La présente invention concerne une méthode pour le traitement de la resténose par la thérapie génique, comprenant l'administration d'un adénovirus recombinant comportant un gène suicide. Elle concerne également des compositions pharmaceutiques particulières permettant l'administration locale et efficace des virus recombinants.

L'athérosclérose est une maladie complexe, polygénique, qui est définie sur le plan histologique par des dépôts (plaques lipidiques ou fibro-lipidiques) de lipides et d'autres dérivés sanguins dans la paroi des grosses artères (aorte, artères coronaires, carotide). Ces plaques, plus ou moins calcifiées selon l'avancement du processus, peuvent être jumelées à des lésions et sont liées à l'accumulation dans les artères de dépots graisseux constitués essentiellement d'esters de cholestérol. Ces plaques s'accompagnent d'un épaississement de la paroi artérielle, avec hypertrophie du muscle lisse, apparition de cellules spumeuses et accumulation de tissu fibreux. La plaque athéromateuse est très nettement en relief sur la paroi, ce qui lui confère un caractère sténosant responsable des occlusions vasculaires par athérome, thrombose ou embolie qui surviennent chez les patients les plus atteints. Ces lésions peuvent donc conduire à des pathologies cardio-vasculaires très graves telles que l'infarctus, la mort subite, l'insuffisance cardiaque, les accidents cérébro-vasculaires, etc.

Depuis 1977, la technique d'angioplastie a été développée pour permettre une intervention non chirurgicale au niveau de la plaque d'athérosclérose. Cependant, le traitement d'une lésion athéroscleuse par angioplastie résulte de façon très fréquente (jusqu'à 50% des cas dans certaines études) en une resténose consécutive à la blessure mécanique de la paroi artérielle. Un événement clef de ce mécanisme est la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la média vers l'intima, notamment du fait de l'absence de protection et/ou de rétrocontrôle exercé par les cellules endothéliales de l'intima.

Le traitement de la resténose par administration de substances chimiques ou protéiques capables de tuer les cellules musculaires lisses vasculaires a été proposé dans l'art antérieur. Ainsi, des dérivés de psolarènes, incorporés par les cellules prolifératives et sensibilisant alors ces cellules à l'action de la lumière, ont été utilisés (March et al, 1993, circulation, 87: 184-191). De même, certaines cytotoxines

constituées d'une protéine de fusion entre un fragment de toxine de plante ou bactérienne et un facteur de croissance ont également été utilisées (Pickering et al, J. Clin Invest , 1993, 91:724-729, Biro et al, 1992, Cire. Res , 71 640-645, Casscells et al, Proc Natl.Acad.Sci.USA, 1992, 89 7159-7163). Cependant, ces traitements présentent de nombreux inconvénients, tels que leur faible spécificité, leur efficacité moyenne, un délai d'action important et une toxicité potentielle.

La présente invention apporte une solution avantageuse à ce problème. La présente invention fournit en effet une méthode particulièrement efficace et sélective pour le traitement de la resténose post-angioplastie par la thérapie génique. La méthode de la présente invention consiste principalement à administrer un adénovirus recombinant comportant un gène suicide, capable de sensibiliser spécifiquement les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération à un agent thérapeutique L'administration simultanée ou subséquente de cet agent thérapeutique entraine alors la mort sélective des cellules sensibilisées Les avantages de la présente invention résident notamment dans la forte capacité des adénovirus de l'invention à infecter les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération. Ceci permet d'utiliser des quantités relativement faibles de principe actif (adénovirus recombinant), et permet également une action efficace et très rapide sur les sites à traiter. Les adénovirus de l'invention sont également capables d'exprimer à très hauts niveaux les gènes suicides introduits, ce qui leur confère une action thérapeutique très efficace. De plus, en raison de leur caractère épisomal, les adénovirus de l'invention ont une persistance limitée dans les cellules prolifératives et donc un effet transitoire parfaitement adapté à l'effet thérapeutique recherché Enfin, la demanderesse a également mis au point une méthode d'administration particulièrement avantageuse qui permet d'infecter avec une grande efficacité certaines cellules cibles essentielles à l'effet thérapeutique recherché

Un premier objet de l'invention concerne donc l'utilisation d'un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement de la resténose

Comme indiqué ci-avant, on entend au sens de la présente invention par gène suicide tout gène dont le produit d'expression confère à la cellule infectée une sensibilité à un agent thérapeutique. A titre d'exemple, on peut citer le gène de la thymidine kinase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une

sensibilité à certains agents thérapeutiques tels le ganciclovir ou l'acyclovir, ou le gène de la cytosine désaminase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à la 5-fluoro-cytosine (5-FC)

La thymidine kinase du virus de l'herpès simplex est capable de phosphoryler les analogues de nucléosides tels que l'acyclovir et le ganciclovir Ces molécules modifiées peuvent être incorporées dans une chaîne d'ADN en cours d'élongation, ce qui a pour conséquence l'arrêt de la synthèse d'ADN, entrainant la mort de la cellule (F L Moolten, Cancer Res 46 (1986) 5276) Cette stratégie permet ainsi d'éliminer spécifiquement les cellules exprimant le gène TK De plus, la synthèse d'ADN étant la cible de la toxicité, seules les cellules en cours de division sont affectées

