Generación y condiciones de cultivo de Cepa de Bacillus subtilis productora de astaxantina (ATX).

CAMPO DE LA INVENCION

La tecnología se enmarca en el campo de las aplicaciones biotecnológicas, en especial al desarrollo de cultivos para obtención de astaxantina que cumpla con los requisitos de la industria, disminuyendo sus limitantes como son el requerimiento de amplias extensiones de terreno, grandes volúmenes de agua con gran consumo energético y la alta susceptibilidad a condiciones estacionales.

ESTADO DEL ARTE

La producción de astaxantina (ATX) en H. lacustrís se ve limitada por la complejidad del ciclo de vida de la microalga y los altos costos asociados al cultivo, entre los que se puede mencionar el requerimiento de amplias extensiones de terreno, grandes volúmenes de agua y gran consumo energético para la instalación y funcionamiento de los sistemas de cultivo, inducción y cosecha. Además, la producción de ATX desde H. /acustris tiene una alta susceptibilidad a condiciones estacionales como temperatura ambiental e intensidad de radiación solar y una facilidad de contaminación de cultivos por bacterias, hongos y protozoos. Junto a ello, el tiempo para la inducción de biosíntesis de ATX es prolongado variando entre 70 a 100 días. Todo lo anterior explica la baja productividad en esta industria, disminuyendo su competitividad.

La astaxantina (ATX) es un pigmento carotenoide liposobluble, sintetizado naturalmente por algunas bacterias, microalgas y levaduras (Davinelli, Nielsen, y Scapagnini 2018). Este pigmento es responsable del color observado en la carne de salmón y crustáceos como el camarón y la langosta, los que incorporan el pigmento a través de la dieta (Nguyen 2013). Por esta razón, la ATX es ampliamente utilizada en la acuicultura como aditivo en la alimentación de salmones (Higuera-Ciapara, Félix-Valenzuela, y Goycoolea 2006), potenciando no sólo el color, sino también la fertilidad de estos peces (Koller, Muhr, y Braunegg 2014). Adicionalmente, la ATX posee características antioxidantes que son incluso superiores a las del 0-caroteno y la vitamina E (o- Tocoferol) (Martin et al. 1999; Miki 1991). Debido a su gran potencial como antioxidante, se le han atribuido numerosos efectos protectores frente a diversas patologías (Higuera-Ciapara, Félix-Valenzuela, y Goycoolea 2006). En este contexto, recientes estudios han vinculado a la ATX a la prevención de enfermedades dermatológicas (Ito, Seki, y Ueda 2018), degenerativas, oculares (Otsuka et al. 2016, Schleicher et al. 2013) y cáncer (McCall et al. 2018); mejor respuesta inmune, actuando como agente antiinflamatorio (Lin et al. 2015; Park et al. 2010); y aumento del colesterol HDL (Yoshida et al. 2010). En virtud de lo anterior, existe una creciente demanda por ATX para su uso en la industria nutracéutica (Davinelli, Nielsen, y Scapagnini 2018).

La ATX es sintetizada principalmente por las microalgas Haematococcus lacustrís (ex H. piuviaiis), Chlorella vulgaris y Chiorococcum sp., y también por la levadura Phaffía rhodozyma (Higuera-Ciapara, Félix-Valenzuela, y Goycoolea 2006), incorporándose a los eslabones superiores de la cadena alimenticia a través de la dieta (Davinelli, Nielsen, y Scapagnini 2018; Lemoine y Schoefs 2010). La molécula de Astaxantina presenta dos átomos de Carbono asimétricos, en las posiciones 3 y 3'. En consecuencia, existen diferentes isómeros ópticos o enantiómeros: (3S,3'S); (3R,3'R) y (3R, 3'S). En la naturaleza abundan los isómeros con quiralidad (3S,3'S) producido principalmente por microalgas como H. iacustrís y (3R,3'R) sintetizado por P. rhodozyma (Ambati et al. 2014; Lemoine y Schoefs 2010). La ATX también es producida de forma sintética desde fuentes petroquímicas, dando lugar a una mezcla de los isómeros (3R,3'R), (3 (3R, 3'S) y (3R,3'R) en proporción 1 :2: l(Liu et al. 2014). Esta ATX sintética da cuenta del 95% de la ATX disponible en el mercado. Sin embargo, su capacidad antioxidante es cerca de 20 veces menor que la de su contraparte natural. Adicional mente, la ATX sintética no ha sido aprobada para el consumo humano, existiendo consideraciones relacionadas a la posible presencia de intermediarios de la síntesis química (Higuera-Ciapara, Félix-Valenzuela, y Goycoolea 2006; Shah et al. 2016). De los isómeros sintetizados de forma natural, el estereoisómero (3S, 3'S) presenta la mayor capacidad antioxidante (Nguyen 2013). Este isómero es obtenido principalmente a partir de H. lacustris, la ATX derivada de esta microalga se encuentra aprobada para el consumo humano como suplemento dietético en Estados Unidos, Japón y varios países de Europa (Shah et al. 2016).

H. lacustris puede acumular hasta 4% de ATX del porcentaje de peso seco en condiciones de laboratorio (Ambati et al. 2014). Sin embargo, el crecimiento de esta alga es lento, y las condiciones industriales de cultivo e inducción en raceways abiertos presentan susceptibilidad a la contaminación por otros organismos (Liu et al. 2014). Por otro lado, la inducción de la acumulación de ATX en H. piuviaiis requiere de grandes extensiones de terreno para exponer la biomasa a alta radiación solar, la cual no es constante a lo largo del año, produciendo fluctuaciones importantes en la producción de ATX. Para este propósito, el cultivo de H. lacustris es diluido en grandes volúmenes de agua, donde una cantidad importante de la misma se pierde por evaporación. Así, la obtención de 1 Kg. de ATX pura desde H. piuviaiis -valorado en 4000 USD- requiere cerca de 400.000 L de agua y tarda desde 4 a 6 meses (información entregada por Astax Chile, ex Pigmentos Naturales S. A.). Por estas razones, la ATX obtenida desde H. piuviaiis -apta para el consumo humano- no supera el 1% de la ATX presente en el mercado (Koller, Muhr, y Braunegg 2014). Considerando la creciente demanda por ATX de origen natural y su limitada producción a nivel industrial, urge diseñar nuevas estrategias para obtener este pigmento con mejores rendimientos, manteniendo sus características funcionales, y así, satisfacer un mercado que se encuentra en aumento.

En este contexto, múltiples aplicaciones biotecnológicas han recurrido al uso de microorganismos como "fábricas celulares químicas" para potenciales aplicaciones industriales. Así, por ejemplo, estudios recientes han descrito el proceso de obtención de ATX desde la bacteria Gram negativa Escherichia coii, con rendimientos de 0,32 g/L, a través de ingeniería metabólica, es decir, a través de la expresión de genes codificantes para enzimas de otros organismos sintetizadores de pigmentos carotenoides (Park et al. 2018; Zhang et al. 2018). La ATX obtenida corresponde a 100% de isómero (3S, 3'S) (Zhang et al. 2018), que como se mencionó anteriormente, es el isómero óptico de mayor capacidad antioxidante, el cual es sintetizado y obtenido industrialmente desde H. lacustris para consumo humano. Los resultados anteriores indican que es factible sintetizar ATX con altos rendimientos y obtener el compuesto de interés con un alto grado de pureza desde bacterias modificadas mediante ingeniería metabólica.

