本発明におけるWDR6蛋白質は、配列番号:2で� ��されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的� ��同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
 WDR6は、例えば、温血動物(例えば、ヒト、� �ウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウ� �、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー� �トリなど)の細胞[例えば、肝細胞、脾細胞、 神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞� ��メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、� ��皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平� ��筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、� ��肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T� �胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細� ��、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核 球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞 、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、ま たはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは 癌細胞など]、あるいはそれらの細胞が存在� �るあらゆる組織もしくは臓器[例えば、脳、� ��の各部位(例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、 海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小 脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓� �生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚� �肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、 胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸 、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織(� �、褐色脂肪組織、白色脂肪組織)、骨格筋な� ��]等から単離・精製される蛋白質であっても よい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系 で生化学的に合成された蛋白質であってもよ いし、あるいは上記アミノ酸配列をコードす る塩基配列を有する核酸を導入された形質転 換体から産生される組換え蛋白質であっても よい。

 配列番号:2で表されるアミノ酸配列と実質� �に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:2 で表されるアミノ酸配列と約60%以上、好まし くは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、 特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが 挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技 術分野において公知の数学的アルゴリズムを 用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた� �合の、最適なアラインメント(好ましくは、� ��アルゴリズムは最適なアラインメントのた� ��に配列の一方もしくは両方へのギャップの� ��入を考慮し得るものである)における、オー バーラップする全アミノ酸残基に対する同一 アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合(%)を 意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的 性質において類似したアミノ酸を意味し、例 えば、芳香族アミノ酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族� ��ミノ酸(Ala、Leu、Ile、Val)、極性アミノ酸(Gln� ��Asn)、塩基性アミノ酸(Lys、Arg、His)、酸性ア� ��ノ酸(Glu、Asp)、水酸基を有するアミノ酸(Ser� ��Thr)、側鎖の小さいアミノ酸(Gly、Ala、Ser、Th r、Met)などの同じグループに分類されるアミ� ��酸が挙げられる。このような類似アミノ酸� ��よる置換は蛋白質の表現型に変化をもたら� ��ない(即ち、保存的アミノ酸置換である)こ� �が予測される。保存的アミノ酸置換の具体� �は当該技術分野で周知であり、種々の文献� �記載されている(例えば、Bowieら,Science, 247:13 06-1310 (1990)を参照)。
 本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は� ��相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Cen ter for Biotechnology Information Basic Local Alignmen t Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギ ャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリ� ��グ=OFF)にて計算することができる。アミノ� �配列の相同性を決定するための他のアルゴ� �ズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl.  Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のアル� ��リズム[該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプ ログラム(version 2.0)に組み込まれている(Altsch ulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Ne edlemanら, J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記載 のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフト� �ェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込� �れている]、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17  (1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズム� �CGC配列アラインメントソフトウェアパッケ� �ジの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に� ��み込まれている]、Pearsonら, Proc. Natl. Acad.� �Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリ� ��ム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケ ージ中のFASTAプログラムに組み込まれている] 等が挙げられ、それらも同様に好ましく用い られ得る。
 より好ましくは、配列番号:2で表されるア� �ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列と� �、配列番号:2で表されるアミノ酸配列と約60% 以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましく は約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も 好ましくは約95%以上の同一性を有するアミノ 酸配列である。

 配列番号:2で表されるアミノ酸配列と実質� �に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質と� �ては、例えば、前記の配列番号:2で表される アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 を含み、配列番号:2で表されるアミノ酸配列� ��含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する� ��白質などが好ましい。ここで「活性」とは� ��IRS-4との結合活性および該分子のリン酸化� �御活性などをいう。「実質的に同質」とは� �それらの活性が定性的(例えば、生理学的ま� ��は薬理学的)に同じであることを示す。した がって、IRS-4との結合活性および該分子のリ� ��酸化制御活性などの活性は同等であること� ��好ましいが、これらの活性の程度(例えば、 約0.1~約10培、好ましくは約0.5~約2倍)や蛋白質 の分子量などの量的要素は異なっていてもよ い。
 IRS-4との結合活性および該分子のリン酸化� �御活性の測定は、自体公知の方法に準じて� �なうことができるが、例えば、後述する方� �等に従って行うことができる。

 また、本発明のWDR6には、例えば、(1)配列番 号:2で表されるアミノ酸配列のうち1または2� �以上(好ましくは、1~100個程度、好ましくは1~ 50個程度、さらに好ましくは1~10個程度、特に 好ましくは1~数(2、3、4もしくは5)個)のアミノ 酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号:2で� ��されるアミノ酸配列に1または2個以上(好ま� ��くは、1~100個程度、好ましくは1~50個程度、� ��らに好ましくは1~10個程度、特に好ましくは 1~数(2、3、4もしくは5)個)のアミノ酸が付加し たアミノ酸配列、(3)配列番号:2で表されるア� ��ノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1~50 個程度、好ましくは1~10個程度、さらに好ま� �くは1~数(2、3、4もしくは5)個)のアミノ酸が� �入されたアミノ酸配列、(4)配列番号:2で表さ れるアミノ酸配列のうち1または2個以上(好ま しくは、1~50個程度、好ましくは1~10個程度、� ��らに好ましくは1~数(2、3、4もしくは5)個)の� ��ミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ� ��配列、または(5)それらを組み合わせたアミ� ��酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
 上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失ま� ��は置換されている場合、その挿入、欠失ま� ��は置換の位置は、蛋白質の活性が保持され� ��限り特に限定されない。

 本発明のWDR6は、好ましくは、配列番号:2� ��表されるアミノ酸配列を有するヒトWDR6蛋白 質(GenBankアクセッション番号:AAF80244)、あるい は他の哺乳動物におけるそのホモログ[例え� �、GenBankにそれぞれアクセッション番号AAK3116 6およびXP_516448として登録されているマウス� �よびチンパンジーホモログ等]である。

 本明細書において、蛋白質およびペプチド� ��、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端 (アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末� �)で記載される。配列番号:2で表されるアミ� �酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、� �発明のWDR6は、C末端がカルボキシル基(-COOH)� �カルボキシレート(-COO ^- )、アミド(-CONH ₂ )またはエステル(-COOR)の何れであってもよい� ��
 ここでエステルにおけるRとしては、例えば 、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピ� ��、n-ブチルなどのC _1-6 アルキル基;例えば、シクロペンチル、シク� �ヘキシルなどのC _3-8 シクロアルキル基;例えば、フェニル、α-ナ� �チルなどのC _6-12 アリール基;例えば、ベンジル、フェネチル� �どのフェニル-C _1-2 アルキル基;α-ナフチルメチルなどのα-ナフ� �ル-C _1-2 アルキル基などのC _7-14 アラルキル基;ピバロイルオキシメチル基な� �が用いられる。
 本発明のWDR6がC末端以外にカルボキシル基(� ��たはカルボキシレート)を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化 されているものも本発明の蛋白質に含まれる 。この場合のエステルとしては、例えば上記 したC末端のエステルなどが用いられる。
 さらに、本発明のWDR6には、N末端のアミノ� �残基のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル� ��、アセチル基などのC _1-6 アルカノイルなどのC _1-6 アシル基など)で保護されているもの、生体� �で切断されて生成し得るN末端のグルタミン� ��基がピログルタミン酸化したもの、分子内� ��アミノ酸の側鎖上の置換基(例えば-OH、-SH、 アミノ基、イミダゾール基、インドール基、 グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、� ��ルミル基、アセチル基などのC _1-6 アルカノイル基などのC _1-6 アシル基など)で保護されているもの、ある� �は糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの� �合蛋白質なども含まれる。

 WDR6の部分ペプチド(以下、単に「本発明の� �分ペプチド」と略称する場合もある)は、上� ��したWDR6の部分アミノ酸配列を有するペプチ ドであり、且つWDR6と実質的に同質の活性を� �する限り、何れのものであってもよい。こ� �で「実質的に同質の活性」とは上記と同意� �を示す。また、「実質的に同質の活性」の� �定はWDR6の場合と同様に行なうことができる� ��
 具体的には、本発明の部分ペプチドとして� ��例えば、配列番号:2で表されるアミノ酸配� �のうち、IRS-4との結合に関わる領域(例えば� �トWDR6の場合、例えば配列番号:2で表される� �ミノ酸配列中アミノ酸番号114-142、155-188、207 -237、256-284、296-326、611-641、772-815、857-892、908 -945、978-1011、1043-1072で示される、いわゆるWD- repeatsの全部または一部など)およびIRS-4のリ� �酸化制御に関わる領域(例えばヒトWDR6の場合 、例えば配列番号:2で表されるアミノ酸配列� ��アミノ酸番号498-518、729-756で示される、Prote in phosphatase 2A regulatory subunit PR55 signatureと 相同性を有する領域など)を含む部分アミノ� �配列を有するものなどが用いられる。本発� �の部分ペプチドは、上記のIRS-4との結合に関 与する領域とIRS-4のリン酸化制御に関与する� ��域を含む限りそのサイズに特に制限はない� ��、好ましくは300個以上の部分アミノ酸配列� ��含むもの、より好ましくは500個以上の部分� ��ミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部� ��アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ� ��配列であってもよく、あるいは不連続な複� ��の部分アミノ酸配列が連結されたものであ� ��てもよい。

 一方、WDR6の部分アミノ酸配列を含むがWDR 6と実質的に同質の活性を有しないペプチド� �例えば、配列番号:2で表されるアミノ酸配列 のうち、IRS-4との結合に関与する領域を含む� ��、リン酸化制御に関与する領域を含まない� ��分アミノ酸配列を有するものなどは、「本� ��明の部分ペプチド」には含まれない。しか� ��ながら、かかるペプチドは、IRS-4と結合す� �ことによりWDR6を介したインスリン/IGF-1シグ� ��ル伝達作用の抑制を遮断することができる� ��で、該シグナル伝達作用を促進したい場合� ��に有用であり得る。

 また、本発明の部分ペプチドはC末端がカル ボキシル基(-COOH)、カルボキシレート(-COO ^- )、アミド(-CONH ₂ )またはエステル(-COOR)の何れであってもよい� ��ここでエステルにおけるRとしては、WDR6に� �いて前記したと同様のものが挙げられる。� �発明の部分ペプチドがC末端以外にカルボキ� ��ル基(またはカルボキシレート)を有してい� �場合、カルボキシル基がアミド化またはエ� �テル化されているものも本発明の部分ペプ� �ドに含まれる。この場合のエステルとして� �、例えば、C末端のエステルと同様のものな� ��が用いられる。
 さらに、本発明の部分ペプチドには、上記� ��たWDR6と同様に、N末端のアミノ酸残基のア� �ノ基が保護基で保護されているもの、N末端� ��グルタミン残基がピログルタミン酸化した� ��の、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が� ��当な保護基で保護されているもの、あるい� ��糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの� ��合ペプチドなども含まれる。

 本発明で用いられるWDR6またはその部分ペ プチドは塩の形態であってもよい。例えば、 生理学的に許容される酸(例:無機酸、有機酸) や塩基(例:アルカリ金属塩)などとの塩が用い られ、とりわけ生理学的に許容される酸付加 塩が好ましい。この様な塩としては、例えば 、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素� �、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢 酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイ ン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ 酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベ ンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる� �

 WDR6は、前述した哺乳動物の細胞または組 織から自体公知の蛋白質の精製方法によって 製造することができる。具体的には、哺乳動 物の組織または細胞をホモジナイズし、低速 遠心により細胞デブリスを除去した後、上清 を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ(� �要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜� �分を精製し)、該画分を逆相クロマトグラフ� ��ー、イオン交換クロマトグラフィー、アフ� ��ニティークロマトグラフィーなどのクロマ� ��グラフィー等に付すことによりWDR6またはそ の塩を調製することができる。

 WDR6またはその部分ペプチドは、公知のペプ チド合成法に従って製造することもできる(� �下、これらの化学合成の説明においては、� �にことわらない限り、WDR6およびその部分ペ� ��チドを包括して、単にWDR6という)。
 ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、� ��相合成法のいずれであってもよい。WDR6を構 成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残 余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する 場合は保護基を脱離することにより目的とす る蛋白質を製造することができる。
 ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知� ��方法、例えば、以下の(1)および(2)に記載さ� ��た方法に従って行われる。
(1) M. BodanszkyおよびM.A. Ondetti, Peptide Synthesi s, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Pre ss, New York (1965年)

 このようにして得られたWDR6は、公知の精製 法により精製単離することができる。ここで 、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留 、カラムクロマトグラフィー、液体クロマト グラフィー、再結晶、これらの組み合わせな どが挙げられる。
 上記方法で得られるWDR6が遊離体である場合 には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに 準じる方法によって適当な塩に変換すること ができるし、逆にWDR6が塩として得られた場� �には、該塩を公知の方法あるいはそれに準� �る方法によって遊離体または他の塩に変換� �ることができる。

 WDR6の合成には、通常市販の蛋白質合成用 樹脂を用いることができる。そのような樹脂 としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒド ロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹 脂、アミノメチル樹脂、4-ベンジルオキシベ� ��ジルアルコール樹脂、4-メチルベンズヒド� �ルアミン樹脂、PAM樹脂、4-ヒドロキシメチル メチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポ リアクリルアミド樹脂、4-(2’,4’-ジメトキ� �フェニル-ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂 、4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノエ チル)フェノキシ樹脂などを挙げることがで� �る。このような樹脂を用い、α-アミノ基と� �鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目� �とするWDR6の配列通りに、自体公知の各種縮� ��方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の� ��後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に� ��種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で� ��子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、� ��的のWDR6またはそのアミド体を取得する。

 上記した保護アミノ酸の縮合に関しては� ��蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を� ��いることができるが、特に、カルボジイミ� ��類がよい。カルボジイミド類としては、DCC� ��N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エ� ��ル-N’-(3-ジメチルアミノプロリル)カルボジ イミドなどが用いられる。これらによる活性 化にはラセミ化抑制添加剤(例えば、HOBt、HOOB t)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加す� ��か、または、対称酸無水物またはHOBtエステ ルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保� ��アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添� ��することができる。

 保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に� ��いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用し� ��ることが知られている溶媒から適宜選択さ� ��うる。例えば、N,N-ジメチルホルムアミド,N, N-ジメチルアセトアミド,N-メチルピロリドン� ��どの酸アミド類、塩化メチレン,クロロホル ムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオ ロエタノールなどのアルコール類、ジメチル スルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジ ンなどのアミン類,ジオキサン,テトラヒドロ� ��ランなどのエーテル類、アセトニトリル,プ ロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチ ル,酢酸エチルなどのエステル類あるいはこ� �らの適宜の混合物などが用いられる。反応� �度は蛋白質結合形成反応に使用され得るこ� �が知られている範囲から適宜選択され、通� �約-20℃~50℃の範囲から適宜選択される。活� �化されたアミノ酸誘導体は通常1.5~4倍過剰で 用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテス トの結果、縮合が不十分な場合には保護基の 脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すこと により十分な縮合を行なうことができる。反 応を繰り返しても十分な縮合が得られないと きには、無水酢酸またはアセチルイミダゾー ルを用いて未反応アミノ酸をアセチル化する ことができる。

 原料の反応に関与すべきでない官能基の保� ��ならびに保護基、およびその保護基の脱離� ��反応に関与する官能基の活性化などは公知� ��基または公知の手段から適宜選択しうる。
 原料のアミノ基の保護基としては、例えば� ��Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボ ニル、イソボルニルオキシカルボニル、4-メ� ��キシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z� �アダマンチルオキシカルボニル、トリフル� �ロアセチル、フタロイル、ホルミル、2-ニト ロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフ ィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
 カルボキシル基は、例えば、アルキルエス� ��ル化(例えば、メチル、エチル、プロピル、 ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチ ル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シク ロオクチル、2-アダマンチルなどの直鎖状、� ��枝状もしくは環状アルキルエステル化)、ア ラルキルエステル化(例えば、ベンジルエス� �ル、4-ニトロベンジルエステル、4-メトキシ� ��ンジルエステル、4-クロロベンジルエステ� �、ベンズヒドリルエステル化)、フェナシル� ��ステル化、ベンジルオキシカルボニルヒド� ��ジド化、ターシャリーブトキシカルボニル� ��ドラジド化、トリチルヒドラジド化などに� ��って保護することができる。
 セリンの水酸基は、例えば、エステル化ま� ��はエーテル化によって保護することができ� ��。このエステル化に適する基としては、例� ��ば、アセチル基などの低級アルカノイル基� ��ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジル� ��キシカルボニル基、エトキシカルボニル基� ��どの炭酸から誘導される基などが用いられ� ��。また、エーテル化に適する基としては、� ��えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル� ��、t-ブチル基などである。
 チロシンのフェノール性水酸基の保護基と� ��ては、例えば、Bzl、Cl ₂ -Bzl、2-ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリー� �チルなどが用いられる。
 ヒスチジンのイミダゾールの保護基として� ��、例えば、Tos、4-メトキシ-2,3,6-トリメチル� ��ンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメ� ��ル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。

 保護基の除去(脱離)方法としては、例え� �、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下� �の水素気流中での接触還元や、また、無水� �ッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオ� �メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸ある� �はこれらの混合液などによる酸処理や、ジ� �ソプロピルエチルアミン、トリエチルアミ� �、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基� �理、また液体アンモニア中ナトリウムによ� �還元なども用いられる。上記酸処理による� �離反応は、一般に約-20℃~40℃の温度で行な� �れるが、酸処理においては、例えば、アニ� �ール、フェノール、チオアニソール、メタ� �レゾール、パラクレゾール、ジメチルスル� �ィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチ オールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が 有効である。また、ヒスチジンのイミダゾー ル保護基として用いられる2,4-ジニトロフェ� �ル基はチオフェノール処理により除去され� �トリプトファンのインドール保護基として� �いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチ� ��ール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の 酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリ ウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ 処理によっても除去される。

 原料のカルボキシル基の活性化されたも� ��としては、例えば、対応する酸無水物、ア� ��ド、活性エステル〔アルコール(例えば、ペ ンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェ ノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメ� �ルアルコール、パラニトロフェノール、HONB� ��N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタ ルイミド、HOBt)とのエステル〕などが用いら� ��る。原料のアミノ基の活性化されたものと� ��ては、例えば、対応するリン酸アミドが用� ��られる。

 WDR6のアミド体を得る別の方法としては、例 えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα-カ ルボキシル基をアミド化して保護した後、ア ミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ば した後、該ペプチド鎖のN末端のα-アミノ基� �保護基のみを除いた蛋白質(ペプチド)とC末� �のカルボキシル基の保護基のみを除去した� �白質(ペプチド)とを製造し、この両蛋白質(� �プチド)を上記したような混合溶媒中で縮合� ��せる。縮合反応の詳細については上記と同� ��である。縮合により得られた保護蛋白質(保 護ペプチド)を精製した後、上記方法により� �べての保護基を除去し、所望の粗蛋白質(粗� ��プチド)を得ることができる。この粗蛋白質 (粗ペプチド)は既知の各種精製手段を駆使し� ��精製し、主要画分を凍結乾燥することで所� ��のWDR6のアミド体を得ることができる。
 WDR6のエステル体は、例えば、カルボキシ末 端アミノ酸のα-カルボキシル基を所望のアル コール類と縮合しアミノ酸エステルとした後 、上記WDR6のアミド体の場合と同様にして得� �ことができる。

