ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ АНГИОГЕ-

НЕЗА

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области фармацевтики и биотехнологии, и может быть использовано для усиления роста новых сосудов в ишемизированных тканях. Изобретение представляет собой плазмидную бицистронную конструкцию, несу- щую ген hHGF фактора роста гепатоцитов человека и ген hVEGF165 фактора роста эндотелия сосудов. Заявляемая бицистронная конструкция может быть использована как лекарственное средство в медицинских целях для обеспечения стимуляции ан- гиогенеза, роста и ремоделирования сосудов, а также восстановления кровоснабже- ния в ишемизированных тканях, для лечения ряда заболеваний человека, обуслов- ленных нарушением кровоснабжения тканей.

Уровень техники

Ишемическая болезнь сердца (ИБС) и критическая ишемия нижних конечно- стей (КИНК), наряду с ишемическими нарушениями мозгового кровообращения, в настоящее время относят к основным причинам инвалидизации и смертности насе- ления.

Одним из перспективных способов лечения КИНК является «терапевтический ангиогенез» - стимуляция роста новых кровеносных сосудов с помощью генной те- рапии. Для индукции ангиогенеза в ишемизированной скелетной мускулатуре было предложено использовать плазмидные конструкции, несущие кДНК генов b-FGF, VEGF165, HGF и других факторов роста. Безопасность таких конструкций была по- казана во многих исследованиях [Pavel Igorevich Makarevich and Yelena Viktorovna Parfyonova (April 5th 2017). Therapeutic Angiogenesis: Foundations and Practical Appli- cation, Physiologic and Pathologic Angiogenesis, Dan Simionescu and Agneta Simiones- cu, IntechOpen, DOI: 10.5772/66411].

В 2011 году на территории РФ был зарегистрирован препарат "Неоваскул- ген", представляющий собой плазмиду, кодирующую фактор роста эндотелия сосу- дов (pCMV-VEGF165), его эффективность и безопасность в комплексной терапии пациентов с хронической ишемией нижних конечностей была доказана в ходе кли- нических исследований. Результат клинического исследования 26-3 фазы с участием 100 пациентов показал значительное улучшение их функционального состояния, что выражалось достоверным увеличением дистанции безболевой ходьбы на 110%. От- сроченное наблюдение не выявило каких-либо побочных эффектов, связанных с применением препарата и показало, что терапевтический эффект после стандартного курса терапии сохраняется на протяжении трех лет. Селективный анализ эффектив- ности терапевтического ангиогенеза у пациентов с фоновым СД (п=15), которые участвовали в исследовании, показал достоверное увеличении дистанции безболевой ходьбы на 202% через 6 месяцев после стандартного курса терапии.

Весной 2019 года Министерство здравоохранения, труда и социального обес- печения Японии (MHLW) разрешило применение генотерапевтического препарата Collatagene компании AnGes, основываясь на результатах успешно завершившихся клинических исследований. Активным компонентом препарата является плазмида с геном фактора роста гепатоцитов - HGF, который обладает ангиогенными свойства- ми, препарат переназначен для лечения критической ишемии нижних конечностей (КИНК). В ходе предыдущего плацебо-контролируемого рандомизированного ис- следования 2 фазы было показано, что его применение обеспечивает достоверное улучшение функционального состояния пациентов с КИНК, что выражается в сни- жении выраженности болевого синдрома и увеличении частоты заживления язвен- ных дефектов (Shigematsu Н., Yasuda К., Iwai Т., Sasajima Т., Ishimaru S., Ohashi U , Yamaguchi T., Ogihara T., Morishita R. Randomized, double -blind, placebo-controlled clinical trial of hepatocyte growth factor plasmid for critical limb ischemia // Gene Ther. 2010. T. 17. N°9. - C. 1152-1161.).

Китайскими учеными в ходе 1 фазы открытого клинического исследования с участием 21 пациента с КИНК на фоне облитерирующего атеросклероза была дока- зана безопасность плазмиды с генами двух изоформ HGF. Также были получены предварительные данные об эффективности, которые выражались в увеличение по- казателей транскутанного напряжения кислорода и лодыжечно-плечевого индекса (A phase I clinical study of naked DNA expressing two isoforms of hepatocyte growth factor to treat patients with critical limb ischemia / Y. Gu, J. Zhang, L. Guo, S. Cu // J. Gene Medicine. - 2011. - Vol.13. P. 602-610). Стоит учитывать, что ангиогенез - это многоэтапный процесс, и каждый этап находится под контролем различных цитокинов и факторов роста, поэтому примене- ние только одного ангиогенного фактора (как в виде рекомбинантного белка, так и виде генетической конструкции) не позволяет добиться значительных результатов. Известно использование в терапевтическом ангиогенезе комплексного введе- ния нескольких плазмид, кодирующих разные ангиогенные факторы роста (АФР), в комбинации друг с другом.

Из уровня техники известно средство для стимуляции ангиогенеза в ишеми- зированной ткани, содержащее смесь в растворе 0,9%-ного NaCl плазмидных кон- струкций pC4W-hVEGFopt, несущую оптимизированный ген hVEGFopt фактора ро- ста эндотелия сосудов, и pC4W-hHGFopt, несущую оптимизированный ген hHGFopt фактора роста гепатоцитов (патент РФ N°2449799, 10.05.2012). Эффективный ангио- генез в ишемизированной ткани достигается при использовании данного средства в массовом соотношении плазмидных конструкций pC4W-hVEGFopt и pC4W- hHGFopt от 1:3 до 3:1. Лучшие результаты достигались при их массовом соотноше- нии 1:1.

Существенными недостатками введения смеси векторов является низкая ве- роятность ко-трансфекции клеток двумя плазмидами, различия экспрессии вводи- мых генов и снижение эффективности их совместного действия. Кроме того, при введении смеси плазмид не представляется возможным предсказать эффективность трансфекции клеток каждым из векторов, описать их фармакокинетику и конечную концентрацию кодируемых АФР, что значительно затрудняет фармацевтическую разработку лекарственных средств на основе комбинации двух и более генетических конструкций. Для ко-экспрессии двух и более генов разрабатываются мультици- стронные конструкции, например, векторы, включающие внутренние сайты посадки рибосом (IRES). Плазмиды, несущие IRES, позволяют осуществлять одновременную экспрессию нескольких генов, однако, эффективность трансляции, обеспечиваемой IRES, обычно существенно уступает кэп-зависимой инициации, а конечное соотно- шение концентраций синтезируемых белков варьирует в зависимости от выбранного IRES. Группой польских ученых было проведено клиническое исследование плаз- мидной конструкции, несущей гены VEGFA и FGF2, разделенные последовательно- стью IRES вируса EMCV, для лечения ишемической болезни сердца [Kukula К, Chojnowska L, D^browski М, Witkowski A, Chmielak Z, Skwarek M, K^dziela J, Teresmska A, Malecki M, Janik P, et al. Intramyocardial plasmid-encoding human vascu- lar endothelial growth factor A165/basic fibroblast growth factor therapy using percutane- ous transcatheter approach in patients with refractory coronary artery disease (VIF-CAD) Am Heart J. 2011;161:581-589.]. Введение плазмиды не привело к улучшению перфу- зии миокарда, однако, улучшились переносимость физической нагрузки и клиниче- ские проявления болезни.