Ingeniería metabólica en bacterias para la obtención de moléculas de interés: E. coH ha sido ampliamente modificada a través de ingeniería metabólica para la obtención de metabolites de alto valor, debido a su rápido crecimiento, facilidad de cultivo, plasticidad metabólica y una amplia gama de herramientas disponibles para la ingeniería genética (Pontrelli et al. 2018). Sin embargo, E. coH también presenta ciertas desventajas que pueden afectar el rendimiento, como por ejemplo: dificultad de producción de moléculas que requieren modificaciones complejas, limitada producción de proteínas heterólogas (codificadas por genes de otros organismos), y condiciones de cultivo restrictivas que acotan las condiciones de crecimiento a nivel industrial y favorecen la contaminación (Becker y Wittmann 2016; Pontrelli et al. 2018). Adicionalmente, las bacterias Gram negativas como E. coH producen endotoxinas, sustancias pirogénicas tóxicas que pueden ser problemáticas para la obtención y purificación de moléculas destinadas al consumo humano (Schallmey, Singh, y Ward 2004). Por estas razones, la bacteria Gram positiva Bacillus subtiHs se ha convertido en una atractiva alternativa para aplicaciones industriales. Con una tasa de crecimiento comparable con la de E. coH (Cheung et al. 2012), B. subtiHs ha sido modificada exitosamente mediante ingeniería metabólica para la producción riboflavina (vitamina B2) (Perkins et al. 1999), isobutanol (S. Li, Wen, y Jia 2011), condroitina (Jin et al. 2016), ácido hialurónico (Westbrook et al. 2018) y enzimas como la o-amilasa y la natoquinasa, entre otras moléculas de interés (Cui et al. 2018). En comparación con E. coH, B. subtiHs no presenta mayor preferencia en cuanto al uso de codones que codifican para un mismo aminoácido (Kunst et al. 1997), concepto conocido como " codon usagd', lo cual es ventajoso para la producción de proteínas heterólogas. Adicionalmente, B. subtiHs presenta una elevada capacidad de secreción de proteínas al medio extracelular, lo cual hace de esta bacteria el organismo de preferencia para la síntesis de enzimas recombinantes a nivel industrial. Más aún, se estima que el 50% del mercado de enzimas está dominado por enzimas obtenidas desde Bacillus spp (Schall mey, Singh, y Ward 2004).

A diferencia de E. coll, B. subtiHs posee la denominación de GRAS (Generally Recognized as Safe) otorgada por la FDA (Hohmann et al. 2016). Al ser una bacteria Gram positiva, se encuentra dotada de una pared celular que la hace adaptable y resistente a amplias condiciones de cultivo, incluso ante elevadas concentraciones de solvente ( L¡ et al. 2011), y puede utilizar fuentes de carbono de bajo costo, abaratando costos de producción (Gu et al. 2018).

Actualmente existen numerosas herramientas disponibles para la manipulación genética de B. subtiHs, una característica relevante de esta bacteria es su competencia natural, es decir, su capacidad de tomar el ADN exógeno y recombinarlo con el ADN propio (Hohmann et al. 2016), de modo que las modificaciones incorporadas permanecen en el genoma de la bacteria y no se pierden durante la fermentación. Dicho de otro modo, la modificación genética es estable y se mantiene luego de varias replicaciones (S. Li, Wen, y Jia 2011). Este punto es de particular relevancia, debido a que el fenómeno de reversión o pérdida del ADN exógeno sí se ha observado al escalar el proceso de producción de ATX en E. coHt ar et al. 2018).

Al ser un carotenoide, la ATX se sintetiza a partir del precursor isoprenoide isopentenil pirofosfato (IPP) y su isómero dimetilalilpirofosfato (DMAPP). La adición secuencial de tres moléculas de IPP a DMAPP da lugar a geranil pirofosfato (GGPP), de 20 átomos de Carbono (C20). Luego, la condensación de dos moléculas de GGPP por la enzima fitoeno sintasa (CrtB) forman fitoeno (C40), que luego de varios pasos catalizados por fitoeno desaturasas (CrtI) da lugar al licopeno, de color rojo. Posteriormente, el licopeno es ciclado por la enzima licopeno ciclasa (CrtY), produciendo 0-caroteno, de color amarillo. Finalmente, la vía metabólica puede seguir una de dos rutas posibles para generar ATX, pero que involucran a las mismas enzimas: 0-caroteno cetolasa (CrtW) y p-caroteno hidroxilasa (CrtZ) (Lemoine y Schoefs 2010; Zhang 2018)

La síntesis de IPP y DMAAPP ocurre a través de una vía metabólica conocida como DOXP/MEP, presente en procariontes y cloroplastos. La generación de IPP constituye el paso limitante en la síntesis de terpenoides como la ATX (Guan et al. 2015; Ward, Chatzivasileiou, y Stephanopoulos 2018). De manera interesante, B. subtiHis es capaz de sintetizar y tolerar altas cantidades de IPP, incluso en mayor medida que cualquier otra bacteria, incluyendo E. coli (Guan et al. 2015; Kuzma et al. 1995). En concordancia con este antecedente, B. subtilis ha sido sometida exitosamente a ingeniería metabólica para sintetizar carotenoides de hasta 30 átomos de carbono (Xue et al. 2015).

Considerando todos estos avances en el desarrollo de los cultivos, aun se cuenta con la necesidad de buscar alternativas para obtener condiciones apropiadas para obtención de astaxantina que cumpla con los requisitos de la industria y permita evadir las limitantes como el ciclo de vida de la microalga, los altos costos asociados al cultivo, requerimiento de amplias extensiones de terreno, grandes volúmenes de agua con gran consumo energético y la alta susceptibilidad a condiciones estacionales como temperatura ambiental e intensidad de radiación solar y una facilidad de contaminación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Esquema del vector de expresión pBS0EXylRPxylA(V2).

Figura 2: Esquema de la secuencia tipo operón que contiene las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX

Figura 3: Vector de expresión con las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX (en oscuro) diseñado.

Figura 4: A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de digestión de vector de expresión base pBS0EXylRPxylA(V2). Carril 1 Vector muestra digerida con enzimas de restricción EcoRI y PstI. Carril 2 Estándar de peso molecular. B) Detalle de bandas y tamaños moleculares del estándar de peso molecular. Figura 5: A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de amplificación por PCR de vector de expresión base pBS0EXylRPxylA(V2). Carril 1 muestra producto de amplificación. Carril 2 Estándar de peso molecular. B) Detalle de bandas y tamaños moleculares del estándar de peso molecular.

Figura 6: A.- Electroforesis en gel de agarosa al 1% de muestra purificada de vector pBS0EXylRPxylA(V2) digerido con las enzimas EcoRI y PstI. B.- Detalle de bandas y tamaños moleculares del estándar de peso molecular.

Figura 7: Esquema del vector de clonamiento pUC-57-ATX-HL.

Figura 8: A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de digestión de muestra de ADN de vector de clonamiento pUC-57-ATX-HL con enzima Ndel (carril 1), Notl (carril 2) y las enzimas EcoRI y PstI (carril 3). B) Detalle de bandas y tamaños moleculares del estándar de peso molecular.

Figura 9. A) Electroforesis en gel de agarosa al 1% de muestra purificada de fragmento de ADN a partir del vector pUC-57-ATX-HL y que contiene las secuencias de las enzimas de la ruta biosintética de ATX digerido con las enzimas EcoRI y PstI. B) Detalle de bandas y tamaños moleculares del estándar de peso molecular.

Figura 10: Esquema del Gibson assembly diseñado. En rojo se muestra el vector pBS0EXylRPxylA(V2) digerido con las enzimas EcoRI y PstI.

Figura 11: Componentes del Gibson assembly diseñado. En rojo se muestra el vector pBS0EXylRPxylA(V2) digerido con las enzimas EcoRI y PstI. En amarillo el fragmento 1, en azul el fragmento 2 y en naranja el fragmento 3. Todos los fragmentos serán obtenidos por PCR.

Figura 12: Productos de PCR de los fragmentos para el Gibson assembly. En el carril uno se muestra el marcado de tamaño molecular lkb de New England Biolabs. En el carril 2 el producto de PCR del fragmento 1. En el Carril 3 el producto de PCR del fragmented. En el carril 3 se muestra el producto de PCR para el fragmento 3. En el carril 4 se muestra el marcado de tamaño molecular 1 kb de New England Biolabs.

Figura 13: Productos de amplificación por PCR del producto de la reacción de Gibson assembly. En el carril 1 se muestra el producto de amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos M13. En el carril 2 se muestra Estándar de ADN GeneRuler 1 kb Plus de Thermofisher.

Figura 14: Productos de amplificación por PCR de las colonias transformadas con el producto de la reacción de Gibson assembly. En los carriles 1 al 4 se muestra el producto de amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos primer seq 743. En el carril 5 al 8 se muestra el producto de amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos. En los carriles M Estándar de ADN GeneRuler 1 kb Plus de Thermofisher.