 本発明の部分ペプチドは、WDR6の全長蛋白 質を適当なペプチダーゼで切断することによ っても製造することができる。

 さらに、WDR6は、それをコードする核酸を含 有する形質転換体を培養し、得られる培養物 からWDR6を分離精製することによって製造す� �こともできる。WDR6またはその部分ペプチド� ��コードする核酸はDNAであってもRNAであって� ��よく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい 。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸 は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい 。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまた はDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の� �合は、センス鎖(即ち、コード鎖)であっても 、アンチセンス鎖(即ち、非コード鎖)であっ� ��もよい。
 WDR6またはその部分ペプチドをコードするDNA としては、ゲノムDNA、温血動物(例えば、ヒ� �、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ� �イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス� �ウサギ、ハムスター、トリなど)のあらゆる� ��胞[例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グ リア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウ� ��細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上� ��細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線� ��芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免� ��細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、� ��チュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、� ��塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞 、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、 乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、または これら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン 細胞など]もしくはそれらの細胞が存在する� �らゆる組織[例えば、脳、脳の各部位(例、嗅 球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床 下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂� �、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺� �胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管(例、� ��腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下 腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子 宮、骨、関節、脂肪組織(例、褐色脂肪組織� �白色脂肪組織)、骨格筋など]由来のcDNA、合� �DNAなどが挙げられる。WDR6またはその部分ペ� ��チドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上 記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分 および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型� �して用い、Polymerase Chain Reaction(以下、「PCR� ��」と略称する)およびReverse Transcriptase-PCR(以 下、「RT-PCR法」と略称する)によって直接増� �することもできる。あるいは、WDR6またはそ� ��部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびc DNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノ ムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当な� �クター中に挿入して調製されるゲノムDNAラ� �ブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロ� ��ーもしくはプラークハイブリダイゼーショ� ��法またはPCR法などにより、それぞれクロー� ��ングすることもできる。ライブラリーに使� ��するベクターは、バクテリオファージ、プ� ��スミド、コスミド、ファージミドなどいず� ��であってもよい。

 WDR6をコードするDNAとしては、例えば、配列 番号:1で表される塩基配列を含有するDNA、ま� ��は配列番号:1で表される塩基配列とストリ� �ジェントな条件下でハイブリダイズする塩� �配列を含有し、前記したWDR6と実質的に同質� ��活性(例:IRS-4への結合活性、IRS-4のリン酸化� ��御活性など)を有する蛋白質をコードするDNA などが挙げられる。
 配列番号:1で表される塩基配列とストリン� �ェントな条件下でハイブリダイズできるDNA� �しては、例えば、配列番号:1で表される塩基 配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さら に好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90% 以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNA などが用いられる。
 本明細書における塩基配列の相同性は、相� ��性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center f or Biotechnology Information Basic Local Alignment Sea rch Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャッ プを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;� ��スマッチスコア=-3)にて計算することができ る。塩基配列の相同性を決定するための他の アルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配 列の相同性計算アルゴリズムが同様に好まし く例示される。

 ハイブリダイゼーションは、自体公知の方� ��あるいはそれに準じる方法、例えば、モレ� ��ュラー・クローニング(Molecular Cloning)第2版( J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press,  1989)に記載の方法などに従って行なうことが� ��きる。また、市販のライブラリーを使用す� ��場合、ハイブリダイゼーションは、添付の� ��用説明書に記載の方法に従って行なうこと� ��できる。ハイブリダイゼーションは、好ま� ��くは、ストリンジェントな条件に従って行� ��うことができる。
 ハイストリンジェントな条件としては、例� ��ば、6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)中45℃で� ��ハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC/0 .1% SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げ� �れる。当業者は、ハイブリダイゼーション� �液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の� �度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミス� �ッチの数、ハイブリダイゼーション反応の� �間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜� �更することにより、所望のストリンジェン� �ーに容易に調節することができる。

 WDR6をコードするDNAは、好ましくは配列番 号:1で表される塩基配列で示されるヒトWDR6蛋 白質をコードする塩基配列を含有するDNA(GenBa nkアクセッション番号:AF099100)、あるいは他の 哺乳動物におけるそのホモログ[例えば、GenBa nkにそれぞれアクセッション番号AF348591およ� �XM_516448として登録されているマウスおよび� �ンパンジーホモログ等]である。

 本発明の部分ペプチドをコードするDNAは� ��配列番号:2で表されるアミノ酸配列の一部� �同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列� �有するペプチドをコードする塩基配列を含� �ものであればいかなるものであってもよい� �具体的には、本発明の部分ペプチドをコー� �するDNAとしては、例えば、(1)配列番号:1で表 される塩基配列の部分塩基配列を有するDNA、 または(2)配列番号:1で表される塩基配列を有� ��るDNAとストリンジェントな条件下でハイブ� ��ダイズする塩基配列を有し、前記したWDR6と 実質的に同質の活性(例:IRS-4への結合活性、IR S-4のリン酸化制御活性など)を有するペプチ� �をコードするDNAなどが用いられる。

 WDR6またはその部分ペプチドをコードする DNAは、該WDR6またはその部分ペプチドをコー� �する塩基配列の一部分を有する合成DNAプラ� �マーを用いてPCR法によって増幅するか、ま� �は適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、WD R6蛋白質の一部あるいは全領域をコードするD NA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイ� ��リダイゼーションすることによってクロー� ��ングすることができる。ハイブリダイゼー� ��ョンは、例えば、モレキュラー・クローニ� ��グ(Molecular Cloning)第2版(前述)に記載の方法� �どに従って行なうことができる。また、市� �のライブラリーを使用する場合、ハイブリ� �イゼーションは、該ライブラリーに添付さ� �た使用説明書に記載の方法に従って行なう� �とができる。

 DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、M utan ^TM -super Express Km(宝酒造(株))、Mutan ^TM -K(宝酒造(株))等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped� �duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるい� �それらに準じる方法に従って変換すること� �できる。

 クローン化されたDNAは、目的によりその� ��ま、または所望により制限酵素で消化する� ��、リンカーを付加した後に、使用すること� ��できる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コ ドンとしてのATGを有し、また3’末端側には� �訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有� �ていてもよい。これらの翻訳開始コドンや� �訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプター� �用いて付加することができる。

 WDR6またはその部分ペプチドをコードするDNA を含む発現ベクターは、例えば、WDR6をコー� �するDNAから目的とするDNA断片を切り出し、� �DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモー� �ーの下流に連結することにより製造するこ� �ができる。
 発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラ� ��ミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13);枯草菌由来の プラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194);酵母由来プラ� ��ミド(例、pSH19,pSH15);昆虫細胞発現プラスミ� �(例:pFast-Bac);動物細胞発現プラスミド(例:pA1-1 1、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);λファージな どのバクテリオファージ;バキュロウイルス� �どの昆虫ウイルスベクター(例:BmNPV、AcNPV);レ トロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ ウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが 用いられる。
 プロモーターとしては、遺伝子の発現に用� ��る宿主に対応して適切なプロモーターであ� ��ばいかなるものでもよい。
 例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプ ロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモー� �ー、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター 、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMu LV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV-TK(� ��純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロ モーターなどが用いられる。なかでも、CMVプ ロモーター、SRαプロモーターなどが好まし� �。
 宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプ� ��モーター、lacプロモーター、recAプロモータ ー、λP _L プロモーター、lppプロモーター、T7プロモー� ��ーなどが好ましい。
 宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモ ーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター� ��どが好ましい。
 宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、 PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモ ーターなどが好ましい。
 宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリン� ��ロモーター、P10プロモーターなどが好まし� ��。

 発現ベクターとしては、上記の他に、所望� ��よりエンハンサー、スプライシングシグナ� ��、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40� �製起点(以下、SV40 oriと略称する場合がある) などを含有しているものを用いることができ る。選択マーカーとしては、例えば、ジヒド ロ葉酸還元酵素遺伝子(以下、dhfrと略称する� ��合がある、メソトレキセート(MTX)耐性)、ア� ��ピシリン耐性遺伝子(以下、amp ^r と略称する場合がある)、ネオマイシン耐性� �伝子(以下、neo ^r と略称する場合がある、G418耐性)等が挙げら� ��る。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハム スター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカ� �として使用する場合、チミジンを含まない� �地によって目的遺伝子を選択することもで� �る。
 また、必要に応じて、宿主に合ったシグナ� ��配列をコードする塩基配列(シグナルコドン )を、WDR6またはその部分ペプチドをコードす� ��DNAの5’末端側に付加(またはネイティブな� �グナルコドンと置換)してもよい。例えば、� ��主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シ グナル配列、OmpA・シグナル配列などが;宿主� ��バチルス属菌である場合、α-アミラーゼ・� ��グナル配列、サブチリシン・シグナル配列� ��どが;宿主が酵母である場合、MFα・シグナ� �配列、SUC2・シグナル配列などが;宿主が動物 細胞である場合、インスリン・シグナル配列 、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体 分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられ る。

 上記したWDR6またはその部分ペプチドをコー ドするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転 換し、得られる形質転換体を培養することに よって、WDR6またはその部分ペプチドを製造� �ることができる。
 宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌� ��バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動� ��細胞などが用いられる。
 エシェリヒア属菌としては、例えば、エシ� ��リヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシ ージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ ミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユ ーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),60巻,160 ( 1968)〕,エシェリヒア・コリJM103〔ヌクレイッ� ��・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Research),9 巻,309 (1981)〕,エシェリヒア・コリJA221〔ジャ ーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー (Journal of Molecular Biology),120巻,517 (1978)〕,エ� ��ェリヒア・コリHB101〔ジャーナル・オブ・� �レキュラー・バイオロジー,41巻,459 (1969)〕,� ��シェリヒア・コリC600〔ジェネティックス(Ge netics),39巻,440 (1954)〕などが用いられる。
 バチルス属菌としては、例えば、バチルス� ��サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン (Gen e),24巻,255 (1983)〕,バチルス・サブチルス207-21 〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Jo urnal of Biochemistry),95巻,87 (1984)〕などが用い� ��れる。
 酵母としては、例えば、サッカロマイセス� ��セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R ^- ,NA87-11A,DKD-5D,20B-12、シゾサッカロマイセス・� ��ンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピ� ��ア・パストリス(Pichia pastoris)KM71などが用い られる。

 昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNP Vの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera  frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由� ��のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five ^TM 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acr ea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがB mNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化� �胞(Bombyx mori N 細胞;BmN細胞)などが用いられ る。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC  CRL1711)、Sf21細胞(以上、Vaughn, J.L.ら、イン・� ��ィボ(In Vivo),13, 213-217,(1977))などが用いられ る。
 昆虫としては、例えば、カイコの幼虫など� ��用いられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315� ��,592 (1985)〕。

 動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞� �サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣� ��胞(以下、CHO細胞と略記)、dhfr遺伝子欠損CHO� ��胞(以下、CHO(dhfr ^- )細胞と略記)、マウスL細胞,マウスAtT-20細胞� �マウスミエローマ細胞,ラットGH3細胞、ヒトF L細胞などが用いられる。

 形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方� ��に従って実施することができる。
 エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージ� ��グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー� ��オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエ� ��エー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),69巻,2110 (1972)� ��ジーン(Gene),17巻,107 (1982)などに記載の方法� ��従って形質転換することができる。
 バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・� ��ンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecu lar & General Genetics),168巻,111 (1979)などに� �載の方法に従って形質転換することができ� �。
 酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザ� ��モロジー(Methods in Enzymology),194巻,182-187 (199 1)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ� ��・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ� ��・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA ),75巻,1929 (1978)などに記載の方法に従って形� ��転換することができる。
 昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ/テ クノロジー(Bio/Technology),6巻,47-55 (1988)などに� ��載の方法に従って形質転換することができ� ��。
 動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細� ��工学実験プロトコール,263-267 (1995)(秀潤社� �行)、ヴィロロジー(Virology),52巻,456 (1973)に記 載の方法に従って形質転換することができる 。

 形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、� ��知の方法に従って実施することができる。
 例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバ� ��ルス属菌である形質転換体を培養する場合� ��培養に使用される培地としては液体培地が� ��ましい。また、培地は、形質転換体の生育� ��必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有� ��ることが好ましい。ここで、炭素源として� ��、例えば、グルコース、デキストリン、可� ��性澱粉、ショ糖などが;窒素源としては、例 えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーン スチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉 エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無 機または有機物質が;無機物としては、例え� �、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウ� �、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げら� �る。また、培地には、酵母エキス、ビタミ� �類、生長促進因子などを添加してもよい。� �地のpHは、好ましくは約5~約8である。
 宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体� ��培養する場合の培地としては、例えば、グ� ��コース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(M iller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ� �イン・モレキュラー・ジェネティックス (Jo urnal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433,� �Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好 ましい。必要により、プロモーターを効率よ く働かせるために、例えば、3β-インドリル� �クリル酸のような薬剤を培地に添加しても� �い。
 宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体� ��培養は、通常約15~約43℃で、約3~約24時間行� ��われる。必要により、通気や撹拌を行って� ��よい。
 宿主がバチルス属菌である形質転換体の培� ��は、通常約30~約40℃で、約6~約24時間行なわ� ��る。必要により、通気や撹拌を行ってもよ� ��。
 宿主が酵母である形質転換体を培養する場� ��の培地としては、例えば、バークホールダ� ��(Burkholder)最小培地〔Bostian, K.L.ら,プロシー� ��ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ� ��・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユー� ��スエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),77巻,4505 (198 0)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter,  G.A.ら,プロシージングズ・オブ・ザ・ナシ� �ナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ� �オブ・ザ・ユーエスエー(Proc. Natl. Acad. Sci.  USA),81巻,5330 (1984)〕などが挙げられる。培� �のpHは、好ましくは約5~約8である。培養は、 通常約20℃~約35℃で、約24~約72時間行なわれ� �。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよ� �。
 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換� ��を培養する場合の培地としては、例えばGrac e's Insect Medium〔Grace, T.C.C.,ネイチャー(Nature) ,195巻,788 (1962)〕に非働化した10%ウシ血清等� �添加物を適宜加えたものなどが用いられる� �培地のpHは、好ましくは約6.2~約6.4である。� �養は、通常約27℃で、約3~約5日間行なわれる 。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
 宿主が動物細胞である形質転換体を培養す� ��場合の培地としては、例えば、約5~約20%の� �児ウシ血清を含む最小必須培地(MEM)〔サイエ ンス(Science),122巻,501 (1952)〕,ダルベッコ改変� ��ーグル培地(DMEM)〔ヴィロロジー(Virology),8巻, 396 (1959)〕,RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ� �ザ・アメリカン・メディカル・アソシエー� �ョン(The Journal of the American Medical Associatio n),199巻,519 (1967)〕,199培地〔プロシージング� �オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バ� �オロジカル・メディスン(Proceeding of the Soci ety for the Biological Medicine),73巻,1 (1950)〕な� �が用いられる。培地のpHは、好ましくは約6~� ��8である。培養は、通常約30℃~約40℃で、約1 5~約60時間行なわれる。必要に応じて通気や� �拌を行ってもよい。
 以上のようにして、形質転換体の細胞内ま� ��は細胞外にWDR6(またはRAIG3)類を製造せしめ� �ことができる。

 前記形質転換体を培養して得られる培養物� ��らWDR6またはその部分ペプチドを自体公知の 方法に従って分離精製することができる。
 例えば、WDR6またはその部分ペプチドを培養 菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合 、培養物から公知の方法で集めた菌体あるい は細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リ ゾチームおよび/または凍結融解などによっ� �菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離� �ろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る� �法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿� �や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、� �リトンX-100 ^TM などの界面活性剤を含んでいてもよい。一方 、膜画分からWDR6またはその部分ペプチドを� �出する場合は、上記と同様に菌体あるいは� �胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリス� �沈澱除去し、上清を高速遠心して細胞膜含� �画分を沈澱させる(必要に応じて密度勾配遠� ��などにより細胞膜画分を精製する)などの方 法が用いられる。また、WDR6またはその部分� �プチドが菌体(細胞)外に分泌される場合には 、培養物から遠心分離またはろ過等により培 養上清を分取するなどの方法が用いられる。
 このようにして得られた可溶性画分、膜画� ��あるいは培養上清中に含まれるWDR6またはそ の部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方 法に従って行うことができる。このような方 法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度 を利用する方法;透析法、限外ろ過法、ゲル� �過法、およびSDS-ポリアクリルアミドゲル電� ��泳動法などの主として分子量の差を利用す� ��方法;イオン交換クロマトグラフィーなどの 荷電の差を利用する方法;アフィニティーク� �マトグラフィーなどの特異的親和性を利用� �る方法;逆相高速液体クロマトグラフィーな� ��の疎水性の差を利用する方法;等電点電気泳 動法などの等電点の差を利用する方法;など� �用いられる。これらの方法は、適宜組み合� �せることもできる。

 かくして得られる蛋白質またはペプチドが� ��離体である場合には、自体公知の方法ある� ��はそれに準じる方法によって、該遊離体を� ��に変換することができ、蛋白質またはペプ� ��ドが塩として得られた場合には、自体公知� ��方法あるいはそれに準じる方法により、該� ��を遊離体または他の塩に変換することがで� ��る。
 なお、形質転換体が産生するWDR6またはその 部分ペプチドを、精製前または精製後に適当 な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任 意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。該蛋白修飾酵素と しては、例えば、トリプシン、キモトリプシ ン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテ インキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いら れる。
 かくして得られるWDR6またはその部分ペプチ ドの存在は、WDR6に対する抗体を用いたエン� �イムイムノアッセイやウエスタンブロッテ� �ングなどにより確認することができる。

 さらに、WDR6またはその部分ペプチドは、上 記のWDR6またはその部分ペプチドをコードす� �DNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状� �血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、� �腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質� �訳系を用いてインビトロ合成することがで� �る。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含� �無細胞転写/翻訳系を用いて、WDR6またはその 部分ペプチドをコードするDNAを鋳型としても 合成することができる。無細胞蛋白質転写/� �訳系は市販のものを用いることもできるし� �それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽� �液はPratt J.M.ら, “Transcription and Tranlation” , Hames B.D.およびHiggins S.J.編, IRL Press, Oxfor d 179-209 (1984) に記載の方法等に準じて調製� ��ることもできる。市販の細胞ライセートと� ��ては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract  system (Promega社製) やRTS 500 Rapid Tranlation Sys tem (Roche社製) 等が挙げられ、ウサギ網状赤� ��球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System� �(Promega社製) 等、さらにコムギ胚芽由来のも のはPROTEIOS ^TM  (TOYOBO社製) 等が挙げられる。このうちコム ギ胚芽ライセートを用いたものが好適である 。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、 例えばJohnston F.B.ら, Nature, 179, 160-161 (1957)� �あるいはErickson A.H.ら, Meth. Enzymol., 96, 38-5 0 (1996) 等に記載の方法を用いることができ� ��。
 蛋白質合成のためのシステムまたは装置と� ��ては、バッチ法(Pratt,J.M.ら (1984) 前述)や、 アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系 に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム (Spirin A.S.ら, Science, 242, 1162-1164 (1988))、透� ��法(木川ら、第21回日本分子生物学会、WID6)� �あるいは重層法(PROTEIOS ^TM Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱� ��明書:TOYOBO社製)等が挙げられる。さらには� �合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネ� �ギー源等を必要時に供給し、合成物や分解� �を必要時に排出する方法(特開2000-333673)等を� ��いることができる。

 本発明において「WDR6の発現を抑制する物 質」とは、WDR6遺伝子の転写レベル、転写後� �節のレベル、蛋白質への翻訳レベル、翻訳� �修飾のレベル等のいかなる段階で作用する� �のであってもよい。従って、WDR6の発現を抑� ��する物質としては、例えば、該遺伝子の転� ��を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへの プロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞� �への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進� ��る物質、mRNAから蛋白質への翻訳を阻害する 物質、WDR6ポリペプチドの翻訳後修飾を阻害� �る物質などが含まれる。いずれの段階で作� �するものであっても好ましく用いることが� �きるが、WDR6蛋白質の産生を直接的に阻害す� ��という意味では、mRNAから蛋白質への翻訳を 阻害する物質が好ましい。

 WDR6のmRNAから蛋白質への翻訳を特異的に� �害する物質として、好ましくは、該mRNAの塩� ��配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩� ��配列またはその一部を含む核酸が挙げられ� ��。