Наиболее близким к заявляемому решению является плазмидная конструк- ция, в которых гены факторов роста HGF и VEGF165 разделены сайтом внутренней посадки рибосом - IRES [Слободкина Е.А., Нимирицкий П.П., Долинкин А.О., Ма- каревич П.И., Парфёнова Е.В. Разработка генотерапевтической плазмидной кон- струкции, кодирующей фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF165), Гены и Клетки - Материалы III Национального Конгресса по Регенеративной Медицине. Москва, 15-18 ноября 2017 года, серия 3, место издания Институт Стволовых Клеток Человека, Москва, Россия Москва, том 12, тезисы]. Общая схема данной плазмиды представлена на фиг.1. Генно-инженерная конструк- ция, представляет собой экспрессионную векторную плазмиду, в которую клониро- ваны вставки кДНК, кодирующие фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов, и содержит:

Основные элементы конструкции:

• последовательность гена HGF

• последовательность гена VEGF 165

• последовательность IRES (различные варианты)

Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции:

• Энхансер 1 - CMV enhancer

• Промотор pCMV (промотор цитомегаловируса)

• Терминатор - bGH poly А (участок полиаденилирования гена бычьего гормона роста)

Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coli

• Точка начала репликации (оп)

• Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий: - ген устойчивости к канамицину

Однако данная плазмида не обеспечивает синтез достаточных количеств ан- гиогенных факторов роста ни in vitro, так, например, концентрации HGF и VEGF165 in vitro (в среде культивирования клеток линии НЕК293Т после их трансфекции) со- ставляют не более 2,72 нМ и 1,6 нМ для HGF и VEGF165 соответственно. При этом соотношение концентраций HGF и VEGF165 непредсказуемо и в среднем составляет от 1:12 до 1:5 в зависимости от используемого IRES. Также данная плазмида не обеспечивает синтез достаточных количеств ангиогенных факторов роста ни in vitro ни при введении мышам - не более 0,72 нг/мл и вплоть до полного отсутствия. Сле- довательно, данный вектор не обладает параметрами, необходимыми для его ис- пользования в качестве экспрессионной конструкции для одновременной экспрессии генов фактора роста гепатоцитов и фактора роста эндотелия сосудов.

Технической проблемой является синтез двух генов в заданном соотношении, обеспечивающем эффективную стимуляцию ангиогенеза.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема решается заявляемым плазмидным вектором, несу- щим гены ангиогенных факторов роста человека, и обеспечивающего синтез данных АФР in vivo в близком к эквимолярному соотношению.

Техническим результатом является создание плазмидной генетической кон- струкции, кодирующей кДНК фактора роста гепатоцитов (hHGF) и кДНК фактора роста эндотелия сосудов (hVEGF165) под независимыми промоторами, позволяю- щей осуществлять синтез данных АФР in vivo в соотношении концентраций HGF/VEGF165 от 0,75:1 до 1:2 при обеспечении стабильного выхода белков. Полу- ченный вектор оказался эффективен, и может быть использован для создания гено- терапевтического препарата.

Для заявляемой генетической конструкции характерны следующие преиму- щества:

1) обеспечивает продукцию значительных количеств АФР: от 50 до 53 нМ и от 14 до 17 нМ для VEGF165 и HGF соответственно;

2) обеспечивает продукцию АФР в соотношении HGF/VEGF165 от 0,75:1 до 1:2;

3) поскольку оба гена (VEGF165 и HGF) имеют собственные промоторы, энхансеры и терминаторы транскрипции, то экспрессия каждого из них происходит независимо и не влияет друг на друга.

Технический результат достигается созданием вектора, схема которого пред- ставлена на фиг.2, а именно генно-инженерной конструкцией для стимуляции ангио- генеза в ишемизированных тканях, включающей:

- последовательность, кодирующую ген фактора роста гепатоцитов, находящуюся под контролем промотора цитомегаловируса - pCMV-HGF;

- последовательность, кодирующую ген фактора роста эндотелия сосудов, нахо- дящуюся под контролем промотора гена b-актина цыпленка - pCAG-VEGF165. При этом, в качестве последовательности, кодирующей ген фактора роста ге- патоцитов используют последовательность SEQ Ш NO:1, а в качестве последова- тельности, кодирующей ген фактора роста эндотелия сосудов используют последо- вательность SEQ Ш NO:2.

Генно-инженерная конструкция включает следующие последовательно рас- пол оженные элементы:

Энхансер 1 - CMV enhancer - 36 - 415 п.о.

Промотор 1 - pCMV (промотор цитомегаловируса) - 488-691 п.о.

Ген hHGF - 784-2970 п.о.

Терминатор 1 - bGH poly А (участок полиаденилирования гена бычьего гор- мона роста) - 3044-3268 п.о.

Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий - ген устой- чивости к антибиотику - 3441-4253 п.о.

Энхансер 2 - CMV enhancer - 4455-4740 п.о.

Промотор 2 - pCAG (промотор гена b-актина цыпленка) - 4742-5019 п.о.

Гибридный интрон - 5019-5248 п.о.

Ген hVEGF165 - 5278-5853 п.о.

Терминатор 2 - SV40 poly А (участок полиаденилирования вируса SV40) - 5908-6029 п.о.

Точка начала репликации (ori) - 6235-6823 п.о.

Техническая проблема также решается применением заявляемой генно- инженерной конструкции в качестве действующего вещества генотерапевтического средства для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях.

Также техническая проблема решается средством для стимуляции ангиогене- за в ишемизированных тканях, включающее заявляемую плазмидную конструкцию и вспомогательные вещества для внутримышечного введения. При этом, в качестве вспомогательных веществ использованы натрия хлорид или вода для инъекций.