Figura 15: Esquema de la ruta biosintética de carotenoides hasta astaxantina. En azul se muestra el nombre del gen en bacterias y en rojo el nombre del mismo gen en la microalga Haematococcus piuviaiis.

Figura 16: Análisis de los extractos de carotenoides obtenidos a partir de biomasa bacteriana. En la imagen de la izquierda se muestra el espectro de absorción de los extractos de las distintas muestras de E.coii transformado. La figura inferior muestra un cromatograma de las distintas muestras analizadas Figura 17: Espectro de absorbencia de extractos de extracto con acetona obtenido desde la biomasa de B. subtiiis transformado con el vector BS-743- ATX-C2 inducido.

Figura 18: Cromatograma de extractos de con acetona obtenido desde la biomasa de B. subtiiis transformado con el vector BS-743-ATX-C2 inducido.

Figura 19: Gel SDS-PAGE con muestras de B. subtiiis sin transformar y transformados con vector 743-ATX. (P) hace referencia al pellet. (SN) hace referencia al sobrenadante.

Figura 20: Cromatograma y espectro de absorción de la astaxantina proveniente desde cultivo de B. subtiiis 743-ATX.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Se presenta un método para la generación de una cepa de B. subtiiis capaz de producir Astaxantina (ATX). Este método comprende la generación de un vector de expresión pBS0E-XylRP-xylA(V2), el cual presenta una secuencia tipo operón que incluye las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX (743-ATX). Esta construcción esta optimizada para la expresión en Bacillus subtiHs wl68 de los genes Fitoeno sintasa (PSY), Fitoeno desaturasa (PDS), Zeta caroteno desaturasa (ZDS), Caroteno isomerasa (CrtISO), Licopeno beta ciclasa (LYC-b), Betacaroteno cetolasa (BKT) y Betacaroteno hidroxilasa (CHBY) de Haematoccocus lacustrís. Además, se optimizó las secuencias ribosome binding site (RBS).

El proceso comprende al menos las siguientes etapas: a) la transformación de bacterias Bacillus subtiHs cepa wl68 con el vector de expresión pBS0E-XylRP-xylA(V2), mediante el uso de transformación química; b) las colonias transformantes de B. subtiHs que incluyen el vector 743-ATX se cultivan en medio líquido TB suplementado con glicerol (30 g/L) a 30°C hasta una ODeoonm de 0,4-0, 6 y con los antibióticos lincomicina/eritromicina; c) Posteriormente se realiza la inducción de la biosíntesis de astaxantina utilizando xilosa al 0,5% durante 72 horas, el cultivo se mantiene con un % de O2 de 50-70 % y un pH de 6,8-7, 1; y d) análisis de carotenoides y de presencia de las proteínas de la ruta biosintética de astaxantina mediante SDS-PAGE.

Las proteínas obtenidas por este método presentan el tamaño esperado correspondientes a las enzimas de las microalga Haematococcus iacustris.

Los resultados demuestran que el vector de expresión 743-ATX es funcional, tanto en E. coii, como en B. subtiHs, lográndose la obtención de carotenoides en condiciones de cultivo inducido en ambas especies de bacterias.

Los resultados de la expresión de la biosíntesis de ATX de la cepa de B. subtiHs 7 -K Á muestran la producción del isómero geométrico all trans y el isómero óptico 3s-3s' con una productividad de ATX de esta cepa está en el rango de 0,5 g m ³ día ^-1 . La cepa de B subtiHs 743-ATX sortea estas dificultades y permitiendo la obtención de ATX en tiempos menores a los que actualmente presenta la industria esto debido a su mayor tasa de replicación y condiciones de cultivo altamente controladas. La calidad de la ATX producida está comprobada por metodologías analíticas (estructuras isoméricas) y funcionales (actividad antioxidante) que indican que la ATX producida por B subtiHs es igual a la ATX natural para consumo humano producida por H. iacustrís.

Esta novedosa tecnología resuelve varios problemas de la producción de ATX actual a partir de la microalga Haematococcus iacustrís. Entre los problemas que resuelve se destacan: a) disminuye el tiempo de obtención de ATX, b) disminuye costos asociados al cultivo, c) reduce el requerimiento de amplias extensiones de terreno, d) reduce grandes volúmenes de agua e) reduce consumo energético para la instalación y funcionamiento de los sistemas de cultivo, inducción y cosecha, e) disminuye la susceptibilidad a condiciones estacionales como temperatura ambiental e intensidad de radiación solar f) reduce el riesgo de contaminación de cultivos por bacterias, hongos y protozoos.

Este proceso puede ser aplicable a cualquier zona geográfica por la utilización de sistemas cerrados. Menor requerimiento de terreno para su implementación. No depende de la variabilidad estacional. Mayor control de las variables críticas del proceso (por ejemplo, temperatura), Disminuye la contaminación de la producción por el uso de sistemas cerrados.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1: Construcción de vectores de expresión para B. subtiHs con secuencias codificantes de los genes necesarios para la producción de ATX.

Se obtuvo una vector de expresión con las secuencias codificantes de los genes Fitoeno sintasa (PSY), Fitoeno desaturasa (PDS), Zeta caroteno desaturasa (ZDS), Caroteno isomerasa (CrtISO), Licopeno beta ciclasa (LYC-b), Betacaroteno cetolasa (BKT) y Betacaroteno hidroxilasa (CHBY)., involucrados en la biosíntesis de ATX. Se utilizó la cepa E. coH DH5o, para la generación de bacterias competentes durante la transformación de vectores plasmidiales puros de concentración conocida y para la transformación de productos de ligación durante clonamientos. Se utilizaron los plásmidos pBS0EXylRPxylA(V2) (ECE743) (figura 1), como vector de expresión que contiene el gen que codifica para la proteína fluorescente roja RFP bajo el control del promotor de expresión inducible por Xilosa pXyl. Resistencia a ampicilina en E coli y a Lincomicina/Eritromicina en B subtUis. Y el vector pUC-57- PATX-HL que contiene en tándem las secuencias codificantes de los genes de las enzimas las Fitoeno sintasa (PSY), Fitoeno desaturasa (PDS), Zeta caroteno desaturasa (ZDS), Caroteno isomerasa (CrtISO), Licopeno beta ciclasa (LYC-b), Betacaroteno cetolasa (BKT) y Betacaroteno hidroxilasa (CHBY). de H. lacustris. Resistencia a kanamicina.

El diseño del vector de expresión fue pensado en forma de un operón, una serie de secuencias codificantes en tándem reguladas por un único promotor de la transcripción. Para el diseño del vector de expresión fueron necesarias dos partes: el vector de expresión base y el inserto que incluye las secuencias codificantes de la ruta biosintética de ATX.

El vector de expresión pBS0EXylRPxylA(V2) (ECE743) tiene 9.149 pares de bases que contiene la secuencia que codifica para la proteína fluorescente roja RFP, flanqueada por sitios de restricción EcoRI y PstI, para el subclonamiento. El inserto presente entre los sitios de restricción EcoRI y PstI está bajo el control del promotor de expresión inducible por Xilosa pXyl. Resistencia a ampicilina en E coli y a Lincomicina/Eritromicina en B subtUis. También se mandaron a sintetizar los oligonucleótidos Primer Seq F y Primer Seq R, necesarios para los análisis de PCR y secuenciación posterior.

El diseño del inserto con las secuencias codificantes de la ruta biosintética de ATX constó de dos etapas. La primera, corresponde al diseño de los sitios de unión del ribosoma (RBS) para aumentar al máximo la tasa de expresión de secuencias codificantes de la ruta biosintética de ATX. Para esto se utilizó el software RBS calculator y Operan calculator y las secuencias codificantes modificadas de la ruta biosintética de ATX obtenidas previamente.

La segunda etapa constó de la inserción de secuencias de enzimas de restricción entre las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX de modo de tener una secuencia de tipo operón que contenga módulos que puedan sacarse o agregarse según necesidad. Junto a ello se agregaron sitios de restricción compatibles con los vectores de expresión para poder realizar el subclonamiento de la secuencia tipo operón que contiene las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX desde un vector de paso hacia el vector de expresión.

Un esquema de la secuencia tipo operón que contiene las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX se muestra en la figura 2, y fue encargada a la empresa la empresa Biomatik (Canadá).

