, eingearbeitet sein. Vorzugsweise ist Harnstoff in O/W-Emulsionen eingearbeitet.

Die Herstellung der galenischen Formulierung erfolgt, indem eine oder mehrere Verbindungen ausgewähtt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und eine oder mehrere Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten gegebenenfalls mit Hilfs- und/oder Trägerstoffen in eine geeignete Formulierungsform gebracht werden. Die Hilfs-und Trägerstoffe stammen aus der Gruppe der Trägermittel, Konservierungsstoffe und anderer üblicher Hilfsstoffe.

Die galenischen Formulierungen auf der Grundlage einer oder mehrerer Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehrerer Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten werden äußerlich angewendet.

Als Anwendungsform seien z. B. genannt : Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Pasten, Salben, Gele, Cremes, Lotionen, Lacke, Puder, Seifen, tensidhaltige Reinigungspräparate, Ole und Sprays. Zusätzlich zu einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physio- logisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehrerer Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten werden der Formulierung beliebige übliche Trägerstoffe, Hilfsstoffe und gegebenenfalls weitere Wirkstoffe zugesetzt.

Die gegebenenfalls in den erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen enthaltenen Hilfsstoffe und Wirkstoffe können sowohl hydrophiler als aus lipophiler Art sein.

Vorzuziehende Hilfsstoffe stammen aus der Gruppe der Konservie- rungsstoffe, Antioxidantien, Stabiiisatoren, Lösungsvermittler, Vitamine, Färbemittel, Geruchsverbesserer.

Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben einer oder mehreren Verbindungen ausgewähtt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehrerer Verbindungen ausgewähit aus Harnstoff und Harnstoffderivaten die üblichen Trägerstoffe enthalten, z. B. tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Traganth, Cellulosederivate, Polyethylenglykole, Silicone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.

Puder und Sprays können neben einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten die übtichen Trägerstoffe enthalten, z. B.

Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polyamid-Pulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel, z. B. Chlorfluorkohlenwasserstoffe, Propan/Butan oder Dimethylether, enthalten.

Lösungen und Emulsionen können neben einer oder mehreren Ver- bindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehrerer Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, z. B. Wasser, Ethanol, Isopropanol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylglykol, Ole, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnußöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Rizinusöl und Sesamöl, Glycerin-

fettsäureester, Polyethylenglykole und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthaiten.

Suspensionen können neben einer oder mehreren Verbindungen aus- gewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehrerer Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten die üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, z. B. Wasser, Ethanol oder Propylenglykol, Suspendiermittel, z. B. ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylen- sorbitester und Polyoxyethylensorbitanester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Traganth oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Seifen können neben einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehrerer Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten die üblichen Trägerstoffe wie Alkalisalze von Fettsäuren, Salze von Fettsäurehalbestern, Fettsäureeiweißhydrolysaten, Isothionate, Lanolin, Fettalkohol, Pflanzenöle, Pflanzenextrakte, Glycerin, Zucker oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Tensidhaltige Reinigungsprodukte können neben einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehrerer Verbindungen ausgewähtt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten die üblichen Trägerstoffe wie Salze von Fettalkoholsulfaten, Fettalkoholethersulfaten, Sulfobernsteinsäure- halbestern, Fettsäureeiweißhydrolysaten, Isothionate, Imidazolinium- derivate, Methyltaurate, Sarkosinate, Fettsäureamidethersulfate, Alkyl- amidobetaine, Fettalkohole, Fettsäureglyceride, Fettsäurediethanolamide, pflanzliche und synthetische Öle, Lanolinderivate, ethoxylierte Glycerin- fettsäureester oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Gesichts-und Körperöle können neben einer oder mehrerer Verbindungen ausgewählt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten die üblichen Trägerstoffe wie synthetische Öle wie Fettsäureester, Fettalkohole, Silikonöle, natürliche Ole wie Pflanzenöle und 6lige Pflanzenauszüge, Paraffinöle, Lanolinöle oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Vorzugsweise liegen die Verbindungen ausgewähit aus Biotin, den physio- logisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen, die Penetrationsenhancer bzw.-promotoren und/oder die Hilfsstoffe in den erfindungsgemäßen galenischen Formulierungen in kolloidalen Trägersystemen eingearbeitet vor, insbesondere liegen sie in Nanopartikeln, Liposomen oder Mikroemulsionen eingearbeitet vor.