Техническая проблема также решается способом стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях, включающим внутримышечное введение лекарственного средства для стимуляции ангиогенеза в ишемизированных тканях, включающего за- являемую плазмидную конструкцию, в терапевтически эффективном количестве.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется следующими чертежами. На фиг. 1 представлена «карта» прототипа плазмидной генетической кон- струкции, кодирующей ген hHGF фактора роста гепатоцитов человека и ген hVEGF165 фактора роста эндотелия сосудов, разделенные последовательностью IRES. На фиг. 2 представлена «карта» плазмидной генетической конструкции, коди- рующей ген hHGF фактора роста гепатоцитов человека и ген hVEGF165 фактора ро- ста эндотелия сосудов под двумя независимыми промоторами.

На фиг. 3. представлена диаграмма, демонстрирующая содержание HGF и VEGF165 в среде культивирования НЕК293Т после трансфекции кальций- фосфатным способом.

На фиг. 4. представлены фотографии, на которых показано формирование ка- пилляроподобных структур клетками HUVEC на матригеле после их обработки экс- периментальной и контрольными средами.

На фиг. 5 представлены графики, демонстрирующие общую длину капилля- роподобных структур, сформированных клетками HUVEC на матригеле через 15 ч после обработки экспериментальной и контрольными средами.

На фиг. 6 представлены графики, демонстрирующие количество точек ветв- ления капилляроподобных структур, сформированных клетками HUVEC на матри- геле через 15 ч после обработки экспериментальной и контрольными средами. На фиг. 7 представлена оценка ишемической перфузии конечностей у мышей в группах исследования.

A. График перфузии конечностей, показывающий относительные значения перфузии; для группы pHGF/VEGF: * р = 0,05 и р = 0,006 по сравнению с группой физиологического раствора (0.9% NaCl) на 7 и 14 дни, соответственно; # р = 0,018 по сравнению с группой пустого вектора на 14 день. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

B. Репрезентативные лазер-доплеровские изображения подкожного кровотока у мышей из экспериментальных групп, полученные на 14-й день после индукции ишемии и инъекции плазмиды. На фиг. 8 представлен анализ плотности кровеносных сосудов на срезах ске- летных мышц животных исследуемых групп.

А. Графическое представление анализа плотности кровеносных сосудов

(средние значения на поле зрения): CD31 + капилляры с просветом, CD31+ капилля- ры без просвета и a-SMA+ сосуды. * р <0,05 для группы pHGF/VEGF по сравнению с группой физиологического раствора (0.9% NaCl). Данные представлены как сред- нее ± стандартная ошибка среднего.

В. Типичное изображение среза мышцы, окрашенного на CD31, a-SMA и DAPI (увеличение х 200). Масштабная шкала соответствует 50 мкм. Осуществление изобретения

Заявляемая генно-инженерная конструкция представляет собой экспрессион- ную векторную плазмиду, в которую клонированы вставки кДНК, кодирующие фак- тор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов человека, а именно кольце- вую ДНК длиной 6888 нуклеотидных пар. Основные элементы конструкции:

• участок pCMV-HGF

• участок pCAG-VEGF165

Расположение кДНК, кодирующих фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов человека, под независимыми промоторами, позволяет осуществ- лять синтез данных АФР in vivo в соотношении концентраций HGF/VEGF165 от 0,75:1 до 1:2 при обеспечении стабильного выхода белков.

Плазмидная конструкция несет оптимизированные гены VEGF165 (фактора роста эндотелия сосудов) и HGF (фактора роста гепатоцитов) человека, которые мо- гут быть заменены на другие (например, нативные) последовательности данных ге- нов.

Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции:

• Энхансер 1 - CMV enhancer - 380 п.о.

• Промотор 1 - pCMV (промотор цитомегаловируса) - 204 п.о.

• Терминатор 1 - bGH poly А (участок полиаденилирования гена бычьего гормона роста) - 225 п.о.

• Энхансер 2 - CMV enhancer - 286 п.о.

• Промотор 2 - pCAG (промотор гена b-актина цыпленка) - 278 п.о.

• Гибридный (химерный) нитрон - 229 п.о.

• Терминатор 2 - SV40 poly А (участок полиаденилирования вируса SV40) - 122 п.о.

Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coir.

- Точка начала репликации (ori) - 589 п.о. - Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий: - ген устойчивости к канамицину - 813 п.о. (может быть заменен на другой ген устойчи- вости к антибиотикам или селективный маркер).

Синтез плазмиды осуществляли с помощью стандартной технологии и обору- дования, применяемых для решения подобных задач в генной инженерии (Watson J.D., Gilman М., Witkowski J., Zoller M. - Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992). В качестве вектора для синтеза заявляемой плазмиды могут быть использованы любые коммерческие векторы, для которых характерна высоко- копийная репликация в Е. coli (более 150 копий на клетку), относительно небольшой размер (3-6 тыс. п.о.) и высокий уровень экспрессии клонируемого гена в клетках млекопитающих.

В качестве генов, кодирующих VEGF165 и HGF могут быть использованы как кодон-оптимизированные последовательности генов данных АФР с последователь- ностями SEQ Ш NO: 1 и SEQ Ш NO: 2, так и нативные гены. Для трансформации и наработки плазмидной ДНК могут быть использованы компетентные штаммы Escherichia coli , например, Е. coli DH-5a.

Основные элементы конструкции:

Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции и гены VEGF165 (фактора роста эндотелия сосудов) и HGF (фактора роста гепатоцитов) че- ловека:

• Энхансер 1 - CMV enhancer

• Промотор 1 - pCMV (промотор цитомегаловируса)

• Последовательность гена HGF

• Терминатор 1 - bGH poly А (участок полиаденилирования гена бычьего гормона роста)

• Энхансер 2 - CMV enhancer

• Промотор 2 - pCAG (промотор гена b-актина цыпленка)

• Последовательность гена VEGF 165

• Г ибридный (химерный) нитрон

• Терминатор 2 - SV40 poly А (участок полиаденилирования вируса SV40)

Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coir. • Точка начала репликации (ori)

• Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий, вы- бранный из группы, включающей, но, не ограничиваясь ими, устойчи- вые к антибиотикам маркеры, такие как ампициллин, канамицин, нео- мицин и тому подобное.

Ниже представлено более подробное описание заявляемого изобретения. Настоящее изобретение может подвергаться различным изменениям и модификаци- ям, понятным специалисту на основе прочтения данного описания. Такие изменения не ограничивают объем притязаний. Например, могут изменяться стратегия сборки генетической конструкции (используемые праймеры, сайты клонирования и т.д.). методы наращивания, выделения и очистки плазмид, способ трансфекции, методы оценки концентраций АФР и др.

