CONSTRUÇÃO GÊNICA, USO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER E PROCESSO PARA SUA PREPARAÇÃO

Criação e Campo da Invenção

[0001] O presente relatório contempla conhecimentos, informações e/ou dados confidenciais utilizáveis na indústria, comércio ou prestação de serviços, para os quais o detentor requer: a proteção estabelecida no inciso XXIX do Art. 5 ^Q da Constituição Federal; a manutenção do status jurídico de confidencialidade/segredo; a manutenção do status físico de confidencialidade/segredo pelo tempo previsto na Lei 9.279/96, Lei da Propriedade Industrial; e os direitos previstos no Art. 195 da Lei 9.279/96.

[0002] A criação industrial ora descrita compreende uma invenção passível de proteção patentária. A referida invenção situa-se nos campos da Biotecnologia, Ciências Farmacêuticas e Medicina. Mais especificamente, a presente invenção é relacionada ao uso de um grupo ou classe específica de fitocistatinas de origem vegetal para o tratamento de câncer, bem como uma composição farmacêutica compreendendo a mesma.

Antecedentes da Criação/Invenção

[0003] Legumaínas são encontradas primariamente localizadas em lisossomos de mamíferos, mas também já foram encontradas em associação com a matriz extracelular. Endogenamente, as legumaínas podem ser inibidas pelas cistatinas; entretanto, as cistatinas animais inibem adicionalmente algumas proteases da classe das catepsinas, não tendo assim uma atividade restrita a uma única família de proteinases cisteínica específica.

[0004] A presente invenção proporciona o uso de uma fitocistatina de origem vegetal para o tratamento de câncer, bem como uma composição farmacêutica compreendendo a mesma, para o tratamento curativo ou profilático de tumores e/ou a inibição de metástases em mamíferos ou outros vertebrados. Em uma concretização, a composição da invenção compreende um polipeptídeo compreendendo somente a região C-terminal de uma ou mais fitocistatina(s) com massa protéica superior a 15 kDaltons. Em outra concretização, a composição da invenção compreende uma construção gênica para a expressão in vivo do referido polipeptídeo.

[0005] Legumaínas são proteases císteínícas pertencentes à família C13 (EC 3,4.22,34), também conhecidas como asparaginil endopeptidases (AEP), devido ao seu mecanismo de ação associado ao reconhecimento e clivagem de sítios de asparagina (Asn) nas proteínas-alvo (Abe et al. 1993). Estas proteases são amplamente distribuídas e evolutivamente conservadas entre plantas e animais (Chen et al. 1997; Christoff et al, 2014). Em animais, as legumaínas correspondem às únicas AEP conhecidas e apresentam uma similaridade estrutural às caspases, além da capacidade de, em algumas situações, clivar ligações peptídicas após resíduos de ácido aspártico (Halfon et al. 1998)(DalI and Brandstetter 2013). Primariamente localizadas em lisossomos, as legumaínas passam por um processo de auto-ativação catalítica em pH ácido, para a remoção dos pro-peptídeos amino e carboxi-terminais (Li et al. 2003), a fim de tornarem-se ativas.

[0008] Embora as legumaínas de mamíferos sejam localizadas majoritariamente em lisossomos, elas também podem ser translocadas para outros compartimentos celulares como o núcleo (Haugen et al. 2013), ou ainda, secretarias em microambientes de tumores, interagindo com integrinas de membrana (Liu et al. 2012)(Liu et al. 2003). No ambiente extracelular, as legumaínas atuam degradando fibronectinas (Monta et a!. 2007) e ativando outras proteases como a gelatínase A, componentes importantes para a mediação da degradação da matriz extracelular (Liu et al. 2003).

[0007] Diversos estudos apontam para a alta expressão e atividade das legumaínas em tecidos tumorais de mamíferos, como carcinomas mamários, carcinomas de cólon, neoplasias do sistema nervoso central e tumores de próstata, estando estas proteases fracamente expressas em tecidos normais (Liu et al. 2003). Estes dados inclusive podem ser verificados no atlas de proteínas humanas (Uhlen et al. 2010), onde a expressão gênica das legumaínas pode ser detectada em níveis médios e altos em várias linhagens celulares cancerosas. As legumaínas também podem ser encontradas em células de macrófagos associados com o ambiente do tumor, ou em macrófagos primários, sendo que sua atividade aumenta quando há exposição a citocinas inflamatórias ou células tumorais (Edgington et al. 2013).

[0008] Em tecidos de câncer de mama invasivo há uma prevalência da expressão de legumaínas (Gawenda et al. 2007), também interagindo com integrinas de membrana das células cancerosas (Liu et al. 2012) e desempenhando papel de enzima oncogênica chave para a manutenção da proliferação e metástase do câncer de mama (Lin et al. 2014) (D'Cosía et al. 2014).

[0009] Em tipos de câncer colorretal, a expressão das legumaínas está aumentada e tem sido positivamente correlacionada com a diferenciação do carcinoma (Murthy et al. 2005), além de uma associação com o desenvolvimento de metástases e sobrevivência (Haugen et al. 2014). Legumaínas também estão positivamente correlacionadas com o aumento da malignidade de tumores de ovário, que apresentam um aumento da migração e invasão celular (Wang et al. 2012), além de também estarem relacionadas com o subgrupo de alto risco de HPV (Sandberg et al. 2012). Foi verificado que tumores de próstata mais agressivos e invasivos apresentam altos níveis de legumaínas (Ohno et al. 2013), assim como tumores gástricos com metástases (Guo et al. 2013) (Li et al. 2013).

[0010] A maioria dos estudos mencionados correlaciona o aumento da expressão de legumaínas com um pior prognóstico de sobrevida dos pacientes, além de sugerir a utilização destas proteases como um biomarcador para identificação destes tipos de câncer.

[0011] Mais recentemente, alguns grupos vêm estudando a utilização das legumaínas como biomarcadores para diagnóstico de doenças relacionadas com estas proteases (Yuan ei a/., 2015). Além de demonstrar a possibilidade de utlíiização das legumainas como alvos para o direcionamento de fármacos, tratamento e combate da doença (Liu et a/., 2015). O desenvolvimento de miceias contendo legumainas e outros fármacos foi recentemente proposto como método de direcionamento no organismo, para a entrega de fármacos e combate local da doença (Lin et ai, 2015).