Weitere typisch galenische Anwendungsformen sind auch Lippenstifte, Lippenpflegestifte, Mascara, Eyeliner, Lidschatten, Rouge, Puder-, Emulsions-und Wachs-Make up sowie Sonnenschutz-, Prä-Sun-und After-Sun-Präparate.

Bevorzugte Anwendungsformen sind Pasten, Salben, Cremes, Emulsionen, Gele und Lacke. Hierbei liegt die erfindungsgemäße galenische Formulierung besonders bevorzugt als O/W-Emulsion vor. Die Applikation auf Hand-und/oder Fußnägel erfolgt vorzugsweise als Lack.

Der Anteil an der oder an den Verbindungen ausgewähtt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen in der erfindungsgemäßen galenischen Formulierung beträgt vorzugsweise von 0,05 bis 5 Gew. % bezogen auf die gesamte galenische Formulierung.

Der Anteil an der oder an den Verbindungen ausgewähit aus Harnstoff und Harnstoffderivaten in der erfindungsgemäßen galenischen Formulierung

beträgt vorzugsweise von 1 bis 40 Gew. % bezogen auf die gesamte galenische Formulierung.

Vorzugsweise enthalten die galenischen Formulierungen neben einer oder mehreren Verbindungen ausgewähtt aus Biotin, den physiologisch verträglichen Salzen von Biotin, Biotinestern und den stereoisomeren Formen dieser Verbindungen und einer oder mehreren Verbindungen ausgewählt aus Harnstoff und Harnstoffderivaten eine oder mehrere Substanzen mit Radikalfängereigenschaften, insbesondere Vitamin E, Vitamin C und/oder deren Ester. Der Anteil an der oder an den Verbindungen mit Radikalfängereigenschaften beträgt vorzugsweise von 0,01 bis 30 Gew. %, besonders bevorzugt von 1 bis 30 Gew. % bezogen auf die gesamte galenische Formulierung.

Alle Verbindungen oder Komponenten, die in den galenischen Formu- lierungen verwendet werden können, sind entweder bekannt und käuflich erwerbbar oder können nach bekannten Methoden synthetisiert werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Verdeutlichung der Erfindung und sind keinesfalls als Limitierung aufzufassen. Alle %-Angaben sind, soweit nichts anderes angegeben ist, Gewichtsprozent.

Folgende Verbindungen oder Komponenten wurden in den Beispielen 1 und 2 verwendet : Biotin Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD '4C-Biotin (spez. Akt. 55 Amersham-Buchler GmbH, mCi/mmol) Braunschweig, BRD Chloroform reinst p. a. Merck KGaA, Darmstadt, BRD Harnstoff Merck KGaA, Darmstadt, BRD Kohlendioxidgas Messer Griesheim, Leipzig, BRD Lanette N Universitätsapotheke der Martin- Luther-Universität Halle Wittenberg Methanol reinst p. a. Laborchemie Apolda GmbH, BRD Methanol gradient grade für die Merck KGaA, Darmstadt, BRD HPLC

Natriumchlorid (NaCI) reinst p. a. Merck KGaA, Darmstadt, BRD Paraffinum subliquidum Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD POPOP Canberra Packard GmbH, Dreieich, BRD PPO Canberra Packard GmbH, Dreieich, BRD Protein Assay Kit P5656 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, BRD Serum free keratinocyte medium (inklusive Gibco BRL Life Technologies GmbH, Eggenstein, rEGF+BPE) BRD Soluene 350 Canberra Packard GmbH, Dreieich, BRD Tesafilm Beiersdorf AG, Hamburg, BRD Toluol Merck-Schuchardt, Hohenbrunn, BRD Trimethylsulfoniumhydroxid Macherey Nagel GmbH, Düren, BRD Vaselinum album Carl Roth GmbH, Karlsruhe, BRD Die INCI-Namen verwendeter Rohstoffe sind wie folgt : Rohstoff INCI Lancettes N Emuigierender Cetylstearylalkohol DAB 10 Paraffin Minera ! öt Arlamol HD Isohexadecan Mirasil DM 350 Dimethicon Lanettes O Cetearylalkohol Span 60 Sorbitanstearat Montanov 68 Cetearylalkohol (und) Cetearylglukosid Rhodicare S Xanthan Gum Arlacel 165 V Glycerylstearat (und) PEG-100 Stearat Germaben II-E Propylenglykol (und) Diazolidinylharnstoff (und) Methylparaben (und) Propylparaben Isolan PDI Diisostearoyl Polyglyceryl-3 Diisostearat Cutina HR Pulver Hydriertes Castoröl