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все проце- дуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или тем- пературе окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25°С.

Фармацевтическая композиция на основе изобретения может вводиться па- рентерально, внутримышечно или любым другим способом, обеспечивающим воз- можность доставки соединения и/или композиции к клеткам/тканям. Например, фармацевтическую композицию можно вводить субъекту в виде внутримышечных инъекций. Для этих целей необходимо использовать стерильные растворы заявляе- мой композиции в фармацевтически приемлемом растворителе (см. ниже). Стериль- ность полученных композиций обеспечивается технологией и процессом их произ- водства или получения в эксперименте.

Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксическому мате- риалу, который не взаимодействует с действием активного компонента фармацевти- ческой композиции. "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к биосов- местимому раствору, который в достаточной степени имеет такие характеристики, как стерильность, pH, изотоничность, стабильность и подобные, и может включать любые растворители, разбавители, включая стерильный физиологический раствор, раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, раствор декс- трозы для инъекций, раствор декстрозы и хлорида натрия для инъекций, содержа- щий лактат раствор Рингера для инъекций и другие водные буферные растворы, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и подобные. Фармацевтически приемлемый носитель также может содержать стабилизаторы, консерванты, антиоксиданты или другие добавки, которые хорошо известны специалистам в данной области, или другой наполнитель, известный из уровня техники. Концентрация плазмидного вектора для высокоэффективной экспрессии ге- нов VEGF165 и HGF человека в носителе должна быть достаточной для обеспечения терапевтического ангиогенеза. Например, при применении раствора на основе 0,9% хлорида натрия терапевтическая доза может составлять приблизительно от 25 до 1000 мкг на кг веса пациента. Введение рекомендуется осуществлять путем внутримышечной инъекции в место, максимально близкое к ишемизированному участку. Введение производится после стандартной обработки кожи, с соблюдением правил асептики, дробно через несколько вколов так, чтобы весь массив мышц пораженного сегмента был инфиль- трирован раствором. Введение может осуществляться как однократно (разово), так и несколько раз в зависимости от показаний, который оценивает лечащий врач на ос- новании специфических параметров пациента, таких как возраст, масса тела, пол, степень повреждения ткани и т.п.

1. Создание плазмидного вектора для высокоэффективной экспрессии генов VEGF165 и HGF человека. Синтез генов и плазмид осуществляли с помощью стандартной технологии и оборудования, применяемых для решения подобных задач в генной инженерии [Sambrook J et al., Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- tory Press, New York, (1989)], [Watson, J.D., Oilman, M., Witkowski, J., Zoller, M. Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, 1992]. Синтез плазмиды осуществляли на основе видоизмененной системы pVAX, преимуществом которой является факт разрешения ее к использованию FDA США, т.е. данные о безопасности входящих в ее состав компонентов. В качестве генов, ко- дирующих VEGF165 и HGF использовали последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Для повышения уровня продукции HGF и VEGF165 в трансфицированных клетках была оптимизирована природная последовательность кДНК этих генов.

Среди триплетов нуклеотидов, кодирующих аминокислоты белковых последова- тельностей природных генов HGF и VEGF165, были выявлены наиболее редко встречаемые последовательности в генах человека. Выявленные редкие триплеты, а также соседние с ними триплеты были заменены на триплеты, кодирующие ту же аминокислоту, но при этом наиболее часто встречающиеся в генах человека. После модификации все аминокислоты природных генов HGF и VEGF165 остались неиз- мененными.

Использованный дизайн плазмидного вектора, с одной стороны, позволил без существенного увеличения размера плазмиды вместить в нее кДНК двух факторов роста, а с другой, позволил обеспечить близкое к оптимальному соотношение про- дуцируемых белков, т.е. высокую продукцию рекомбинантного human-BDNF и уме- ренную продукцию human-uPA.

Ниже представлен пример реализации изобретения, который не ограничивает настоящее изобретение, а лишь демонстрирует возможность его осуществления с достижением технического результата.

Пример

Используемый экспрессионный вектор pVax2 был создан из коммерческого вектора pVaxl (ThermoFisher) и был взят как основной каркасный вектор для кон- струирования заявляемого изобретения. Модификация заключалась во вставке SV40 энхансера между CMV промотором и CMV энхансером pVaxl и замене гена устой- чивости к канамицину KanR.

1. На первом этапе была проведена рестирикция pVax2 Ceil (в буфере W+BSA) и вставка фосфорилированного дуплекса с получением конструкции pVax2-VEGFIns.

Таблица 1

2. На втором этапе конструкция pVax2-VEGFIns подвергалась рестрикция

AsuNHI+Pmel (CutSmart) с последующей вставкой оптимизированного hHGF, со- бранного из синтетических олигонуклеотидов и рестрицированного AsuNHI (CutSmart), с получением конструкции pVax2-CMV_hHGF-VEGFIns. Олигонуклео- тиды для сборки hHGF opt приведены в таблице 2 и 3. Таблица 2

Таблица 3

3. На третьем этапе была осуществлена последовательная рестрикция кон- струкции pVax2-hHGF-VEGFIns рестриктазами Xbal (CutSmart) и Bspl3I (2К), а за- тем вставка С AG- промотора, амплифицированного из вектора рХ458 с помощью праймеров, приведенных в таблице 4, и последовательно рестрицированного Xbal (CutSmart) и Bspl3I (2К). В итоге была получена конструкция pVax2-CMV_hHGF- CAG_VEGFIns. Затем, на четвертом этапе, была проведена рестрикция вектора pVax2-

CMV_hHGF-CAG_VEGFIns PciSI (В), и осуществлена вставка hVEGF165, собранно- го из синтетических олигонуклеотидов и рестрицированного PciSI (В) с получением заявляемой плазмиды pVax2-CMV_hHGF-CAG_hVEGF165. Олигонуклеотиды для сборки hVEGF165 приведены в таблицах 5 и 6. Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Затем полученный продукт трансформировали в Е. coli DH5a и трансформан- ты отбирали на основании устойчивости к канамицину. Плазмидную ДНК, выделен- ную приблизительно из 10 таких колоний, анализировали на наличие кДНК HGF и VEGF165 рестрикционным расщеплением, используя различные ферменты рестрик- ции. Одну такую плазмиду секвенировали, используя автоматический ДНК секвена- тор (ABI), и она была определена, как имеющая правильную интеграцию и последо- вательность кДНК HGF и VEGF165 в векторе pVax2.