 WDR6蛋白質、即ち配列番号:2で表されるアミ� ��酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ� ��酸配列を含有する蛋白質、をコードする塩� ��配列またはその一部、あるいは該塩基配列� ��相補的な塩基配列またはその一部を含有す� ��核酸とは、前述のWDR6またはその部分ペプチ ドをコードする核酸だけではなく、フレーム の合わない塩基配列をも含む意味で用いられ る。
 目的核酸の標的領域と相補的もしくは実質� ��に相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目� ��核酸とハイブリダイズすることができる核� ��は、該目的核酸に対して「アンチセンス」� ��あるということができる。一方、目的核酸� ��標的領域と相同性を有する塩基配列を含む� ��酸は、該目的核酸に対して「センス」であ� ��ということができる。ここで「相同性を有� ��る」とは、塩基配列間で約70%以上、好まし� ��は約80%以上、より好ましくは約90%以上、最� ��好ましくは約95%以上の同一性または相補性� ��有することをいい、「実質的に相補的であ� ��」とは、塩基配列間で約70%以上、好ましく� ��約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も� ��ましくは約95%以上の相補性を有することを� ��う。

 好ましくは、WDR6蛋白質をコードする塩基配 列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配 列としては、(a)配列番号:1で表される塩基配� ��または(b)該塩基配列の相補鎖配列とハイス� ��リンジェントな条件下でハイブリダイズす� ��塩基配列であって、配列番号:2で表される� �ミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質� �活性を有する蛋白質をコードする配列と、� �補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が� �げられる。ここで「実質的に同質の活性」� �は前記と同義である。
 ハイストリンジェントな条件としては、例� ��ば、6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)中45℃で� ��ハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC/0 .1% SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げ� �れる。

 より好ましくは、WDR6蛋白質をコードする 塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な 塩基配列としては、(a)配列番号:1で表される� ��トWDR6 mRNAの塩基配列、または他の哺乳動物 におけるそのホモログ、さらにはそれらの天 然のアレル変異体のmRNA配列と、相補的もし� �は実質的に相補的な塩基配列が挙げられる� �

 「WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは� �質的に相補的な塩基配列の一部」とは、WDR6� ��mRNAに特異的に結合することができ、且つ該 mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害し得るも� �であれば、その長さや位置に特に制限はな� �が、配列特異性の面から、標的配列に相補� �もしくは実質的に相補的な部分を少なくと� �10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より� ��ましくは約20塩基以上含むものである。

 具体的には、WDR6のmRNAの塩基配列と相補的� �しくは実質的に相補的な塩基配列またはそ� �一部を含む核酸(以下、「WDR6に対するアンチ センス核酸」、「本発明のアンチセンス核酸 」ともいう)として、以下の(i)~(iii)のいずれ� �のものが好ましく例示される。
(i) WDR6のmRNAに対するアンチセンス核酸(=狭義 のアンチセンス核酸)
(ii) WDR6のmRNAに対するsiRNA
(iii) WDR6のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸

(i) WDR6のmRNAに対する(狭義の)アンチセンス核 酸
 本発明における、WDR6のmRNAに対する「狭義� �」アンチセンス核酸とは、該mRNAの塩基配列� ��相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列� ��たはその一部を含む核酸であって、標的mRNA と特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合 することにより、タンパク質合成を抑制する 機能を有するものである(以下、本項目(i)に� �いて「本発明のアンチセンス核酸」という� �合は、狭義のWDR6に対するアンチセンス核酸� ��意味し、それ以外の部分で「本発明のアン� ��センス核酸」という場合は、特に断らない� ��り、WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは� �質的に相補的な塩基配列またはその一部を� �む核酸を包括的に指す用語として用いられ� �)。
 アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボー� �を含有しているポリデオキシリボヌクレオ� �ド、D-リボースを含有しているポリリボヌク レオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-� ��リコシドであるその他のタイプのポリヌク� ��オチド、非ヌクレオチド骨格を有するその� ��のポリマー(例えば、市販のタンパク質核酸 および合成配列特異的な核酸ポリマー)また� �特殊な結合を含有するその他のポリマー(但� ��、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるよう� ��塩基のペアリングや塩基の付着を許容する� ��置をもつヌクレオチドを含有する)などが挙 げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、 二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドで� �ってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチ� �(または非修飾オリゴヌクレオチド)、公知の 修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知 られた標識のあるもの、キャップの付いたも の、メチル化されたもの、1個以上の天然の� �クレオチドを類縁物で置換したもの、分子� �ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非� �電結合(例えば、メチルホスホネート、ホス� ��トリエステル、ホスホルアミデート、カル� ��メートなど)を持つもの、電荷を有する結合 または硫黄含有結合(例、ホスホロチオエー� �、ホスホロジチオエートなど)を持つもの、� ��えばタンパク質(例、ヌクレアーゼ、ヌクレ アーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シ グナルペプチド、ポリ-L-リジンなど)や糖(例� ��モノサッカライドなど)などの側鎖基を有し ているもの、インターカレント化合物(例、� �クリジン、ソラレンなど)を持つもの、キレ� ��ト化合物(例えば、金属、放射活性をもつ金 属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有する� �の、アルキル化剤を含有するもの、修飾さ� �た結合を持つもの(例えば、α-アノマー型の� ��酸など)であってもよい。ここで「ヌクレオ シド」、「ヌクレオチド」および「核酸」と は、プリンおよびピリミジン塩基を含有する のみでなく、修飾されたその他の複素環型塩 基をもつようなものを含んでいて良い。この ような修飾物は、メチル化されたプリンおよ びピリミジン、アシル化されたプリンおよび ピリミジン、あるいはその他の複素環を含む ものであってよい。修飾されたヌクレオシド および修飾されたヌクレオチドはまた糖部分 が修飾されていてよく、例えば、1個以上の� �酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換� �れていたり、またはエーテル、アミンなど� �官能基に変換されていてよい。

 上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであ� ��てもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメ ラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの 場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形 成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase H に認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起 こすことができる。したがって、RNase Hによ� ��分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標� ��配列は、mRNA中の配列だけでなく、WDR6遺伝� �の初期翻訳産物におけるイントロン領域の� �列であってもよい。例えば、ヒトの場合、WD R6遺伝子は第3番染色体の3p21.31領域に存在す� �ので、この領域のゲノム配列と、配列番号:1 で表されるヒトWDR6 cDNA塩基配列とをBLAST、FAS TA等のホモロジー検索プログラムを用いて比� ��して、イントロン配列を決定することがで� ��る。

 本発明のアンチセンス核酸の標的領域は� ��該アンチセンス核酸がハイブリダイズする� ��とにより、結果としてWDR6タンパク質への翻 訳が阻害されるものであればその長さに特に 制限はなく、これらタンパク質をコードする mRNAの全配列であっても部分配列であっても� �く、短いもので約10塩基程度、長いものでmRN Aもしくは初期転写産物の全配列が挙げられ� �。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の� �題等を考慮すれば、約10~約40塩基、特に約15~ 約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ま� ��いが、それに限定されない。具体的には、W DR6遺伝子の5'端ヘアピンループ、5'端6-ベース ペア・リピート、5'端非翻訳領域、翻訳開始� ��ドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止� ��ドン、3'端非翻訳領域、3'端パリンドローム 領域または3'端ヘアピンループなどが、アン� ��センス核酸の好ましい標的領域として選択� ��うるが、それらに限定されない。

 さらに、本発明のアンチセンス核酸は、W DR6のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズし� �タンパク質への翻訳を阻害するだけでなく� �二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して� �重鎖(トリプレックス)を形成し、RNAへの転写 を阻害し得るもの(アンチジーン)であっても� ��い。

 アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド� ��子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、� ��定性(化学的および/または対酵素)や比活性( RNAとの親和性)を向上させるために、種々の� �学修飾を含むことができる。例えば、ヌク� �アーゼなどの加水分解酵素による分解を防� �ために、アンチセンス核酸を構成する各ヌ� �レオチドのリン酸残基(ホスフェート)を、例 えば、ホスホロチオエート(PS)、メチルホス� �ネート、ホスホロジチオネートなどの化学� �飾リン酸残基に置換することができる。ま� �、各ヌクレオチドの糖(リボース)の2'位の水� ��基を、-OR(Rは、例えばCH ₃ (2'-O-Me)、CH ₂ CH ₂ OCH ₃ (2'-O-MOE)、CH ₂ CH ₂ NHC(NH)NH ₂ 、CH ₂ CONHCH ₃ 、CH ₂ CH ₂ CN等を示す)に置換してもよい。さらに、塩基 部分(ピリミジン、プリン)に化学修飾を施し� ��もよく、例えば、ピリミジン塩基の5位への メチル基やカチオン性官能基の導入、あるい は2位のカルボニル基のチオカルボニルへの� �換などが挙げられる。

 RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-end o(S型)とC3'-endo(N型)の2つが支配的であり、一� �鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが� �二本鎖を形成するとN型に固定される。した� ��って、標的RNAに対して強い結合能を付与す� ��ために、2'酸素と4’炭素を架橋することに� ��り、糖部のコンフォーメーションをN型に固 定したRNA誘導体であるBNA(LNA)(Imanishi, T. et al ., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al.,  Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004)やENA(Morita, K.  et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 16 19-21, 2003)もまた、好ましく用いられ得る。

 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチ� ��は、WDR6のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配� �に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的� ��列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機(アプ� �イド・バイオシステムズ社、ベックマン社� �)を用いて、これに相補的な配列を合成する� ��とにより調製することができる。また、上� ��した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、� ��ずれも自体公知の手法により、化学的に合� ��することができる。

(ii) WDR6のmRNAに対するsiRNA
 本明細書においては、WDR6のmRNAに相補的な� �リゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、� �わゆるsiRNAもまた、WDR6のmRNAの塩基配列と相� ��的もしくは実質的に相補的な塩基配列また� ��その一部を含む核酸に包含されるものとし� ��定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入� ��るとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、い わゆるRNA干渉(RNAi)と呼ばれる現象は、以前か ら線虫、昆虫、植物等で知られていたが、こ の現象が動物細胞でも広く起こることが確認 されて以来[Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リ� ��ザイムの代替技術として汎用されている。s iRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づい� ��、市販のソフトウェア(例:RNAi Designer; Invitr ogen)を用いて適宜設計することができる。

 siRNAを構成するリボヌクレオシド分子も� �た、安定性、比活性などを向上させるため� �、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の� �飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、 天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子 を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる� �合があるので、RISC複合体が機能できる最小� ��の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。

 siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及び� ��ンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ 合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90~ 約95℃で約1分程度変性させた後、約30~約70℃� ��約1~約8時間アニーリングさせることにより� ��製することができる。また、siRNAの前駆体� �なるショートヘアピンRNA(shRNA)を合成し、こ� ��をダイサー(dicer)を用いて切断することによ り調製することもできる。

(iii) WDR6のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
 本明細書においては、生体内で上記のWDR6の mRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザイン された核酸もまた、WDR6のmRNAの塩基配列と相� ��的もしくは実質的に相補的な塩基配列また� ��その一部を含む核酸に包含されるものとし� ��定義される。そのような核酸としては、上� ��したshRNAやそれを発現するように構築され� �発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRN A上の標的配列のセンス鎖およびアンチセン� �鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ(例� ��ば15から25塩基程度)のスペーサー配列を間� �挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNA� �デザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成� ��ることにより調製することができる。shRNA� �発現カセットを含む発現ベクターは、上記sh RNAをコードする二本鎖DNAを常法により作製し た後、適当な発現ベクター中に挿入すること により調製することができる。shRNAの発現ベ� ��ターとしては、U6やH1などのPol III系プロモ� ��ターを有するものが用いられ得る。この場� ��、該発現ベクターを導入された動物細胞内� ��転写されたshRNAは、自身でループを形成し� �後に、内在の酵素ダイサー(dicer)などによっ� ��プロセシングされることにより成熟siRNAが� �成される。

 WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実� �的に相補的な塩基配列またはその一部を含� �核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコ� ��ド領域の内部で特異的に切断し得るリボザ� ��ムが挙げられる。「リボザイム」とは、狭� ��には、核酸を切断する酵素活性を有するRNA� ��いうが、本明細書では配列特異的な核酸切� ��活性を有する限りDNAをも包含する概念とし� ��用いるものとする。リボザイムとして最も� ��用性の高いものとしては、ウイロイドやウ� ��ルソイド等の感染性RNAに見られるセルフス� ��ライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型や� ��アピン型等が知られている。ハンマーヘッ� ��型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハ� �マーヘッド構造をとる部分に隣接する両端� �数塩基ずつ(合わせて約10塩基程度)をmRNAの所 望の切断部位と相補的な配列にすることによ り、標的mRNAのみを特異的に切断することが� �能である。このタイプのリボザイムは、RNA� �みを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃する� �とがないというさらなる利点を有する。WDR6� �mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNA� ��リカーゼと特異的に結合し得るウイルス核� ��由来のRNAモチーフを連結したハイブリッド� ��ボザイムを用いることにより、標的配列を� ��本鎖にすることができる[Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 98(10): 5572-5577 (2001)]。さらに、リボザ イムを、それをコードするDNAを含む発現ベク ターの形態で使用する場合には、転写産物の 細胞質への移行を促進するために、tRNAを改� �した配列をさらに連結したハイブリッドリ� �ザイムとすることもできる[Nucleic Acids Res.,� �29(13): 2780-2788 (2001)]。

 WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実� �的に相補的な塩基配列またはその一部を含� �核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのよ� �な特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療� �適用されたり、付加された形態で与えられ� �ことができうる。こうして付加形態で用い� �れるものとしては、リン酸基骨格の電荷を� �和するように働くポリリジンのようなポリ� �チオン体、細胞膜との相互作用を高めたり� �核酸の取込みを増大せしめるような脂質(例� ��ホスホリピド、コレステロールなど)などの 疎水性のものが挙げられる。付加するに好ま しい脂質としては、コレステロールやその誘 導体(例、コレステリルクロロホルメート、� �ール酸など)が挙げられる。こうしたものは� ��核酸の3'端または5'端に付着させることがで き、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介 して付着させることができうる。その他の基 としては、核酸の3'端または5'端に特異的に� �置されたキャップ用の基で、エキソヌクレ� �ーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を 阻止するためのものが挙げられる。こうした キャップ用の基としては、ポリエチレングリ コール、テトラエチレングリコールなどのグ リコールをはじめとした当該分野で知られた 水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定 されるものではない。

 これらの核酸のWDR6タンパク質発現阻害活 性は、WDR6遺伝子を導入した形質転換体、生� �内や生体外のWDR6遺伝子発現系、または生体� ��や生体外のWDR6タンパク質翻訳系を用いて調 べることができる。

 本発明におけるWDR6の発現を抑制する物質 は、上記のようなWDR6のmRNAの塩基配列と相補� ��もしくは実質的に相補的な塩基配列または� ��の一部を含む核酸に限定されず、WDR6タンパ ク質の産生を直接的または間接的に阻害する 限り、低分子化合物などの他の物質であって もよい。そのような物質は、例えば、後述す る本発明のスクリーニング方法により取得す ることができる。

 本発明において「WDR6の活性を抑制する物 質」とは、いったん機能的に産生されたWDR6� �ンパク質が、IRS-4と相互作用して該分子のリ ン酸化を制御する作用を抑制する限り、いか なるものであってもよく、例えば、WDR6とIRS-4 との複合体形成を阻害する物質や、WDR6のIRS-4 に対するリン酸化制御活性を阻害する物質等 が挙げられる。

 具体的には、WDR6の活性を抑制する物質とし て、例えば、WDR6に対する中和抗体が挙げら� �る。該抗体はポリクローナル抗体、モノク� �ーナル抗体の何れであってもよい。これら� �抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製� �法に従って製造することができる。抗体の� �イソタイプは特に限定されないが、好まし� �はIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙� �られる。また、該抗体は、標的抗原を特異� �に認識し結合するための相補性決定領域(CDR) を少なくとも有するものであれば特に制限は なく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F( ab’) ₂ 等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディ� ��、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製� ��れたコンジュゲート分子、あるいはポリエ� ��レングリコール(PEG)等のタンパク質安定化� �用を有する分子等で修飾されたそれらの誘� �体などであってもよい。
 以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、お� ��び該抗体の製造法について説明する。

(1)抗原の調製
 本発明の抗体を調製するために使用される� ��原としては、上記したWDR6蛋白質またはその 部分ペプチド(以下、抗体の説明においては� �特にことわらない限り、これらを包括して� �に「WDR6」という)、あるいはそれと同一の抗 原決定基を1種あるいは2種以上有する(合成)� �プチドなど、何れのものも使用することが� �きる(以下、これらを単に本発明の抗原と称� ��ることもある)。
 WDR6は、上記した通り、例えば、(a)哺乳動物 の組織または細胞から公知の方法あるいはそ れに準ずる方法を用いて調製、(b)ペプチド・ シンセサイザー等を使用する公知のペプチド 合成方法で化学的に合成、(c)WDR6をコードす� �DNAを含有する形質転換体を培養、あるいは(d )WDR6をコードする核酸を鋳型として無細胞転� ��/翻訳系を用いて生化学的に合成することに よって製造される。
(a)哺乳動物の組織または細胞からWDR6を調製� �る場合、その組織または細胞をホモジナイ� �した後、粗分画物(例、膜画分、可溶性画分) をそのまま抗原として用いることもできる。 あるいは酸、界面活性剤またはアルコールな どで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、 ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン 交換クロマトグラフィー、アフィニティーク ロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー を組み合わせることにより精製単離すること もできる。得られたWDR6をそのまま免疫原と� �ることもできるし、ペプチダーゼ等を用い� �限定分解により部分ペプチドを調製してそ� �を免疫原とすることもできる。
(b)化学的に本発明の抗原を調製する場合、該 合成ペプチドとしては、例えば上述の(a)の方 法を用いて天然材料より精製したWDR6と同一� �構造を有するもの、具体的には、WDR6のアミ� ��酸配列において少なくとも3個以上、好まし くは6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所� �アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を1種あ� ��いは2種以上含有するペプチドなどが用いら れる。
(c)DNAを含有する形質転換体を用いて本発明の 抗原を製造する場合、該DNAは、公知のクロー ニング方法〔例えば、Molecular Cloning 2nd ed.(J . Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 198 9)に記載の方法など〕に従って作製すること� ��できる。該クローニング方法とは、(1)WDR6を コードする遺伝子配列に基づきデザインした DNAプローブを用い、ヒトcDNAライブラリーか� �ハイブリダイゼーション法により該抗原を� �ードするDNAを単離するか、(2)WDR6をコードす� ��遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプライ� ��ーを用い、哺乳動物由来のcDNAを鋳型として PCR法により該抗原をコードするDNAを調製し、 該DNAを宿主に適合する発現ベクターに挿入す る方法などが挙げられる。該発現ベクターで 宿主を形質転換して得られる形質転換体を適 当な培地中で培養することにより、所望の抗 原を得ることができる。
(d)無細胞転写/翻訳系を利用する場合、上記(c )と同様の方法により調製した抗原をコード� �るDNAを挿入した発現ベクター(例えば、該DNA� ��T7、SP6プロモーター等の制御下におかれた� �現ベクターなど)を鋳型とし、該プロモータ� ��に適合するRNAポリメラーゼおよび基質(NTPs)� ��含む転写反応液を用いてmRNAを合成した後、 該mRNAを鋳型として公知の無細胞翻訳系(例:大 腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽 出液)を用いて翻訳反応を行わせる方法など� �挙げられる。塩濃度等を適当に調整するこ� �により、転写反応と翻訳反応を同一反応液� �で一括して行うこともできる。

 免疫原としては完全なWDR6蛋白質分子やそ の部分アミノ酸配列を有するペプチドを用い ることができる。部分アミノ酸配列としては 、例えば3個以上の連続するアミノ酸残基か� �なるもの、好ましくは4個以上、より好まし� ��は5個以上、いっそう好ましくは6個以上の� �続するアミノ酸残基からなるものが挙げら� �る。あるいは、該アミノ酸配列としては、� �えば20個以下の連続するアミノ酸残基からな るもの、好ましくは18個以下、より好ましく� ��15個以下、いっそう好ましくは12個以下の連 続するアミノ酸残基からなるものが挙げられ る。これらのアミノ酸残基の一部(例:1ないし 数個)は置換可能な基(例:Cys、水酸基等)によ� �て置換されていていもよい。免疫原として� �いられるペプチドは、このような部分アミ� �酸配列を1ないし数個含むアミノ酸配列を有� ��る。