[0012] Já foi demonstrado que tanto a auto-ativação quanto a atívidade das legumainas pode ser regulada por inibidores de proteases cisteínicas, como as cistatinas C, E/M e F em mamíferos. Entretanto, as legumainas não são o alvo exclusivo destas cistatinas, elas também possuem um domínio capaz de inibir algumas proteases cisteínicas do tipo papaínas (catepsinas) (Abrahamson 1997)(Aivarez-Fernandez et al. 1999)(Cheng et ai. 2006). Estudos de um dos presentes inventores (Christoff AP, 2015 Tese de Doutorado) confirmaram que algumas cistatinas de plantas (fitocistatinas) possuem um domínio exclusivo na região C-terminal da proteína capaz de inibir especificamente as legumainas de plantas, em adição à capacidade inibitória já descrita em ensaios in vitro, contra a legumaína de humanos (Martinez et al. 2007) e, sem inibir a atividade das proteases da família C1 A, do tipo papaínas/catepsinas. Mais recentemente, Christoff em seu estudo de tese de doutorado (Christoff AP, 2015) demonstrou as relações entre as fitocistatinas e especificamente algumas das funções da região C-terminal da fitocistatina extendida de plantas na bioquímica e/ou fisiologia de plantas.

[0013] Tendo em vista essa relação protease/inibidor, diversos estudos avaliaram as correlações e interações entre legumainas e cistatinas em diversos tipos de tumores em mamíferos e verificaram um efeito inibitório das cistatinas nas células tumorais, consistente com o envolvimento das legumainas (Liu et al. 2003). Incluindo dados retratados no atlas de genética e citogenética em oncologia e citologia (Ahmad eí a/., 2010), onde a perda do controle das legumainas por CST6 (E/M), uma cistatina humana, implica na progressão do câncer. Em células de meianoma, a invasão tecidual é suprimida pela superexpressão da cistatina E/M, que regula a atividade das legumaínas (Briggs et al. 2010), também de forma intra e extracelular em linhagens de células de rim (Smith et al. 2012). Esta cistatina encontra-se em teores diminuídos em células metastátícas de câncer de mama e gliomas, sendo em muitos casos por alterações epigenéticas (Sotiropoulou et al. 1997)(Shridhar et aL 2004)(Zhang et al. 2004)(Ai et aL 2006)(Schagdarsurengin et al. 2007) (Qiu et al. 2008). Desta forma, cistatinas com capacidade inibitória de legumaínas foram postuladas como importantes candidatos a supressores de tumores e metástases em mamíferos.

[0014] Baseando-se nestes estudos de atividades de legumaínas (profeases C13), diferentes metodologias vêm sendo propostas para o desenvolvimento de biomarcadores de tecidos cancerígenos (Edgington et al. 20l 3)(Chen et aL 2014)(Jíang et al. 2014) e também para a criação de novas drogas que possam auxiliar no tratamento do câncer (Sutherland et al. 2006)(Drag and Salvesen 2010)(Scott and Taggart 2010)(Lee and Bogyo 2012)(Liu et al. 2014)(Smith and Ástrand 2014). Entretanto, nenhum dos estudos a que os inventores tiveram acesso revelou, considerou ou sugeriu o uso de regões C-terminais de fitocistatinas estendidas para o tratamento do câncer em vertebrados, incluindo mamíferos.

[0015] Até o momento, apenas alguns estudos sugeriram a possibilidade de utilização de cistatinas de animais (não estendidas, menores que 15kDa) para o tratamento contra o câncer, mas não fitocistatinas. Entretanto o foco destes estudos encontra-se na inibição das catepsinas B e L (proteases C1 A) e seus papéis importantes na invasão de células tumorais em câncer de mama (Gianotti ei a/., 2008). Ou, ainda, através da inibição de catepsinas na formação de melanomas, interferindo no processo de angiogênese e prevenindo a invasão e migração do melanoma (Oliveira et a!., 201 1 ). Diferentemente da invenção aqui proposta, estes estudos prévios focam -se em um subgrupo diferente de fitocistatinas (não estendidas), cujo papel é inibir um subconjunto diferente de proteases cisteínicas pertencentes à família C1 A. [0018] Desta forma, um caráter inédito e inesperado da invenção aqui proposta encontra-se na utilização de uma ou mais fitocístatinas de plantas, maiores que

15kDa, cuja extensão C-terminal possui a habilidade seletiva de inibição de proteases do tipo legumaínas, que pertencem à família C13.

[0017] A literatura científica que circunscreve a invenção e mencionada acima inclui:

[0018] Abe Y, Shirane K, Yokosawa H, et a!. (1993) Asparaginyl Endopeptidase of Jack Bean Seeds. Biol Chem 268:3525-3529.

[ÕQ19]Abrahamson M (1997) Cystatin E is a Novel Human Cysteíne Proteinase Inhibitor with Structural Resemblance to Family 2Cystatins. J Biol Chem 272:10853-10858, doi: 10.1074/jbc.272.16.10853.

[0020] Ai L, Kim W-J, Kim T-Y, et al. (2006) Epigenetic silencing of the tumor suppressor cystatin M occurs during breast cancer progressíon. Cancer Res 66:7899-909. doi: 10.1 158/0008-5472. CAN-06-0576.

[0021] Ahmad M, Arsaban M, Delabrousse H, Labarussias M, Berre V, Maio a., Dessen P, Huret JL. 2010. Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology: an Internet information source with free access. Oncologie 12, 685-686.

[0022] Alvarez-Fernandez M, Barrett a J, Gerhartz B, et al. (1999) Inhibition of mammalian legumain by some cystatins is due to a novel second reactive site. J Biol Chem 274:19195-203.

[0023] Briggs JJ, Haugen MH, Johansen HT, et al. (2010) Cystatin E/M suppresses legumain activity and invasion of human melanoma. BMC Cancer 10:17. doi: 10.1 186/1471 -2407-10-17.

[0024] Chen J, Dando PM, Rawlings ND, et al. (1997) Cloning, Isolation, and Characterization of Mammalian Legumain, an Asparaginyl Endopeptidase. J Biol Chem 272:8090-8098.