Folgende Geräte und Hilfsmittel wurden in den Beispielen verwendet : Absorptionsreader Labsystems, iEMS, Merlin, Bornheim- Hersel, BRD Biopsiestanzen Stiefel Laboratorium GmbH, Offenbach, BRD Flüssigkeitszintillationszähier Wallac 1410, Berthold, Berlin, BRD Franz-Diffusionszelle Crown Glass Company, Sommerville, New Jersey, USA mit Wasserbad Thermostat B3-DC1, Haake, Karlsruhe, BRD GC-Anlage Finnigan MAT Magnum, GC-Varian 3400, Finnigan-MAT, Bremen, BRD GC-Kapillarsäule FFAP, Macherey-Nagel, Düren oder Fisher Scientific, Nidderau, BRD Gefriermikrotom Mikrotom-Modell 1206, Frigomobil Reichert-Jung, Heidelberg-Nuilloch, BRD Gewebe-Kulturflaschen Greiner GmbH, Frickenhausen, BRD HaCaT-Keratiozyten Deutsches Krebsforschungsinstitut Heidelberg, BRD Präzisionswaagen Typ 870-13, Gottl. Kern & Sohn, Albstadt 1, BRD Sterilfilter Nalgene 0,2 um Nalge-Company, Worcester, USA Szintillationsmeßgefäße Pony Vial, Pico Glass Vial, Econo Glass Vial, Canberra Packard GmbH, Dreieich, BRD Vakuumrotationsverdampfer Rotivapor RE 111, Laboratoriums- technik Buchli, Flawil, Schweiz Mit Wasserbad Buchli 461, Laboratoriumstechnik Buchli, Flawil, Schweiz

Der in den Beispielen 1 und 2 verwendete Puffer nach Mc lloaine entspricht der Pufferlösung ohne Biotin aus den Beispielen 4 und 5 und wird wie folgt hergestellt : 86 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat- monohydrat-Lösung wird mit 14 ml 0,1 M Zitronensäuremonohydrat- Lösung vermischt (pH : 7,2).

Beispiel 1 Untersuchungen zum Lipidgehalt von humanen Keratinozyten Durchführung der Untersuchungen zum Lipidstoffwechsel : HaCaT-Zellen (human adult low calcium high temperature keratinocytes) und native humane Keratinozyten werden in Gibco's Keratinocyte Serum Free Medium (SFM) unter Zusatz von BPE (25 llg/ml Rinderhypophysenextrakt) und rEGF (0,1-0,2 ng/ml, rekombinanter Epidermaler Wachstumsfaktor) in 5% iger C02-Atmosphäre (pH 7,2-7,4) bei 36,6 °C im low calcium-Status (0,09 mM) in Kulturflaschen (1 Million Zellen/20 ml SFM) kultiviert und am 3. Tag nach Einsaat mit der Biotinlösung (Biotin gelöst in Puffer nach Mc lloaine ; Mediumkonzentration <BR> <BR> 10-'-10-3 mol/I und Lösungsmittelkontrolle) versetzt. Am 6. Tag erfolgt das Ernten der konfluenten Monolayer und die Probenvorbereitung, wobei einzelne Pellets zu je 3 Millionen Zellen für die Lipidextraktion sowie für die Proteinbestimmung verwendet werden.

Durchführung der Lipidextraktion : Die Extraktion der Zellen erfolgt in Aniehnung an die Lipidextraktion von Bligh und Dyer (B. E. Bligh et al. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 : 911-917). Dazu wird das Zellpellet mit 20 ml eines Lösungsmittelgemisches versetzt (Chloroform : Methanol = 2 : 1), unter Rühren homogenisiert und 30 min. im Dunkeln unter Schütteln extrahiert. Anschließend wird über einen Sterilfilter filtriert und der Extrakt am Vakuumrotationsverdampfer einge- engt. Der Lipidfilm wird in 4 ml Methanol (gradient grade für die HPLC) aufgenommen und via GC-MS analysiert.

Analytik der Fettsäuren mittis GC-MS : Die extrahierten Lipide der Keratinozyten werden als methanolische Lösungen via GC-MS analysiert, um die darin enthaltenen Fettsäuren zu quantifizieren. 100 pI der Lösung werden mit je 1 J 0,2 M Trimethylsulfioniumhydroxid zu Methylestern umgesetzt, um die Verdampfbarkeit zu verbessern.