Plus préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès humain (hTK HSV-1) La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (voir notamment McKnight et al , Nucleic Acid Res 8 (1980) 5931) Il est également possible d'utiliser des dérivés de cette séquence présentant une plus grande spécificité de substrat ou une meilleure activité kinase De tels dérivés peuvent en particulier être obtenus par mutagénèse au niveau du site de liaison comme décrit précédemment (Balasubramaniam et al , J Gen Virol 71 (1990) 2979, Munir et al , JBC 267 (1992) 6584)

II est également possible d'utiliser le gène de la cytosine désaminase, dont le produit d'expression confère aux cellules mammifères une sensibilité à la 5-fluoro- cytosine (5-FC) La cytosine désaminase est capable de catalyser la désamination de la cytosine en uracile Les cellules qui expriment ce gène sont donc capables de convertir la 5-fluoro-cytosine (5-FC) en 5-fluoro-uracile (5-FU), qui est un métabolite toxique La séquence de ce gène a été décrite dans la littérature (Anderson et al Arch Microbiol 152 (1989) 115)

Plus généralement, tout gène capable de conférer aux cellules infectées une sensibilité à un agent thérapeutique peut être utilisé dans le cadre de la présente invention Le gène de la thymidine kinase constitue un mode de réalisation particulièrement avantageux

Pour la construction des adénovirus selon l'invention, différents sérotypes peuvent être utilisés II existe en effet de nombreux sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu Parmi ces sérotypes, on préfère cependant utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93

05954) Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, urine, (exemple Mavl, Beard et al , Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple . SAV) De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple] De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.

Comme indiqué ci-avant, les adénovirus selon l'invention sont défectifs, c'est- à-dire qu'ils sont incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par le gène suicide Préférentiellement, l'adénovirus défectif conserve néanmoins les séquences de son génome qui sont nécessaires à l'encapsidation des particules virales

Préférentiellement, les adénovirus défectifs de l'invention comprennent les ITR, une séquence permettant l'encapsidation et le gène suicide Encore plus préférentiellement, dans le génome des adénovirus de l'invention, le gène El et au moins l'un des gènes E2, E4, L1-L5 sont non fonctionnels Le gène viral considéré peut être rendu non fonctionnel par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par suppression totale, substitution, délétion partielle, ou addition d'une ou plusieurs bases dans le ou les gènes considérés De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyens des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes

Plus préférentiellement on utilise un adénovirus défectif, rendu non fonctionnel par une délétion totale ou partielle de la région E 1 et une délétion dans la région E4 La région E4 comprend 7 phases de lecture La délétion dans la région E4 peut être transcomplémentée par la présence, dans la lignée cellulaire servant à la multiplication des virus, soit simplement de la phase de lecture ORF6 soit des phases de lecture ORF6 et ORF6/7

Les adénovirus préférés selon l'invention sont choisis parmi les suivants -Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ΔE4 comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion de tout ou partie de la région E4

-Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ORF3", ORF6", comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et des nucléotides 34801-34329 et 341 15- 33126 de la région E4

-Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ΔE4, ORFl ⁺ comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORFl . Plus spécifiquement la délétion dans la région E4 a son extrémité 5' comprise dans la phase de lecture ORF7 et son extrémité 3' comprise dans la phase de lecture ORF2 Par exemple dans la région couvrant les nucléotides 33093- 35053. -Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ΔE4, ORF4 ⁺ comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion de la région E4 à l'exception de la phase de lecture ORF4 Plus particulièrement deux délétions sont faites, l'une dont l'extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF7 et dont extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORF6, l'autre dont l'extrémité 5' est comprise dans la phase de lecture ORF3 et dont l'extrémité 3' est située dans la phase de lecture ORFl ou dans la région promotrice de E4 Par exemple une délétion couvrant les nucléotides 33093-33695 et une délétion couvrant les nucléotides 34634-35355

-Adénovirus recombinant défectif ΔE1, ΔE4, comprenant une délétion de tout ou partie de la région El et une délétion couvrant la totalité de la région E4 chiosie par exemple parmis les délétions suivantes nucléotides 32720-35835, ou 33466- 35355, ou 33093-35355

La construction de ces vecteurs est décrite dans les brevets n° FR 9500749 et n°FR 9506532

Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J 3 (1984) 2917) En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre le gène suicide La recombinaison homologue se produit après co- transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al , J Gen Virol 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus

Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n° FR 93 05954 et FR 93 08596.

Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.

Avantageusement, dans les adénovirus de l'invention, le gène suicide est placé sous le contrôle d'un promoteur permettant son expression dans les cellules infectées. Il peut s'agir du propre promoteur du gène suicide, d'un promoteur hétérologue ou d'un promoteur synthétique. Notamment, il peut s'agir de promoteurs issus de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris du virus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs El A, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules musculaires lisses vasculaires, de manière à ce que le gène suicide ne soit exprimé et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule musculaire lisse vasculaire. Parmi les promoteurs actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules musculaires lisses vasculaires on peut citer notamment le promoteur de l'actine α du muscle lisse.