[0025] Chen Y, Wu S, Chen C, Tzou S (2014) Peptide-based MRI contrast agent and near-ínfrared fluorescent probe for intratumoral legumain detection. Biomaterials 35:304-315. [0028] Cheng T, Hitomi K, van Vlijmen-Wil!ems IMJJ, et al. (2008) Cystatin M/E is a high affinity inhibitor of cathepsin V and cathepsin L by a reactive site that is distinct from the legumain-binding site. A novel clue for the role of cystatin M/E in epidermal cornification. J Biol Chem 281 :15893-9, doi: 10.1074/jbc.M600694200.

[0027] Christoff AP, Margis R (2014) The díversity of rice phytocystatins. Mo! Genet Genomics 1 -10. doi: 10.1007/S00438-014-0892-7.

[0028] Christoff AP, Turchetto-Zolet AC, Margis R (2014) Uncovering legumain genes in rice. Plant Sci 215-218:100-9. doi: 10.1016/j.piantsci.2013.1 1 .005.

[0029] Christoff, AP. Diversidade de fitocistatinas em arroz e suas proteinases cisteínicas-alvo, com enfoque em fitocistatinas carboxi-estendídas e inibição de iegumaínas. 14/09/2015. 141 páginas. Tese de Doutorado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Departamento de Genética.

[0030] DOosta Z, Higgins C, Ong C, Irwin G (2014) TBX2 represses CST6 resuiting in uncontrolled legumain activity to sustain breast cancer proliferation: a novel cancer-selective target pathway with therapeutic. Oncotarget 5:

[0031] Dall E, Brandstetter H (2013) Mechanistic and structural studies on legumain explain its zymogenicíty, distinct activation pathways, and regulation. Proc Natl Acad Sei USA 1 10:10940-5. doi: 10.1073/pnas.13006861 10.

[0032] Drag M, Salvesen GS (2010) Emerging principies in protease-based drug discovery. Nat Rev Drug Discov 9:690-701 . doi: 10.1038/nrd3053.

[0033] Edgington LE, Verdoes M, Ortega A, et al. (2013) Functional ímaging of legumain in cancer using a new quenched activity-based probe. J Am Chem Soe 135:174-82. doi: 10.1021/ja307083b.

[0034] Gawenda J, Traub F, Lííck HJ, et al, (2007) Legumain expression as a prognostic factor in breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 102:1 -6. doi: 10.1007/S10549-006-931 1 -z.

[0035] Gianotti A, Sommer C a., Carmona AK, Henrique-Silva F. 2008. Inhibiíory effect of the sugarcane cystatin CaneCPI-4 on cathepsins B and L and human breast cancer ceil invasion. Biológical Chemistry 389, 447-453. [0038] Guo P, Zhu Z, Sun Z, et al. (2013) Expression of legumain correlates with prognosis and metastasis in gastric carcinoma. PLoS One 8:e73090. doi: 10.1371/journal.pone.0073090.

[0037] Ha!fon S, Patel S, Vega F, et a!. (1998) Autocata!ytic activation of human legumain at aspartic acid residues. FEBS Lett 438:1 14-1 18.

[0038] Haugen MH, Boye K, Nes!and JM, et al. (2014) Hígh expression of the cysteíne proteinase legumain in colorectal cancer - !mp!ications for therapeutic targeting. Eur J Cancer. doi: 10.1016/j.ejca.2014.10.020.

[0039] Haugen MH, Johansen HT, Pettersen SJ, et al. (2013) Nuclear legumain activity in colorectal cancer. PLoS One 8:eS2980. doi:

10.1371/journa!.pone.0052980.

[0040] Jiang Y, Lu J, Wang Y, et ai. (2014) Molecular-Dynamics-Simulation- Driven Design of a Protease-Responsive Probe for //? Vivo Tumor Imaging. Adv Mater 1 -5. doi: 10.1002/adma.201403547.

[0041] Lee J, Bogyo M (2012) Synthesis and evaluation of aza-peptidyl inhibitors of the lysosomal asparagínyl endopeptidase, legumain. Bioorg Med Chem Lett 22:1340-3. doi: 10.1016/j.bmcl.201 1 .12.079.

[0042] Li DN, Matthews SP, Antoniou AN, et al. (2003) Multistep autoactivation of asparaginyi endopeptidase in vitro and in vivo. J Biol Chem 278:38980-90. doi: 1 G.1074/jbc.M3059302G0,

[0043] Li N, Liu Q, Su Q, et al. (2013) Effects of legumain as a potential prognostic factor on gastric câncers. Med Oncol 30:821 . doi: 10.1007/s12032- 013-0821 -9.

[0044] Lin Y, Qíu Y, Xu C, et al. (2014) Functional role of asparagínyl endopeptidase ubiquitination by TRAF8 in tumor invasion and metastasis. J Natl Cancer Inst 108:d]u012. doi: 10.1093/jnci/dju012.

[0045] Lin S, Deng F, Huang P, Li L, Wang L, Li Q, Chen L, Chen H, Nan K. 2015. A novel legumain protease-activated micelle cargo enhances anticancer activity and cellular ínternalizatíon of doxorubícin. J. Mater. Chem. B 3, 6001 - 60. [0048] Liu C, Sun C, Huang H, et al. (2003) Overexpression of legumain in íumors is significant for invasion/metastasis and a candidate enzymatic target for prodrug therapy. Cancer Res 2957-2984.

[0047] Liu Y, Bajjuri KM, Liu C, Sinha SC (2012) Targeting cell surface alpha(v)beta(3) integrin increases therapeutic efficacies of a legumain protease- activated auristatin prodrug, Mol Pharm 9:168-75. doi: 10.1021 /mp200434n.

[0048] Liu Z, Xiong M, Gong J, et al. (2014) Legumain proíease-activated TAT- liposome cargo for targeting tumours and their microenvironment. Nat Commun 5:4280. doi: 10.1038/ncomms5280.

[0049] Liu Y, Goswami RK, Liu C, Sinha SC. 2015. Chemically Programmed Bispecific Antibody Targeting Legumain Protease andavβs Integrin Mediates Strong Antitumor Effects. Molecular Pharmaceutics, 150609092733002.