El diseño final del vector de expresión se hizo en base al vector pBS0EXylRPxylA(V2), ya que se puede controlar el nivel de expresión con las concentraciones del inductor xilosa. El vector de expresión con las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX diseñado se muestra en la figura 3.

Generación y verificación de ios vectores de expresión para B. subtiiis codificantes para genes Fitoeno sintasa (PSY), Fitoeno desaturasa (PDS), Zeta caroteno desaturasa (ZDS), Caroteno isomerasa (CrtISO), Licopeno beta ciciasa (LYC-b), Betacaroteno cetoiasa (BKT) y Betacaroteno hidroxiiasa (CHBY). de H. iacustris.

Se procedió a la verificación del vector base de expresión análisis mediante ensayos de digestión con enzimas de restricción y PCR. Para esto se seleccionaron 10 colonias desde la placa con bacterias del ensayo anterior y se crecieron en 5 mL de medio Terrific Broth con amplicilina a una concentración final de 100 pg/mL a 37°C con 200 RPM de agitación durante 16 horas en un incubador con control de temperatura. Concluido el tiempo se retiró el cultivo de la incubadora, se guardó una alícuota de 500 pL a 4°C y el volumen restante se utilizó para extracción de ADN plasmidial mediante el kit Plasmid Mini prep de GeneAid según las instrucciones del fabricante. El ADN plasmidial extraído se analizó mediante ensayos de digestión con enzimas de restricción y PCR. El ensayo de digestión se realizó incubando lpg de ADN plasmidial con las enzimas EcoRI y PstI (Thermofisher) durante una hora a 37°C. Los resultados fueron analizados mediante un gel de agarosa al 1% teñido con SybrSafe (Themofisher).

Los resultados esperados son un fragmento de 1.100 pb correspondiente al inserto de RFP presente en el vector de expresión y un fragmento 8.031 correspondiente al vector de expresión sin el inserto de RFP. Los resultados obtenidos se muestras en la figura 4a donde se observa una banda entre los marcadores de 1.000 y 1.500 pb y una segunda banda entre los 7.000 y 10.000 pb, lo que sugiere que se posee el vector de expresión base pBS0EXylRPxylA(V2) La figura 4b muestra el detalle de las bandas presentes en el estándar de peso molecular utilizado.

La muestra fue sometida a un protocolo de PCR correspondiente a una denaturación inicial de cinco minutos, seguido de 35 ciclos sucesivos denaturación por 30s a 95°C, hibridación de primers a 50 °C por 30s y elongación a 72°C por 30s para la extensión del DNA. Se realizó una extensión final de productos de PCR por 5 minutos para la extensión final de los productos de PCR. El producto de PCR se analizó mediante un gel de agarosa al 1% teñido con SybrSafe (Themofisher). El resultado esperado es un amplicón de 1.202 pb que se muestra en la figura 5 donde se puede observar una banda entre los 1.000 y 1.500 pares de bases, de acuerdo con lo esperado.

Los resultados de los experimentos de digestión por enzimas de restricción y de amplificación por PCR sugieren fuertemente que el ADN plasmidial obtenido corresponde al vector pBS0EXylRPxylA(V2).

El vector de expresión pBS0EXylRPxylA(V2) se digiere con las enzimas de restricción EcoRI y PstI en una cantidad de 10 pg. Se separa por electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con con SybrSafe (Themofisher) y se recupera la banda de 8.031 pares de bases correspondiente al vector de expresión digerido. La banda que contiene el vector digerido se purifica con el kit de purificación desde gel de Geneaid, según las instrucciones del proveedor.

En la figura 6 se muestra el resultado de la electroforesis de la muestra de vector pBS0EXylRPxylA(V2) digerido y purificado, se observa una única banda entre los 7.000 y 10.000 pares de bases, que está de acuerdo con lo esperado (única banda de 8.031pb).

Con este resultado se obtiene el vector de expresión listo para ligar con el inserto que contiene fragmento tipo operón que contiene con las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX.

Fragmento tipo operón que contiene con ias secuencias codificantes modificadas de ias enzimas de ia ruta biosintética de A TX.

Se gestiona la síntesis de este fragmento en la empresa biomatik (Canadá). El fragmento de ADN llega insertado en el vector de clonamiento pUC-57-Kan en forma de polvo liofilizado. Se recibe el día 14 de octubre del año 2020. El vector de clonamiento que contiene la secuencia de las enzimas encargadas de la biosíntesis de astaxantina será llamado pUC57-ATX-HL. En la figura 7 se muestra un esquema del vector de clonamiento pUC-57-ATX-HL.

El ADN de pUC57-ATX-HL obtenido es resuspendido en 100 pl de agua libre de nucleasas quedando a una concentración de 50 ng/pl estimado por espectrofotometría. Se utilizaron 2 pL (100 ng) de ADN resuspendido para transformar bacterias E. coii DH5o mediante electroporación 1 kV por 2 milisegundos. Las bacterias transformadas se recuperan en medio SOC durante una hora a 37 °C con agitación de 200 RPM y posteriormente siembran en placas Petri con agar LB-kanamicina a una concentración de 30 pg/mL y se dejan incubar a 37 °C durante 16 horas. Transcurrido el tiempo se retiran las placas del incubador.

Se extrae plásmido desde las colonias de bacterias transformadas con el vector pUC57-ATX-HL con el kit plasmid mini kit de GeneAid. El ADN plasmidial de pUC-57-ATX-HL se digiere durante una hora a 37 °C con la enzima de restricción Ndel. La muestra se separa mediante una electroforesis en gel de agarosa al l%y teñido con con SybrSafe (Themofisher).

El resultado esperado es un patrón de digestión de cuatro bandas de 6.364, 2916, 2521 y 1346 pares de bases al digerir con la enzima Ndel. Al digerir con la enzima Notl se espera la presencia de dos bandas una de 10.612 pares de bases y otra de 2535 pares bases. La digestión de este mismo vector con las enzimas EcoRI y PstI genera dos bandas, una de 10.629 pares de bases y una segunda de 2.518 pares de bases. En la figura 8 se muestra el resultado de la electroforesis de la muestra de ADN de pUC-57-ATX-HL digerido con la enzima de restricción Ndel, digerido con la enzima de restricción Notl y digerido con las enzimas de restricción EcoRI y PstI. En el primer carril se pueden observar cuatro bandas la mayor entre 5.000 y 7.000 pares de bases, la segunda banda de casi 3.000 pares de bases. Una tercera banda entre 3.000 y 2.000 pares de bases y finalmente una cuarta banda entre los 1.500 y 1.000 pares de bases. En el segundo carril se muestra una la digestión del vector de clona miento pUC- 57-ATX-HL con la enzima de restricción Notl, se pueden notar dos bandas, una entre los 20.000 y 10.000 pares de bases y la segunda entre 2.000 y 3000 pares de bases. En el tercer carril se muestra una la digestión del vector de clonamiento pUC-57-ATX-HL con las enzimas de restricción EcoRI y PstI, se pueden notar dos bandas, una entre los 20.000 y 10.000 pares de bases y la segunda entre 2.000 y 3000 pares de bases.

Este resultado sugiere que el vector de clonamiento pUC-57-ATX-HL posee las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX.

Con el resultado anterior se procede a purificar el fragmento de ADN que contiene las secuencias de las enzimas de la ruta biosintética de ATX desde el vector de clonamiento pUC-57-ATX-HL. Se realizó una digestión de lpg de ADN del vector de clonamiento pUC-57-ATX-HL con las enzimas de restricción EcoRI y PstI durante una hora a 37 °C. La muestra digerida se separó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,75%. La banda de 10.629 pares de bases se recupera desde el gel y se purifica con el kit de purificación desde gel de Geneaid, según las instrucciones del proveedor. En la figura 9 se muestra el resultado de la purificación del fragmento de ADN a partir del vector pUC-57- ATX-HL y que contiene las secuencias de las enzimas de la ruta biosintética de ATX.