Dans un mode particulier de réalisation de l'invention, on utilise un adénovirus recombinant défectif comprenant un gène suicide sous le contrôle d'un promoteur viral, choisi de préférence parmi le LTR-RSV ou le promoteur précoce du CMV.

Selon un autre mode avantageux, il s'agit d'un promoteur actif spécifiquement ou majoritairement dans les cellules musculaires lisses vasculaires.

La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement efficace pour le traitement de la resténose. Par ailleurs, pour augmenter encore l'efficacité et la spécificité du traitement, la demanderesse a mis au point une méthode permettant une administration locale des adénovirus recombinants au niveau des sites à traiter. Plus particulièrement, cette méthode repose sur l'utilisation d'un ballon d'angioplastie enrobé d'un film hydrophile (par exemple un hydrogel) imbibé d'adénovirus, qui peut

ainsi être appliqué de manière précise sur le site à traiter, et permettre une libération locale et efficace des adénovirus au niveau des cellules à traiter.

En outre, la demanderesse a montré que, sur des artères saines, cette méthode d'administration permettait d'infecter un pourcentage élevé de cellules de la média (jusqu'à 9,6%), qui sont les cibles les plus logique pour la prévention de la resténose.

De manière tout à fait avantageuse, la demanderesse a également montré que les virus et la méthode selon l'invention permettaient un transfert efficace et sélectif de gènes dans une artère athéromateuse. Plus particulièrement, la demanderesse a démontré pour la première fois la capacité des adénovirus de transférer un gène thérapeutiquement efficace dans une artère athéromateuse. Ceci est tout à fait essentiel puisque l'efficacité thérapeutique du traitement de la resténose passe par la démonstration de la capacité à transférer le gène thérapeutique, dans les bonnes cellules et avec une efficacité appropriée, dans les conditions physiopathologiques. Les artères athéromateuses sont caractérisées par la présence au niveau de l'intima (i) de dépots de matrice extracellulaire, (ii) de dépots lipidiques constitués essentiellement de cellules spumeuses de type macrophagique et (iii) de cellules musculaires lisses en prolifération.

Les résultats présentés ci-après montrent que, dans ces artères athéromateuses, les virus selon l'invention permettent un pourcentage d'infection moindre mais d'une plus grande spécificité (compte tenu de fait de la présence de cellules de type macrophagique dans ce cas, les cellules macrophagiques n'étant pas transduites) et s'accompagnant d'une efficacité thérapeutique importante. Les résultats obtenus montrent notamment un transfert très sélectif de l'adénovirus dans les cellules cibles, c'est à dire les cellules musculaires lisses en prolifération. Sur l'ensemble de la population cellulaire présente au niveau de la zone athéromateuse, plus de 95% des cellules infectées sont des cellules musculaires lisses vasculaires. Ainsi, les cellules macrophagiques présentes au niveau de l'intima ne sont pas infectées du tout (aucune cellule macrophagique infectée n'a été détectée). S'agissant des cellules musculaires lisses en prolifération (dans la néointima), le traitement selon l'invention permet d'infecter un pourcentage inférieur à 1% (0.2% par exemple). Ceci est bien inférieur aux résultats décrits antérieurement dans des artères saines ou présentant des lésions de la paroi mais qui ne représentent pas une situation physiopathologique de la resténose (abrasion endothéliale d'une artère saine). La demanderesse a également montré que l'infection de ce faible pourcentage de cellules permettait néanmoins un effet thérapeutique important, mis en évidence notamment par la mesure du diamètre

luminal Ce résultat est particulièrement surprenant et implique l'existence d'un effet cytotoxique induit (effet "by-stander") in vivo L'invention décrit donc pour la première fois une méthode permettant le transfert sélectif de gènes dans les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération dans une artère athéromateuse comprenant l'administration dans ladite artère d'un adénovirus recombinant défectif contenant ledit gène au moyen d'un cathéter à ballonet d'angioplastie Le terme transfert sélectif implique un transfert essentiellement dans les cellules musculaires lisses vasculaires en prolifération et pas de transfert dans les cellules macrophagiques environnantes Cette méthode permet un traitement de la resténose par transfert d'un gène suicide tel que le gène TK puis traitement par le gancyclovir ou l'acyclovir par exemple Cette méthode de traitement est en outre caractérisée par un effet de toxicité induite in vivo

Un autre objet de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant défectif et un hydrogel Plus spécifiquement, l'invention concerne une composition comprenant un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide, et un hydrogel L'hydrogel utilisé dans le cadre de la présente invention peut être préparé à partir de tout polymère (homo ou hétéro) bio-compatible et non cytotoxique. De tels polymères ont par exemple été décrits dans la demande WO93/08845 Certains d'entre eux, comme notamment ceux obtenus à partir d'oxyde d'éthylène et/ou de propylène sont commerciaux