 あるいは、WDR6を発現する哺乳動物細胞自 体を、本発明の抗原として直接用いることも できる。哺乳動物細胞としては、上記(a)項で 述べたような天然の細胞、上記(c)項で述べた ような方法で形質転換した細胞などを用いる ことができる。形質転換に用いる宿主として は、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスタ ー、ニワトリなどから採取した細胞であれば 何れのものでも良く、HEK293、COS7、CHO-K1、NIH3T 3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、またはP3 88などが好ましく用いられる。WDR6を発現する 天然の哺乳動物細胞または形質転換した温血 動物細胞は、組織培養に用いられる培地(例� �RPMI1640)または緩衝液(例、Hanks’ Balanced Salt� �Solution)に懸濁された状態で免疫動物に注射� �ることができる。免疫方法としては、抗体� �生を促すことのできる方法であれば何れの� �法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋� �内注射または皮下注射などが好ましく用い� �れる。

 本発明の抗原は、免疫原性を有していれ� ��不溶化したものを直接免疫することもでき� ��が、分子内に1ないし数個の抗原決定基しか 有しない低分子量(例えば、分子量約3,000以下 )の抗原(即ち、WDR6の部分ペプチド)を用いる� �合には、これらの抗原は通常免疫原性の低� �ハプテン分子なので、適当な担体(キャリア� ��)に結合または吸着させた複合体として免疫 することができる。担体としては天然もしく は合成の高分子を用いることができる。天然 高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒト などの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウ シ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリ ン、例えばニワトリのオボアルブミン、例え ばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動 物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘ モシアニン(KLH)などが用いられる。合成高分� ��としては、例えばポリアミノ酸類、ポリス� ��レン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、� ��リプロピレン類などの重合物または共重合� ��などの各種ラテックスなどが挙げられる。

 該キャリアーとハプテンとの混合比は、� ��体に結合あるいは吸着させた抗原に対する� ��体が効率よく産生されれば、どのようなも� ��をどのような比率で結合あるいは吸着させ� ��もよく、通常ハプテンに対する抗体の作製� ��あたり常用されている上記の天然もしくは� ��成の高分子キャリアーを、重量比でハプテ� ��1に対し0.1~100の割合で結合あるいは吸着さ� �たものを使用することができる。

 また、ハプテンとキャリアーのカプリン� ��には、種々の縮合剤を用いることができる� ��例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプト� ��ァンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンな� ��のジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架� ��するグルタルアルデビトなどのジアルデヒ� ��化合物、トルエン-2,4-ジイソシアネートな� �のジイソシアネート化合物、チオール基同� �を架橋するN,N’-o-フェニレンジマレイミド� �どのジマレイミド化合物、アミノ基とチオ� �ル基を架橋するマレイミド活性エステル化� �物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋す� �カルボジイミド化合物などが好都合に用い� �れる。また、アミノ基同志士を架橋する際� �も、一方のアミノ基にジチオピリジル基を� �する活性エステル試薬(例えば、3-(2-ピリジ� �ジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル(SPDP )など)を反応させた後還元することによりチ� ��ール基を導入し、他方のアミノ基にマレイ� ��ド活性エステル試薬によりマレイミド基を� ��入後、両者を反応させることもできる。

(2)モノクローナル抗体の作製
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
 本発明の抗原は、温血動物に対して、例え� ��腹腔内注入、静脈注入,皮下注射、皮内注射 などの投与方法によって、抗体産生が可能な 部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈 剤とともに投与される。投与に際して抗体産 生能を高めるため、完全フロイントアジュバ ントや不完全フロイントアジュバントを投与 してもよい。投与は通常1~6週毎に1回ずつ、� �2~10回程度行われる。用いられる温血動物と� ��ては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モル� ��ット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツ� ��、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗I g抗体産生の問題を回避するためには投与対� �と同一種の哺乳動物を用いることが好まし� �が、モノクローナル抗体作製には一般にマ� �スおよびラットが好ましく用いられる。

 ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に� ��難であることから、本発明の抗体がヒトを� ��与対象とする場合には、(i)後述する方法に� ��って作製されるヒト抗体産生動物(例:マウ� �)を免疫してヒト抗体を得る、(ii)後述する方 法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは 完全ヒト抗体を作製する、あるいは(iii)体外� ��疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト-ヒ ト(もしくはマウス)ハイブリドーマ作製技術� ��ファージディスプレイ法等とを組み合わせ� ��ヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外� ��疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制さ� ��る抗原に対する抗原を取得できる可能性が� ��ることの他、ng~μgオーダーの抗原量で抗体� ��得ることが可能であること、免疫が数日間� ��終了することなどから、不安定で大量調製� ��困難な抗原に対する抗体を得る方法として� ��非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも� ��ましく用いられ得る。

 体外免疫法に用いられる動物細胞としては� ��ヒトおよび上記した温血動物(好ましくはマ ウス、ラット)の末梢血、脾臓、リンパ節な� �から単離されるリンパ球、好ましくはBリン� ��球等が挙げられる。例えば、マウスやラッ� ��細胞の場合、4~12週齢程度の動物から脾臓を 摘出・脾細胞を分離し、適当な培地(例:ダル� ��ッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、� �ムF12培地等))で洗浄した後、抗原を含む胎仔 ウシ血清(FCS;5~20%程度)添加培地に浮遊させて4 ~10日間程度CO ₂ インキュベーターなどを用いて培養する。抗 原濃度としては、例えば0.05~5μgが挙げられる がこれに限定されない。同一系統の動物(1~2� �齢程度が好ましい)の胸腺細胞培養上清を常� ��に従って調製し、培地に添加することが好� ��しい。

 ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養� ��清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5� ��IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じ てアジュバント物質(例:ムラミルジペプチド� ��)を抗原とともに培地に添加して免疫感作を 行うことが好ましい。

 モノクローナル抗体の作製に際しては、� ��原を免疫された温血動物(例:マウス、ラッ� �)もしくは動物細胞(例:ヒト、マウス、ラッ� �)から抗体価の上昇が認められた個体もしく� ��細胞集団を選択し、最終免疫の2~5日後に脾� ��またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後4 ~10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生 細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合さ せることにより抗体産生ハイブリドーマを調 製することができる。血清中の抗体価の測定 は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させ た後、抗体に結合した標識剤の活性を測定す ることにより行うことができる。

 骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイ� ��リドーマを産生し得るものであれば特に制� ��はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌� ��ないものが好ましく、また、細胞融合効率� ��高いものがより好ましい。また、ハイブリ� ��ーマの選択を容易にするために、HAT(ヒポキ サンチン、アミノプテリン、チミジン)感受� �の株を用いることが好ましい。例えばマウ� �骨髄腫細胞としてはNS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等が 、ラット骨髄腫細胞としてはR210.RCY3、Y3-Ag 1. 2.3等が、ヒト骨髄腫細胞としてはSKO-007、GM 1 500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、UC729-6等が挙げられる。

 融合操作は既知の方法、例えばケーラーと� ��ルスタインの方法[ネイチャー(Nature)、256巻� ��495頁(1975年)]に従って実施することができる 。融合促進剤としては、ポリエチレングリコ ール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられ� ��が、好ましくはPEGなどが用いられる。PEGの� ��子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘� ��が比較的低いPEG1000~PEG6000が好ましい。PEG濃� ��としては例えば10~80%程度、好ましくは30~50%� ��度が例示される。PEGの希釈用溶液としては� ��血清培地(例:RPMI1640)、5~20%程度の血清を含む 完全培地、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリ� ��緩衝液等の各種緩衝液を用いることができ� ��。所望によりDMSO(例:10~20%程度)を添加するこ ともできる。融合液のpHとしては、例えば4~10 程度、好ましくは6~8程度が挙げられる。
 抗体産生細胞(脾細胞)数と骨髄細胞数との� �ましい比率は、通常1:1~20:1程度であり、通常 20~40℃、好ましくは30~37℃で通常1~10分間イン� ��ュベートすることにより効率よく細胞融合� ��実施できる。

 抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトラ� ��スフォームし得るウイルスに抗体産生細胞� ��感染させて該細胞を不死化することによっ� ��も得ることができる。そのようなウイルス� ��しては、例えばエプスタイン-バー(EB)ウイ� �ス等が挙げれらる。大多数の人は伝染性単� �球症の無症状感染としてこのウイルスに感� �した経験があるので免疫を有しているが、� �常のEBウイルスを用いた場合にはウイルス粒 子も産生されるので、適切な精製を行うべき である。ウイルス混入の可能性のないEBシス� ��ムとして、Bリンパ球を不死化する能力を保 持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した 組換えEBウイルス(例えば、潜伏感染状態から 溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子にお ける欠損など)を用いることもまた好ましい� �

 マーモセット由来のB95-8細胞はEBウイルスを 分泌しているので、その培養上清を用いれば 容易にBリンパ球をトランスフォームするこ� �ができる。この細胞を例えば血清及びペニ� �リン/ストレプトマイシン(P/S)添加培地(例:RPM I1640)もしくは細胞増殖因子を添加した無血清 培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等 により培養上清を分離し、これに抗体産生B� �ンパ球を適当な濃度(例:約10 ⁷ 細胞/mL)で浮遊させて、通常20~40℃、好ましく は30~37℃で通常0.5~2時間程度インキュベート� �ることにより抗体産生B細胞株を得ることが� ��きる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球� ��して提供される場合、大部分の人はEBウイ� �ス感染細胞に対して傷害性を示すTリンパ球� ��有しているので、トランスフォーメーショ� ��頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血� ��等とEロゼットを形成させることによってT� �ンパ球を予め除去しておくことが好ましい� �また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球� �抗体産生Bリンパ球と混合し、パーコール等� ��密度勾配を用いてロゼットを分離すること� ��より標的抗原に特異的なリンパ球を選別す� ��ことができる。さらに、大過剰の抗原を添� ��することにより抗原特異的なBリンパ球はキ ャップされて表面にIgGを提示しなくなるので 、抗IgG抗体を結合したヒツジ赤血球と混合す ると抗原非特異的なBリンパ球のみがロゼッ� �を形成する。従って、この混合物からパー� �ール等の密度勾配を用いてロゼット非形成� �を採取することにより、抗原特異的Bリンパ� ��を選別することができる。

 トランスフォーメーションによって無限� ��殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体� ��泌能を安定に持続させるためにマウスもし� ��はヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させること� ��できる。骨髄腫細胞としては上記と同様の� ��のが用いられ得る。

 ハイブリドーマのスクリーニング、育種は� ��常HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チ ミジン)を添加して、5~20% FCSを含む動物細胞� ��培地(例:RPMI1640)もしくは細胞増殖因子を添� �した無血清培地で行われる。ヒポキサンチ� �、アミノプテリンおよびチミジンの濃度と� �ては、例えばそれぞれ約0.1mM、約0.4μMおよび 約0.016mM等が挙げられる。ヒト-マウスハイブ� ��ドーマの選択にはウワバイン耐性を用いる� ��とができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に� ��べてウワバインに対する感受性が高いので� ��10 ^-7 ~10 ^-3 M程度で培地に添加することにより未融合の� �ト細胞を排除することができる。

 ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞� ��ある種の細胞培養上清を用いることが好ま� ��い。フィーダー細胞としては、ハイブリド� ��マの出現を助けて自身は死滅するように生� ��期間が限られた異系の細胞種、ハイブリド� ��マの出現に有用な増殖因子を大量に産生し� ��る細胞を放射線照射等して増殖力を低減さ� ��たもの等が用いられる。例えば、マウスの� ��ィーダー細胞としては、脾細胞、マクロフ� ��ージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィー� ��ー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げ� ��れる。細胞培養上清としては、例えば上記� ��各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞� ��培養上清が挙げられる。
 また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識� ��て融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セ� ��ソータ(FACS)を用いて抗原と結合する細胞を� ��離することによっても選択することができ� ��。この場合、標的抗原に対する抗体を産生� ��るハイブリドーマを直接選択することがで� ��るので、クローニングの労力を大いに軽減� ��ることが可能である。

 標的抗原に対するモノクローナル抗体を産� ��するハイブリドーマのクローニングには種� ��の方法が使用できる。
 アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害す� ��ので、できるだけ早く培地から除去するこ� ��が好ましい。マウスやラットの場合、ほと� ��どの骨髄腫細胞は10~14日以内に死滅するの� �、融合2週間後からはアミノプテリンを除去� ��ることができる。但し、ヒトハイブリドー� ��については通常融合後4~6週間程度はアミノ� ��テリン添加培地で維持される。ヒポキサン� ��ン、チミジンはアミノプテリン除去後1週間 以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウ ス細胞の場合、例えば融合7~10日後にヒポキ� �ンチンおよびチミジン(HT)添加完全培地(例:10 % FCS添加RPMI1640)の添加または交換を行う。融 合後8~14日程度で目視可能なクローンが出現� �る。クローンの直径が1mm程度になれば培養� �清中の抗体量の測定が可能となる。

 抗体量の測定は、例えば標的抗原またはそ� ��誘導体あるいはその部分ペプチド(抗原決定 基として用いた部分アミノ酸配列を含む)を� �接あるいは担体とともに吸着させた固相(例� ��マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上 清を添加し、次に放射性物質(例: ¹²⁵ I, ¹³¹ I, ³ H, ¹⁴ C)、酵素(例:β-ガラクトシダーゼ、β-グルコ� �ダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パー� �キシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素)、蛍光物� ��(例:フルオレスカミン、フルオレッセンイ� �チオシアネート)、発光物質(例:ルミノール� �ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲ� �ン)などで標識した抗免疫グロブリン(IgG)抗� �(もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一� ��の動物由来のIgGに対する抗体が用いられる) またはプロテインAを加え、固相に結合した� �的抗原(抗原決定基)に対する抗体を検出する 方法、抗IgG抗体またはプロテインAを吸着さ� �た固相にハイブリドーマ培養上清を添加し� �上記と同様の標識剤で標識した標的抗原ま� �はその誘導体あるいはその部分ペプチドを� �え、固相に結合した標的抗原(抗原決定基)に 対する抗体を検出する方法などによって行う ことができる。

 クローニング方法としては限界希釈法が通� ��用いられるが、軟寒天を用いたクローニン� ��やFACSを用いたクローニング(上述)も可能で� ��る。限界希釈法によるクローニングは、例� ��ば以下の手順で行うことができるがこれに� ��定されない。
 上記のようにして抗体量を測定して陽性ウ� ��ルを選択する。適当なフィーダー細胞を選� ��して96ウェルプレートに添加しておく。抗� �陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地(� ��:10% FCSおよびP/S添加RMPI1640)中に30細胞/mLの� �度となるように浮遊させ、フィーダー細胞� �添加したウェルプレートに0.1mL(3細胞/ウェル )加え、残りの細胞懸濁液を10細胞/mLに希釈し て別のウェルに同様にまき(1細胞/ウェル)、� �らに残りの細胞懸濁液を3細胞/mLに希釈して� ��のウェルにまく(0.3細胞/ウェル)。目視可能� ��クローンが出現するまで2~3週間程度培養し� ��抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度� ��ローニングする。ヒト細胞の場合はクロー� ��ングが比較的困難なので、10細胞/ウェルの� ��レートも調製しておく。通常2回のサブクロ ーニングでモノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマを得ることができるが、その安定性を 確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再ク ローニングを行うことが望ましい。

 ハイブリドーマはインビトロまたはインビ� ��で培養することができる。
 インビトロでの培養法としては、上記のよ� ��にして得られるモノクローナル抗体産生ハ� ��ブリドーマを、細胞密度を例えば10 ⁵ ~10 ⁶ 細胞/mL程度に保ちながら、また、FCS濃度を徐 々に減らしながら、ウェルプレートから徐々 にスケールアップしていく方法が挙げられる 。
 インビボでの培養法としては、例えば、腹� ��内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫( MOPC)を誘導したマウス(ハイブリドーマの親株 と組織適合性のマウス)に、5~10日後に10 ⁶ ~10 ⁷ 細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、 2~5週間後に麻酔下に腹水を採取する方法が挙 げられる。

(b)モノクローナル抗体の精製
 モノクローナル抗体の分離精製は、自体公� ��の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精� ��法[例:塩析法、アルコール沈殿法、等電点� �殿法、電気泳動法、イオン交換体(例:DEAE、QE AE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、 抗原結合固相あるいはプロテインAあるいは� �ロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみ� ��採取し、結合を解離させて抗体を得る特異� ��精製法など]に従って行うことができる。

 以上のようにして、ハイブリドーマを温� ��動物の生体内又は生体外で培養し、その体� ��または培養物から抗体を採取することによ� ��て、モノクローナル抗体を製造することが� ��きる。

 WDR6の活性を阻害するためには、WDR6に対� �る抗体はWDR6の機能を中和するものでなけれ� ��ならないので、得られたモノクローナル抗� ��の中和活性について調べる必要がある。中� ��活性は、抗体の存在下および非存在下にお� ��るWDR6とIRS-4との結合性や、IRS-4のリン酸化� �程度を比較することにより測定することが� �きる。

 好ましい一実施態様において、本発明の� ��体はヒトを投与対象とする医薬品として使� ��されることから、本発明の抗体(好ましくは モノクローナル抗体)はヒトに投与した場合� �抗原性を示す危険性が低減された抗体、具� �的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウ� �-ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましく� ��完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキ� ��ラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工� ��的に作製することができる。また、完全ヒ� ��抗体は、上記したヒト-ヒト(もしくはマウ� �)ハイブリドーマより製造することも可能で� ��あるが、大量の抗体を安定に且つ低コスト� ��提供するためには、後述するヒト抗体産生� ��物(例:マウス)またはファージディスプレイ� ��を用いて製造することが望ましい。

(i)キメラ抗体の作製
 本明細書において「キメラ抗体」とは、H鎖 およびL鎖の可変領域(V _H およびV _L )の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領� �(C _H およびC _L )の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を� �味する。可変領域の配列は、例えばマウス� �の容易にハイブリドーマを作製することが� �きる動物種由来であることが好ましく、定� �領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由� �であることが好ましい。

 キメラ抗体の作製法としては、例えば米国� ��許第6,331,415号に記載される方法あるいはそ� ��を一部改変した方法などが挙げられる。具� ��的には、まず、上述のようにして得られる� ��ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ(例え ば、マウス-マウスハイブリドーマ)から、常� ��に従ってmRNAもしくは全RNAを調製し、cDNAを� �成する。該cDNAを鋳型として、適当なプライ� ��ー(例えば、センスプライマーとしてV _H およびV _L の各N末端配列をコードする塩基配列を含む� �リゴDNA、アンチセンスプライマーとしてC _H およびC _L のN末端配列をコードする塩基配列とハイブ� �ダイズするオリゴDNA(例えばBio/Technology, 9: 8 8-89, 1991参照))を用い、常法に従ってPCRでV _H およびV _L をコードするDNAを増幅・精製する。同様の方 法により、他の哺乳動物(例:ヒト)のリンパ球 等より調製したRNAからRT-PCRによりC _H およびC _L をコードするDNAを増幅・精製する。常法を用 いてV _H とC _H 、V _L とC _L をそれぞれ連結し、得られたキメラH鎖DNAお� �びキメラL鎖DNAを、それぞれ適当な発現ベク� ��ー(例えば、CHO細胞、COS細胞、マウス骨髄腫 細胞等で転写活性を有するプロモーター(例:C MVプロモーター、SV40プロモーター等)を含む� �クターなど)に挿入する。両鎖をコードするD NAは別個のベクターに挿入してもよいし、1個 のベクターにタンデムに挿入してもよい。得 られたキメラH鎖およびキメラL鎖発現ベクタ� ��で宿主細胞を形質転換する。宿主細胞とし� ��は、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄� ��細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣(CHO )細胞、サル由来のCOS-7細胞、Vero細胞、ラッ� �由来のGHS細胞などが挙げられる。形質転換� �動物細胞に適用可能ないかなる方法を用い� �もよいが、好ましくはエレクトロポレーシ� �ン法などが挙げられる。宿主細胞に適した� �地中で一定期間培養後、培養上清を回収し� �上記と同様の方法で精製することにより、� �メラモノクローナル抗体を単離することが� �きる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤ� �、ニワトリ等のトランスジェニック技術が� �立し、且つ家畜(家禽)として大量繁殖のノウ ハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を 用い、常法によってトランスジェニック動物 を作製することにより、得られる動物の乳汁 もしくは卵から容易に且つ大量にキメラモノ クローナル抗体を得ることもできる。さらに 、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タ バコなどのトランスジェニック技術が確立し 、且つ主要作物として大量に栽培されている 植物細胞を宿主細胞として、プロトプラスト へのマイクロインジェクションやエレクトロ ポレーション、無傷細胞へのパーティクルガ ン法やTiベクター法などを用いてトランスジ� ��ニック植物を作製し、得られる種子や葉な� ��から大量にキメラモノクローナル抗体を得� ��ことも可能である。
 得られたキメラモノクローナル抗体をパパ� ��ンで分解すればFabが、ペプシンで分解すれ� ��F(ab’) ₂ がそれぞれ得られる。