[0050] Margis R, Reis EM, Viliereí V (1998) Structural and phyiogenetic relationships among plant and animal cystatins. Arch Bioehem Biophys 359:24- 30. doi: 10.1006/abbi.1998.0875.

[0051] Martinez M, Diaz-Mendoza M, Carrillo L, Diaz I (2007) Carboxy terminal extended phytocystatins are bifunctional inhibitors of papai n and legumain cysteine proteinases. FEBS Lett 581 :2914-8. doi: 10.1016/j.febslet.2007.05.042.

[0052] Morita Y, Araki H, Sugimoto T, et al. (2007) Legumain/asparaginyl endopeptidase controls extracellular matrix remodeling through the degradation of fibronectin in mouse renal próxima l tubular cells. FEBS Lett 581 :1417-24. doi: 10.1016/j.febslet.2007.02.064.

[0053] Murthy R, Arbman G, Gao J (2005) Legumain expression in relation to clinicopathologic and biológical variables in colorectal cancer. Clin cancer 1 1 :2293-2299.

[0054] Ohno Y, Nakashima J, !zumi M, et ai. (2013) Association of legumain expression pattern with prostate cancer invasiveness and aggressiveness. World J Urol 31 :359-64. doi: 10.1007/s00345-012-0977-z.

[0055] Oliveira JP, Magliarelli HF, Pereira F V., el a/. 201 1 . Sugarcane cystatin caneCPI-4 inhibits melanoma growth by angiogenesis disruption. Journal of Cancer Science and Therapy 3, 181 -187.

[0056] Qiu J, Ai L, Ramachandran C, et ai. (2008) Invasion suppressor cystatin E/M (CST6): high-level cell type-specific expression in normal brain and epigenetic silencing in gliomas. Lab Invest 88:910-25. doi: 10.1038/labínvest.2008.66.

[0057] Sandberg A, Lindell G, Kállstrõm BN, et al. (2012) Tumor proteomics by multivariate anaiysis on individual pathway data for enaracterizatíon of vulvar cancer phenotypes. Mol Geil Proteomics 1 1 :M1 12.016998. doi: 10.1074/mcp.M1 12.018998.

[0058] Schagdarsurengin U, Pfeifer GP, Dammann R (2007) Frequent epigenetic inactivation of cystatin M in breast carcinoma.Oncogene 26:3089- 94. doi: 10.1038/sj.onc.1210107.

[0059] Scott CJ, Taggart CG (2010) Biologic protease inhibitors as novel therapeutic agents. Biochimie 92:1681 -8. doi: 10.1016/j.biochi.2010.03.010.

[0080] Shridhar R, Zhang J, Song J, et al. (2004) Cystatin M suppresses the maíignant phenotype of human MDA-MB-435S cells.Oncogene 23:2206-15. doi: 10.1038/sj.onc.1207340.

[0061] Smith R, Àstrand O (2014) Synthesis of a novel legumain-cleavable colchícine prodrug with cell-specific toxicity. Bioorganic Med chemestry 22:3309-3315.

[0062] Smith R, Johansen HT, Nilsen H, et al. (2012) Intra- and extracellular regulation of activity and processing of legumain by cystatin E/M. Biochimie 94:2590-9. doi: 10.1016/j.biochi.2012.07.026.

[0083] Sotíropoulou G, Anisowicz a., Sager R (1997) Identification, Cloning, and Characterization of Cystatin M, a Novel Cysteine Proteinase Inhibitor, Down-reguiated in Breast Cancer. J Biol Chem 272:903-910. doi: 10.1074/jbc.272.2.903.

[0064] Sutherland MSK, Sanderson RJ, Gordon K a, et al. (2006) Lysosomal trafficking and cysteine protease metabolism confer target-specific cytotoxicity by peptide-linked anti-CD30-auristatin conjugates. J Biol Chem 281 :10540-7. doi: 10.1074/jbc.M510026200.

[0085] Uhlen M, Oksvold P, Fagerberg L, et al 2010. Towards a knowledge- based Human Proíein Atlas. Nature biotechnology 28, 1248-1250.

[0068] Wang L, Chen S, Zhang M, et al. (2012) Legumain: a biornarker for diagnosis and prognosis of human ovarian cancer. J Cell Biochem 1 13:2679- 86. doi: 10.1002/jcb.24143.

[0087] Zhang J, Shridhar R, Dai Q, et al. (2004) Cystatin : a novel candidate tumor Suppressor gene for breast cancer. Cancer Res 6957-6964.

[0068] Yuan Y, Ge S, Sun H, Dong X, Zhao H, An L, Zhang J, Wang J, Hu B,

Liang G. 2015. Intraceliular Self-Assembly and Disassembly of 19 F

Nanoparticies Confer Respective 'Off and Όη' 19 F NMR/MRI Signals for

Legumain Actívity Detection in Zebrafish. ACS Nano 9, 51 17-5124.

[0069] A literatura patentária relacionada à presente invenção inclui os seguintes documentos:

[0070] O documento WO 2006/066358, depositado por Sugar Industry Innovation PTU ítd. e intitulado Vacuole Targeting Peptide and Nucleic Acid", revela uma sequência nucieotídica e uma sequência peptídíca que direciona ao vacúolo. São reveladas construções gênicas e a expressão de proteínas quiméricas em plantas, notadamente monocotiledôneas, como cereais e cana de açúcar.

[0071] O documento WO 02 094980, intitulado "Phytocystatin", revela uma cistatina de Vigna unguiculata e seus usos farmacêutico, cosmético e agronómico, em particular para plantas transgênicas - para produzir plantas resistentes a certos estresses, como a dessecação.

[0072] O documento WO 0070071 , intitulado " Senescence-related Promoters", revela regiões de iniciação de transcrição e promotoras isoladas de milho e caracterizadas. Tais regiões são capazes de modificar a expressão gênica durante a senescêncía de plantas. A matéria revelada, portanto, se relaciona ao uso destas regiões em construções gênicas que modificam a expressão gênica da planta.

[0073] A presente invenção difere de todos os referidos documentos por várias razões técnicas. Por exemplo, nenhum de tais documentos revela ou sequer sugere a abordagem de tratar o câncer de mamíferos ou outros vertebrados com polipeptídeos dotados exclusivamente da região carboxi-terminal de fitocisíatinas de plantas. Tampouco revelam ou sugerem seu uso em composições para o tratamento preventivo, curativo ou profilático de câncer e/ou a inibição de metástases.