Gerät Finnigan MAT Magnum, GC-Varian 3400 Autosampler Finnigan MAT A 200 S Detektor (MS) lontrap lonisierung Elektronenstoß 70 eV Kapillarsäule FFAP, 25 m x 0,25 mm x 0,25 um, mit 10 m unbelegter Vorsäule Injektionsart splitless, Splitventiiöffnung nach 1 min Injektionstemperatur 250 °C Temperaturprogramm 60-160 °C : 15 °C/min 160-240 °C : 25 °C/min Quellentemperatur 220 °C Trägergas Helium, Vordruck 13 psi Flußrate 40 cm/min Kalibrierung Externer Standard (Konzentrationen : 0,02-10 ug/ml) Bestimmung des Proteingehaltes : Der Proteingehalt der Zellen wird mit dem Protein Assay Kit nach der Lowry-Methode bestimmt. Nach der Präparation laut Vorschrift zum Kit (P 5656) erfolgte die Messung am Absorptionsreader bei 690 nm.

Die Ergebnisse des Einflusses von Biotin auf den Fettsäuregehalt von HaCaT-Keratinozyten sind für verschiedene Konzentrationen von Biotin (gelöst in Puffer nach Mc lloaine) in den Abbildungen 1 bis 4 dargestellt.

Als Kontrolle ist in den Abbildungen 1 bis 4 zudem der Fettsäuregehatt der HaCaT-Keratinozyten nach entsprechender Einwirkung des Puffers ohne Biotin dargestellt. Die Gehalte der Fettsäuren Myristinsäure (MA),

Palmitinsäure (PA), Stearinsäure (SA), Otsäure (OS) und Linolsäure (LA) sind bezogen auf den Proteingehalt der Zellen dargestellt.

Beispiel 2 Penetrationsuntersuchungen an humaner Haut ex vivo Modellbeschreibung und Versuchsbedingungen : Zur Charakterisierung des Penetrationsverhaltens von Biotin aus unterschiedlichen Emulsionen in humane exzidierte Haut, wird als in vitro- Modell die FRANZ'sche Diffusionszelle gewähit. Die Auswahl des Modells stützt sich auf die Erfahrungen der Autoren, die korrelierende Ergebnisse zwischen den in vitro-Daten des Modells und den in vivo-Resultaten feststellen konnten (R. J. Feldmann, et al. (1970) : Absorption of some organic compounds through the skin in man. J. Invest. Dermatol. 54 : 399-404 ; T. J. Franz (1975) : Percutaneous absorption. On the relevance of in vitro data. J. Invest. Dermatol. 64 : 190-195).

Der Grundkörper der FRANZ'schen Diffusionszelle besteht aus einem doppelwandigen, temperierbaren Glasteil. Darin befindet sich die durch Rühren ständig im homogenen Zustand gehaltene Akzeptorflüssigkeit. Im direkten Kontakt zum Akzeptor liegt das Probenmaterial auf einer Gaze, die durch einen Glasring und eine Metallklammer stabilisiert wird. Eine Glasbedeckung fungiert als Verdunstungsschutz zur Einhaltung weitgehend konstanter Hydratationsbedingungen während des U ntersuchungszeitraumes.

Durch den Einsatz von Wasser als Akzeptormedium werden bei der einmaligen Applikation der zu untersuchenden Vehikel sink-Bedingungen für den hydrophilen Wirkstoff realisiert. Zur Standardisierung der Versuchsbedingungen kann auf Probandenmaterial mit geringer Schwankung des Alters zurückgegriffen werden.

Um Informationen über das Penetrationsausmaß des Wirkstoffes im Kurzzeit-als auch im Langzeitbereich zu erhalten, erfolgt die Datenaufnahme nach Einwirkzeiten von 30 und 300 min.

Aus folgenden Komponenten wird eine erfindungsgemäße O/W-Emulsion (wasserhaltige hydrophile Salbe) enthaltend Biotin und Harnstoff hergestellt : Gew.-% B Lanette N (1) 9.0 Paraffinum subliquidum (2) 10.5 Vaselinum album (2) 10.5 A Wasser, demineralisiert und ad 100 Puffer nach Mc lloaine (Gew.-Verhaltnis = 50 : 50) Biotin (2) 0.1 Harnstoff (3) 10.0 Herstellung : Der Wirkstoff Biotin wird zunächst im Puffer nach Mc Iloaine gelöst und zusammen mit dem Harnstoff (trifft nur bei der harnstoffhaltigen erfindungsgemäß. en Formutierung zu) in demineralisiertem Wasser verteilt.