 また、マウスV _H およびV _L をコードするDNAを適当なリンカー、例えば1~4 0アミノ酸、好ましくは3~30アミノ酸、より好� ��しくは5~20アミノ酸からなるペプチド(例:[Ser -(Gly)m]nもしくは[(Gly)m-Ser]n(mは0~10の整数、nは1 ~5の整数)等)をコードするDNAを介して連結す� �ことによりscFvとすることができ、さらにC _H3 をコードするDNAを適当なリンカーを介して連 結することによりminidodyモノマーとしたり、C _H 全長をコードするDNAを適当なリンカーを介し て連結することによりscFv-Fcとすることもで� �る。このような遺伝子工学的に修飾(共役)さ れた抗体分子をコードするDNAは、適当なプロ モーターの制御下におくことにより大腸菌や 酵母などの微生物で発現させることができ、 大量に抗体分子を生産することができる。

 マウスV _H およびV _L をコードするDNAを1つのプロモーターの下流� �タンデムに挿入して大腸菌に導入すると、� �ノシストロニックな遺伝子発現によりFvと呼 ばれる二量体を形成する。また、分子モデリ ングを用いてV _H およびV _L のFR中の適当なアミノ酸をCysに置換すると、� ��鎖の分子間ジスルフィド結合によりdsFvと呼 ばれる二量体が形成される。

(ii)ヒト化抗体
 本明細書において「ヒト化抗体」とは、可� ��領域に存在する相補性決定領域(CDR)以外の� �べての領域(即ち、定常領域および可変領域� ��のフレームワーク領域(FR))の配列がヒト由� �であり、CDRの配列のみが他の哺乳動物種由� �である抗体を意味する。他の哺乳動物種と� �ては、例えばマウス等の容易にハイブリド� �マを作製することができる動物種が好まし� �。
 ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国� ��許第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,761号お� ��び第5,693,762号に記載される方法あるいはそ� ��らを一部改変した方法などが挙げられる。� ��体的には、上記キメラ抗体の場合と同様に� ��て、ヒト以外の哺乳動物種(例:マウス)由来� ��V _H およびV _L をコードするDNAを単離した後、常法により自 動DNAシークエンサー(例:Applied Biosystems社製等 )を用いてシークエンスを行い、得られる塩� �配列もしくはそこから推定されるアミノ酸� �列を公知の抗体配列データベース[例えば、K abat database (Kabatら,「Sequences of Proteins of Im munological Interest」,US Department of Health and Hu man Services, Public Health Service, NIH編, 第5版,� �1991参照) 等]を用いて解析し、両鎖のCDRおよ びFRを決定する。決定されたFR配列に類似し� �FR配列を有するヒト抗体のL鎖およびH鎖をコ� ��ドする塩基配列[例:ヒトκ型L鎖サブグルー� �IおよびヒトH鎖サブグループIIもしくはIII(Kab atら,1991(上述)を参照)]のCDRコード領域を、決� ��された異種CDRをコードする塩基配列で置換� ��た塩基配列を設計し、該塩基配列を20~40塩� �程度のフラグメントに区分し、さらに該塩� �配列に相補的な配列を、前記フラグメント� �交互にオーバーラップするように20~40塩基程 度のフラグメントに区分する。各フラグメン トをDNAシンセサイザーを用いて合成し、常法 に従ってこれらをハイブリダイズおよびライ ゲートさせることにより、ヒト由来のFRと他� ��哺乳動物種由来のCDRを有するV _H およびV _L をコードするDNAを構築することができる。よ り迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来CDRを ヒト由来V _H およびV _L に移植するには、PCRによる部位特異的変異誘 発を用いることが好ましい。そのような方法 としては、例えば特開平5-227970号公報に記載� ��逐次CDR移植法等が挙げられる。このように� ��て得られるV _H およびV _L をコードするDNAを、上記キメラ抗体の場合と 同様の方法でヒト由来のC _H およびC _L をコードするDNAとそれぞれ連結して適当な宿 主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を 産生する細胞あるいはトランスジェニック動 植物を得ることができる。

 ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工� ��的手法を用いてscFv、scFv-Fc、minibody、dsFv、Fv などに改変することができ、適当なプロモー ターを用いることで大腸菌や酵母などの微生 物でも生産させることができる。
 ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリド� ��マの作製技術が確立していない他の動物種� ��好ましく投与し得るモノクローナル抗体を� ��製するのにも応用することができる。例え� ��、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリな� ��の家畜(家禽)として広く繁殖されている動� �やイヌやネコなどのペット動物などが対象� �して挙げられる。

(iii)ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体� ��作製
 内因性免疫グロブリン(Ig)遺伝子をノックア ウト(KO)した非ヒト温血動物に機能的なヒトIg 遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、 該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生 される。従って、マウス等のようにハイブリ ドーマ作製技術が確立している動物を用いれ ば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製 と同様の方法によって完全ヒトモノクローナ ル抗体を取得することが可能となる。まず、 ヒトIgのH鎖およびL鎖のミニ遺伝子を通常の� �ランスジェニック(Tg)技術を用いて導入した� ��ウスと、内因性マウスIg遺伝子を通常のKO技 術を用いて不活性化したマウスとを交配して 得られたヒト抗体産生マウス(Immunol. Today, 17 : 391-397, 1996を参照)を用いて作製されたヒト モノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段 階にあり、現在までのところ抗ヒトIgヒト抗� ��(HAHA)の産生は報告されていない。

 その後、Abgenix社[商品名:XenoMouose(Nat. Genet ., 15: 146-156, 1997; 米国特許第5,939,598号等を� ��照)]やMedarex社[商品名:Hu-Mab Mouse(Nat. Biotechno l., 14: 845-851, 1996; 米国特許第5,545,806号等を 参照)]が酵母人工染色体(YAC)ベクターを用い� �より大きなヒトIg遺伝子を導入したTgマウス� ��作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗� ��を産生し得るようになった。しかしながら� ��ヒトIg遺伝子は、例えばH鎖の場合、約80種� �V断片、約30種のD断片および6種のJ断片が様� �に組み合わされたVDJエクソンが抗原結合部� �をコードすることによりその多様性を実現� �ているため、その全長はH鎖が約1.5Mb(14番染� �体)、κL鎖が約2Mb(2番染色体)、λL鎖が約1Mb(22� ��染色体)に達する。ヒトにおけるのと同様の 多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現 するためには、各Ig遺伝子の全長を導入する� ��とが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクタ� ��(プラスミド、コスミド、BAC、YAC等)に挿入� �能なDNAは通常数kb~数百kbであり、クローニン グしたDNAを受精卵に注入する従来のトランス ジェニック動物作製技術では全長の導入は困 難であった。

 Tomizukaら(Nat. Genet., 16: 133-143, 1997)は、Ig遺 伝子を担持するヒト染色体の自然断片(hCF)を� ��ウスに導入して(染色体導入(TC)マウス)、完� ��長ヒトIg遺伝子を有するマウスを作製した� �即ち、まず、H鎖遺伝子を含む14番染色体お� �びκL鎖遺伝子を含む2番染色体を例えば薬剤� ��性マーカー等で標識したヒト染色体を有す� ��ヒト-マウスハイブリッド細胞を48時間程度� ��錘糸形成阻害剤(例:コルセミド)で処理して� ��1~数本の染色体もしくはその断片が核膜に� �包されたミクロセルを調製し、微小核融合� �によりマウスES細胞に染色体を導入する。薬 剤を含む培地を用いてヒトIg遺伝子を有する� ��色体もしくはその断片を保持するハイブリ� ��ドES細胞を選択し、通常のKOマウス作製の場 合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入す る。得られるキメラマウスからコートカラー を指標にする等して生殖系列キメラを選択し 、ヒト14番染色体断片を伝達するTCマウス系� �(TC(hCF14))およびヒト2番染色体断片を伝達す� �TCマウス系統(TC(hCF2))を樹立する。常法によ� �内因性H鎖遺伝子およびκL鎖遺伝子をKOされ� �マウス(KO(IgH)およびKO(Igκ))を作製し、これら 4系統の交配を繰り返すことにより、4種の遺� ��子改変をすべて有するマウス系統(ダブルTC/ KO)を樹立することができる。
 上記のようにして作製されるダブルTC/KOマ� �スに、通常のマウスモノクローナル抗体を� �製する場合と同様の方法を適用すれば、抗� �特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブ� �ドーマを作製することができる。しかしな� �ら、κL鎖遺伝子を含むhCF2がマウス細胞内で� ��安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通� ��のマウスの場合に比べて低いという欠点が� ��る。

 一方、前記Hu-Mab MouseはκL鎖遺伝子の約50%を 含むが、可変領域クラスターが倍加した構造 を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖� ��多様性を示し(他方、H鎖遺伝子は約10%しか� �まないのでH鎖の多様性は低く、抗原に対す� ��応答性が不十分である)、
且つYACベクター(Igκ-YAC)によりマウス染色体� �に挿入されているので、マウス細胞内で安� �に保持される。この利点を生かし、TC(hCF14)� �ウスとHu-Mab Mouseとを交配してhCF14とIgκ-YACと を安定に保持するマウス(商品名:KMマウス)を� ��製することにより、通常のマウスと同等の� ��イブリドーマ取得効率および抗体の抗原親� ��性を得ることができる。

 さらに、より完全にヒトにおける多様な� ��体レパートリーを再現するために、λL鎖遺� ��子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作� ��することもできる。かかる動物は、上記と� ��様の方法でλL鎖遺伝子を担持するヒト22番� �色体もしくはその断片を導入したTCマウス(TC (hCF22))を作製し、これと上記ダブルTC/KOマウ� �やKMマウスとを交配することにより得ること もできるし、あるいは、例えばH鎖遺伝子座� �λL鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体(HAC)を 構築してマウス細胞に導入することにより得 ることもできる(Nat. Biotechnol., 18: 1086-1090, 2 000)。

 本発明の抗体を医薬品として利用する場� ��はモノクローナル抗体であることが望まし� ��が、ポリクローナル抗体であってもよい。� ��発明の抗体がポリクローナル抗体である場� ��には、ハイブリドーマの利用を要しないの� ��、ハイブリドーマ作製技術は確立されてい� ��いがトランスジェニック技術は確立されて� ��る動物種、好ましくはウシ等の有蹄動物や� ��ワトリ等を用いて、上記と同様の方法によ� ��ヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量� ��ヒト抗体を安価に製造することも可能であ� ��(例えば、Nat. Biotechnol., 20: 889-894,2002参照)� ��得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト� ��体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、� ��ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の� ��製技術を組み合わせることによって精製す� ��ことができる。

(iv)ファージディスプレイヒト抗体ライブラ� �ーを用いた完全ヒト抗体の作製
 完全ヒト抗体を作製するもう1つのアプロー チはファージディスプレイを用いる方法であ る。この方法はPCRによる変異がCDR以外に導入 される場合があり、そのため臨床段階で少数 のHAHA産生の報告例があるが、その一方で宿� �動物に由来する異種間ウイルス感染の危険� �がない点や抗体の特異性が無限である(禁止� ��ローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作� ��可能)等の利点を有している。

 ファージディスプレイヒト抗体ライブラリ� ��の作製方法としては、例えば、以下のもの� ��挙げられるが、これに限定されない。
 用いられるファージは特に限定されないが� ��通常繊維状ファージ(Ffバクテリオファージ) が好ましく用いられる。ファージ表面に外来 蛋白質を提示する方法としては、g3p、g6p~g9p� �コート蛋白質のいずれかとの融合蛋白質と� �て該コート蛋白質上で発現・提示させる方� �が挙げられるが、よく用いられるのはg3pも� �くはg8pのN末端側に融合させる方法である。� ��ァージディスプレイベクターとしては、1)� �ァージゲノムのコート蛋白質遺伝子に外来� �伝子を融合した形で導入して、ファージ表� �上に提示されるコート蛋白質をすべて外来� �白質との融合蛋白質として提示させるもの� �他、2)融合蛋白質をコードする遺伝子を野生 型コート蛋白質遺伝子とは別に挿入して、融 合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発 現させるものや、3)融合蛋白質をコードする� ��伝子を有するファージミドベクターを持つ� ��腸菌に野生型コート蛋白質遺伝子を有する� ��ルパーファージを感染させて融合蛋白質と� ��生型コート蛋白質とを同時に発現するファ� ��ジ粒子を産生させるものなどが挙げられる� ��、1)の場合は大きな外来蛋白質を融合させ� �と感染能力が失われるため、抗体ライブラ� �ーの作製のためには2)または3)のタイプが用� ��られる。

 具体的なベクターとしては、Holtら(Curr. Opin . Biotechnol., 11: 445-449, 2000)に記載されるも� �が例示される。例えば、pCES1(J. Biol. Chem., 2 74: 18218-18230, 1999参照)は、1つのラクトース� �ロモーターの制御下にg3pのシグナルペプチ� �の下流にκL鎖定常領域をコードするDNAとg3p� �グナルペプチドの下流にCH3をコードするDNA� �His-tag、c-myc tag、アンバー終止コドン(TAG)を� ��してg3pコード配列とが配置されたFab発現型� ��ァージミドベクターである。アンバー変異� ��有する大腸菌に導入するとg3pコート蛋白質� ��にFabを提示するが、アンバー変異を持たな� ��HB2151株などで発現させると可溶性Fab抗体を� ��生する。また、scFv発現型ファージミドベク ターとしては、例えばpHEN1(J. Mol. Biol., 222:58 1-597, 1991)等が用いられる。
 一方、ヘルパーファージとしては、例えばM 13-KO7、VCSM13等が挙げられる。
 また、別のファージディスプレイベクター� ��して、抗体遺伝子の3’末端とコート蛋白質 遺伝子の5’末端にそれぞれシステインをコ� �ドするコドンを含む配列を連結し、両遺伝� �を同時に別個に(融合蛋白質としてではなく) 発現させて、導入されたシステイン残基同士 によるS-S結合を介してファージ表面のコート 蛋白質上に抗体を提示し得るようにデザイン されたもの(Morphosys社のCysDisplay ^TM 技術)等も挙げられる。

 ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナ� ��ーブ/非免疫ライブラリー、合成ライブラリ ー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
 ナイーブ/非免疫(non-immunized)ライブラリーは 、正常なヒトが保有するV _H およびV _L 遺伝子をRT-PCRにより取得し、それらをランダ ムに上記のファージディスプレイベクターに クローニングして得られるライブラリーであ る。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺な どのリンパ球由来のmRNA等が鋳型として用い� �れる。疾病履歴などのV遺伝子のバイアスを� ��くすため、抗原感作によるクラススイッチ� ��起こっていないIgM由来のmRNAのみを増幅した ものを特にナイーブライブラリーと呼んでい る。代表的なものとしては、CAT社のライブラ リー(J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991; Nat. Biotec hnol., 14: 309-314, 1996参照)、MRC社のライブラ� �ー(Annu. Rev. Immunol., 12: 433-455, 1994参照)、Dy ax社のライブラリー(J. Biol. Chem., 1999 (上述) ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,14: 7969-7974, 2000参� �)等が挙げられる。
 合成ライブラリーは、ヒトB細胞内の機能的 な特定の抗体遺伝子を選び、V遺伝子断片の� �例えばCDR3等の抗原結合領域の部分を適当な� ��さのランダムなアミノ酸配列をコードするD NAで置換し、ライブラリー化したものである� ��最初から機能的なscFvやFabを産生するV _H およびV _L 遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築 できるので、抗体の発現効率や安定性に優れ ているとされる。代表的なものとしては、Mor phosys社のHuCALライブラリー(J.Mol. Biol., 296: 57 -86, 2000参照)、BioInvent社のライブラリー(Nat.  Biotechnol., 18: 852, 2000参照)、Crucell社のライ� �ラリー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938, 1995 ; J. Immunol. Methods, 272: 219-233, 2003参照)等が 挙げられる。
 免疫(immunized)ライブラリーは、標的抗原に� �する血中抗体価が上昇したヒトから採取し� �リンパ球、あるいは上記体外免疫法により� �的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等� �ら、上記ナイーブ/非免疫ライブラリーの場� ��と同様にしてmRNAを調製し、RT-PCR法によって V _H およびV _L 遺伝子を増幅し、ライブラリー化したもので ある。最初から目的の抗体遺伝子がライブラ リー中に含まれるので、比較的小さなサイズ のライブラリーからでも目的の抗体を得るこ とができる。

 ライブラリーの多様性は大きいほどよいが� ��現実的には、以下のパンニング操作で取り� ��えるファージ数(10 ¹¹ ~10 ¹³ ファージ)と通常のパンニングでクローンの� �離および増幅に必要なファージ数(100~1,000フ� ��ージ/クローン)を考慮すれば、10 ⁸ ~10 ¹¹ クローン程度が適当であり、約10 ⁸ クローンのライブラリーで通常10 ^-9 オーダーのKd値を有する抗体をスクリーニン� ��することができる。

 標的抗原に対する抗体をファージディスプ� ��イ法で選別する工程をパンニングという。� ��体的には、例えば、抗原を固定化した担体� ��ファージライブラリーとを接触させ、非結� ��ファージを洗浄除去した後、結合したファ� ��ジを担体から溶出させ、大腸菌に感染させ� ��該ファージを増殖させる、という一連の操� ��を3~5回程度繰り返すことにより抗原特異的� ��抗体を提示するファージを濃縮する。抗原� ��固定化する担体としては、通常の抗原抗体� ��応やアフィニティークロマトグラフィーで� ��いられる各種担体、例えばアガロース、デ� ��ストラン、セルロースなどの不溶性多糖類� ��ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリ� ��ン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属な� ��からなるマイクロプレート、チューブ、メ� ��ブレン、カラム、ビーズなど、さらには表� ��プラズモン共鳴(SPR)のセンサーチップなど� �挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着� �用いてもよく、また、通常蛋白質あるいは� �素等を不溶化、固定化するのに用いられる� �学結合を用いる方法でもよい。例えばビオ� �ン-(ストレプト)アビジン系等が好ましく用� �られる。標的抗原であるWDR6がオリゴペプチ� ��などの小分子である場合には、抗原決定基� ��して用いた部分が担体との結合により被覆� ��れないように特に注意する必要がある。非� ��合ファージの洗浄には、BSA溶液などのブロ� ��キング液(1-2回)、Tween等の界面活性剤を含む PBS(3-5回)などを順次用いることができる。ク� ��ン酸緩衝液(pH5)などの使用が好ましいとの� �告もある。特異的ファージの溶出には、通� �酸(例:0.1M塩酸など)が用いられるが、特異的� ��ロテアーゼによる切断(例えば、抗体遺伝子 とコート蛋白質遺伝子との連結部にトリプシ ン切断部位をコードする遺伝子配列を導入す ることができる。この場合、溶出するファー ジ表面には野生型コート蛋白質が提示される ので、コート蛋白質のすべてが融合蛋白質と して発現しても大腸菌への感染・増殖が可能 となる)や可溶性抗原による競合的溶出、あ� �いはS-S結合の還元(例えば、前記したCysDisplay ^TM では、パンニングの後、適当な還元剤を用い て抗体とコート蛋白質とを解離させることに より抗原特異的ファージを回収することがで きる)による溶出も可能である。酸で溶出し� �場合は、トリスなどで中和した後で溶出フ� �ージを大腸菌に感染させ、培養後、常法に� �りファージを回収する。