La méthode de traitement de l'invention consiste donc avantageusement à introduire, au niveau du site à traiter, une composition comprenant un hydrogel imbibé d'adénovirus recombinants. L'hydrogel peut être déposé directement sur la surface du tissu à traiter, par exemple au cours d'une intervention chirurgicale Avantageusement, l'hydrogel être introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter, par exemple d'un cathéter à ballonnet, notamment lors de l'angioplastie, ce qui permet d'éviter tout traumatisme supplémentaire du à une nouvelle intervention au site d'angioplastie. De manière particulièrement avantageuse, l'hydrogel imbibé est introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter à ballonnet, protégé par un manchon Comme décrit dans les exemples, l'hydrogel présente de nombreux avantages il permet d'améliorer le glissement du ballonnet ce qui lui permet de passer par des artères fortement sténosées. De plus l'hydrogel est utilisable avec n'importe quel type de ballonnet d'angioplastie ce qui permet en particulier d'utiliser des ballonet à perfusion Ainsi,

selon un mode particulier de réalisation, les adénovirus selon l'invention sont administrés au moyen de ballonnets à perfusion, en particulier de cathéters à ballonnet à canaux ("channelled balloon angioplasty cathéter", Mansfield Médical, Boston Scientific Corp., Watertown, MA). Ce dernier est constitué d'un ballonnet conventionnel recouvert d'une couche de 24 canaux perforés qui sont perfusés par un lumen indépendant à travers un orifice d'infusion supplémentaire. Ces ballonnets à perfusion qui permettent de maintenir un flux sanguin et ainsi de diminuer les risques d'ischémie du myocarde, lors du gonflement du ballonnet, permettent également de délivrer localement un médicament a pression normale, pendant un temps relativement long, plus de vingt minutes, qui est nécessaire pour une infection optimale.

Il est particulièrement intéressant d'utiliser un cathéter à ballonnet à perfusion enrobé d'hydrogel. Dans ce cas on cumule les avantages des deux c'est à dire ; la possibilité de garder le ballonnet gonflé pendant une période de temps plus longue tout en gardant les propriétés de glissement facilité et de site-spécificité de l'hydrogel. On obtient dans ce cas une efficacité d'infection optimale.

Les résultats présentés dans les exemples démontrent en effet l'efficacité de ce système pour le transfert percutané de gènes dans les parois artérielles.

Un autre objet de la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un adénovirus recombinant défectif et du poloxamère. Plus spécifiquement, l'invention concerne une composition comprenant un adénovirus recombinant défectif comportant un gène suicide, et du poloxamère. Le poloxamère 407 est un polyol biocompatible non toxique, il est disponible dans le commerce (BASF, Parsippany, NJ).

Une méthode de traitement de l'invention consiste donc avantageusement à introduire, au niveau du site à traiter, une composition comprenant du poloxamère imbibé d'adénovirus recombinants. Le poloxamère peut être déposé directement sur la surface du tissu à traiter, par exemple au cours d'une intervention chirurgicale. Avantageusement, le poloxamère être introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter, par exemple d'un cathéter à ballonnet, notamment lors de l'angioplastie, ce qui permet d'éviter tout traumatisme supplémentaire du à une nouvelle intervention au site d'angioplastie. De manière particulièrement avantageuse, le poloxamère imbibé est introduit au niveau du site à traiter au moyen d'un cathéter à ballonnet, protégé par un manchon. Le poloxamère présente essentiellement les mêmes avantages que l'hydrogel tout en ayant un viscosité moindre.

Il est particulièrement intéressant d'utiliser un cathéter à ballonnet à perfusion enrobé de poloxamère en particulier de cathéters à ballonnet à canaux Dans ce cas on cumule les avantages des deux c'est à dire , la possibilité de garder le ballonnet gonflé pendant une période de temps plus longue tout en gardant les propriétés de glissement facilité et de site-spécificité du poloxamère On obtient dans ce cas aussi une efficacité d'infection optimale

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs

Légende des figures

Figure 1 Représentation du vecteur pONT-tk Figure 2 Représentation du vecteur pRSV-tk

Figure 3 Effet cytotoxique de la combinaison ganciclovir/ Ad-LTR-tk sur cellules musculaires lisses en culture Figure 4 Réduction de la resténose par transfert adénoviral du gène tk et administration de ganciclovir

Techniques générales de biologie moléculaire

Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc . sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T et al , "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y , 1982, Ausubel F M et al (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987]

Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories) Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur

Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1.

La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 1_3 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham. L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR

[Polymérase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 210 (1985) 1350- 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzy . 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant. La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.

Exemples

Exemple 1. Construction du vecteur Ad-LTR-TK portant le gène TK sous le contrôle du promoteur du LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV) (figure 1).

Cet exemple décrit la construction d'un adénovirus recombinant comprenant le gène de la thymidine kinase du virus de l'herpès simplex (tk) sous le contrôle d'un promoteur viral (promoteur LTR-RSV). Cet adénovirus a été construit par recombinaison homologue entre l'adénovirus défectif Ad-dll324 et le plasmide pRSVtk portant le ^" gène tk sous contrôle du promoteur RSV (exemple 1.3 ). Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1.1 ), par substitution du promoteur transactivable par EBNA1 par le promoteur RSV (exemple 1.2.).