[0074] Com base na literatura patentária e não patentária a que os inventores tiveram acesso, nota-se claramente a necessidade da busca por novas soluções alternativas àquelas já existentes para contornar as limitações do estado da técnica. O presente pedido de patente revela soluções a estes problemas.

[0075] Do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção que, aos olhos dos inventores, possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Sumário da Criação/Invenção

[0076] A presente invenção tem como conceito inventivo comum aos seus diversos objetos o tratamento de câncer de mamíferos ou outros vertebrados através do uso de um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6, ou uma ou mais sequências com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6.

[0077] Referido polipeptídeo se assemelha a fitocistatina(s), porém compreende apenas o domínio carboxi-terminal ligante seletivo de legumaína, um tipo de protease, sendo modulador de sua atividade e/ou inibidor exclusivo de legumaína(s), ao contrário das cistatinas animais conhecidas, que também inibem outros alvos. Na presente invenção, é surpreendentemente demonstrado que o referido polipeptídeo é potencialmente útil para a preparação de composição para o tratamento do câncer - agindo como supressor de tumor e/ou da formação de metástases.

[0078] É um dos objetos da invenção uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer de mamíferos e/ou outros vertebrados, composição esta compreendendo:

- um veículo farmaceuticamente aceitável; e

- um ou mais polipeptídeos compreendendo uma ou mais sequências com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6, ou uma ou mais sequências com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6; ou

- uma ou mais construções gênicas úteis para a expressão, em mamíferos e/ou outros vertebrados, de um ou mais polipeptídeos conforme definido acima.

[0079] Em uma concretização, a composição da invenção compreende um polipeptídeo compreendendo um arranjo de duas ou mais sequências polipeptídicas fusionadas, repetidas ou em sequência de diferentes domínios carboxi-terminais de fitocistatinas.

[0080] Em uma concretização, a composição da invenção compreende uma construção gênica contendo um arranjo de duas ou mais sequências nucleotídicas codificantes dos referidos polipeptídeos fusionadas em fase, repetidas ou em sequência de iguais ou diferentes sequências nucleotídicas com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:5, ou com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:5, para administração da construção gênica e expressão do(s) polipeptídeo(s) diretamente no organismo do mamífero/vertebrado.

[0081] A composição farmacêutica a invenção se apresenta na forma de dosagem oral, sublingual, injetável, transdérmica, tópica (em creme, gel ou emulsão), inalável e/ou como supositório.

[0082] Em uma concretização, a composição farmacêutica da invenção compreende um construção gênica ou vetor de expressão compreendendo:

- uma ou mais sequências nucleotídicas com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:5, ou uma ou mais sequências nucleotídicas com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:5;

- um promotor functional em mamíferos e/ou outros vertebrados, ligado à sequência nucleotídica codificante descrita acima; e

- uma sequência nucleotídica selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma sequência sinal de secreção; uma sequência que facilite a exportação; uma sequência nucleotídica codificante de outra sequência polipeptídica inibidora de protease; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências,

sendo heteróloga qualquer das sequências nucleotídicas acima definidas.

[0083] É um outro dos objetos da invenção uma construção gênica ou vetor de expressão para a expressão de um ou mais polipeptídeos úteis para o tratamento de câncer de mamíferos ou outros vertebrados, referida construção gênica compreendendo:

- uma ou mais sequências nucleotídicas com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:5, ou uma ou mais sequências nucleotídicas com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:5;

- um promotor functional no organismo-alvo, ligado à sequência nucleotídica codificante descrita acima; e

- uma sequência nucleotídica selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma sequência sinal de secreção; uma sequência que facilite a exportação; uma sequência nucleotídica codificante de outra sequência polipeptídica inibidora de protease; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências,

sendo heteróloga qualquer das sequências nucleotídicas acima definidas.

[0084] É outro dos objetos da invenção o uso do polipeptídeo descrito acima ou da construção gênica descrita acima para a preparação de um medicamento contra o cancer.

[0085] É outro dos objetos da invenção um processo de preparação de medicamento contra o câncer, referido processo compreendendo: uma etapa de misturar um polipeptídeo conforme descrito acima, ou uma construção gênica conforme descrito acima; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0086] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0087] A figura 1 mostra representações esquemáticas de concretizações da invenção: em A) é ilustrada uma sequência de polipeptídeo artificial/não natural de Seq ID No:6, compreendendo uma região carboxi-terminal derivada de fitocistatina de arroz; em B) é ilustrada uma sequência de outro polipeptídeo recombinante único que resulta respectivamente da combinação de duas regiões carboxi-terminais da cistatina de mamão, seguidas de uma região carboxi-terminal de uma cistatina de milho e uma região carboxi-terminal de uma cistatina de arroz.

[0088] A figura 2 mostra uma representação esquemática de concretizações de construção gênica da presente invenção, sendo indicados: em A) 21 , um plasmídeo pCAMBIA, que viabiliza a expressão tanto em plantas quanto em bactérias para a expressão de um polipeptídeo codificado pela SeqlD No. 6; 22, uma origem de replicação; 23, um promotor funcionalmente ligado à sequência codificante; 24, a sequência codificante Seq ID No:5; e 25, um gene repórter (GFP), a região terminadora de transcrição; em B) é mostrada a representação esquemática do plasmídeo pRSFDuet™-1 , que proporciona a coexpressão de duas sequências codificantes de interesse. Este vetor contém dois sítios múltiplos de clonagem (MCS), cada um precedido de um promotor T7lac e um sítio de ligação a ribossomo (rbs).

[0089] A figura 3 mostra um gráfico indicativo do número de células U343 após 5 dias de tratamento com uma concretização de composição da invenção, compreendendo uma fitocistatina recombinante de arroz (O, sativa) contendo somente a porção carboxi-terminal. No eixo "y" é representado o número total de células e no eixo "x" são representados os resultados de cada condição testada, respectivamente: controle de células U343 (sem a administração da composição da invenção); e células U343 que receberam tratamentos de 1 , 10 e 50 micromolar do referido polipeptídeo.