 パンニングにより抗原特異的抗体を提示� ��るファージが濃縮されると、これらを大腸� ��に感染させた後プレート上に播種してクロ� ��ニングを行う。再度ファージを回収し、上� ��の抗体価測定法(例:ELISA、RIA、FIA等)やFACSあ� ��いはSPRを利用した測定により抗原結合活性� ��確認する。

 選択された抗原特異的抗体を提示するフ� ��ージクローンからの抗体の単離・精製は、� ��えば、ファージディスプレイベクターとし� ��抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子の連結部� ��アンバー終止コドンが導入されたベクター� ��用いる場合には、該ファージをアンバー変� ��を持たない大腸菌(例:HB2151株)に感染させる� ��、可溶性抗体分子が産生されペリプラズム� ��しくは培地中に分泌されるので、細胞壁を� ��ゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収� ��、上記と同様の精製技術を用いて行うこと� ��できる。His-tagやc-myc tagを導入しておけば� �IMACや抗c-myc抗体カラムなどを用いて容易に� �製することができる。また、パンニングの� �に特異的プロテアーゼによる切断を利用す� �場合には、該プロテアーゼを作用させると� �体分子がファージ表面から分離されるので� �同様の精製操作を実施することにより目的� �抗体を精製することができる。

 ヒト抗体産生動物およびファージディス� ��レイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒ� ��抗体作製技術は、他の動物種のモノクロー� ��ル抗体を作製するのにも応用することがで� ��る。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、� ��ワトリなどの家畜(家禽)として広く繁殖さ� �ている動物やイヌやネコなどのペット動物� �どが対象として挙げられる。非ヒト動物に� �いては標的抗原の人為的免疫に対する倫理� �問題が少ないので、免疫ライブラリーの利� �がより有効である。

(3)ポリクローナル抗体の作製
 本発明のポリクローナル抗体は、それ自体� ��知あるいはそれに準じる方法に従って製造� ��ることができる。例えば、免疫抗原(蛋白質 もしくはペプチド抗原)自体、あるいはそれ� �キャリアー蛋白質との複合体をつくり、上� �のモノクローナル抗体の製造法と同様に温� �動物に免疫を行い、該免疫動物からWDR6に対� ��る抗体含有物を採取して、抗体の分離精製� ��行うことにより製造することができる。

 温血動物を免疫するために用いられる免� ��抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し� ��キャリアー蛋白質の種類およびキャリアー� ��白質とハプテンとの混合比は、キャリアー� ��白質に架橋させて免疫したハプテンに対し� ��抗体が効率良くできれば、どのようなもの� ��どのような比率で架橋させてもよいが、例� ��ば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロ� ��リン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1 に対し、約0.1~約20、好ましくは約1~約5の割合 でカプルさせる方法が用いられる。

 また、ハプテンとキャリアー蛋白質のカプ� ��ングには、種々の縮合剤を用いることがで� ��るが、グルタルアルデヒドやカルボジイミ� ��、マレイミド活性エステル、チオール基、� ��チオビリジル基を含有する活性エステル試� ��等が用いられる。
 縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産� ��が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希� ��剤とともに投与される。投与に際して抗体� ��生能を高めるため、完全フロイントアジュ� ��ントや不完全フロイントアジュバントを投� ��してもよい。投与は、通常約1~約6週毎に1回 ずつ、計約2~約10回程度行われる。

 ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫� ��れた温血動物の血液、腹水など、好ましく� ��血液から採取することができる。
 抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は� ��上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にし� ��測定できる。ポリクローナル抗体の分離精� ��は、上記のモノクローナル抗体の分離精製� ��同様の免疫グロブリンの分離精製法に従っ� ��行うことができる。

 別の好ましい態様においては、WDR6の活性 を阻害する物質は、WDR6に対してアンタゴニ� �ト活性を示す低分子化合物である。ここで� �アンタゴニスト活性」とは、WDR6に結合してW DR6とIRS-4との結合を阻害するか、WDR6のIRS-4に� ��するリン酸化制御活性を阻害する活性を意� ��する。中枢におけるインスリン/IGF-1シグナ� ��の作用を増強する目的においては、WDR6の活 性を阻害する物質は血液脳関門(BBB)を通過で� ��るものである必要があるので、低分子化合� ��は、脳内移行性において抗体のような大き� ��分子に比べて有利である。そのような化合� ��は、例えば、後述する本発明のスクリーニ� ��グ法を用いて取得することができる。

 本発明において「WDR6の発現を増強する物 質」とは、生体内でのWDR6の量を増大させる� �質をいい、例えば、上記したWDR6蛋白質もし� ��はその部分ペプチド、それをコードする核� ��などが挙げられる。

 本発明において「WDR6の活性を増強する物質 」とは、WDR6のIRS-4との結合性を増大させるか 、あるいはWDR6のIRS-4に対するリン酸化制御活 性を増大させる物質をいい、例えば、WDR6に� �するアゴニスト抗体やWDR6に対してアゴニス� ��活性を示す低分子化合物等が挙げられる。� ��こで「アゴニスト活性」とは、WDR6に結合し てWDR6とIRS-4との結合を促進するか、WDR6のIRS-4 に対するリン酸化制御活性を促進する活性を 意味する。
 WDR6に対するアゴニスト抗体は、上記したWDR 6に対する中和抗体と同様の手法を用いて取� �されるモノクローナル抗体について、抗体� �存在下および非存在下におけるWDR6とIRS-4と� �結合性やIRS-4のリン酸化の程度を比較して、 そのアゴニスト活性を試験することにより得 ることができる。また、WDR6に対してアゴニ� �ト活性を示す低分子化合物は、例えば、後� �する本発明のスクリーニング法を用いて取� �することができる。

 WDR6はIRS-4と結合してインスリン/IGF-1シグ� ��ル伝達系の作用を負に制御する。従って、W DR6またはその部分ペプチド、それをコードす る核酸またはその一部、WDR6に対する中和抗� �またはアゴニスト抗体、WDR6をコードする核� ��に対するアンチセンス核酸、WDR6に対してア ゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を示 す低分子化合物等は、以下の用途を有してい る。

(I)インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用調節 剤等
 WDR6は、IRS-4と結合してインスリン/IGF-1シグ� ��ル伝達系の作用を負に制御する。中枢にお� ��るインスリン/IGF-1シグナルの作用は、神経� ��胞の保護および分化促進、摂食抑制(摂食抑 制ホルモン前駆体(プロオピオメラノコルチ� �)の転写活性化および摂食促進ホルモン(神経 ペプチドY)の転写抑制、GLUT2活性化による糖� �り込みの促進による神経興奮等)などであり� ��末梢における該シグナルの作用は、肝臓に� ��ける糖新生抑制、グリコーゲンの合成亢進� ��分解抑制などによる糖代謝促進、脂肪酸合� ��亢進、脂肪細胞における糖取り込み促進、� ��肪分化抑制、筋肉におけるグリコーゲン合� ��亢進や糖取り込み促進などである。したが� ��て、WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質 、例えば、WDR6をコードする核酸に対するア� �チセンス核酸、WDR6に対する中和抗体、WDR6に 対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合 物等は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作 用を増強し、老化;神経変性疾患(例:アルツハ イマー病、ダウン症、ポリグルタミン病、パ ーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオ ン病、小脳変性症等);摂食障害(例:過食症、� �食症からの反転による過食等);肥満、インス リン抵抗性、糖尿病、糖尿病合併症(例:ケト� ��シス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、� ��尿病性腎症、糖尿病性網膜症)、耐糖能異常 、高脂血症等の代謝疾患;高血圧、動脈硬化� �虚血性心疾患、脳血管障害等の他の生活習� �病などの病態または疾患の予防および改善/� ��療剤などとして使用することができる。
 さらに、IRS-4はFGFやNGFなどの下流に位置し� �おり、神経細胞の分化や保護に重要な役割� �果たしていると考えられる。WDR6はIRS-4のリ� �酸化制御を介してそのシグナルを負に調節� �るので、WDR6の発現もしくは活性を阻害する� ��質はまた、FGFやNGFからのシグナルを介して� ��神経細胞保護作用を発揮し得ると考えられ� ��。

 本発明のアンチセンス核酸を含有する医� ��または動物薬は低毒性であり、そのまま液� ��として、または適当な剤型の医薬組成物と� ��て、ヒトまたは他の温血動物(例、マウス、 ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ 、イヌ、サル、トリなど)に対して経口的ま� �は非経口的(例、血管内投与、皮下投与など) に投与することができる。

 本発明のアンチセンス核酸を上記のインス� ��ン/IGF-1シグナル伝達系の作用増強剤、抗老� ��剤、神経細胞保護剤、抗肥満剤、インスリ� ��抵抗性改善剤、糖尿病の予防・治療剤など� ��医薬または動物薬として使用する場合、自� ��公知の方法に従って製剤化し、投与するこ� ��ができる。即ち、本発明のアンチセンス核� ��を、単独あるいはレトロウイルスベクター� ��アデノウイルスベクター、アデノウイルス� ��ソシエーテッドウイルスベクターなどの適� ��な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可� ��な態様で挿入した後、常套手段に従って製� ��化することができる。該核酸は、そのまま� ��、あるいは摂取促進のための補助剤ととも� ��、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのよ� ��なカテーテルによって投与することができ� ��。あるいは、エアロゾル化して吸入剤とし� ��気管内に局所投与することもできる。
 さらに、体内動態の改良、半減期の長期化� ��細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記� ��酸を単独またはリポソームなどの担体とと� ��に製剤(注射剤)化し、静脈、皮下等に投与� �てもよい。

 本発明のアンチセンス核酸は、それ自体� ��投与してもよいし、または適当な医薬また� ��動物薬組成物(以下、単に「医薬組成物」と 略記する)として投与してもよい。投与に用� �られる医薬組成物としては、本発明のアン� �センス核酸と薬理学的に許容され得る担体� �希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっ� �よい。このような医薬組成物は、経口また� �非経口投与に適する剤形として提供される� �

 非経口投与のための組成物としては、例� ��ば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は� ��脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉� ��射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良� ��。このような注射剤は、公知の方法に従っ� ��調製できる。注射剤の調製方法としては、� ��えば、上記本発明のアンチセンス核酸を通� ��注射剤に用いられる無菌の水性液、または� ��性液に溶解、懸濁または乳化することによ� ��て調製できる。注射用の水性液としては、� ��えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補� ��薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解� ��助剤、例えば、アルコール(例、エタノール )、ポリアルコール(例、プロピレングリコー� ��、ポリエチレングリコール)、非イオン界面 活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50(polyoxyet hylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil)〕等と 併用してもよい。油性液としては、例えば、 ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤と して安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール 等を併用してもよい。調製された注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好ましい 。直腸投与に用いられる坐剤は、上記アンチ センス核酸を通常の坐薬用基剤に混合するこ とによって調製されてもよい。

 経口投与のための組成物としては、固体� ��たは液体の剤形、具体的には錠剤(糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆� �剤、散剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤を� ��む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げら れる。このような組成物は公知の方法によっ て製造され、製剤分野において通常用いられ る担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してい ても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、 例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン 酸マグネシウムが用いられる。

 上記の非経口用または経口用医薬組成物� ��、活性成分の投与量に適合するような投薬� ��位の剤形に調製されることが好都合である� ��このような投薬単位の剤形としては、例え� ��、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプ ル)、坐剤が挙げられる。本発明のアンチセ� �ス核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通� �5~500mg、とりわけ注射剤では5~100mg、その他の 剤形では10~250mg含有されていることが好まし� ��。

 本発明のアンチセンス核酸を含有する上� ��医薬または動物薬の投与量は、投与対象、� ��象疾患、症状、投与ルートなどによっても� ��なるが、例えば、成人の糖尿病の治療・予� ��のために使用する場合には、本発明のアン� ��センス核酸を1回量として、通常0.01~20mg/kg体 重程度、好ましくは0.1~10mg/kg体重程度、さら� ��好ましくは0.1~5mg/kg体重程度を、1日1~5回程� �、好ましくは1日1~3回程度、静脈注射により� ��与するのが好都合である。他の非経口投与� ��よび経口投与の場合もこれに準ずる量を投� ��することができる。症状が特に重い場合に� ��、その症状に応じて増量してもよい。

 なお、前記した各組成物は、本発明のア� ��チセンス核酸との配合により好ましくない� ��互作用を生じない限り他の活性成分を含有� ��てもよい。

 さらに、本発明のアンチセンス核酸は、� ��の薬剤、例えば、インスリン抵抗性改善薬( 例、トログリタゾン、ビオグリタゾン等のチ アドリジン誘導体等)、血糖降下薬(例、トル� ��タミド、グリコピラミド、アセトヘキサミ� ��等のスルホニルウレア薬、グリミジン、グ� ��ブゾール等のスルホンアミド薬、メトフォ� ��ミン、ブフォルミン等のビグアナイド薬等) 、アルドース還元酵素阻害薬(例、エパルレ� �タット等)、α-グルコシダーゼ阻害薬(例、ボ グリボース、アカルボース等)ソマトメジンC� ��剤(例、メカセルミン等)などの抗糖尿病薬;� ��枢性抗肥満薬(例、デキスフェンフルラミン 、フェンフルラミン、フェンテルミン等)、MC H受容体拮抗薬(例、SB-568849、SNAP-7941等)、ニュ ーロペプチドY拮抗薬(例、CP-422935等)、カンナ ビノイド受容体拮抗薬(例、SR-141716、SR-147778� �)、グレリン拮抗薬、レプチン、β3アゴニス� ��などの抗肥満薬;アリセプトなどのアルツハ イマー病治療薬などと併用してもよい。本発 明のアンチセンス核酸および上記薬剤は、同 時または異なった時間に患者に投与すればよ い。

 WDR6に対する中和抗体や、WDR6に対してア� �タゴニスト活性を示す低分子化合物を含有� �る医薬または動物薬は低毒性であり、その� �ま液剤として、または適当な剤型の医薬組� �物として、ヒトまたは他の温血動物(例、マ� ��ス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ� ��ネコ、イヌ、サル、トリなど)に対して経口 的または非経口的(例、血管内投与、皮下投� �など)に投与することができる。

 上記の抗体や低分子化合物は、それ自体� ��投与してもよいし、または適当な医薬組成� ��として投与してもよい。投与に用いられる� ��薬組成物としては、上記の抗体もしくは低� ��子化合物またはその塩と薬理学的に許容さ� ��得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含む� ��のであってもよい。このような医薬組成物� ��、経口または非経口投与に適する剤形とし� ��提供される。

 非経口投与のための組成物としては、例� ��ば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は� ��脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉� ��射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良� ��。このような注射剤は、公知の方法に従っ� ��調製できる。注射剤の調製方法としては、� ��えば、上記本発明の抗体もしくは低分子化� ��物またはその塩を通常注射剤に用いられる� ��菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁ま� ��は乳化することによって調製できる。注射� ��の水性液としては、例えば、生理食塩水、� ��ドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が� ��いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アル� ��ール(例、エタノール)、ポリアルコール(例� ��プロピレングリコール、ポリエチレングリ� ��ール)、非イオン界面活性剤〔例、ポリソル ベート80、HCO-50(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydro genated castor oil)〕等と併用してもよい。油性 液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用 いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル 、ベンジルアルコール等を併用してもよい。 調製された注射液は、適当なアンプルに充填 されることが好ましい。直腸投与に用いられ る坐剤は、上記抗体または低分子化合物を通 常の坐薬用基剤に混合することによって調製 されても良い。

 経口投与のための組成物としては、固体� ��たは液体の剤形、具体的には錠剤(糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆� �剤、散剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤を� ��む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げら れる。このような組成物は公知の方法によっ て製造され、製剤分野において通常用いられ る担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有してい ても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、 例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン 酸マグネシウムが用いられる。

 上記の非経口用または経口用医薬組成物� ��、活性成分の投与量に適合するような投薬� ��位の剤形に調製されることが好都合である� ��このような投薬単位の剤形としては、例え� ��、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプ ル)、坐剤が挙げられる。抗体や低分子化合� �は、投薬単位剤形当たり通常5~500mg、とりわ� ��注射剤では5~100mg、その他の剤形では10~250mg� ��有されていることが好ましい。

 上記の抗体または低分子化合物を含有す� ��上記医薬または動物薬の投与量は、投与対� ��、対象疾患、症状、投与ルートなどによっ� ��も異なるが、例えば、成人の糖尿病の治療� ��予防のために使用する場合には、抗体また� ��低分子化合物を1回量として、通常0.01~20mg/kg 体重程度、好ましくは0.1~10mg/kg体重程度、さ� ��に好ましくは0.1~5mg/kg体重程度を、1日1~5回� �度、好ましくは1日1~3回程度、静脈注射によ� ��投与するのが好都合である。他の非経口投� ��および経口投与の場合もこれに準ずる量を� ��与することができる。症状が特に重い場合� ��は、その症状に応じて増量してもよい。

 なお、前記した各組成物は、上記抗体や� ��分子化合物との配合により好ましくない相� ��作用を生じない限り他の活性成分を含有し� ��もよい。

 さらに、上記の抗体または低分子化合物� ��、本発明のアンチセンス核酸を含有する医� ��において前記したと同様の他の薬剤と併用� ��てもよい。上記の抗体または低分子化合物� ��それらの他の薬剤とは、同時または異なっ� ��時間に患者に投与すればよい。

 WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質は、 中枢におけるインスリン/IGF-1シグナル伝達系 の作用を増強し、神経細胞の分化・再生・保 護や、摂食抑制などの作用を通じて、寿命延 長効果を奏することから、老化防止などの目 的で、各種の加工食品や飲料のような一般食 品や、特定保健用食品、栄養機能食品等の保 健機能食品、あるいは飼料へ添加し、あるい はサプリメントとして利用することができる 。
 本発明において「食品」とは、食品全般(飲 料を含む)を意味するが、いわゆる健康食品� �含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能� �品制度に規定される特定保健用食品や栄養� �能食品をも含むものであり、さらにサプリ� �ントも包含される。

 本発明における食品は、WDR6の発現もしく は活性を抑制する物質を、適宜の食品として 許容される担体、例えば、各種加工用食材、 調味料、香料、甘味料等とともに使用して、 自体公知の方法で製造し、また、散剤、錠剤 、カプセル剤、ドリンク剤等の製剤とするこ とができる。食品として許容される担体には 、前記の医薬組成物において薬学的に許容さ れる担体が含まれる。

 本発明の食品の製造に際しては、さらに� ��抗酸化剤等の老化防止に効果のある他の成� ��、ビタミン類、他の栄養補給用添加剤等を� ��宜配合することができる。

 WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質は 、上記本発明の食品と同様の目的で、ペット 動物や家畜・家禽などの非ヒト動物用の飼料 として利用することができる。本発明におけ る飼料は、適宜の飼料として許容される担体 、例えば、通常の飼料材等を使用して自体公 知の方法で製造できる。飼料として許容され る担体には、前記の医薬組成物において薬学 的に許容される担体が含まれる。動物への投 与は、前記したヒトへの投与と同様か、ある いは通常の飼料に添加することによって行う ことができる。

 本発明の食品および飼料に含まれる、WDR6 の発現もしくは活性を抑制する物質の量は、 特に限定されないが、1日あたりの摂取量が� �記した本発明の医薬または動物薬における� �与量と同様の範囲となるようにするのが好� �しい。