1.1. Construction du plasmide pONTtk

a) Construction du plasmide p7tkl

Cet exemple décrit la construction du plasmide p7tkl contenant la phase ouverte de lecture du gène tk de 1 131 paires de bases ( ATG 1 14-1 16 et codon stop TGA 1242-1244), insérée dans un multisite de clonage

Le fragment BglII-NcoI contenant le gène de la thymidine kinase (tk) du virus heφès simplex type 1 a été isolé à partir du plasmide pHSV-106 (commercialisé par Gibco BRL), réparé par l'action du fragment klenovv puis inséré au site Smal du plasmide pGEM7zf(+) (commercialisé par Promega) Les sites Smal et BglII sont détruits lors de cette étape, le site Ncol est conservé

Le plasmide obtenu a été désigné p7tkl

b) Construction du plasmide pONTl

Cet exemple décrit la construction d'un plasmide contenant un promoteur chimère constitué d'une séquence nécessaire à la transactivation par l'antigène EBNA1 et du promoteur TPI du virus EBV Le fragment EcoRI(7315)-SmaI(8191) du virus EBV a été isolé à partir de la souche B95-8 La séquence complète du virus EBV a été décrite par Baer et al (Nature 310 (1984) 207) Ce fragment contient les séquences nécessaires à la transactivation par l'antigène nucléaire 1 (EBNA1) (D Reisman & B Sugden, 1986, Molecular and Cellular Biology, vol 6 pp 3838-3846) Ce fragment a ensuite été fusionné au fragment Nrul(166 241)-PstI(166 559) de l'EBV B95-8 (le site PstI a été digéré par la polymérase T4), contenant le promoteur TPI Le promoteur chimère ainsi obtenu a ensuite été inséré dans le multisite de clonage du plasmide pBluescript II SK pour générer le plasmide pONTl

c) Construction du plasmide pONTtk Le plasmide pONTtk comporte le gène de la thymidine kinase du virus de l'heφès simplex (tk) clone dans le plasmide p7tkl, sous le contrôle du promoteur chimère EBNA1-RE/TP1 clone dans le plasmide pONTl

Pour construire ce plasmide, le fragment BamHI-XhoI de pONTl qui contient le promoteur chimère transactivé par EBNA-1 et EBNA-2, et le fragment Xhol-Clal de p7tkl qui contient la phase ouverte de lecture de tk ont été clones aux sites BamHI (478) et Clal (4550) du plasmide pAd RSVbgal Le plasmide pAd RSVbGal contient, dans l'orientation 5'->3',

- le fragment PvuII correspondant à l'extrémité gauche de l'adénovirus Ad5 comprenant la séquence ITR, l'origine de réplication, les signaux d'encapsidation et l'amplificateur E 1 A,

- le gène codant pour la b-galactosidase sous le contrôle du promoteur RSV (du virus du sarcome de Rous),

- un second fragment du génome de l'adénovirus Ad5, qui permet la recombinaison homologue entre le plasmide pAd.RSVbGal et l'adénovirus dl324. Le plasmide pAd.RSVbGal a été décrit par Stratford-Perricaudet et al. (J. Clin. Invest. 90 (1992) 626).

Tous les sites de clonage sont conservés. Le plasmide obtenu a été désigné pONTtk.

1.2. Construction du plasmide pRSVtk Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pONTtk (exemple 1.1.), par substitution du promoteur transactivable par EBNA1 par le promoteur RSV. Pour cela, le promoteur RSV a été isolé sous forme d'un fragment BamHI-SalI à partir du plasmide pAd.RSV.βgal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest 90 (1992) 626), puis clone aux sitesBamHI(478) et Sall(1700) du plasmide pONTtk. Le plasmide résultant a été désigné pRSVtk (figure 1).

1.3. Construction de l'adénovirus recombinant Ad-RSV-tk

Le vecteur pRSVtk a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en trcms les fonctions codées par les régions El (El A et El 1B) d'adénovirus.

Plus précisément, l'adénovirus Ad-RSV-tk a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimmappaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pRSVtk, selon le protocole suivant : le plasmide pRSVtk, linéarisé par Xmnl, et l'adénovirus Ad-dll324, linéarisé par l'enzyme Clal, ont été co- transfectés dans la lignée 293 en présence de phosphate de calcium, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recombinants ainsi générés ont été sélectionnés par purification sur plaque. Après isolement, l'ADN de l'adénovirus recombinant a été amplifié dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture contenant l'adénovirus défectif recombinant non purifié ayant un titre d'environ 10* ° pfu/ml.

Les particules virales sont ensuite purifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-RSV-tk peut être conservé à -80°C dans 20 % de glycérol.

Exemple 2 : Activité d'un adénovirus selon l'invention en présence de ganciclovir sur les cellules musculaires lisses en culture.