Anschließend erfolgt die anteilmäßige Einarbeitung der Wasserphase B in die aufgeschmolzene lipohile Phase A der restlichen Bestandteile der Emulsion. Das System wird bis zum Erkalten gerührt.

Bezugsquellen : (1) Universitätsapotheke der Martin-Luther-Universität Halle- Wittenberg (2) Carl Roth GmbH, Karlsruhe (3) Merck KGaA, Darmstadt Präparation des biologischen Materials : Die für die Penetrationsstudien verwendeten Hautpräparate stammen von Mammareduktionsplastiken. Das Untersuchungsmaterial wird innerhalb von 2 h-4 h nach der Operation aufgearbeitet. Dazu erfolgt zunächst die Säuberung mit isotonischer NaCI-Lösung. Es schließt sich das

mechanische Entfernen des subkutanen Fettgewebes und die Herstellung runder Stücke mit Hilfe eines Locheisens (d = 2 cm) an, so daß danach einzeln in Aluminiumfolie verpackte Präparate bei-20 °C im Tiefkühischrank für maximal drei Monate gelagert werden können.

Das Alter der Probandinnen lag zwischen 17 und 53 Jahren, wobei bei der Versuchsplanung aus Standardisierungsgründen versucht wird, weitgehend auf altersgleiche Haut zurückzugreifen.

Versuche mit radioaktiv markierten Substanzen : Zirka 30 min. vor Versuchsbeginn werden die FRANZ'schen Diffusionszellen mit dem Akzeptormedium Wasser gefüllt und auf 32 °C temperiert. Unmittelbar vor der Vehikelapplikation wird diese mit dem in Ethanol gelösten Tracer'4C-Biotin (5 uCi) versetzt. Dabei ist Wert auf homogene Vermischung mit der unmarkierten Zubereitung sowie auf die vollständige Verdunstung des Lösungsmittels zu legen. Anschließend erfolgt der homogene Antrag von ca. 20 mg Emulsion auf der gesamten Epidermisfläche eines aufgetauten und mit einem Watteträger vom Gefrierwasser getrockneten Hautstückes. Unmittelbar nach der Vehikelapplikation wird dieses auf eine Gaze gelegt und in der Diffusionszelle fixiert.

Nach Ablauf der Versuchszeiten von 30 min. und 300 min. wird die Haut dem Modell entnommen und der Formulierungsrückstand vorsichtig mit Watteträgern entfernt. Die weitere Aufarbeitung erfordert die Fixierng des Untersuchungsmateriais mit Stecknadeln an der Peripherie auf einer mit Aluminiumfolie bespannten Polystyrenunterlage. Unter Zuhilfenahme einer Schablone kann das Stratum corneum reproduzierbar auf einer Kreisfläche (d = 1,6 cm) durch 20 Tesafilmabrisse vollständig eliminiert werden. Dessen quantitative Bestimmung erfolgt in paarweise Fraktionierung der Abrisse (10 x 2). Aus der lebenden Haut werden je drei Stanzbiopsien (d = 0,6 cm) entnommen, die zur Anfertigung von Horizontalschnitten (8 x 20 um-Epidermis, 30 x 40 um-Dermis) an einem Gefriermikrotom dienen. Für die Quantifizierung der Proben werden <BR> <BR> <BR> diese mit Methanol und Szintillator [4,0 g PPO (2,5-Diphenyloxazol) und<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 0,1 g POPOP 1,4-Di-2- (5-phenyloxazolyi)-benzen in 1,0 1 Toluol)] versetzt,

wobei zuvor die Epidermis-und Dermisschnitte sowie die Stanzenreste zur vollstandigen Zersetzung des Gewebes über Nacht in 100 NI bzw. 1 ml Soluene im Szintillationsmeßgefäß belassen werden. Im Anschluß daran werden die Proben unter Mitführung zweier Leerwerte im Flüssigkeitsszintillationszähler vermessen.

Die Ergebnisse für die Penetration von Biotin aus der erfindungsgemäßen O/W-Salbe dieses Beispiels enthaltend 10 Gew. % Harnstoff (s. Werte für U O/W) sind für Einwirkzeiten von 30 min. und 300 min. in Abbildung 5 für das Stratum corneum, in Abbildung 6 für die Epidermis und in Abbildung 7 für die Dermis dargestellt. Als Vergleich sind in den Abbildungen 5 bis 7 zudem die Ergebnisse für die Penetration von Biotin aus einer entsprechend der erfindungsgemäßen O/W-Salbe hergestellten Salbe, in der jedoch Harnstoff durch eine Lösung bestehend aus 50 Gew. % demineralisiertem Wasser und 50 Gew. % Puffer nach Mc Iloaine ersetzt ist (s. Werte für ST O/W), dargestellt. Die Ergebnisse sind als Konzentration (nmol Biotin pro mm3 Stratum corneum, Epidermis oder Dermis) dargestellt.