 前述の通り、インスリン/IGF-1シグナル伝達� ��は、中枢において、摂食抑制ホルモン前駆� ��の転写活性化および摂食促進ホルモンの転� ��抑制や、GLUT2活性化による糖取り込み促進� �より神経を興奮させることで摂食抑制など� �関与し、末梢においては、例えば、肝臓に� �ける脂肪酸合成亢進や脂肪細胞における脂� �分解抑制などに関与している。したがって� �WDR6の発現もしくは活性を増強する物質、例� ��ば、WDR6またはその部分ペプチド、それをコ ードする核酸、WDR6に対するアゴニスト抗体� �WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分� ��化合物等は、インスリン/IGF-1シグナル伝達� ��の作用を抑制して、摂食促進、脂肪代謝促� ��等の効果を発揮することにより、摂食障害( 例、拒食症、過食症からの反転による拒食等 )や代謝疾患(例、血中脂質濃度を改善するこ� ��による)等の疾患の予防・治療剤などとして 使用することができる。
 さらに、IRS-4はインスリン刺激によりPI3-キ� ��ーゼ、PKB/Aktを活性化してアポトーシスを抑 制し、細胞生存を促進する役割を果たすと考 えられる。WDR6はIRS-4のリン酸化制御を介して インスリンからのシグナルを負に調節するの で、WDR6の発現もしくは活性を増強する物質� �また、アポトーシス促進剤、細胞増殖/分化� ��制剤などとして、癌や自己免疫疾患(例、関 節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎等)� �どの疾患の予防・治療に効果を発揮し得る� �考えられる。

 WDR6またはその部分ペプチド、それをコー ドする核酸、WDR6に対するアゴニスト抗体、� �たはWDR6に対してアンタゴニスト活性を示す� ��分子化合物を含有する医薬または動物薬は� ��毒性であり、そのまま液剤として、または� ��当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは� ��の温血動物(例、マウス、ラット、ウサギ、 ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、ト リなど)に対して経口的または非経口的(例、� ��管内投与、皮下投与など)に投与することが できる。

 WDR6またはその部分ペプチド、WDR6に対する� �ゴニスト抗体、またはWDR6に対してアンタゴ� ��スト活性を示す低分子化合物を上記の摂食� ��害、代謝疾患、癌、自己免疫疾患の予防・� ��療剤などの医薬または動物薬として使用す� ��場合、上記のWDR6に対する中和抗体やWDR6に� �してアンタゴニスト活性を示す低分子化合� �と同様の方法により製剤化し、同様の投与� �路・用量で投与することができる。また、WD R6またはその部分ペプチドをコードする核酸� ��上記の医薬または動物薬として使用する場� ��、上記の本発明のアンチセンス核酸と同様� ��方法により製剤化し、同様の投与経路・用� ��で投与することができる。
 但し、WDR6の発現もしくは活性を増強する物 質は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用 を抑制するので、神経細胞保護作用を抑制し たり、末梢における糖代謝を変化させたりし て、投与対象にとって望ましくない副作用を 生じる可能性がある。したがって、WDR6の発� �もしくは活性を増強する物質は、インスリ� �/IGF-1シグナル伝達系の作用もしくはIRS-4の下 流因子の活性化を抑制すべき部位(例えば、� �床下部等の中枢や、肝臓、脂肪組織、骨格� �などの末梢)に、局所的に投与されることが� ��り安全であり得る。

(II)インスリン/IGF-1シグナル伝達系の異常等� �診断剤
 WDR6をコードする核酸またはその一部(以下� �「本発明のセンス核酸」という場合がある)� ��よび本発明のアンチセンス核酸は、プロー� ��やプライマーとして使用することにより、� ��トまたは他の温血動物(例えば、ラット、マ ウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、 イヌ、サル、トリなど)におけるWDR6をコード� ��るDNAまたはmRNAの異常(遺伝子異常)を検出す� ��ことができるので、例えば、該DNAまたはmRNA の損傷、突然変異あるいは発現低下や、該DNA またはmRNAの増加あるいは発現過多などの遺� �子診断剤として有用である。
 本発明のセンスまたはアンチセンス核酸を� ��いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公� ��のノーザンハイブリダイゼーションやPCR-SSC P法(ゲノミックス(Genomics),第5巻,874~879頁(1989年 )、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナ� �・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オ� �・ユーエスエー(Proceedings of the National Acade my of Sciences of the United States of America),第8 6巻,2766~2770頁(1989年))などにより実施すること ができる。
 例えば、ノーザンハイブリダイゼーション� ��によりWDR6の発現低下が検出された場合は、 例えば、WDR6の機能不全が関与する疾患に罹� �している可能性が高いか、あるいは将来罹� �する可能性が高いと診断することができる� �WDR6の機能不全が関与する疾患としては、例� ��ば、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用� ��異常亢進に関連する疾患、例えば、摂食障� ��、低血糖、脂肪代謝異常が関与する代謝疾� ��、癌、自己免疫疾患(例、関節リウマチ、ク ローン病、潰瘍性大腸炎等)などが挙げられ� �。
 また、ノーザンハイブリダイゼーション等� ��よりWDR6の発現過多が検出された場合は、例 えば、WDR6の過剰発現が関与する疾患に罹患� �ている可能性が高いか、あるいは将来罹患� �る可能性が高いと診断することができる。WD R6の過剰発現が関与する疾患としては、例え� ��、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用の� ��全に関連する疾患、例えば、神経変性疾患( 例:アルツハイマー病、ダウン症、ポリグル� �ミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬� �症、プリオン病、小脳変性症等);摂食障害;� �満、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病合� �症(例:ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性 神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症)� �耐糖能異常、高脂血症等の代謝疾患;高血圧� ��動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障害など� ��他の生活習慣病などが挙げられる。

 本発明の抗体は、WDR6を特異的に認識するこ とができるので、被験試料中のWDR6の検出に� �用することができる。
 すなわち、本発明は、
(i)本発明の抗体と、被験試料および標識化さ れたWDR6とを競合的に反応させ、該抗体に結� �した標識化されたWDR6の割合を測定すること� ��特徴とする被験試料中のWDR6の定量法、およ び
(ii)被験試料と、担体上に不溶化した本発明� �抗体および標識化された別の本発明の抗体� �を、同時あるいは連続的に反応させた後、� �溶化担体上の標識剤の量(活性)を測定するこ とを特徴とする被験試料中のWDR6の定量法を� �供する。

 上記(ii)の定量法においては、2種の抗体はWD R6の異なる部分を認識するものであることが� ��ましい。例えば、一方の抗体がWDR6のN端部� �認識する抗体であれば、他方の抗体としてWD R6のC端部と反応するものを用いることができ る。
 また、WDR6に対するモノクローナル抗体を用 いてWDR6の定量を行うことができるほか、組� �染色等による検出を行うこともできる。こ� �らの目的には、抗体分子そのものを用いて� �よく、また、抗体分子のF(ab') ₂ 、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。
 本発明の抗体を用いるWDR6の定量法は、特に 制限されるべきものではなく、被験試料中の 抗原量(例えば、WDR6量)に対応した抗体、抗原 もしくは抗体-抗原複合体の量を化学的また� �物理的手段により検出し、これを既知量の� �原を含む標準液を用いて作製した標準曲線� �り算出する測定法であれば、いずれの測定� �を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー� �競合法、イムノメトリック法およびサンド� �ッチ法が好適に用いられるが、感度、特異� �の点で、後述するサンドイッチ法を用いる� �が特に好ましい。

 標識物質を用いる測定法に用いられる標識� ��としては、例えば、放射性同位元素、酵素� ��蛍光物質、発光物質などが用いられる。放� ��性同位元素としては、例えば、〔 ¹²⁵ I〕、〔 ¹³¹ I〕、〔 ³ H〕、〔 ¹⁴ C〕などが用いられる。上記酵素としては、� �定で比活性の大きなものが好ましく、例え� �、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ� �アルカリフォスファターゼ、パーオキシダ� �ゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる� �蛍光物質としては、例えば、フルオレスカ� �ン、フルオレッセンイソチオシアネートな� �が用いられる。発光物質としては、例えば� �ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェ� �ン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに� �抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオ� �ン-(ストレプト)アビジン系を用いることも� �きる。

 抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては� ��物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質� ��るいは酵素等を不溶化・固定化するのに用� ��られる化学結合を用いてもよい。担体とし� ��は、アガロース、デキストラン、セルロー� ��などの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリ� ��クリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あ� ��いはガラス等があげられる。

 サンドイッチ法においては不溶化した本発� ��の抗体に被験試料を反応させ(1次反応)、さ� ��に標識化した別の本発明の抗体を反応させ( 2次反応)た後、不溶化担体上の標識剤の量(活 性)を測定することにより被験試料中のWDR6量� ��定量することができる。1次反応と2次反応� �逆の順序で行っても、また、同時に行って� �よいし、時間をずらして行ってもよい。標� �化剤および不溶化の方法は前記のそれらに� �じることができる。また、サンドイッチ法� �よる免疫測定法において、固相化抗体ある� �は標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも1� ��類である必要はなく、測定感度を向上させ� ��等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用い てもよい。
 サンドイッチ法によるWDR6の測定法において は、1次反応と2次反応に用いられる本発明の� ��体は、WDR6の結合する部位が相異なる抗体が 好ましく用いられる。例えば、上述のように 、2次反応で用いられる抗体が、WDR6のC端部を 認識する場合、1次反応で用いられる抗体と� �ては、好ましくはC端部以外、例えばN端部を 認識する抗体が用いられる。

 本発明の抗体は、サンドイッチ法以外の測� ��システム、例えば、競合法、イムノメトリ� ��ク法あるいはネフロメトリーなどにも用い� ��ことができる。
 競合法では、被験試料中の抗原と標識抗原� ��を抗体に対して競合的に反応させた後、未� ��応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗� ��(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識� �を測定し、被験試料中の抗原量を定量する� �本反応法には、抗体として可溶性抗体を用� �、ポリエチレングリコールや前記抗体(1次抗 体)に対する2次抗体などを用いてB/F分離を行� ��液相法、および、1次抗体として固相化抗体 を用いるか、あるいは1次抗体は可溶性のも� �を用い、2次抗体として固相化抗体を用いる� ��相化法とが用いられる。
 イムノメトリック法では、被験試料中の抗� ��と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対� ��て競合反応させた後固相と液相を分離する� ��、あるいは、被験試料中の抗原と過剰量の� ��識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を� ��え未反応の標識化抗体を固相に結合させた� ��、固相と液相を分離する。次に、いずれか� ��相の標識量を測定し被験試料中の抗原量を� ��量する。
 また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるい� ��溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性� ��沈降物の量を測定する。被験試料中の抗原� ��が僅かであり、少量の沈降物しか得られな� ��場合にもレーザーの散乱を利用するレーザ� ��ネフロメトリーなどが好適に用いられる。

 これら個々の免疫学的測定法を本発明の定� ��方法に適用するにあたっては、特別の条件� ��操作等の設定は必要とされない。それぞれ� ��方法における通常の条件、操作法に当業者� ��通常の技術的配慮を加えてWDR6の測定系を構 築すればよい。これらの一般的な技術手段の 詳細については、総説、成書などを参照する ことができる。
 例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセ� �」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続� �ジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発� �)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書 院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫 測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、� �川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学� ��院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY」  Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vo l. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol.  74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol.  84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoas says))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part� �E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Me thods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Par t I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies) )(以上、アカデミックプレス社発行)などを参 照することができる。
 以上のようにして、本発明の抗体を用いる� ��とによって、WDR6を感度よく定量することが できる。

 したがって、被験温血動物由来の生体試料( 例、血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液 、関節液、精液、尿、生検サンプル等)を被� �体とし、本発明の抗体を用いて該被験体中� �WDR6の濃度を定量することによって、WDR6濃度 の減少が検出された場合、例えば、インスリ ン/IGF-1シグナル伝達系の作用の異常亢進に関 連する疾患、例えば、摂食障害、低血糖、脂 肪代謝異常が関与する代謝疾患、癌、自己免 疫疾患(例、関節リウマチ、クローン病、潰� �性大腸炎等)などの疾患に罹患しているか、� ��るいは将来罹患する可能性が高いと診断す� ��ことができる。
 一方、WDR6濃度の増加が検出された場合には 、例えば、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の 作用の不全に関連する疾患、例えば、神経変 性疾患(例:アルツハイマー病、ダウン症、ポ� ��グルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性� ��索硬化症、プリオン病、小脳変性症等);摂� �障害;肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、糖� ��病合併症(例:ケトーシス、アシドーシス、� �尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性� �膜症)、耐糖能異常、高脂血症等の代謝疾患; 高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障 害等の他の生活習慣病などの疾患に罹患して いるか、あるいは将来罹患する可能性が高い と診断することができる。

(III)インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用調� ��剤のスクリーニング
 本発明はまた、WDR6を産生する能力を有する 細胞における該タンパク質(遺伝子)の発現を� ��試験化合物の存在下と非存在下で比較する� ��とを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル� ��達系の作用を調節する物質のスクリーニン� ��方法を提供する。

 WDR6の発現量は、前記した本発明のセンス核 酸または本発明のアンチセンス核酸(以下、� �れらを包括して「本発明の核酸」という)を� ��いて、WDR6のmRNAを検出することにより、RNA� �ベルで測定することができる。あるいは、� �発現量は、前記した本発明の抗体を用いて� �WDR6タンパク質を検出することにより、タン� ��ク質レベルで測定することもできる。
 従って、より具体的には、本発明は、
(a)WDR6を産生する能力を有する細胞を試験化� �物の存在下および非存在下に培養し、両条� �下における該タンパク質をコードするmRNAの� ��を、本発明の核酸を用いて測定、比較する� ��とを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル� ��達系の作用を調節する物質のスクリーニン� ��方法、および
(b)WDR6を産生する能力を有する細胞を試験化� �物の存在下および非存在下に培養し、両条� �下における該タンパク質の量を、本発明の� �体を用いて測定、比較することを特徴とす� �、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を� �節する物質のスクリーニング方法を提供す� �。

 例えば、WDR6のmRNA量またはタンパク質量の� �定は、具体的には以下のようにして行うこ� �ができる。
(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物(� �えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、� �タ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、あるい� �、肥満/糖尿病マウス(例、ob/obマウス、db/db� �ウス、A ^y マウス、KKマウス等)、肥満/糖尿病ラット(例� ��Zucker obeseラット、GKラット等)、高血圧ラッ ト、動脈硬化ウサギ、アルツハイマー病モデ ルマウス(例、Tg2576マウス等)など)に対して、 薬剤(例えば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、降圧� �、血管作用薬、神経細胞保護剤など)あるい� ��物理的ストレス(例えば、浸水ストレス、電 気ショック、明暗、低温など)などを与え、� �定時間経過した後に、血液、あるいは特定� �臓器・組織(例えば、脳、視床下部、肝臓、� ��肪組織、骨格筋など)、あるいは細胞(例え� �、神経細胞、肝細胞、脂肪細胞、筋細胞な� �)を得る。
 得られた細胞等に含まれるWDR6 mRNAは、例え ば、通常の方法により該細胞等からmRNAを抽� �し、例えば、TaqMan PCRなどの手法を用いるこ とにより定量することができ、自体公知の手 段によりノーザンブロットを行なうことによ り解析することもできる。一方、WDR6タンパ� �質量は、ウェスタンブロット解析や以下に� �述する各種イムノアッセイ法を用いて定量� �ることができる。
(ii)WDR6またはその部分ペプチドを発現する形� ��転換体を前述の方法に従って作製し、該形� ��転換体に含まれるWDR6またはその部分ペプチ ドあるいはそれをコードするmRNAを同様にし� �定量、解析することができる。

 試験化合物としては、例えばタンパク質� ��ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合� ��化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽� ��液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ� ��これらの物質は新規なものであってもよい� ��、公知のものであってもよい。

 WDR6の発現量を変化させる物質のスクリーニ ングは、
(i)正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に 対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを 与える一定時間前(30分前ないし24時間前、好� ��しくは30分前ないし12時間前、より好ましく は1時間前ないし6時間前)もしくは一定時間後 (30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ない� ��2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間 後)、または薬剤あるいは物理的ストレスと� �時に試験化合物を投与し、投与後一定時間� �過後(30分後ないし3日後、好ましくは1時間後 ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし2 4時間後)、該動物から単離した細胞に含まれ� ��WDR6をコードするmRNA量、あるいはWDR6タンパ� ��質量を定量、解析することにより、あるい� ��
(ii)形質転換体を常法に従い培養する際に試� �化合物を培地中に混合させ、一定時間培養� �(1日後ないし7日後、好ましくは1日後ないし3 日後、より好ましくは2日後ないし3日後)、該 形質転換体に含まれるWDR6をコードするmRNA量� ��あるいはWDR6タンパク質量を定量、解析する ことにより行うことができる。

 上記(b)のスクリーニング方法におけるWDR6タ ンパク質の量の測定は、具体的には、例えば 、
(i)本発明の抗体と、被験試料および標識化さ れたWDR6タンパク質とを競合的に反応させ、� �抗体に結合した標識化されたタンパク質を� �出することにより該試料中のWDRタンパク質� �定量する方法、
(ii)被験試料と、担体上に不溶化した本発明� �抗体および標識化された別の本発明の抗体� �を、同時あるいは連続的に反応させた後、� �溶化担体上の標識剤の量(活性)を測定するこ とにより、該試料中のWDR6タンパク質を定量� �る方法等が挙げられる。
 具体的な測定は、前記した本発明の抗体を� ��いた診断法と同様にして行うことができる� ��

 例えば、上記のスクリーニング方法にお� ��て、試験化合物の存在下におけるWDR6の発現 量が、試験化合物の非存在下における発現量 に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、よ り好ましくは約50%以上阻害された場合に、該 試験化合物を、WDR6の発現を抑制する物質と� �て選択することができる。一方、試験化合� �の存在下におけるWDR6の発現量が、試験化合� ��の非存在下における発現量に比べて、約20%� ��上、好ましくは30%以上、より好ましくは約5 0%以上増大した場合に、該試験化合物を、WDR6 の発現を増強する物質として選択することが できる。

 上記スクリーニング方法を用いて得られる� ��合物は、WDR6の発現量を変化させることによ り、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を 調節するための安全で低毒性な医薬として有 用である。
 前述のとおり、WDR6の発現を抑制する物質は 、WDR6とIRS-4との相互作用を抑制することによ ってインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を 増強するので、老化;神経変性疾患(例:アルツ ハイマー病、ダウン症、ポリグルタミン病、 パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリ オン病、小脳変性症等);摂食障害;肥満、イン スリン抵抗性、糖尿病、糖尿病合併症(例:ケ� ��ーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害� ��糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症)、耐糖能異 常、高脂血症等の代謝疾患;高血圧、動脈硬� �、虚血性心疾患、脳血管障害等の他の生活� �慣病などの病態または疾患の予防および改� �/治療剤などとして使用することができる。� ��た、WDR6の発現を抑制する物質は、IRS-4との� ��互作用を抑制することによって、FGFやNGFか� ��のシグナルを介しても神経細胞保護作用を� ��揮し得る。
 一方、WDR6の発現を増強する物質は、インス リン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制して、 摂食促進、脂肪代謝促進等の効果を発揮する ことにより、摂食障害や脂肪代謝異常が関与 する代謝疾患等の疾患の予防・治療剤などと して使用することができる。また、WDR6の発� �を増強する物質は、インスリン刺激によるIR S-4を介したPI3-キナーゼ、PKB/Aktの活性化を阻� ��するので、アポトーシス促進剤、細胞増殖/ 分化抑制剤などとして、癌や自己免疫疾患(� �、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸� �等)などの疾患の予防・治療に効果を発揮し� ��る。
 WDR6の発現を調節する物質を上記医薬として 使用する場合は、前記WDR6に対してアゴニス� �もしくはアンタゴニスト活性を示す低分子� �合物等と同様にして製剤化し、同様の投与� �路、用量で投与することができる。