L'activité de l'adénovirus contenant le gène TK préparé dans l'exemple 1 a été contrôlée sur des modèles in vitro de cellules musculaires lisses Pour cela, les cellules musculaires lisses isolées à partir d'aorte de rat et de lapin ont été infectées par l'adénovirus recombinant Ad-RSV-tk, et incubées en présence de ganciclovir. L'effet de la combinaison Ad-RSV-tk/ganciclovir sur la viabilité cellulaire est ensuite confirmé par test colorimétrique MTT, 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium bromide, selon la technique décrite par Mosman (J.Immunol.Meth 65 (1983) 55), ou de manière plus précise par comptage cellulaire

Brièvement, les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont mises en culture par digestion enzymatique d'aorte de lapin NZW selon une méthode adaptée de Chamley et al (Cell Tissue Res 177 ^• 503-522 1977) Les cellules sont maintenues en présence de 20% de sérum de veau foetal et utilisées pour l'ensemble des tests (cf. infra) avant le dixième passage Dans l'ensemble de nos expériences, les cellules musculaires lisses sont caractérisées par immunomarquage à l'aide d'anticoφs anti- αSM-actine (Sigma)

Afin de mesurer l'activité cytotoxique de la combinaison Ad-RSV- TK/ganciclovir, les CMLV d'aorte de lapin sont incubées en présence de l'adénovirus dilué dans du milieu de culture (DMEM, 0,5% SVF) Après environ une heure à 37°C en atmosphère humide, le milieu contenant la solution adénovirale est aspiré et remplacé par du milieu de culture (DMEM, 0,5% SVF) pour une période de 18 à 24 heures Différentes concentrations de ganciclovir sont alors ajoutées dans un milieu riche en SVF (10%) Quatre jours après l'addition du ganciclovir, les cellules sont dénombrées ( 100% de la viabilité cellulaire correspondant aux cellules non transduites par Ad-RSV-TK et non traitées par le ganciclovir)

La combinaison Ad-RSV-TK ganciclovir induit un effet cytotoxique vis-à-vis des CMLV de lapin (cf Figure 3) Cette cytotoxicité varie en fonction de la concentration de ganciclovir et de la multiplicité d'infection d' Ad-RSV-TK. Dans nos conditions expérimentales i e quatre jours d'incubation en présence de 10% SVF, la combinaison Ad-RSV-TK (M O I 1000)/ganciclovir (25 μM) entraîne une cytolyse totale Dans ces conditions expérimentales où une forte multiplicité d'infection permet de transduire la majorité des cellules, la CI50 est 0,3 μM A faible multiplicité d'infection (M O I 10), la CI50 est inférieure à 5 μM Ainsi, les concentrations de

ganciclovir actives in vitro, sur CML, sont compatibles avec une utilisation thérapeutique. En effet, chez les patients traités pour infection virale par une dose non toxique de ganciclovir, il est possible d'atteindre des concentrations plasmatiques supérieure à 15 μM (Paul et Dummer, Am.J.Med.Sci. 4 : 272-277, 1992). En outre, cette étude in vitro démontre qu'il est possible d'induire un effet cytotoxique majeur en dépit d'un faible pourcentage de transduction par l'adénovirus Ad-RSV-TK. La présence de la protéine HSV-TK a été mise en évidence par immunofluorescence indirecte à l'aide d'anticoφs monoclonaux spécifiques de HSV- TK (anticoφs monoclonal 4C8, Yale University). Dans les CMLV de lapin (et humaines) traitées par Ad-RSV-TK, la localisation de la protéine TK est cytoplasmique mais également nucléaire. Nous avons ainsi montré que l'utilisation d'une multiplicité d'infection de 10 est associée à une transduction de moins de 5% des CMLV. De manière générale, à multiplicité d'infection équivalente, le pourcentage de cellules transduites par Ad-RSV-TK est similaire à celui obtenu à l'aide d'un adénovirus contrôle codant pour la β-galactosidase (ex. : plus de 90% de cellules transduites à multiplicité d'infection 1000). Ces données démontrent donc que la transduction de moins de 5% de CMLV entraine une cytotoxicité importante en présence d'une concentration optimale de ganciclovir (cf. figure 3 : baisse de 80% de la viabilité cellulaire à 25 μM). L'immunodétection de la protéine HSV-TK illustre donc l'importance de l'effet "bystander" observé sur les CMLV traitées par la combinaison Ad-RSV-TK/ganciclovir. Cet effet "bystander" peut avoir sa contrepartie in vivo. En particulier, ces données suggèrent fortement qu'un transfert limité d'adénovirus Ad-RSV-TK, notamment dans une artère pathologique, peut aboutir à une réduction significative de la masse néointimale, riche en CML et responsable de la resténose chez le patient.

D'autre part, l'effet cytolytique est sélectif puisque ni le simple traitement par ganciclovir ni la transduction par Ad-RSV-TK per se n'est associé à une mort cellulaire. La cytotoxicité de l'association Ad-RSV-TK/ganciclovir a été confirmée par le test colorimétrique MTT. Enfin, des résultats similaires, à savoir une toxicité sélective en présence de ganciclovir et d'adénovirus, ont été observés sur culture primaire de cellules musculaires lisses humaines.

Ces données mettent donc en évidence le blocage efficace de la prolifération de CMLV in vitro par Ad-RSV-TK.