[0090] A figura 4 mostra um gráfico indicativo do número de células A172 após 5 dias de tratamento com a composição indicada na descrição da figura 3. No eixo "y" é representado o número total de células e no eixo "x" são representados os resultados de cada condição testada, respectivamente: controle de células A172 (sem a administração da composição da invenção); e células A172 que receberam tratamentos de 1 , 10 e 50 micromolar do referido polipeptídeo.

[0091] A figura 5 mostra um gráfico indicativo do número de células C6 após 5 dias de tratamento com a composição indicada na descrição da figura 3. No eixo "y" é representado o número total de células e no eixo "x" são representados os resultados de cada condição testada, respectivamente: controle de células C6 (sem a administração da composição da invenção); e células C6 que receberam tratamentos de 1 , 10 e 50 micromolar do referido polipeptídeo.

[0092] A figura 6 mostra um gráfico indicativo do número de células U138 após 5 dias de tratamento com a composição indicada na descrição da figura 3. No eixo "y" é representado o número total de células e no eixo "x" são representados os resultados de cada condição testada, respectivamente: controle de células U138 (sem a administração da composição da invenção); e células U138 que receberam tratamentos de 1 , 10 e 50 micromolar do referido polipeptídeo.

[0093] A figura 7 mostra um gráfico ilustrativo da proliferação celular cumulativa ao longo do tempo para células de glioma U343 submetidas ao tratamento com a composição indicada na descrição da figura 3. No eixo "y" é representada a duplicação celular cumulativa e no eixo "x" é representado o tempo em dias. São mostrados: em A, a curva relativa à proliferação/controle, ou seja, sem a administração do ativo; em B, C e D as curvas relativas à administração do referido polipeptídeo, respectivamente nas concentrações 1 , 10 e 50 micromolar.

[0094] A figura 8 mostra um gráfico ilustrativo da proliferação celular cumulativa ao longo do tempo para células de glioma A172 submetidas ao tratamento com a composição indicada na descrição da figura 3. No eixo "y" é representada a duplicação celular cumulativa e no eixo "x" é representado o tempo em dias. São mostrados: em A, a curva relativa à proliferação/controle, ou seja, sem a administração do ativo; em B, C e D as curvas relativas à administração do referido polipeptídeo, respectivamente nas concentrações 1 , 10 e 50 micromolar.

[0095] A figura 9 mostra um gráfico ilustrativo da proliferação celular cumulativa ao longo do tempo para células de glioma C6 submetidas ao tratamento com a composição indicada na descrição da figura 3. No eixo "y" é representada a duplicação celular cumulativa e no eixo "x" é representado o tempo em dias. São mostrados: em A, a curva relativa à proliferação/controle, ou seja, sem a administração do ativo; em B, C e D as curvas relativas à administração do referido polipeptídeo, respectivamente nas concentrações 1 , 10 e 50 micromolar.

[0096] A figura 10 mostra um gráfico ilustrativo da proliferação celular cumulativa ao longo do tempo para células de glioma U138 submetidas ao tratamento com a composição indicada na descrição da figura 3. No eixo "y" é representada a duplicação celular cumulativa e no eixo "x" é representado o tempo em dias. São mostrados: em A, a curva relativa à proliferação/controle, ou seja, sem a administração do ativo; em B, C e D as curvas relativas à administração do referido polipeptídeo, respectivamente nas concentrações 1 , 10 e 50 micromolar. [0097] A figura 1 1 mostra uma representação esquemática dos dados da sequência gênica da fitocistatina de arroz com terminação carboxi-extendida. A representação da sequência nucleotídica completa do locus no cromossomo 1 de arroz, sendo indicados: as regiões em branco correspondem aos introns e as regiões sombreadas correspondem aos exons.

Descrição Detalhada da Criação/Invenção

[0098] Legumaínas são encontradas primariamente localizadas em lisossomos de mamíferos, mas também já foram encontradas em associação com a matriz extracelular. Endogenamente, as legumaínas podem ser inibidas pelas cistatinas; entretanto, as cistatinas animais inibem adicionalmente algumas proteases da classe das catepsinas, não tendo assim uma atividade específica. A presente invenção proporciona uma composição para a ligação e/ou inibição seletiva de legumaínas de mamíferos e/ou outros vertebrados.

[0099] A presente invenção tem como conceito inventivo comum aos seus diversos objetos o uso, para a prepação de um medicamento para o tratamento de câncer de mamíferos ou outros vertebrados, de um polipeptídeo que compreende uma ou mais sequências com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6, ou uma ou mais sequências com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6.

[0100] Referido polipeptídeo se assemelha a fitocistatina(s), porém compreende apenas o domínio carboxi-terminal ligante seletivo de legumaína, um tipo de protease, sendo modulador de sua atividade e/ou inibidor exclusivo de legumaína(s), ao contrário das cistatinas animais conhecidas, que também inibem outros alvos. Na presente invenção, é surpreendentemente demonstrado que o referido polipeptídeo é útil para o tratamento de câncer de mamíferos e/ou outros vertebrados, agindo como supressor de tumor e/ou da formação de metástases.

[0101] O câncer não pode ser considerado uma doença única em sua etiologia, existindo mais de 100 tipos diferentes nomeados pelo órgão ou tipo celular em que a doença se inicia. Caracterizando-se por um crescimento desordenado de células, as células cancerosas podem invadir outros tecidos, espalhando-se pelo organismo através de metástases. Segundo dados coletados e divulgados pelo NIH (National Institutes of Health), pela OMS (Organização Mundial de Saúde) e pelo INCA (Instituto Nacional do Câncer), em 2012 houve 14,1 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes no mundo. As perspectivas para 2030 incluem 21 ,4 milhões de casos novos e 13,2 milhões de mortes por câncer mundialmente. Tendo em vista estes altos números, o câncer é um grande problema de saúde pública - que afeta profundamente pelo menos 1 milhão de pessoas diagnosticadas por ano.