Схема полученной плазмиды представлена на фиг.2. Таким образом, генно-инженерная конструкция, представляющая собой экс- прессионную векторную плазмиду (кольцевую ДНК длиной 6888 нуклеотидных пар), в которую клонированы вставки кДНК, кодирующие фактор роста эндотелия сосудов и фактор роста гепатоцитов человека (несет оптимизированные гены VEGF165 (фактора роста эндотелия сосудов) и HGF (фактора роста гепатоцитов че- ловека), содержит основные элементы конструкции: • участок pCMV-HGF 488 - 2970 п.о.

• участок рС AG- VEGF 1654742 - 5853 п.о.

Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции:

• Энхансер 1 - CMV enhancer - 36-415 п.о.

• Промотор 1 - pCMV (промотор цитомегаловируса) - 488-691 п.о.

• Терминатор 1 - bGH poly А (участок полиаденилирования гена бычьего гормона роста) - 3044-3268 п.о.

• Энхансер 2 - CMV enhancer - 4455-4720 п.о.

• Промотор 2 - pCAG (промотор гена b-актина цыпленка) - 4742-5019 п.о.

• Гибридный нитрон - 5020-5248 п.о.

• Терминатор 2 - SV40 poly А (участок полиаденилирования вируса SV40) - 5908-6029 п.о.

Регуляторные элементы экспрессии и трансляции конструкции в бактерии Е. coir.

Точка начала репликации (ori) - 6235-6823 п.о.

Селективный маркер для отбора трансформированных бактерий: - ген устой- чивости к канамицину - 3441-4253 п.о. (может быть заменен на другой ген устойчи- вости к антибиотикам или селективный маркер).

Для амплификации всех полученных плазмидных ДНК использовались бак- терии Е. coli штамма DH-5a. После трансформации бактерии культивировались в течение ночи в селективной среде LB с канамицином в концентрации 100 мкг/мл. После окончания инкубации бактерии осаждали центрифугированием и использова- ли для выделения плазмидной ДНК на колонке (Qiagen, США).

1. Приготовление заявляемой генетической конструкции

Для трансформации и наработки плазмидной ДНК (пДНК) использовали штамм Е. coli DH-5a. Исходный штамм Е. coli DH-5a является музейным и хранится во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов. Трансформиро- ванный штамм Е. coli DH-5a-CMV-HGF_CAG-VEGF165 отличается от исходного штамма Е. coli DH-5a устойчивостью к антибиотику канамицину, обеспечиваемой введенной в состав штамма плазмиды «CMV-HGF_CAG-VEGF165». Штамм- продуцент DH-5a-CMV-HGF_CAG-VEGF165 для наработки плазмидной ДНК полу- чали трансформацией исходного компетентного штамма Е. coli DH-5a соответству- ющей плазмидой, с последующим отбором рекомбинантных клонов на среде LB с канамицином при 37°С. Трансформацию компетентных клеток Е. coli штамма DH5a проводили следующим образом. В эппендорф, содержащий 1 иг пДНК добавляли суспензию размороженных на льду бактерий (объем культуры 30 мкл), после чего проводили трансформацию методом «теплового шока». Для этого пробирку поме- щали в термостат, нагретый до 42°С на 45 сек, после чего на 5 мин переносили в лед. После этого к полученной культуре добавляли стерильную среду LB (500 мкл) и ин- кубировали на термошейкере в течение 60 мин (500 об/мин, 37°С). После этого 150 мкл полученной суспензии переносили в ламинарном бактериологическом боксе на заранее подготовленные чашки Петри диаметром 100 мм залитые LB-агаром, содер- жащим селектирующий агент - канамицин (100 мкг/мл). Контролем трансформации служила проба без внесения пДНК, в которой адекватным считалось отсутствие бак- териального роста в LB-агаре с канамицином. После этого суспензию распределяли по поверхности LB-агара с помощью прожжённой проволочной петли и полученную культуру переносили в инкубатор на 15-17 ч при температуре 37°С. По окончании инкубации одну колонию бактерий с помощью стерильного шпателя переносили в жидкую культуру малого объема (15-20 мл, соотношение объема жидкости и воздуха не менее 1:4-1 :5) на среде LB, содержащей 100 мкг/мл канамицина. После этого кол- бу с инокулированной средой помещали в термошейкер на 18 часов (250 об/мин, 37°С). Далее полученную культуру переносили в жидкую среду LB со 100 мкг/мл канамицина объемом 500 мл в соотношении 1:500, после чего ее инкубировали в аналогичных условиях в течение 15-18 ч для получения большого объема бактери- альных клеток, содержащих пДНК. Полученную культуру бактерий в среде LB (объ- емом от 500 мл до 3 л в зависимости от количества пДНК) осаждали центрифугиро- ванием (12000 g, 15 мин), после чего жидкую фазу удаляли, а осадок использовали для выделения пДНК. Лизис, очистку от эндотоксинов и выделение плазмиды про- водили с использованием наборов компании Qiagen (Midi или Maxi EndoFree kit) co- гласно протоколу производителя

2. Трансфекция клеток линии НЕК293Т

Трансфекция клеток линии НЕК293Т проводилась кальций-фосфатным мето- дом, однако, возможно использование и другого метода (например, протокол транс- фекции с помощью Lipofectamine 2000). Трансфекция проводилась в 6-луночном планшете по достижении клетками 80-90% конфлюэнтного монослоя. Для этого 2 мкг пДНК смешивали с раствором 0,3 М СаСЬ и по каплям добавляли к 2xHBS (pH=7,10), состоящему из 280 мМ NaCl; 50 мМ HEPES; 1,5 мМ Na ₂ HP0 _4. После это- го полученную смесь инкубировали 1 мин и по каплям добавляли к среде культиви- рования НЕК293Т (DMEM/10% ФБС, объем 2 мл/лунке). Через 15-16 часов клетки отмывали и к ним добавляли бессывороточную DMEM, которую через 48 ч собира- ли, откручивали от клеточного дебриса и использовали для оценки продукции VEGF165 и HGF. Концентрации VEGF165 и HGF в среде культивирования клеток НЕК293Т через 48 ч после трансфекции составили 51,50 и 15,48 нМ соответственно. Соотношение молярных концентраций HGF/VEGF165 равнялось 0,3. Полученные данные представлены на фиг. 3 3. Тестирование биологической активности плазмид путем оценки форми- рования капилляроподобных структур клетками HUVEC на матригеле (tube assay) модель ангиогенеза in vitro Клетки HUVEC 3-4 пассажа высаживали на 48-луночный планшет, покрытый слоем Матригеля (BD Biosciences). Перед началом эксперимента клетки депривиро- вали в бессывороточной среде для культивирования клеток эндотелия (М200) в те- чение 4 ч. Затем на клетки наносили среду, собранную с трансфицированных клеток НЕК293Т (общий объем среды 2000 мкл). В качестве положительного контроля ис- пользовали клетки, к которым добавлялась полная среда культивирования (M200+supl). Планшет с клетками помещали в систему прижизненного анализа кле- ток - IncuCyte®, клетки фотографировали в режиме фазового контраста со 100х уве- личением каждые 2 часа. Длину трубочек и число точек ветвления оценивали с ис- пользованием программного пакета ImageJ. Результат представлен на фиг. 4-6.