Para la obtención del vector de expresión con el fragmento de ADN que contiene las secuencias de las enzimas necesarias para la biosíntesis de ATX se utiliza el método de Gibson assembly. Este método permite generar fragmentos de gran tamaño mediante fragmentos de menor tamaño generados con PCR y uniéndolos en las zonas de 15 a 40 nucleótidos que se sobreponen en cada uno de los fragmentos, estos fragmentos se pueden unir a un vector utilizando el mismo principio. En la figura 10 se muestra un esquema del Gibson assembly diseñado. Se diseñan oligonucleótidos para generar fragmentos de PCR con zonas que se sobreponen entre ellos y el vector pBS0EXylRPxylA(V2) digerido con las enzimas EcoRI y PstI. En la figura 11 se muestran los componentes del diseño para el Gibson assembly^ los oligonucleótidos diseñados.

Con los oligonucleótidos disponibles se hicieron reacciones de PCR esperando tamaños de 3179 pb para el fragmento 13437 pb para el fragmento 2 y 4174 pb para el fragmento 3. La enzima polimerasa de alta fidelidad utilizada fue SuperFi II de Thermofisher. En la figura 12 se muestra los productos de PCR obtenidos con los oligonucleótidos para los fragmentos del Gibson assembly. Se puede observar una única banda de los tamaños esperados en cada uno de los fragmentos.

Con los productos de PCR de cada uno de los fragmentos, más el vector pBS0EXylRPxylA(V2) digerido con las enzimas EcoRI y PstI se realiza la reacción con NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit según las indicaciones del fabricante.

Para determinar si la reacción con NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit permite la formación del vector esperado, el mix de ensamble ya procesado, fue utilizado como templado para PCR. Estas reacciones fueron realizadas utilizando oligonucleotidos M13 y la enzima polimerasa de alta fidelidad utilizada fue SuperFi II de Thermofisher. Se espera un producto de 12.000 pb aproximadamente.

En la figura 13 se muestra los productos de PCR obtenidos con los oligonucleótidos M13. Se puede observar una única banda de los tamaños esperados en dos reacciones Gibson realizadas de manera independiente.

El producto de la reacción de Gibson assembly fue transformado en bacterias DH5o mediante electroporación 2,5 kV por 5 milisegundos. Las bacterias transformadas se recuperan en medio SOC durante una hora a 37 °C con agitación de 200 RPM y posteriormente siembran en placas Petri con agar LB- amplicilina a una concentración de 100 pg/mL y se dejan incubar a 37 °C durante 16 horas. Transcurrido el tiempo se retiran las placas del incubador. Se seleccionan colonias y se hace un cultivo de 5 mi durante 16 horas a 37 °C. Transcurrido el tiempo se extrae plásmido desde las colonias de bacterias transformadas con el producto de la reacción de Gibson assembly con el kit plasmid mini kit de GeneAid. El ADN extraído se analiza mediante PCR con los oligonucleótidos utilizando oligonucleotidos M13 y los primer seq 743 esperando un producto de 12000 pb aproximadamente en ambos casos. En la figura 14 se muestra el resultado de las amplificaciones por PCR de las colonias seleccionadas.

Estos resultados indican, que por medio de esta metodología efectivamente obtenemos la construcción esperada formada por el vector de expresión pBS0EXylRPxylA(V2) el cual contiene el fragmento tipo operón con las secuencias codificantes modificadas de las enzimas de la ruta biosintética de ATX.

Ejemplo 2: Producción de clones de E. coH DH5o productores de carotenoides.

El vector 743-ATX que incluyen las secuencias de la ruta metabólica de la biosíntesis de astaxantina (figura 15) fue transformado en bacterias F.co//DH5a mediante electroporación. Donde 100 mi de cultivo de E. coii DH5o fueron incubadas a 30°C hasta llegar a una ODeoonm de 0,6. El cultivo fue centrifugado a 2500xg por 10 minutos a 4°C y posteriormente lavado 5 veces con una solución de glicerol 10%. Una vez removido el sobrenadante el pellet fue resuspendido en glicerol 10% y alicuotado en volúmenes de 100 pL. Para realizar la electroporación, se agregó 50 ng de ADN a las alícuotas preparadas, se transfirieron a una cubeta de electroporación de 2mm (thermo Fisher). Las bacterias fueron electroporadas a 1 kV por 2 milisegundos en un equipo micro pulser de Bio-RAD. Inmediatamente estas fueron recuperadas en medio SOC durante una hora a 37 °C con agitación de 200 RPM. Finalmente, las bacterias fueron sembradas en medio LB agar con el antibiótico ampicilina a una concentración de 100 pg/ml.

Las colonias de bacterias E.coH DH5o transformantes fueron sembradas en placas de agar-LB con ampicilina (100pg/mL). Las colonias transformantes que incluyen el vector 743-ATX se pueden distinguir de las colonias que no lo contienen en base a su coloración anaranjada, debido a la producción de carotenoides por efecto de la expresión basal del vector 743-ATX, este resultado sugiere que las colonias de color anaranjado poseen el vector 743- ATX y que este es funcional.

Las colonias de F.co// DH5o productoras de carotenoides fueron seleccionadas y cultivadas para realizar pruebas de funcionalidad del vector 743-ATX. Las pruebas de funcionalidad del vector 743-ATX se realizó mediante el cultivo e inducción de la biosíntesis de astaxantina, donde 100 mi de cultivo de E. coH DH5o fueron incubadas a 37°C hasta llegar a una ODeoonm de 0,6 en medio TB. Se indujo la expresión de las enzimas de la ruta biosintética de ATX agregando una solución de xilosa 50% hasta tener una concentración final de 2% de xilosa. Se dejó inducir a 37°C por 24 horas. El cultivo inducido fue centrifugado y se eliminó el sobrenadante. El pellet de bacterias se congeló a -20°C hasta su utilización para el análisis de carotenoides. Los resultados obtenidos desde las pruebas de funcionalidad sugieren que el vector de expresión 743-ATX responde al estímulo del agente inductor, lo que indica que es un vector completamente funcional. Los pellets de bacterias productoras de carotenoides inducidos fueron estudiados para determinar la presencia de astaxantina. Se extrajeron carotenoides desde biomasa bacteriana inducida, para lo cual se utilizó acetona como solvente en una relación 1:5 respecto de la masa húmeda. El pellet de bacterias inducidas (1 gr aprox) se resuspendió en 5 mi de acetona y se agitó con vortex hasta homogenizar la muestra, posteriormente se incubó a 55°C por 5 minutos y se sonicó por 30 minutos a 40 Khz a 55°C en baño ultrasónico, luego se centrifugó a lO.OOOxg por 5 minutos. La extracción se repitió 4 veces. Finalmente, la acetona se evaporó hasta un volumen de 100 pL y se guardó a -20°C hasta su uso. Los extractos de carotenoides obtenidos a partir de biomasa bacteriana fueron analizados mediante HPLC y espectrofotometría.

Los extractos de carotenoides fueron analizados por espectrofotometría en el rango de 300 a 550 nm para determinar la presencia de carotenoides. Para todas las muestras que presentan carotenoides se analizaron en un equipo de cromatografía HPLC YL9100 plus con detector YL9160 PDA con arreglo de diodos e inyección manual.

La determinación de ATX a partir de extracciones de carotenoides desde biomasa bacteriana inducida se realizó por comparación con una solución madre de 300 pg mL-1 de un estándar de ATX (Astaxanthin SML 0982-50MG > 97% Haematococcus pluvialis, Sigma-Aldrich).

Se inyectaron alícuotas de las soluciones estándar recién preparadas y las muestras en el sistema de HPLC en una columna Luna 3pm Sílice de 150 mm x 4,6 mm, en fase normal y condiciones ¡socráticas de fase móvil hexano/acetona 82:18 v/v con detección a 474 nm.

Los resultados de los espectros de absorción mostraron una alta absorbencia en los rangos de los 360 hasta los 480 nm, característico de los carotenoides. Los resultados de los análisis por HPLC muestran el mismo tiempo de retención en la columna de la muestra y el estándar de astaxantina utilizado. Estos resultados sugieren que, dentro de los carotenoides producidos por las bacterias transformadas e inducidas, se encuentra astaxantina. En la figura 16 se muestra el espectro de absorbencia de los extractos de carotenoides obtenidos a partir de biomasa bacteriana, junto a ello se muestra un cromatograma de las muestras y su comparación con el estándar de astaxantina.