 本発明はまた、WDR6またはその部分ペプチド 、あるいはそれを産生する細胞を用いること による、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作 用を調節する物質のスクリーニング方法を提 供する。該スクリーニング方法は、(A)WDR6とIR S-4の結合性を利用する方法、(B)IRS-4の活性化( リン酸化)の程度を指標とする方法に大別さ� �る。いずれの方法においても、IRS-4もしくは WDR6との結合能を保持するその部分ペプチド� �あるいはそれを産生する細胞がさらに用い� �れる。
(A)WDR6とIRS-4の結合性を利用するスクリーニン グ方法
 WDR6はIRS-4と結合してそのリン酸化を制御す� ��ことができるので、WDR6またはその部分ペプ チドとIRS-4またはその部分ペプチドを用いた� ��インディングアッセイ系を構築することに� ��って、WDR6またはその部分ペプチドと同様の 作用を有する化合物のスクリーニングや、WDR 6またはその部分ペプチドの作用を阻害する� �合物のスクリーニングを行うことができる� �すなわち、本発明は、WDR6またはその部分ペ� ��チドとIRS-4またはその部分ペプチドを用い� �、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を� �節する物質のスクリーニング方法を提供す� �。
 より具体的には、本発明は、
(a)(1)IRS-4またはその部分ペプチドに、WDR6また はその部分ペプチドを接触させた場合と(2)IRS -4またはその部分ペプチドに、WDR6またはその 部分ペプチドおよび試験化合物を接触させた 場合との、IRS-4またはその部分ペプチドとWDR6 またはその部分ペプチドとの結合量の比較を 行うことを特徴とする、インスリン/IGF-1シグ ナル伝達系の作用を調節する物質のスクリー ニング方法、
(b)(1)IRS-4またはその部分ペプチドを産生する� ��胞に、WDR6またはその部分ペプチドを接触さ せた場合と(2)IRS-4またはその部分ペプチドを� ��生する細胞に、WDR6またはその部分ペプチド および試験化合物を接触させた場合との、IRS -4またはその部分ペプチドとWDR6またはその部 分ペプチドとの結合量の比較を行うことを特 徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の 作用を調節する物質のスクリーニング方法、 および
(c)IRS-4またはその部分ペプチドおよびWDR6また はその部分ペプチドを産生し、且つ両者が結 合した場合にレポーター遺伝子の転写が活性 化される細胞における該レポーター遺伝子の 発現量を、試験化合物の存在下と非存在下と で比較することを特徴とする、インスリン/IG F-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のス クリーニング方法を提供する。

 上記(a)または(b)のスクリーニング方法にお� ��て用いられるIRS-4は、ヒトまたは他の温血� �物の細胞から自体公知の方法(例えば、WDR6に ついて上記したと同様の方法)を用いて単離� �製することができる。IRS-4の部分ペプチドは 、WDR6との結合に必要なドメインのアミノ酸� �列を有する限り特に制限されず、インスリ� �受容体のチロシンキナーゼによりリン酸化� �れるリン酸化部位などを含んでいてもよい� �該部分ペプチドはIRS-4を適当な蛋白質分解酵 素を用いて消化することにより得ることがで きる。また、IRS-4およびその部分ペプチドは� ��自体公知の遺伝子工学的手法に従ってそれ� ��コードするDNAをクローニングした後、前記� ��たWDR6の発現方法に従って組換え生産するこ ともできる。
 WDR6およびその部分ペプチド(以下、単にWDR6� ��いう場合がある)は、上記の方法に従って調 製することができる。
 IRS-4を産生する細胞としては、それを発現� �るヒトまたは他の温血動物細胞であれば特� �制限はない。また、IRS-4またはその部分ペプ チド(以下、単にIRS-4という場合がある)を産� �する細胞としては、上記の遺伝子工学的手� �により作製された形質転換体が例示される� �

 試験化合物としては、例えばタンパク質� ��ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合� ��化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽� ��液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ� ��これらの物質は新規なものであってもよい� ��、公知のものであってもよい。

 結合量の測定は、例えば、標識した抗WDR6抗 体および抗IRS-4抗体を用いたウェスタンブロ� ��ト解析、WDR6またはIRS-4のいずれかを標識(例 えば、〔 ³ H〕、〔 ¹²⁵ I〕、〔 ¹⁴ C〕、〔 ³⁵ S〕などで)しての結合アッセイやゲルシフト� ��ッセイ、あるいは表面プラズモン共鳴(SPR)� �どにより行うことができる。
 上記のスクリーニング方法において、IRS-4� �結合してWDR6とIRS-4との結合を阻害する化合� �を、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用� �調節する物質として選択することができる� �

 本スクリーニング方法において、WDR6とIRS-4� ��の反応は、通常約37℃で数時間程度行うこ� �ができる。
 例えば、標識WDR6を用いた結合アッセイによ り上記のスクリーニング方法を実施するには 、まず、IRS-4またはそれを産生する細胞をス� ��リーニングに適したバッファーに懸濁する� ��とによりIRS-4標品を調製する。バッファー� �、pH約4~10(望ましくは、pH約6~8)のリン酸バッ� ��ァー、トリス-塩酸バッファーなどの、WDR6� �IRS-4との結合を阻害しないバッファーであれ ばいずれでもよい。また、非特異的結合を低 減させる目的で、CHAPS、Tween-80 ^TM (花王-アトラス社)、ジギトニン、デオキシコ レートなどの界面活性剤をバッファーに加え ることもできる。さらに、プロテアーゼによ るWDR6やIRS-4の分解を抑える目的で、PMSF、ロ� �ペプチン、バシトラシン、アプロチニン、E- 64(タンパク質研究所製)、ペプスタチンなど� �プロテアーゼ阻害剤を添加することもでき� �。
 一方、細胞が固定化細胞の場合、培養器に� ��定化させたまま、つまり細胞を生育させた� ��態で、あるいはグルタルアルデヒドやパラ� ��ルムアルデヒドで固定した細胞を用いて、W DR6とIRS-4を結合させることができる。この場� ��、該緩衝液は培地やハンクス液などが用い� ��れる。
 そして、0.01ml~10mlの該IRS-4標品に、一定量(� �えば、2000Ci/mmolの場合、約10000cpm~1000000cpm)の� ��識したWDR6(例えば、〔 ¹²⁵ I〕で標識したWDR6)を添加し、同時に10 ^-4 M~10 ^-10 Mの被検物質を共存させる。非特異的結合量(N SB)を知るために大過剰の未標識のWDR6を加え� �反応チューブも用意する。反応は0℃~50℃、� ��ましくは4℃~37℃で20分~24時間、望ましくは3 0分~3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で 濾過(IRS-4産生細胞を用いる場合)またはB/F分� �(精製IRS-4を用いる場合)し、適量の同バッフ� ��ーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙または固� ��に残存する放射活性(例えば、〔 ¹²⁵ I〕の量)を液体シンチレーションカウンター� ��たはγ-カウンターで測定する。拮抗する物� ��がない場合のカウント(B ₀ )から非特異的結合量(NSB)を引いたカウント(B ₀ -NSB)を100%とした時、特異的結合量(B-NSB)が、� �えばカウント(B ₀ -NSB)の50%以下になる被検物質をIRS-4活性化調� �物質として選択することができる。

 本発明のスクリーニング用キットは、WDR6、 好ましくはさらにIRS-4またはそれを産生する� ��胞を含有するものである。
 本発明のスクリーニング用キットの例とし� ��は次のものが挙げられるが、これに限定さ� ��るものではない。
〔スクリーニング用試薬〕
1) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
 Hanks' Balanced Salt Solution(ギブコ社製)に、0.0 5%のウシ血清アルブミン(シグマ社製)を加え� �もの。孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し� ��4℃で保存するか、あるいは用時調製しても 良い。
2) IRS-4標品
 HeLa細胞またはHEK293細胞を12穴プレートに5×1 0 ⁵ 個/穴で継代し、37℃、5%CO ₂ 、95%airで2日間培養したもの。
3) 標識したWDR6標品
 WDR6を〔 ³ H〕、〔 ¹²⁵ I〕、〔 ¹⁴ C〕、〔 ³⁵ S〕などで標識したもの。
4) WDR6標準液
 WDR6を0.1%ウシ血清アルブミン(シグマ社製)を 含むPBSで0.1mMとなるように溶解し、-20℃で保� ��したもの。
〔測定法〕
1) 12穴組織培養用プレートにて培養したIRS-4� ��生細胞を、測定用緩衝液1mlで2回洗浄した後 、490μlの測定用緩衝液を各穴に加える。
2) 10 ^-3 ~10 ^-10 Mの被検物質溶液を5μl加えた後、5nMの標識し� ��WDR6を5μl加え、室温にて1時間反応させる。� ��特異的結合量を知るためには被検物質のか� ��りに10 ^-4 MのWDR6を5μl加えておく。
3) 反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回� ��浄する。細胞に結合した標識WDR6を0.5mlの0.2N  NaOH-1%SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーター A(和光純薬製)と混合する。
4) 液体シンチレーションカウンター(ベック� ��ン社製)を用いて放射活性を測定し、Percent  Maximum Binding(PMB)を次式(数1)で求める。なお、 〔 ¹²⁵ I〕で標識されている場合は、液体シンチレ� �ターと混合することなしに直接ガンマーカ� �ンターで測定できる。

 PMB: Percent Maximum Binding
 B : 検体を加えた時の結合量
 NSB: Non-specific Binding(非特異的結合量)
 B ₀ : 最大結合量

 上記(c)のスクリーニング法において用いら� ��る細胞としては、(1)IRS-4またはその部分ペ� �チドと転写因子(例えば、GAL4、VP16等)の結合� ��メインもしくは転写活性化ドメインのいず� ��か一方との融合蛋白質をコードする、(2)WDR6 またはその部分ペプチドと転写因子の他方の ドメインとの融合蛋白質をコードするDNA、お よび(3)該転写因子により活性化されるプロモ ーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含 有する細胞、好ましくは酵母細胞、哺乳動物 細胞等が挙げられる。レポーター遺伝子とし ては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ガ ラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファ ターゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、ク ロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ遺伝子、グリーンフルオレセントプロテ イン(GFP)遺伝子などが挙げられる。
 本スクリーニング方法において、上記の細� ��を、使用する宿主細胞に適合した培養条件� ��で数時間~1日程度培養した後、細胞抽出液� �たは上清液を得て、常法によりレポーター� �伝子の検出を行う。
 上記のスクリーニング方法において、レポ� ��ター遺伝子の発現を調節する化合物を、イ� ��スリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節す� ��物質として選択することができる。

(B)IRS-4の活性化を指標とするスクリーニング� ��法
 WDR6とIRS-4との相互作用に及ぼす試験化合物� ��効果をIRS-4の活性化を測定することにより� �べれば、該物質がIRS-4の活性化を抑制するか 、あるいは促進するかを直接評価することが できる。すなわち、本発明は、IRS-4またはそ� ��部分ペプチドを産生する細胞における該蛋� ��質もしくは該ペプチドの活性化を、(1)WDR6ま たはその部分ペプチドの存在下と、(2)WDR6ま� �はその部分ペプチドおよび試験化合物の存� �下とで、測定・比較することによる、イン� �リン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する� �質のスクリーニング方法を提供する。

 本スクリーニング法において、IRS-4または� �の部分ペプチドを産生する細胞(以下、単にI RS-4産生細胞という場合がある)としては、IRS- 4を内因的に産生する細胞や、IRS-4またはその 部分ペプチドをコードするDNAを導入された動 物細胞などが挙げられる。
 WDR6またはその部分ペプチド(以下、単にWDR6� ��いう場合がある)は外部から細胞に添加して もよいし、あるいはIRS-4産生細胞自体が産生� ��るものであってもよい。後者の場合、WDR6は 内因的に産生されてもよいし、IRS-4産生細胞� ��宿主として上記WDR6の発現方法に従って遺伝 子工学的に作製された形質転換体であっても よい。

 試験化合物としては、例えばタンパク質� ��ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合� ��化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽� ��液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ� ��これらの物質は新規なものであってもよい� ��、公知のものであってもよい。

 IRS-4の活性化は、IRS-4の自己リン酸化、IRS -4カスケードの下流に位置するキナーゼ(例え ば、PI3K、PKB/Akt等)やIRS-4の基質となり得る他� ��蛋白質もしくは合成ペプチドのリン酸化な� ��を測定することにより評価することができ� ��。

 具体的には、まずIRS-4産生細胞をマルチウ� �ルプレート等に培養する。スクリーニング� �行うにあたっては、前もって新鮮な培地あ� �いは細胞に毒性を示さない適当なバッファ� �に交換し、試験化合物(細胞がWDR6を産生しな い場合はさらにWDR6)などを添加して一定時間� ��ンキュベートした後、細胞を抽出あるいは� ��清液を回収して、生成した産物をそれぞれ� ��方法に従って定量する。
 IRS-4や他の蛋白質もしくはペプチドのリン� �化の検出は、リン酸化蛋白質(ペプチド)特異 的抗体を用いたウェスタンブロット解析や、 基質蛋白質(ペプチド)における[ ³² P]標識ATPの取込みをゲル電気泳動およびオー� ��ラジオグラフィーにより検出する等の方法� ��より行うことができる。

 上記のスクリーニング方法において、IRS-4� �生細胞に試験化合物を添加した際にIRS-4の活 性が増大(IRS-4や他の蛋白質もしくはペプチド のリン酸化の程度が増大)した場合、該化合� �をインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を� �強させる物質として選択することができる� �一方、試験化合物を添加した際にIRS-4の活性 が低下(IRS-4や他の蛋白質もしくはペプチドの リン酸化の程度が低減)した場合、該化合物� �インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑� �する物質として選択することができる。
 例えば、上記のスクリーニング方法におい� ��、試験化合物の存在下におけるIRS-4のリン� �化の程度が、試験化合物の非存在下におけ� �それに比べて、約20%以上、好ましくは30%以� �、より好ましくは約50%以上増大した場合に� �該化合物をインスリン/IGF-1シグナル伝達系� �作用を増強させる物質として選択すること� �できる。一方、試験化合物の存在下におけ� �IRS-4のリン酸化の程度が、試験化合物の非存 在下におけるそれに比べて、約20%以上、好ま しくは30%以上、より好ましくは約50%以上低下 した場合に、該化合物をインスリン/IGF-1シグ ナル伝達系の作用を抑制する物質として選択 することができる。

 上記スクリーニング方法を用いて得られる� ��合物は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の� ��用を調節するための安全で低毒性な医薬と� ��て有用である。
 前述のとおり、インスリン/IGF-1シグナル伝� ��系の作用を増強させる物質は、老化;神経変 性疾患(例:アルツハイマー病、ダウン症、ポ� ��グルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性� ��索硬化症、プリオン病、小脳変性症等);摂� �障害;肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、糖� ��病合併症(例:ケトーシス、アシドーシス、� �尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性� �膜症)、耐糖能異常、高脂血症等の代謝疾患; 高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障 害等の他の生活習慣病などの病態または疾患 の予防および改善/治療剤などとして使用す� �ことができる。また、WDR6とIRS-4との相互作� �を抑制することによって、FGFやNGFからのシ� �ナルを介しても神経細胞保護作用を発揮し� �る。
 一方、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作� ��を抑制する物質は、摂食促進、脂肪代謝促� ��等の効果を発揮することにより、摂食障害� ��脂肪代謝が関与する代謝疾患等の疾患の予� ��・治療剤などとして使用することができる� ��また、インスリン刺激によるIRS-4を介したPI 3-キナーゼ、PKB/Aktの活性化を阻害するので、 アポトーシス促進剤、細胞増殖/分化抑制剤� �どとして、癌や自己免疫疾患(例、関節リウ� ��チ、クローン病、潰瘍性大腸炎等)などの疾 患の予防・治療に効果を発揮し得る。

 WDR6の活性を調節する物質を上記医薬とし て使用する場合は、前記WDR6に対してアゴニ� �トもしくはアンタゴニスト活性を示す低分� �化合物等と同様にして製剤化し、同様の投� �経路、用量で投与することができる。

 本発明はまた、被験物質を動物に投与し、� ��動物の視床下部における、E2D3、PKCβ、EAAC1� �Fth1およびASSからなる群より選択される1以上 の遺伝子、並びに/あるいは配列番号:13で表� �れる塩基配列を含む核酸および/または配列� ��号:14で表される塩基配列を含む核酸の発現� ��調べることを含む、該物質の神経細胞保護� ��用の評価方法を提供する。
 E2D3、PKCβ、EAAC1、Fth1およびASS遺伝子のcDNA配 列、およびそれらにコードされる蛋白質のア ミノ酸配列の例は、それぞれ配列番号:3およ� ��4、配列番号:5および6、配列番号:7および8、 配列番号:9および10、並びに配列番号:11およ� �12に記載されている。また、配列番号:13で表 される塩基配列および配列番号:14で表される 塩基配列からなるESTは、GenBankにBF396681および BF394337としてそれぞれ登録されている。
 これらの遺伝子および/または核酸の発現は 、WDR6について前記したと同様の方法で、そ� �らをコードする核酸や、それらに対する抗� �を用いて測定することができる。被験物質� �投与や発現量の測定は、WDR6の発現量を変化� ��せる化合物のスクリーニングにおいて前記� ��たと同様の方法が適宜用いられる。

 被験物質の投与群において、非投与群と� ��較してこれらの遺伝子および/または核酸の 発現量が有意に変化した場合、該物質を神経 細胞保護作用を有する物質の候補として選択 することができる。

 本明細書および図面において、塩基やアミ� ��酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commi ssion on Biochemical Nomenclature による略号ある� ��は当該分野における慣用略号に基づくもの� ��あり、その例を下記する。またアミノ酸に� ��し光学異性体があり得る場合は、特に明示� ��なければL体を示すものとする。
 DNA     :デオキシリボ核酸
 cDNA    :相補的デオキシリボ核酸
 A       :アデニン
 T       :チミン
 G       :グアニン
 C       :シトシン
 RNA     :リボ核酸
 mRNA    :メッセンジャーリボ核酸
 dATP    :デオキシアデノシン三リン酸
 dTTP    :デオキシチミジン三リン酸
 dGTP    :デオキシグアノシン三リン酸
 dCTP    :デオキシシチジン三リン酸
 ATP     :アデノシン三リン酸
 EDTA    :エチレンジアミン四酢酸
 SDS     :ドデシル硫酸ナトリウム

 Gly     :グリシン
 Ala     :アラニン
 Val     :バリン
 Leu     :ロイシン
 Ile      :イソロイシン
 Ser     :セリン
 Thr     :スレオニン
 Cys     :システイン
 Met     :メチオニン
 Glu     :グルタミン酸
 Asp     :アスパラギン酸
 Lys     :リジン
 Arg     :アルギニン
 His     :ヒスチジン
 Phe     :フェニルアラニン
 Tyr     :チロシン
 Trp     :トリプトファン
 Pro     :プロリン
 Asn     :アスパラギン
 Gln     :グルタミン
 pGlu    :ピログルタミン酸
 Me     :メチル基
 Et      :エチル基
 Bu     :ブチル基
 Ph     :フェニル基
 TC     :チアゾリジン-4(R)-カルボキサミド 基

 また、本明細書中で繁用される置換基、保� ��基および試薬を下記の記号で表記する。
 Tos     :p-トルエンスルフォニル
 CHO    :ホルミル
 Bzl      :ベンジル
 Cl ₂ Bzl    :2,6-ジクロロベンジル
 Bom     :ベンジルオキシメチル
 Z       :ベンジルオキシカルボニル
 Cl-Z     :2-クロロベンジルオキシカルボ� �ル
 Br-Z     :2-ブロモベンジルオキシカルボ� �ル
 Boc     :t-ブトキシカルボニル
 DNP     :ジニトロフェノール
 Trt      :トリチル
 Bum     :t-ブトキシメチル
 Fmoc     :N-9-フルオレニルメトキシカルボ ニル
 HOBt     :1-ヒドロキシベンズトリアゾー� �
 HOOBt    :3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキ� ��-1,2,3-ベンゾトリアジン
 HONB     :1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3- ジカルボキシイミド
 DCC      :N,N’-ジシクロヘキシルカルボ� �イミド

 以下に実施例を示して、本発明をより詳� ��に説明するが、これらは単なる例示であっ� ��、本発明の範囲を何ら限定するものではな� ��。