Exemple 3 : Transfert artériel d'un adénovirus recombinant par voie percutanée

Cet exemple décrit la mise au point d'une technique particulièrement efficace pour le transfert de gènes par voie percutanée Cette technique repose sur l'utilisation d'un cathéter à ballonet à hydrogel Les résultats présentés montrent que, de manière tout à fait avantageuse, cette technique permet d'infecter efficacement certaines populations cellulaires provilégiées, notamment pour le traitement de la resténose

Cet exemple a été réalisé au moyen d'un adénovirus recombinant défectif comprenant le gène de la β-galactosidase d'E coli sous le contrôle du promoteur du RSV-RSV et d'un signal de localisation nucléaire La construction de cet adénovirus a été décrite notamment dans Stratford-Perricaudet et al , (J Clin Invest 90 (1992) 626)

Les expériences ont été réalisées sur des lapins blancs de Nouvelle Zélande anesthésiés à l'acépromazine et maintenus sous pentobarbital Le transfert de gène a été effectué au niveau de l'artère iliaque externe

L'adénovirus Ad-RSV β-Gal (1-2 10 ¹⁰ pfu dans 100 μl de tampon phosphate) a été déposé sur un cathéter à ballonnet préalablement enduit d'hydrogel (Hydroplus, Mansfield Médical, Boston Scientific Corp , Watertown, MA) (Riessen et al , Hum Gène Ther 4 (1993) 749) Le cathéter utilisé est un cathéter à ballonnet de 2 cm de longueur, et de diamètre compris entre 2,5 et 3 mm Le cathéter a ensuite été introduit, en utilisant un manchon protecteur, dans l'artère fémorale droite Une pression de une atmosphère a ensuite été appliquée, puis le cathéter a été dirigé jusqu'à l'artère iliaque externe où une pression de 6 atmosphère a alors été appliquée au ballonnet pendant 30 minutes Cette expérience a été réalisée sur 27 lapins 3 à 28 jours après l'administration, les animaux ont été sacrifiés par overdose de pentobarbital

Transfert et expression du gène dans la paroi artérielle

Les artères des animaux sacrifiés ont été isolées, et l'expression de la β- galactosidase a été détectée par coloration en présence de X-gal selon la technique de

Sanes et al (EMBO J 5 (1986) 3133) Pour chaque animal, deux segments artériels au moins ont été soit montés sur OCT (Laboratoires Miles Inc , IL) pour des expériences de cryosection, ou enduit de paraffine, coupés en sections de 6 μm et contrecolorés à

l'hématoxyline et l'éosine. L'expression a été considérée comme positive seulement lorsqu'une coloration bleu foncé était observée dans le noyau. Les résultats obtenus montrent clairement que les artères des animaux infectés présentent une coloration bleu caractéristique de la ^β gal. Une analyse microscopique révèle qu'il n'y a pas d'endothélium intact résiduel, mais que la continuité de la lamina élastique interne est préservée. L'analyse microscopique montre également que les cellules de la média ont été infectées par les adénovirus et expriment le gène transféré. Plus précisément, alors que dans le cas d'une administration par cathéter à double ballonnets, 0,4% seulement des cellules de la média ont été infectées, 9,6% le sont en utilisant un cathéter à ballonnet enduit d'hydrogel (voir analyse moφhométrique ci-après). De plus, les 9,6 % sont calculés par rapport à l'épaisseur totale de la média mais dans les couches superficielles de la média, 100% des cellules sont infectées. Ces résultats sont bien supérieurs à ceux obtenus avec les cathéters à double ballonnets, ou par transfert de gène nu ou au moyen de liposomes Ces expériences démontrent combien les adénovirus peuvent constituer un vecteur particulièrement avantageux pour l'administration de gènes suicides en vue du traitement de la resténose.

Analyse moφhométrique

L'efficacité de transfert a été déterminée sur 7 lapins traités. Tous ces animaux ont reçu 5.10^ pfu d'adénovirus pour infecter un segment artériel de 2 cm de longueur, de telle sorte que la multiplicité d'infection est similaire pour chaque animal. Pour chaque artère iliaque transfectée, deux segments sériés de 5 mm de longueur ont été prélevés de la zone cible et, pour chaque segment, au moins trois sections au hasard ont été examinées au microscope optique après coloration au X-gal. Sur chaque section, l'efficacité de transfert a été déterminée par le rapport des cellules de la média colorées sur le nombre total des cellules de la média. Au total, plus de 30.10^ cellules provenant des artères infectées par les adénovirus (48 sections) ont été comptées. Le pourcentage moyen de cellules de la média infectées est de 4.02%, avec des valeurs pouvant atteindre 9,6%». Dans le cas d'un transfert par cathéter à double ballonnet, le pourcentage moyen est seulement de 0, 18%.

Cinétique d'expression

Pour déterminer la durée de l'expression du gène transféré par les adénovirus selon l'invention, une étude de l'expression de la ^β -gal a été réalisée au cours du temps sur 20 lapins traités soit par cathéter à double ballonnet (10 animaux), soit par cathéter à ballonnet imbibé d'hydrogel (10 animaux). Pour chaque groupe, 2 animaux ont été sacrifiés au jour 3, 7, 14, 21 et 28 L'expression a été détectée par examens macroscopique et microscopique d'artères colorées au X-gal comme décrit plus haut. Les résultats obtenus montrent, pour chaque groupe, une expression stable pendant 14 jours, suivie d'une baisse à 21 jours. Aucune expression n'est détectée à 28 jours. La même cinétique à pu être mise en évidence dans une artère pathologique dans le modèle de lapin athéromateux Ces résultats confirment l'effet transitoire des vecteurs de l'invention, particulièrement avantageux et adapté au traitement de la resténose notamment au niveau des parois athéromateuses