Los resultados obtenidos en esta etapa permiten concluir que el vector 743-ATX es funcional y que en condiciones de inducción se produce carotenoides, uno con tiempos de retención similar al de astaxantina.

Ejemplo 3: Producción de clones de B. subtiHs productores de carotenoides.

Para la transformación de B. subtiHs, primeramente, se extrajo ADN plasmidial desde bacterias E. coH DH5o productora de carotenoides. Con el objetivo de analizar vectores éstos fueron purificados, en baja escala, por MiniPrep. Una colonia de bacterias resistente a la presión selectiva del antibiótico fue inoculada en 5mL de medio TB y se incubó a 37°C con agitación (200rpm) por 16h. Las bacterias fueron colectadas por centrifugación a 2500xg por lOmin y posteriormente resuspendidas en 200pL de solución de resuspensión (50mM Tris-HCI, pH7,5; lOmM EDTA; 100pg/mL RNasa A) del kit de MiniPrep. Se transfirió la suspensión de bacterias a un tubo de l,5mL y se agregó 250pL de Solución de Lisis (0,2M NaOH; l%p/v SDS), se mezcló por inversión y se incubó por 5 min a temperatura ambiente. Luego se agregó 300pL de solución de neutralización (4,09M hidrocloruro de guanidinio; 0,759M acetato de potasio; 2,12M ácido acético), se mezcló por inversión y se centrifugó a 14000xg por 6min. El sobrenadante obtenido anteriormente fue introducido dentro de una matriz de silica con afinidad por DNA centrifugando lmin a 14000xg. La matriz fue lavada agregándole tampón de lavado (60mM acetato de potasio; 8,3mM Tris-HCI, pH 7,5; 0,04mM EDTA, pH 8,0; 60%v/v etanol). Finalmente, el DNA retenido fue eluído agregando 50 pL tampón de elusion (10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH8,0) a la matriz y aplicando una centrifugación de 30s a 13000xg. La elusion fue repetida utilizando 20 pL de tampón. Con el ADN plasmidial del vector 743-ATX, se dispuso la transformación de B subtilis, se realizó un pre-inóculo de 5 mi en medio TB con B. subtiHs desde una colonia en placa de agar y se incubó por 16 horas a 37 °C a 150-180 RPM de agitación. Al día siguiente se diluyó en pre-inóculo de B. subtilis crecido en la noche anterior en 10 mi de medio MNGE hasta una ODeoonm de 0,1- El medio MNGE inoculado con B. subtilis se incubó a 37 °C con 150-180 RPM de agitación hasta una ODeoonm de 1. El medio MNGE inoculado B. subtilis con una ODeoonm de 1, fue alicuotada en tubos con 400 pL y se agregó 600 ng ADN de vector 743-ATX. La alícuota de medio MNGE con ADN se incubó a 37 °C con 150-180 RPM de agitación durante 1 hora. Al cabo del tiempo se agregaron 100 pL de mix de expresión y se incubó a 37°C con 150-180 RPM de agitación durante 3 horas más. El medio MNGE con ADN se sembró con asa en medio sólido con Lincomicina (25pg/ml) y Eritromicina (lp/ml) y se incubó 37°C durante 16 horas. La presencia de colonias B. subtilis en placa con los marcadores de selección, sugiere que la transformación con el vector 743-ATX fue exitosa.

Se seleccionaron, desde la placa, dos colonias de B. subtilis transformantes que presentaron resistencia los marcadores de selección lincomicina/eritomicina para pruebas de inducción de la síntesis de carotenoides. Las colonias BS-743- ATX 2 y BS-743-ATX 3, se cultivaron en medio TB con Lincomicina (25 pg/mL) y eritromicina (lpg/mL) para hacer pruebas de inducción. Las pruebas de inducción de las colonias BS-743-ATX C2 y BS-743-ATX C3 se realizaron inoculando 100 mi de medio TB con 1 ml de pre-cultivo de B. subtilis 7 -K Á de distintas colonias transformantes seleccionadas. Los matraces inoculados con las transformantes fueron incubadas a 37°C hasta llegar a una ODeoonm de 0,6 en medio TB. Se indujo la expresión de las enzimas de la ruta biosintética de ATX agregando una solución de xilosa 50% hasta tener una concentración final de 2% de xilosa. Se dejó inducir a 37°C por 24 horas. El cultivo inducido fue centrifugado y se eliminó el sobrenadante. El pellet de bacterias se congeló a -20°C hasta su utilización para el análisis de carotenoides.

La biomasa de B. subtilis transformado con el vector BS-743-ATX-C2 inducido fue sometida a una extracción de carotenoides con acetona obtenido desde biomasa de B. subtih's transformado con el vector BS-743-ATX-C2 inducido presenta un intenso color amarillo, indicativo de la presencia de carotenoides.

El extracto obtenido desde biomasa de B. subtUis fue analizado mediante espectrofotometría (figura 17) y por cromatografía HPLC (figura 18). Los resultados muestran la presencia de carotenoides en las muestras de biomasa de B. subtUis transformado con el vector 743-ATX, a diferencia de los observado en la biomasa de B. subtUis sin transformar.

Junto al análisis de los carotenoides en B subtUis transformado con el vector 743-ATX, se analizó la presencia de las enzimas de la ruta metabólica productora de carotenoides en cultivos inducidos de B. subtUis transformado con el vector 743-ATX. Para obtener un perfil de proteínas de las colonias obtenidas en B. subtUis con el vector 743-ATX se realizó un SDS-PAGE, 50 pg de proteína total fueron diluidas en tampón de carga (50 mM Tris-HCI pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, DTT 0,1 M y azul de bromofenol 0,1%) y denaturadas a 95°C por 5 min. Las muestras fueron sembradas en un gel de acrilamida/bisacrilamida al 10%. La electroforesis se realizó a voltaje constante de 100 volts en tampón de corrida (Tris-base 25 mM, glicina 192 mM y SDS 0,1%, pH 6,8). Cómo referencia de los tamaños moleculares se utilizó el marcador de tamaño molecular SeeBlue2 de Thermofisher.

Para identificar las bandas se realizó una tinción con azul de Coomasie (2% H3PO4, 10% (NH4)2SO4, 20% metanol, y 0.1% Coomassie G-250). Se lavaron los geles 3 veces durante 5 minutos con 100 mi de agua desionizada para eliminar el SDS y las sales tampón, que interfieren con la unión del tinte a la proteína. La tinción se realizó durante 24 horas a temperatura ambiente con suave agitación. Posteriormente, se realizaron repetidos lavados al gel con 100 mi de agua durante 1-3 horas con agitación suave.

Los resultados muestran la presencia de proteínas de tamaños similares a los esperados para:

1. Fitoeno sintasa (PSY)= 45 kDa

2. Fitoeno desaturasa (PDS)= 63 kD

3. Zeta-caroteno desaturasa (ZDS)= 64 kDa 4. Caroteno ¡somerasa (Crtlso)= 68 kDa

5. Licopeno beta ciclasa (LYC-b) = 62 kDa

6. Beta-caroteno cetolasa (BKT)= 36 kDa

7. Caroteno hidroxilasa (CHBY)= 35 kDA

Estos resultados siguieren que el vector de expresión produce las enzimas de la ruta metabólica de carotenoides hasta la producción de astaxantina (figura 19). En la figura 20 se presenta el cromatograma y espectro de absorción de la astaxantina obtenida, proveniente desde el cultivo de B. subtilis7 3-K .