[0102] Os tratamentos para o câncer vêm avançando, salvando vidas e estendendo a taxa de sobrevivência de pessoas com diversos tipos de câncer. Apesar da maior parte das causas de câncer serem sabidamente multifatoriais e variadas entre indivíduos, algumas das vias moleculares, que já são conhecidas, apresentam-se de forma similar em alguns tipos de câncer. Uma destas vias relaciona-se à atividade alterada e aumentada de proteases cisteínicas do tipo legumainas. De forma independentemente, esta atividade aumentada já foi detectada em tipos diferentes de câncer incluindo de mama, cólon, pulmões, próstata, ovário, rins, entre outros. Na maioria destes estudos os tumores apresentando uma maior atividade de legumainas estão associados a um alto nível de metástases e um pior prognóstico de sobrevida.

[0103] Assim, trabalhos recentes vêm tentando desenvolver drogas que tenham como alvo específico as legumainas. Em geral há um foco maior para a pesquisa de pró-drogas sintéticas e alguns estudos focam na utilização das cistatinas de animais como inibidores das legumainas. Entretanto, as cistatinas de animais, embora sejam objeto de intense estudo no momento, proporcionam baixa especificidade para a inibição de legumainas animais. Desta forma, a pesquisa e o desenvolvimento de outras entidades moleculares continua sendo uma importante demanda para o desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento do câncer. [0104] A vasta diversidade de tipos de câncer nos quais é encontrado um aumento das proteases do tipo legumaínas, em associação com a agressividade e a formação de metástases, justifica esforços e investimentos no desenvolvimento de inibidores eficazes, de baixo ou nenhum efeito colateral e com potencial terapêutico. Neste contexto, a presente invenção atende, dentre outros, os objetivos do incentivo do governo federal (decreto n ^Q 6.041 , fevereiro 2007) para geração e produção nacional de novas biomoléculas e/ou proteínas recombinantes de interesse terapêutico.

[0105] A presente invenção proporciona soluções aos problemas do estado da técnica, ao proporcionar um candidato útil ao tratamento de câncer de mamíferos ou vertebrados, através de um polipeptídeo de origem vegetal.

[0106] Para fins da presente invenção as seguintes definições são utilizadas:

[0107] Polipeptídeo recombinante ou modificado: No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "polipeptídeo não natural, ou polipeptídeo recombinante, ou polipeptídeo modificado" como um polipeptídeo que não ocorre naturalmente.

[0108] Organismo-alvo: No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "organismo-alvo", aquele organismos que recebe a construção gênica da invenção, parq eue a expressçao gênica ocorra no organismo-alvo. Referido organismo-alvo inclui, sem se limitar a, bactéricas, leveduras e outros fungos, plantas ou outras células vegetais, células animais, mamíferos e/ou outros vertebrados.

[0109] Composição farmacêutica: No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "composição farmacêutica" como toda e qualquer composição que contenha um princípio ativo, com fins profiláticos, paliativos e/ou curativos, atuando de forma a manter e/ou restaurar a homeostase, podendo ser administrada de forma tópica, parenteral, enteral, intratecal, oral, intravenoso, intranasal, intravítreo e intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular e intraocular e sua administração e/ou formulação.

[0110] Formulação ou veículo farmaceuticamente aceitável: No contexto do presente pedido de patente, deve-se entender "formulação ou veículo farmaceuticamente aceitável" uma formulação contendo excipientes e carreadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos por técnicos no assunto, como é o desenvolvimento de doses e tratamentos convenientes para uso em composições particulares que podem ser descritas em uma série de regimes de tratamento, incluindo oral, tópico, parenteral, intravenoso, intranasal, intravítreo e intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular e intraocular e sua administração e/ou formulação.

[0111] Distúrbios celulares: No contexto do presente pedido de patente, "distúrbios celulares" deve ser entendido como qualquer distúrbio celular que altere as funções fisiológicas normais de uma célula ou tecido, em especial mamíferos ou outros vertebrados. No contexto do presente pedido de patente, o termo compreende qualquer alteração bioquímica ou molecular que resulte em ou esteja associada à alteração da expressão e/ou atividade de legumaína(s) em células ou tecidos, incluindo neoplasias.

[0112] A presente invenção contribui, primeiramente, com o conhecimento científico acerca da atividade dos inibidores de proteases cisteínicas de plantas para o tratamento de câncer de mamíferos ou outros vertebrados. Ao longo da evolução dos organismos, diversos genes e proteínas permaneceram com funções relacionadas entre os dois reinos. Entretanto, apesar ser conhecido que legumainas estão envolvidas no processo de desenvolvimento de tumores e metástases e que cistatinas têm a habilidade de inibir a atividade destas proteases, ao melhor do conhecimento dos inventores não havia até o momento nenhum relato disponível da abordagem de utilizar e efetivamente testar unicamente a região C-terminal de fitocistatinas de plantas para o tratamento de câncer de mamíferos. Talvez o fato de que os inibidores de plantas evolutivamente adquiriram a propriedade inibitória específica apenas para legumainas explique essa lacuna. A presente invenção proporciona uma abordagem inovadora ao estender estes tipos de análises através dos reinos de organismos, proporcionando a identificação de biomoléculas com potenciais terapêuticos. Além disso, os sistemas vegetais têm diversas vantagens sobre outros na produção de drogas novas, pois requerem muito menos esforço e investimentos em testes pré-clínicos do que os sistemas convenicionais.

[0113] Entre outros objetos, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer de mamíferos e/ou outros vertebrados, composição esta compreendendo:

- um veículo farmaceuticamente aceitável; e

- um ou mais polipeptídeos compreendendo uma ou mais sequências polipeptídicas com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6, ou uma ou mais sequências com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6.

[0114] Os exemplos a seguir ilustram algumas das formas de concretizar a invenção, sem contudo limitar o escopo da mesma.

Exemplo 1 - Composição para o tratamento de câncer em mamíferos e/ou outros vertebrados - Compreendendo Polipeptídeo Recombinante

[0115] Regiões de genes de fitocistatinas carboxi-estendidas de plantas previamente conhecidas foram selecionadas para avaliação da funcionalidade dos polipeptídeos recombinantes resultantes. Os genes de fitocistatinas carboxi-estendidas das plantas foram obtidos de: arabidopsis (Arabidopsis thaliana), mamão (Carica papaya), soja (Glycine max), arroz (Oryza sativa), milho (Zea mays) e eucalipto (Eucaliptos grandis). A escolha dos genes destas espécies foi baseada em filogenias previamente apresentadas (Christoff and Margis 2014; Christoff 2015), de forma a contemplar a inclusão das espécies que representam boa amostragem da diversidade de fitocistatinas em plantas. As sequências codificantes das regiões C-terminais das fitocistatinas de diferentes plantas, foram inseridas nos vetores de destino utilizando o sistema de enzimas de restrição próprio de cada vetor e posterior ligação com DNA ligase.