4. Инъекция плазмид в скелетные мышцы мышей с последующей низковолъ- товой электропорацией Для внутримышечного введения плазмид использовался стерильный раствор пДНК в 0,9% NaCl, который вводился в т. tibialis anterior однократно. Животным вводилось по 100 мкг пДНК, растворенной в 30-50 мкл физиологического раствора

(2-3 мг/мл). Чрескожно игла инсулинового шприца вводилась параллельно продоль- ной оси мышцы, после чего раствор медленно вводился в толщу мышцы во избежа- ние разрыва перимизия. Для повышения эффективности трансфекции был использо- ван метод низковольтовой электропорации, описанный Schertzer и Lynch, с мини- мальной модификацией: было опущено введение гиалуронидазы, описанное в ори- гинальном методе. Непосредственно после инъекции плазмид на кожу, прилегаю- щую к т. tibialis anterior , накладывались пластинчатые электроды, смазанные про- водящим гелем. Затем с использованием генератора импульсных токов постоянной фор мы марки BTX-Harvard apparatus ЕСМ 830 (Harvard apparatus, США) проводи- лась электропорация тремя импульсами с напряжением 80 В/см расстояния между электродами, частотой 1 гЦ и продолжительностью 20 мсек. Затем полярность элек- тродов менялась и подавалось еще 3 импульса с аналогичными приведенным харак- теристиками. Поле проведения электропорации поверхность кожи очищалась 70% этиловым спиртом.

5. Опыты ex vivo на модели эксплантной культуры скелетной мышцы

Образцы т. tibialis anterior мыши были выделены на 2 день после введения пДНК. Подготовку эксплантной культуры на матригеле выполняли по методу Jang et al. (Jang HS, Kim HJ, Kim JM, Lee YS, Kim KL, et al. (2004) A novel ex vivo angiogene- sis assay based on electroporation-mediated delivery of naked plasmid DNA to skeletal muscle. Mol Ther 9: 464-474.). Образцы скелетной мышцы высаживали на матригель и затем культивировали в полной среде DMEM с 4,5 г/л D-глюкозы (Life Technologies, США) и 2% ФБС (Gibco, США) при стандартных условиях. На 3 и 7 сутки культивирования эксплантов отбирали образцы культуральной среды для оценки содержания VEGF165 и HGF человека методом ИФА. Концентрации VEGF165 и HGF, продуцированных мышиными мышечными эксплантами после инъекции, составили 0,81 и 0,35 нг/мл соответственно на 3 день и 0,82 и 0,49 нг/мл на 7 день. Соотношение молярных концентраций HGF/VEGF165 равнялось 0,24 на 3 день и 0,32 на 7 день.

6. Сравнительная оценка продукции VEGF165 и HGF клетки НЕК29 разны- ми плазмидами

На первом этапе на основе вектора pVAX нами были созданы прототипы за- являемой генетической конструкции, а именно плазмиды, несущие различные вари- анты IRES для осуществления одновременной экспрессии генов факторов роста HGF и VEGF165, характеризующиеся общей схемой строения: HGF-IRES -VEGF165. Для оценки продукции VEGF165 и HGF клетки НЕК293Т трансфицировали кальций фосфатным способом, концентрации VEGF165 и HGF в клеточной среде оценива- лись методом ИФА (результаты представлены в таблице 7).

Таблица 7

Плазмида N°1 - конструкция HGF-IRES_EMCV-VEGF 165 в качестве послед о- вательности IRES несет IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV). Молярные кон- центрации HGF и VEGF165 составили 1,48 и 0,28 нМ соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 5,42.

Плазмида N°2 - конструкция HGF-IRES_Bip-VEGF165 отличается от кон- струкции N°1 тем, что в качестве IRES используется последовательность IRES эука- риотического белка Bip. Аналогичными анализами показано, что концентрации HGF и VEGF165 в среде культивирования трансфицированных плазмидами клеток НЕК293Т составляют 2,72 и 0,27 нМ соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 10,7.

Плазмида N°3 - конструкция HGF-IRES_FGF1-VEGF165 отличается от кон- струкции N°1 тем, что включает последовательность IRES эукариотического белка FGF1. Молярные концентрации HGF и VEGF165 составили 0,08 и 1,59 нМ соответ- ственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 11,38.

In vivo продукция белков VEGF165 и HGF оценивалась на модели эксплант- ной культуры скелетных мышц, выделенных после инъекции с электропорации век- торов по пункту 1 (100 нг/мл) мышам. Образцы культуральной среды для оценки со- держания VEGF165 и HGF методом ИФА отбирались на 3 и 7 сутки культивирова- ния эксплантов.

Для плазмиды N°1 концентрации HGF и VEGF165, продуцированных мыши- ными мышечными эксплантами, не детектировались методом ИФА. Для плазмиды N°2 концентрации HGF в среде культивирования мышечных эксплантов составили 0,72 нг/мл и 0,48 нг/мл на 3 и 7 дни соответственно. Концен- трация белка VEGF165 была ниже порога чувствительности используемого метода детекции.

Для плазмиды N°3 концентрации HGF и VEGF165 также не детектировались методом ИФА.

Таким образом, векторы N°N°1, 2, 3 не дали достаточной для оценки методом ИФА продукции АФР. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что син- тезируемые количества белков VEGF165 и HGF ниже констант диссоциации данных АФР с их рецепторами и недостаточны для проявления их биологического действия. В качестве альтернативного варианта мультицистронного вектора была со- здана и протестирована следующая генетическая конструкция:

N° 4 - вектор, в котором гены белков VEGF165 и HGF имеют собственные не- зависимые промоторы: цитомегаловируса (CMV) и куриного бета-актина (CAG) для генов HGF и VEGF165 соответственно - «CMV_CAG». Молярные концентрации HGF и VEGF165 составили 6,05 и 5,92 нМ соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 1,38.