Sélectivité du transfert et de l'expression au niveau des parois artérielles

Afin de contrôler la dissémination possibles à d'autres tissus des adénovirus injectés, dans tous les animaux sacrifiés 3 jours après l'injection, des échantillons de tissu provenant du foie, cerveau, testicules, coeur, poumon, rein, et muscle squelettique, ainsi qu'un segment artériel adjacent au site traité ont été prélevés immédiatement après le sacrifice. Sur chaque échantillon, le transfert et l'expression du gène ont été mis en évidence par PCR (au moyen de sondes dirigées contre le gène codant pour la protéine IX de l'adénovirus et contre le gène lacZ) et histochimie. Les résultats obtenus montrent que aucun des échantillons prélevés à partir des animaux traités par cathéter à ballonnets enduits d'hydrogel, ne présente de coloration dans les tissus testés De la même manière, aucune présence de virus n'a pu être détectée par PCR dans les échantillons testés, même en utilisant un protocole optimisé et très sensible de 45 cycles d'amplifications

Ces résultats démontrent l'efficacité du mode d'administration selon l'invention pour délivrer de manière très locale les gènes thérapeutiques.

Exemple 4 : Transfert artériel de l'adénovirus Ad-RSV-TK.

Cet exemple démontre les propriétés de l'adénovirus-TK de l'invention pour le traitement de la resténose par transfert sélectif dans une artère athéromateuse.

Modèle animal :

L'efficacité du transfert artériel a été évaluée dans un modèle de resténose chez le lapin blanc de Nouvelle Zélande. Les lapins ont été préalablement soumis à un régime riche en cholestérol ( 1 %) pendant deux semaines. L'artère iliaque a été abrasée à l'aide d'un ballonnet de latex (4F) par cinq inflations successives. Les animaux ont de nouveau été soumis à un régime hypercholestérolémiant pendant six semaines. Le transfert artériel a été effectué par voie percutanée, selon la procédure précédemment décrite, au niveau de l'artère lésée. L'adénovirus Ad-RSV-TK (4.10^ pfi dans 40 μl de tampon phosphate) a donc été déposé sur un cathéter à ballonnet préalablement enduit d'hydrogel (Hydroplus, Mansfield Médical, Boston Scientific Coφ., Watertown, MA) (Riessen et al., Hum. Gène Ther. 4 (1993) 749). Le cathéter utilisé est un cathéter à ballonnet de 2 cm de longueur, et de diamètre de 2,5 mm.

Basé sur une lésion double, consécutive à l'abrasion et l'angioplastie, ce modèle de resténose, et non pas uniquement de sténose, permet d'évaluer l'efficacité du transfert adénoviral d'un gène suicide dans une artère athéromateuse.

A la lumière des données expérimentales in vitro et afin de vérifier la sélectivité du traitement par Ad-RSV-TK, les animaux ont été divisés en deux groupes, traités ou non par ganciclovir. Le traitement par ganciclovir a été prolongé pendant cinq jours (du deuxième au septième jour suivant l'angioplastie) à raison de

2x25 mg/kg/jour.

Analyse moφhométrique :

Six semaines après l'angioplastie, les animaux ont été sacrifiés par pentabarbital, les artères iliaques fixées et prélevées en vue de l'analyse moφhométrique. Les contours de la lumière ainsi que des limitantes élastiques internes/externes ont été évalués après coloration à l'orcéine/hématoxyline. Au total, six blocs ont été analysées par artère, dont 4 compris dans la zone d'angioplastie et deux immédiatement en amont et en aval de cette zone. Pour chaque bloc, trois sections adjacentes ont été analysées. Brièvement, différents paramètres tels que le diamètre luminal, le rapport intima/média ont été calculés. Les échantillons pour lesquels ces contours n'ont pu être mis en évidence, en raison d'une rupture de la limitante élastique interne ou d'une occlusion thrombotique, ont été exclus.

L'analyse moφhométrique met en évidence un rapport intima/média élevé dans le groupe contrôle ayant été soumis au transfert adénoviral par angioplastie mais

non traité par ganciclovir (5,73 +/- 0,81, n=3). La sévérité de la lésion permet donc d'évaluer l'efficacité d'un traitement par transfert de gène sur une artère pathologique. En outre, ainsi que le montre l'étude immunohistochimique, les lésions induites dans ce modèle animal sont riches en macrophages mais également riches en cellules musculaires lisses qui constituent le cible thérapeutique du transfert génique. L'ensemble de ces données soulignent l'intérêt du modèle utilisé qui ne repose pas sur une simple abrasion endothéliale au niveau d'une artère saine et par conséquent mime, du moins partiellement, la pathologie de la resténose post-angioplastie chez l'homme. L'analyse moφhométrique montre que le rapport intima/média est réduit de 42% (p<0.05) dans le groupe d'animaux soumis à la combinaison Ad-RSV- TK/ganciclovir (3,30 +/- 1,26, n=6). La réduction significative de ce paramètre démontre que le transfert local du gène TK par adénovirus recombinant, en association avec l'administration de ganciclovir, constitue une approche thérapeutique prometteuse comme traitement préventif de la resténose post-angioplastie.