[0116] Na composição da invenção, o polipeptídeo é selecionado dentre diferentes variantes, dentre os possuem maior atividade inibitória (Ki) contra a legumaína de mamíferos ou humana. O elemento comum às diferentes concretizações e composição da invenção é um polipeptídeo compreendendo uma região específica de uma fitocistatina carboxi-extendida, independentemente da planta de origem ou de ser um polipeptídeo sintético. Nesta concretização, a composição da invenção compreende um extraio de fitocistatina recombínante de arroz (O, sativa) contendo somente a porção carboxi-termina!, conforme indicado na SeqlD No:8 e na figura 1 A.

Exemplo 2 - Construção Gênica

[0117] A construção gênica da invenção é útil para a expressão de um ou mais polipeptídeos úteis para o tratamento de câncer de mamíferos ou outros vertebrados. A referida construção gênica compreende:

- uma ou mais sequências nucleotídicas com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:5, ou uma ou mais sequências nucleotídicas com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:5;

- um promotor functional no organismo-alvo, ligado à sequência nucleotídica codificante descrita acima; e

- uma sequência nucleotídica selecionada dentre: uma sequência nucleotídica terminadora de transcrição; um marcador de seleção; uma sequência sinal de secreção; uma sequência que facilite a exportação; uma sequência nucleotídica codificante de outra sequência polipeptídica inibidora de protease; combinações dos mesmos ou ainda um plasmídeo compreendo tais sequências,

sendo heteróloga qualquer das sequências nucleotídicas acima definidas.

[0118] Nesta concretização, ilustrada esquematicamente na figura 2A, a construção gênica da invenção compreende como sequência codificante de polipeptídeo a Seq ID No.5, conforme ilustrado no exemplo 1 .

[0119] De se salientar que cada sistema de expressão proporciona vantagens e desvantagens, sendo a escolha do sistema mais eficiente para a expressão das biomoléculas em cada caso uma questão de ponderar a quantidade de proteína recuperada e/ou o grau de pureza da mesma. Semelhantemente, a construção gênica da invenção pode ser direcionada à expressão do polipeptídeo recombinante da invenção em bactérias, leveduras, plantas, para sua subsequente administração, ou ainda diretamente em mamíferos ou outros vertebrados.

Exemplo 3 - Composição compreendendo Polipeptídeo Recombinante em arranjo de sequências fusionadas.

[0120] Nesta concretização, o polipeptídeo compreende um arranjo em sequência fusionada, com quatro domínios carboxi-terminais de fitocistatinas, sendo dois de mamão repetidos seguidos de um de milho e outro de arroz, conforme ilustra esquematicamente a figura 1 B. O referido arranjo em sequência também é ligante seletivo de legumaína(s), sendo útil na modulação e/ou inibição de sua atividade. A preparação desta composição é feita de acordo com o processo da invenção, o qual inclui uma etapa de misturar:

- um ou mais polipeptídeos compreendendo uma ou mais sequências com similaridade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6, ou uma ou mais sequências com identidade igual ou superior a 70% com a SeqlD No:6; ou

- uma ou mais construções gênicas úteis para a expressão, em mamíferos e/ou outros vertebrados, de um ou mais dos referidos polipeptídeos; e

- um veículo farmaceuticamente aceitável.

Exemplo 4 - Testes em linhagens de câncer de mamífero

[0121] A composição da invenção surpreendentemente demonstrou proporcionar o tratamento curativo ou profilático de uma variadade de desordens celulares, notadamente o câncer. A composição desta concretização da invenção compreende: meio de cultura de células humanas como veículo; e um polipeptídeo recombinante de fitocistatina de arroz (O. sativa) contendo somente a porção carboxi -terminal (Figura 1 A), tendo sido administrada a células de mamíferos. Experimentos com a administração desta concretização de composição da invenção em células de glíoma demonstraram resultados surpreendentes e muito promissores, conforme relatado a seguir. [0122] Em experimento realizado com 4 linhagens distintas de glioma, sendo 3 linhagens humanas e uma linhagem murina (C6), foi feito o plaqueamento destas em placa de 24 poços em monocata e tratadas no dia seguinte com a composição da invenção contendo o referido polipeptídeo nas concentrações de 1 uM, 10uM e 50uM. O tratamento foi de 5 dias, com a presença da composição da invenção e no quinto dia o meio foi trocado por meio sem a composição da invenção, sendo a avaliação feita ao longo do tempo. Os versados na técnica saberão que o veículo utilizado nesta concretização da invenção pode ser substituído por outro(s), de acordo com a célula e/ou organismo a ser tratado e de amplo conhecimento na técnica.

[0123] Os resultados, mostrados nas figuras 3 a 6, permitem concluir que: (i) nas condições e células testadas, as doses 1 UM e 10uM, parecem não fazer muito efeito a longo prazo nessas 4 linhagens testadas; (ii) a dose de 50uM dá indícios de efeito antitumoral em células de glioma a curto prazo, embora para algumas linhagens o efeito não se mantenha a longo prazo e a capacidade pro!iferativa da população tratada parece ser restaurada; (iii) a dose de 50uM proporcionou a eliminação completa de uma das linhagens de glioma mais resistentes, que são irresponsívas à maioria dos tratamentos quimioterápicos disponíveis.

[0124] Os gráficos das figuras 7-10, ilustram os perfis de proliferação celular das linhagens tratadas com a composição da invenção, demonstrando promissores efeitos. As figuras 3 e 7 mostram a redução da proliferação celular em células U138. As figuras 5 e 9 mostram a redução da proliferação celular em células C6. As figuras 8 e 10 mostram a redução muito substancial da proliferação celular em células U343, que são células de linhagens de glioma mais resistentes às quimioterápicos disponíveis na técnica.

[0125] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.