Beispiel 3 Aus folgenden Komponenten wird eine erfindungsgemäße Hand-und Nagelcreme enthaltend Biotin und Harnstoff hergestellt : Gew.-% A Paraffin (Art.-Nr. 107162) (1) 2.0 Arlamol HD (2) 2.0 Isopropylpalmitat (3) 3.0 Sojaöl (4) 0.5 Mirasil DM 350 (5) 1.0 Lanette O (3) 1.0 Span 60 (2) 1.5 Montanov 68 (6) 4.0 (-)-a-Bisabolol (Art.-Nr. 130170) (1) 0.3

B Wasser, demineralisiert ad 100 Glycerin, 87% ig (Art.-Nr. 104091) (1) 10.0 D-Panthenol (7) 0.5 D- (+)-Biotin (Art.-Nr. 130220) (1) 0.05 Harnstoff (1) 10.0 Konservierungsmittel q. s.

C Rhodicare (5) 0.3 D Parfüm Bianca (8) 0.2 Als Konservierungsmittel können 0.05 % Propyl-4-hydroxybenzoat (Art.-Nr. 107427), 0.15 % Methyl-4-hydroxybenzoat (Art.-Nr. 106757) oder 0.30 % Germall 115 (ISP, Frechen) verwendet werden.

Herstellung : Die vereinigten Phasen A und B werden getrennt auf 75 °C erhitzt. Danach wird die Phase C bei 75 °C unter Rühren langsam zur Phase B gegeben und gerührt bis eine homogene Mischung entsteht. Anschließend wird Phase A zugegeben und bis zur Homogenität gerührt. Es wird unter Rühren abkühlen gelassen und das Parfüm bei ca. 35 °C zugegeben.

Bezugsquellen : (1) Merck KGaA, Darmstadt (2) ICI Surfactants, Essen (3) Henkel KGaA, Düsseldorf (4) Gustav Heess, Stuttgart (5) Rhodia, Frankfurt (6) Seppic, Frankreich (7) BASF AG, Ludwigshafen (8) H&R, Holzminden

Beispiel 4 Aus folgenden Komponenten wird eine erfindungsgemäße O/W-Emulsion enthaltend Biotin und Harnstoff hergestelit : Gew.-% A Paraffin, dickflüssig (1) 8.0 Isopropylmyristat (1) 7.0 Lanette O (2) 3.0 Arlacel 165 V (3) 5.0 B Wasser, demineralisiert ad 100 Glycerin, 87% ig (1) 3.0 Harnstoff (1) 10.0 Biotinpufferlösung (1 % ig) (1) 10.0 Germaben II-E (4) 0.5 Herstellung : Die vereinigten Phasen A und B werden getrennt auf 75 °C erhitzt. Danach wird die Phase A unter Rühren langsam zur Phase B gegeben und die resultierende Emulsion homogenisiert. Anschließend wird unter Rühren auf 30 °C abkühlen gelassen.

Bezugsquellen : (1) Merck KGaA, Darmstadt (2) Henkel KGaA, Düsseldorf (3) ICI (4) ISP

Beispiel 5 Aus folgenden Komponenten wird eine erfindungsgemäße W/O-Emulsion enthaltend Biotin und Harnstoff hergestellt : Gew.-% A Isolan PDI (2) 3.0 Paraffinöl, flüssig (1) 17.0 Isopropylmyristat (1) 5.0 Wachs, gebleicht (1) 0.2 Cutina HR Pulver (3) 0.3 B Wasser, demineralisiert ad 100 Glycerin, 87% ig (1) 4.0 Harnstoff (1) 10.0 Biotinpufferlösung (1 % ig) (1) 10.0 Magnesiumsulfat-Hepta- (1) 0.5 hydrat Germaben II-E (4) 0.5 Herstellung : Die vereinigten Phasen A und B werden getrennt auf 75 °C erhitzt. Danach wird die Phase B unter Rühren langsam zur Phase A gegeben und homogenisiert. Anschließend wird unter Rühren auf Raumtemperatur abkühlen gelassen.

Bezugsquellen : (1) Merck KGaA, Darmstadt (2) Th. Goldschmidt (3) Henkel KGaA, Düsseldorf (4) ISP