Ejemplo 4: Secuencias optimizadas

SEQ ID N° 1: Fitoeno sintasa (PSY) atggctacacctcttcctacaaaacgtacacattctatcgtttctgttcctcctgctatg cttcatcaatctcttcctgg ccgttgccgtcctcattcttctcgttgccctgttgctatctctgctacacttgttggccc tgatcctcgttggtctatcgc ttcttctcaagttgttcctaaacaacctcaacttaaaggcaaagatgttgaagaagctgc tatgtggcgttgcatc gatcttcatcgtcgtcttcctaacggcggcgctcctcaacaagcttctcgttggacacct gctacacttgaagaag cttaccaacgttgcggccaagttacatctgaatttgctaaaacattctaccttggcacac aacttatgacacctatc caagctaaatctatctgggctatctacgtttggtgccgtcgtacagatgaacttgttgat ggccctaacgctaaca aaatcacacctaaagctcttgatcgttgggaagaacgtcttgaagctacattcgctggcc gtccttacgatgttctt gatgctgctctttctgatacaatctctaaattccctatggatatccaacctttcaaagat atgatcgaaggcatgcgt atggatcttcataaaacacgttaccaaacattcgatgaactttacgaatactgctaccgt gttgctggcacagttg gccttatgacaatgcctgttatgggcatcgatccttcttacaaaggccctatggatgttg tttacaaagctgctcttg ctcttggcacagctaaccaacttacaaacatccttcgtgatgttggcgaagatgctcgtg aacgtaaccgtatcta ccttcctatggaagatcttcaacaattcggccttacagaacaagatgttcttggcgctgt tcatgttccttctcaagg caaagtttctgaaaaatggcgtgctttcatgaaattccaaatcgctcgtgctcgtcaatg cttcgctgatgctgaat ctggcgttgatcaacttgaagctaaagctcgttggcctgtttggtctgctcttatccttt accgtcaaatccttgatgc tatcgaaaaaaacgattacgataacttctctcaacgtgcttacgtttctaaagctaaaaa aatggcttctcttcctct tgctcttacacgtgctcttcttcctcaacatcgtggctaa

SEQ ID N° 2: Fitoeno desaturasa (PDS) tgcatacaacaatgcgtggccaagcttctggctctggctgcacatctggccgtcaaacac gtggccattggtctc gtcgttctgttcgtgaacgtggcgctcttcgtgttgttgctaaagattaccctacacctg atttccaatcttctgatac ataccaagaagctctttctctttctacaaaacttcgtaacgctcctcgtcctgctaaacc tcttcgtgttgttatcgct ggcgctggccttgctggcctttctgctgctaaataccttgctgatgctggccatcatcct gttgttcttgaaggccgt gatgttcttggcggcaaagttgctgcttggaaagatgaagatggcgattggtacgaaaca ggccttcatatcttc ttcggcgcttaccctaacatccaaaaccttttcaaagaacttggcatccaagatcgtctt caatggaaagaacatt ctatgatcttcgctatgcctgatgctcctggcgaattttctcgtttcgatttccctgaac ttcctgctccttggaacggc atcatcgctatccttcgtaacaaccaaatgctttcttggcctgaaaaaatccgtttcgct atcggccttcttcctgcta tcatcttcggccaacgttactgcgaagaacaagatgaacttacagttacagaatggatgc gtaaacaaggcgtt cctgatcgtgttaacgaagaagttttcatcgctatggctaaagctcttaacttcatcaac cctgatgatctttctatg acagttgttcttacagctcttaaccgtttccttcaagaacaacatggctctaaaatggct ttccttgatggcgctcct cctgaacgtctttgccaacctatggttgattacttcaaagctcgtggcggcgatcttatg ttcaactctcgtgttaaa caaatcgttcttaacgatgataaatctgttaaacatcttgctcttacaaacggccaaaca gttgaaggcgatcttta catctctgctatgcctgttgatatcatgaaaatccttatgcctgatccttgggcttctat gccttacttcaaacaactt aacggccttgaaggcgttcctgttatcaacatccatatctggttcgatcgtaaacttaca acagttgatcatcttctt ttctctcgttctcctcttctttctgtttacgctgatatgtctacaacatgcaaagaatac gctgatgaaaaaaaatcta tgcttgaacttgttttcgctcctgctaaagaatggatcggccgtcctgatgaagaaatca tcgctgctacaatgac agaacttgaacgtcttttccctacagaagttcgtgctgatcaatctatggctaaaatcct taaatacaaagttgtta aaacacctctttctgtttacaaatctacagctggccgtgaaaaattccgtcctacacaac gttctcctatctctaactt ctaccttgctggcgattacacaaaacaaaaataccttgcttctatggaaggcgctgtttt ctctggcaaacttgtta cagaagctatcgttgaagattggtctgctcgtggcgttacatcttctgctgcttctcgtc aacctgctcttgctgctg ctggcgttgttgctggctctgctgctgttatcggcgctgctcttgttgctgcttctggcg ctcttgctggcggcatgta a

SEQ ID N° 3: Zeta-caroteno desaturasa (ZDS) atgcaacaagttcaagctggccaacctgttcgtcgttcttgccctgctggctctgttcgt catcgtcttcgtttcggcc gtatccaacgtcaacgtcttgctgttttcgctcaagctgttgaagctcctcctgctcctc ctgctcgtgctcctcaagc tacagttgctcctcgtaaaacacctaaagatgtttctgctgttgctcttaaagatgttcc tcttcgttctctttaccctg atgaacctgctcctcctgctcctggcgctcctaaacttaaagttgctatcgttggcggcg gccttgctggcctttcta cagctgttgaacttcttgaacaaggccatcaagttgatatctacgaagctcgtcctttca tgggcggcaaagttgc ttcttacgttgataaagatggcaaccatatcgaacttggccttcatgttttcttcggctg ctacttcaaccttttccgtc ttatggctaaatgcggcgttcttgaaaaccttcttgttaaagaacatacacatacattct gcaacaacgatggcga tgttcgtgaacttgatttccgtcttttccttggcgatacaaaagttggcgctcctttcca tggccttaaagctttcttca caacacctcaactttctgctgctgataaagctgctaacgctcttgctcttggcacatctc ctatcgttcgttctcttttc gatcctgttggcggcatgcgtgatatccgtgctcttgattctatctctttcaaagattgg ttcacatctcatggcggc tctgaacaatctatcaaacgtatgtgggatcctatcgcttacgctcttggcttccttgat tgcaaagatatctctgct cgttgcatgcttacaatcttccaattcttcgctacaaaaacagatgcttctgttcttcgt atgcttaacggctctcctg ctgaacgtcttcttaaacctatccttgaatacatcgaagctaaaggcggccgtgttcatc ttcgtcatggctgcaaa gaagttctttacgaagatggccctgatggcgttcctcgtgttacaggccttcgtgttggc cctgaaggccgtgaac aacttgttcaagctgatgcttacgttgctgctcttgatgttcctggcgctaaacgtcttc ttcctcaagcttggcgtcg tttccctcaattcgataacatctggcaacttgttggcgttcctgttatcacagttcaact tcgttacaacggctgggtt acagaagctgctcaagaaaaagttaaagatcttcgtgttgctgctggccttgataacctt ctttactctgctgatgtt ttcttctcttgcttcgctgatcttgctcttgtttctcctatggaatacttcaaagaaggc caaggctctcttatgcaagt tgttatcacacctgctgctccttacatgccttggacaaacgaacgtatcgctgctgaagc tgatcgtcaagttcgtc aacttttcccttctgctcgtggccttacaaacacatggcattctgttgttaaaatctctc aatctctttaccttgaagct cctggcatggatcgttggcgtcctgatcaagctacacctgttcctaacttcttcctttct ggctcttacacaaaacaa gattacatcgattctatggaaggcgctacactttctggccgtcaaacagctgctgaaatc gttaaagctgctccta aacttgctaaagctgctaaacaacttgctatgtctgcttaa