Конструкция N° 4 была протестирована in vivo на модели эксплантной куль- туры скелетных мышц мышей, описанной в пункте 2. Продукция белков VEGF165 и HGF оценивалась методом ИФА. После инъекции и электропорации мышам вектора N° 4 концентрации HGF в среде культивирования мышечных эксплантов составили 1,14 нг/мл и 1,3 нг/мл на 3 и 7 дни соответственно. Концентрации VEGF165 составили 0,5 нг/мл и 0,2 нг/мл на 3 и 7 дни соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 2,28 на 3 день и 6,67 на 7 день культивирования эксплантов. Таким образом, только вектор, включающий два отдельных промотора для независимой экспрессии обоих АФР дает продукцию белков HGF и VEGF165 in vitro и in vivo.

На основе вектора N°4, сконструирована заявляемая генетическая конструк- ция «pHGF/VEGF». Вектор представляет собой аналогичную плазмиде N°4 кон- струкцию, отличающуюся тем, что в ней последовательностью гена HGF заменена на оптимизированную. Концентрации белков HGF и VEGF165 в среде культивиро- вания трансфицированных плазмидой клеток НЕК293Т составили 15,48 и 51,5 нМ соответственно. Соотношение HGF/VEGF165 равнялось 0,3.

Для исследования специфической терапевтической активности комбиниро- ванного генного лекарственного средства, предназначенного для индукции роста но- вых кровеносных сосудов и восстановления кровоснабжения тканей ишемизирован- ных нижних конечностей, было изучено влияние препарата на восстановление кро- вотока в ишемизированной конечности мыши с помощью лазерного доплеровского сканирования.

Для моделирования ишемии задней конечности использовали самцов мыши линии С57/В6 в возрасте 8-10 недель. Перед операцией мышей вводили в наркоз с помощью интраперитонеальной инъекции 300 мкл 2,5% раствора авертина. Исполь- зовалась модель ишемии задней конечности мыши, разработанная в более ранних работах нашего коллектива (Makarevich Р., Tsokolaeva Z., Shevelev A., Rybalkin F, Shevchenko E., Beloglazova L, Vlasik T., Tkachuk V., Parfyonova Y. (2012) Combined transfer of human VEGF165 and HGF genes renders potent angiogenic effect in ischemic skeletal muscle. PLoS One). Кожу надрезали по средней линии бедра левой задней ко- нечности, a. femoralis и ее крупные ветви лигировали дистальнее паховой связки и проксимальнее ее подколенной бифуркации. Сосуд иссекали между верхней и ниж- ней лигатурами. После остановки кровотечения кожа ушивалась атравматической иглой (шелк 5-0) непрерывным швом. Все хирургические манипуляции проводились в асептических условиях с использованием бинокулярного микроскопа. После за- вершения операции для компенсации кровопотери всем животным подкожно бо- люсно вводили 1,5 мл тёплого стерильного физиологического раствора и помещали в отдельную клетку до полного выхода из наркоза. Животных рандомизировали для введения экспериментальных или контрольных растворов в следующие терапевтиче- ские группы:

1) «pHGF/VEGF» - однократное введение pHGF/VEGF (150 мкг), n = 9 2) «пустой вектор» - группа отрицательного контроля с однократным введе- нием экспрессионного вектора, не несущего терапевтических генов (коммерчески доступный pVAX2) (150 мкг) *, и = 7

3) «физиологический раствор» - отрицательный контроль растворителя, груп- па с введением 0,9% NaCl (150 мкл), п = 8.

Перед введением плазмиды разводили стерильным физиологическим раство- ром. Растворы вводили тремя равными инъекциями (по 50 мкл каждая) в anterior tibia muscle, femoral biceps muscle и femoral quadriceps muscle.

Для оценки восстановления подкожного кровотока на подошвенной поверх - ности задних лап мышей использовали лазер-допплеровский сканер (Moor Instruments Ltd, Millwey, Великобритания). Измерения проводили сразу после опера- ции и затем на 7ой и 14 дни. Перед сканированием животных наркотизировали при помощи помощью интраперитонеальной инъекции авертина, как было описано вы- ше. Измерения перфузии (и = 3-4) проводились на подошвенной поверхности ног животного, вариабельность данных анализировалась с помощью программного обеспечения Moor Image Review. Показания снимались до получения трёх последо- вательных измерений с минимальным (<10%) отклонением. Для исключения влия- ния внешних факторов полученные данные нормировали на значения кровотока в интактной конечности и представляли в виде относительной перфузии (%).

Данные представлены в формате среднего ± стандартная ошибка стреднего (СОС). Статистическая оценка различий показателей перфузии проводилась по U- критерию Манна-Уитни, значимыми принимались отличия при р<0,05.