SEQ ID N° 4: Caroteno isomerasa (Crtlso) atgatgcttaacggccatcaaacacatcgtcaagttacagaatctcgtggccgttctaca ggcaaccctgttgttc ctgcttgcgtttctgctcatcaatgctctacatctggccgtgctgctgaatggcctgctc aatgccctcgtgttcgttc taaagcttaccctcaacaatctcaacttgcttctcgtggcgctaaagctcaagctgctcg tacagtttaccctcctct tgaagaagttcaaaaacttcctatcgaagctcctacagatatcgaatacgatgctgctat catcggcggcggcat gggcggccttgctacagcttctcaacttgttgctaaaggcgctaaagttgttgttcttga aaaataccttgttcctg gcggctctgctgctcatttcaaacgtgctggcttcacattcgatgttggctcttctatga tgttcggcatgggctcta aaggcacaacaaaccttatcacaaaatgccttgaagctgttggcaaagctatcgatacag ttcctgatccttctca agttcattaccatcttcctgcttcttctgctcatcctgaaggcctttctatcaaagtttg gcgtgcttacgatgatttcg ttgaagaaatgggccttcgtttccctcatgaaaaagaaggcgttaaaaaattctacgatg attgctggaaagtttt caactctcttaacgttcttgaacttaaatctcttgaagaacctcgttaccttcttacaca attcgctcgtcaacctcttg cttgccttacacttgctgcttacgctacatctaacacaggcgatatcgctcgtcgttaca tcaaagatcctgttcttct taaattcatcgatcttgaatgcttcatctggtctacagtttctgctgatatgacacctat gatcaacgctggcatggt tttctgcgatcgtcatttcggcggcatcaactaccctgttggcggcgttggccgtcttgc tgaacttcttgttgatgg catcacagaacgtggctctcatatcgtttacaaagctaacgttaaagaaatccttacaca tgctgctgctgaaga agctgctcctcgtgctgttggcgttcgtcttgctgatggccgtgaatttcgtggcaaaac agttgtttctaacgctac acgttgggatacattcgataaacttcttggcgaagataaagttcctgaatctgaaaaact tttcaaacaacgttac aaaaaagctccttctttcttctctatgcatatgggcgttaaagctgaagttttcgctgct cgtcctggccgtgctgct gttggcgattgccatcatatcatccttgaagattgggctcgtatggaagatacacatggc acacttttcgtttctctt ccttctgttcttgatccttctcttgctcctgctggccaacatatcgttcatgctttcaca cctgattggatcgaagattg gcaaggccttgatgtttctgcttacgaagctcgtaaacaacaagttgctgatcaacttgt tcaacgtcttgatgctg ttttccctggccttgctgcttctgttacatacatggaagctggcacacctcgtacacatc gtcgttaccttaaccgtg aagatggcacatacggccctatcccttctcgtcgtcctcttggcatgctttctatgcctc ttaaccgtacagctgttcc tggcctttactgcgttggcgattctacattccctggccaaggcgttaacgctgttgtttt ctctggcttcggctgcgct catcgtatcgcttgcgatacaggccgtgaaccttcttggcctcttcttgatcgtgctttc aacgctacacttgattac gttcgtgatcgttcttaa

SEQ ID N° 5: Licopeno beta ciclasa (LYC-b) atgctttctcctcttcaacgtctttgcgctggctcttcttactctgctggccctgctctt gttcttcttcctcctgctcctcg tgtttgcctttctaaacaacatgatttcgatcaaacagctcaatggcctcgtcgtcgtct tgttcgtgcttctgctgct acagcttctgaacaacgtcctgctcgtacatctccttctggctacgttatgcgtgatcct atgccttggcctacagct tctgatatcgctcttacacaacatgatcttcaagctacacctgaagttgatcttatcgtt gctggcgctggcccttct ggcatcgctgttgctgaacgtgttgctgctgctggcttctctgtttgcgttgttgatcct gaacctcttggcatctggc ctaacaactacggcgcttgggttgatgaatttgaagctatgggccttggcgaatacatgg aaatcgtttggccta aagcttctgttcatctttctaacaaacctgaaggcgaaaaattcctttctcgtccttacg gccgtgttgatcgtcctc gtcttaaatctatgcttcttaaaaaatgcgctgctcatggcgttacattccttgaaggca aagttgaaggcgttaac catggcgaaggccgttctgctgtttctcttgctgatggccgttctatccgtggctctctt gttcttgatgctacaggcc atgttcgtaaacttatcaaattcgatcaaaaattcgatcctggctaccaaggcgcttacg gcatcgttgctgaagtt gaatctcatcctttcgatcttgaaacaatgcttttcatggattggcgtgatgaacataca caaggcaaccctgctat gcatgctgctaacaacgctcttcctacattcctttacgctatgcctttctctaaaacacg tatcttccttgaagaaac atctcttgttgctcgtcctgctgttggcttcgatgaacttaaagaacgtcttgatgctcg tcttaaatggcttggcatc aaagttaaagctgttgaagaagaagaatactgccttatccctatgggcggcgttcttcct acacatcctcaacgtg ttcttggcatcggcggcacagctggcatggttcatccttctacaggcttcatgatgtctc gtatgcttggcgctgttc ctacaatcgctgatgctatcgttgatcaactttctgctcctgctgataaagctacatctc ttgctgctcgtaaacctg gctctgaagctgaagctgaagctatgtctgctgctgtttggcgtgctgcttggcctgttg aacgtatccgtcaacgt cttttcaacacattcggcatggaacttcttctttctcttgatcttcaacaaacacgtgat ttcttctctgctttcttcaac ctttctgatttccattggcatggcttcctttctacacgtctttctttctctcaacttctt ggcttcggcatcacacttttctt caaatcttctaacaacatccgtatccatcttcttaaacttggcgttcctggccttgttcg tatccttttcatgcttgctcc tacacttcgtggctactacaaacatgctcctacagttcgtcaacaaaaagctgttgctga tgctgctgctgctgttg ctgctcgtacagctgctgctgctaaacctgctgatcttcctcctgctatgatcaaataa SEQ ID N° 6: Beta-caroteno cetolasa (BKT)

Atgcatgttgcttctgctcttatggttgaacaaaaaggctctgaagctgctgcttct tctcctgatgttcttcgtgctt gggctacacaataccatatgccttctgaatcttctgatgctgctcgtcctgctcttaaac atgcttacaaacctcctg cttctgatgctaaaggcatcacaatggctcttacaatcatcggcacatggacagctgttt tccttcatgctatcttcc aaatccgtcttcctacatctatggatcaacttcattggcttcctgtttctgaagctacag ctcaacttcttggcggctc ttcttctcttcttcatatcgctgctgttttcatcgttcttgaatttctttacacaggcct tttcatcacaacacatgatgct atgcatggcacaatcgctcttcgtcatcgtcaacttaacgatcttcttggcaacatctgc atctctctttacgcttggt tcgattactctatgcttcatcgtaaacattgggaacatcataaccatacaggcgaagttg gcaaagatcctgattt ccataaaggcaaccctggccttgttccttggttcgcttctttcatgtcttcttacatgtc tctttggcaattcgctcgtct tgcttggtgggctgttgttatgcaaatgcttggcgctcctatggctaaccttcttgtttt catggctgctgctcctatcc tttctgctttccgtcttttctacttcggcacataccttcctcataaacctgaacctggcc ctgctgctggctctcaagtt atggcttggttccgtgctaaaacatctgaagcttctgatgttatgtctttccttacatgc taccatttcgatcttcattg ggaacatcatcgttggcctttcgctccttggtggcaacttcctcattgccgtcgtctttc tggccgtggccttgttcct gctcttgcttaa

SEQ ID N° 7: Caroteno hidroxilasa (CHBY) atgacattccataaacctgtttctggcgcttctgctcttcctcatatcggccctcctcct catcttcatcgttctttcgct gctacaacaatgctttctaaacttcaatctatctctgttaaagctcgtcgtgttgaactt gctcgtgatatcacacgtc ctaaagtttgccttcatgctcaacgttgctctcttgttcgtcttcgtgttgctgctcctc aaacagaagaagctcttgg cacagttcaagctgctggcgctggcgatgaacattctgctgatgttgctcttcaacaact tgatcgtgctatcgctg aacgtcgtgctcgtcgtaaacgtgaacaactttcttaccaagctgctgctatcgctgctt ctatcggcgtttctggc atcgctatcttcgctacataccttcgtttcgctatgcatatgacagttggcggcgctgtt ccttggggcgaagttgct ggcacacttcttcttgttgttggcggcgctcttggcatggaaatgtacgctcgttacgct cataaagctatctggca tgaatctcctcttggctggcttcttcataaatctcatcatacacctcgtacaggcccttt cgaagctaacgatcttttc gctatcatcaacggccttcctgctatgcttctttgcacattcggcttctggcttcctaac gttcttggcgctgcttgctt cggcgctggccttggcatcacactttacggcatggcttacatgttcgttcatgatggcct tgttcatcgtcgtttccct acaggccctatcgctggccttccttacatgaaacgtcttacagttgctcatcaacttcat cattctggcaaatacgg cggcgctccttggggcatgttccttggccctcaagaacttcaacatatccctggcgctgc tgaagaagttgaacg tcttgttcttgaacttgattggtctaaacgttaa