На приведенном рисунке (фиг. 7) видно, что однократная инъекция плазмиды pHGF/VEGF индуцировала значительное восстановление перфузии задних конечно- стей на 7 день (34,14% ± 3,6% для pHGF/VEGF по сравнению с 25,51% ± 2,59% в контрольной группе, которой вводился физиологический раствор; р = 0,04). К 14 дню эти различия увеличились еще больше, и перфузия в группе pHGF/VEGF была в 1,5 раза выше, чем в группе, получавшей физиологический раствор (53,06% ± 2,71% против 35,76% ± 2,20% соответственно; р = 0,006) и в 1,33 раза выше, чем в группе, которой вводился пустой вектор (53,06% ± 2,71% против 39,83% ± 4,53% соответ- ственно; р = 0,018). Полученные результаты убедительно демонстрируют эффектив- ность использования плазмиды pHGF/VEGF для восстановления кровотока в ишеми- зированной задней конечности мыши. Для оценки специфической ангиогенной эффективности по восстановлению кровотока с использованием бицистронной плазмиды мы исследовали её влияние на рост сосудов в ишемизированной конечности мыши. На 14 день животных умерщ- вляли путем летальной ингаляции изофлурана. Ишемированные m. tibialis anterior выделяли и замораживали в среде TissueTek medium (Sakura Finetek, Leiden, Нидер- ланды). Срезы толщиной 7 мкм готовили с помощью криотома Microm НМ 505Е (MICROM International GmbH, Walldorf, Германия) и хранили при -700С. Для имму- нофлуоресцентного анализа срезы m. tibialis anterior фиксировали на предметных стеклах ацетоном, охлажденным до -200С в течение 20 минут, высушивали и про- мывали раствором PBS 5 мин. Предметные стекла блокировали 10% нормальной ослиной сывороткой (30 мин), промывали и инкубировали в течение ночи с первич- ными антителами (крысиные антитела против CD31 мыши, #553370 BD Biosciences Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, США; кроличьи антитела против a-SMA, #56945 Abeam. , Кембридж, Массачусетс, США), разбавленными блокирующим рас- твором (1% BSA в PBS). После этого срезы окрашивали вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor® 488 (#А21206, Thermo Scientific, Waltham, MA, США) или вторичными антителами, конъюгированным с Alexa Fluor® 594 (#А21209, Thermo Scientific, Waltham, MA, США) (1: 800) в течение 1 ч; все стекла контрастировали с помощью красителя DAPI (40,6-диамидино-2-фенилиндол) (Sigma-Aldrich, Милуоки, Висконсин, США). Микрофотографии срезов получали при 200-кратном увеличении в 5 случайных полях зрения с использованием Zeiss Axio Observer A1 (Zeiss, Оберкохен, Германия). Полученные изображения анализи- ровали с помощью программного обеспечения ImageJ (ImageJ, NIH, США). Количе- ство CD31 -положительных и a-SMA-положительных структур (>30 мкм в диаметре) подсчитывалось в 2-3 полях зрения с 5-6 срезов для каждого образца, после чего рас- считывалось среднее количество структур на поле зрения для каждого животного и для каждой исследуемой группы. После подсчета значительно большее количество CD31+ капилляров с просветом было обнаружено в группе pHGF/VEGF, чем в груп- пе отрицательного контроля с физиологическим раствором: 30,37 ± 4,26 против 16,54 ± 2,30 соответственно (рис. 8, А). Умеренное увеличение CD31+ сосудов без просвета было обнаружено в группе pHGF/VEGF, но это увеличение не было стати- стически значимым. Значительных различий в плотности a-SMA+ сосудов у живот- ных, которым вводили плазмиду pHGF/VEGF, по сравнению с группами с пустым вектором или физиологическим раствором не выявлено. Суммируя полученные на in vivo модели ишемии результаты, можно сделать вывод о том, что плазмидная бицистронная конструкция, несущая ген hHGF фактора роста гепатоцитов человека и ген hVEGF165 фактора роста эндотелия сосудов, с двумя отдельными промоторами для каждого из генов, обладает специфической биологической активностью: при введении в мышцы с нарушенным кровоснабжени- ем стимулирует восстановления перфузии тканей конечности кровью и их васкуля- ризацию.

Как следует из описанного выше, единственным вектором, позволяющим до- стигать оптимальных концентраций и соотношения АФР является заявляемая кон- струкция с двумя отдельными промоторами для каждого из генов: CMV для гена HGF и CAG для гена VEGF165. Использование двух отдельных кассет с собствен- ными энхансерами, промоторами и терминаторами транскрипции для каждого из ге- нов обеспечивает независимую экспрессию каждого из них. Результаты эксперимен- тов с вектором, выбранном в качестве прототипа - плазмидой N° 4, а также с заявля- емой конструкцией показали активность обоих промоторов как in vitro в клетках че- ловека, так и in vivo в эксплантной культуре мышц, полученной после инъекции плазмиды мышам. Однако, только использование заявляемого вектора обеспечивает продукцию белков HGF и VEGF165 в близком к эквимолярному соотношению с не- болыним преобладанием «активатора ангиогенеза» - фактора роста эндотелия сосу- дов. Все варианты векторов, основанные на отличных способах реализации, не поз- воляют достичь технического результата и не могут быть использованы для одно- временной экспрессии in vivo двух ангиогенных факторов роста (АФР) с одной гене- тической конструкции в достаточных количествах и в оптимальном соотношении.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Открытое общество с ограниченной ответственностью «Генная и клеточная тера- пня» (ООО «Г енная и клеточная терапия»)

<120> ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ АНГИОГЕНЕЗА

<160> SEQ ID NOH

<210> 1

<211 > 2187

<212> ДНК

<213> Кодон-оптимизированная последовательность Homo sapiens (human)

<223 > Нуклеотидная последовательность гена фактор роста гепатоцитов (hHGF)

<400> 1

1 ATGTGGGTGA CCAAGCTGCT GCCAGCCCTG CTGCTGCAGC ATGTCCTCCT 51 GCATCTCCTC CTGCTCCCCA TCGCCATCCC CTATGCAGAG GGACAAAGGA 101 AAAGAAGAAA ТАСААТТСАТ G A ATT С А А А А А АТ С AGC A A A GACCACCCTG 151 ATCAAGATCG ACCCCGCCCT GAAGATCAAG ACCAAAAAAG TGAATACTGC 201 AGACCAGTGT GCCAATAGAT GTACCAGGAA CAAGGGCCTG ССАТТСАСТТ 251 GCAAGGCTTT TGTTTTTGAT AAAGCAAGAA AACAATGCCT CTGGTTCCCC 301 TTCAATAGCA TGTCAAGTGG AGTGAAAAAA GAATTTGGCC ATGAATTTGA 351 CCTCTATGAA AACAAAGACT АС ATT AGAAA CTGCATCATT GGTAAAGGAC 401 GCAGCTACAA GGGAACAGTA ТСТАТСАСТА AGAGTGGCAT CAAATGTCAG 451 CCCTGGAGTT CCATGATACC ACACGAACAC AGCTTTCTGC CTTCCAGCTA 501 CCGGGGCAAG GACCTGCAGG AGAACTACTG CCGGAACCCT CGAGGGGAAG 551 AAGGGGGACC CTGGTGTTTC ACAAGCAATC CAGAGGTACG CTACGAAGTC 601 TGTGACATTC CTCAGTGTTC AGAAGTTGAA TGCATGACCT GCAATGGGGA 651 GAGTTATCGA GGTCTCATGG АТС AT АС AGA ATCAGGCAAG ATTTGTCAGC 701 GCTGGGATCA TCAGACACCA CACCGGCACA AATTCTTGCC TGAAAGATAT 751 CCCGACAAGG GCTTTGATGA TAATTATTGC CGCAATCCCG ATGGCCAGCC 801 GAGGCCATGG TGCTATACTC TTGACCCTCA CACCCGCTGG GAGTACTGTG 851 С A ATT А А А АС ATGCGCTGAC A AT ACT AT G A ATGACACTGA TGTTCCTTTG 901 GAAACAACTG AATGCATCCA AGGTCAAGGA GAAGGCTACA GGGGCACTGT 951 СААТАССАТТ TGGAATGGAA TTCCATGTCA GCGTTGGGAT TCTCAGTATC 1001 CTCACGAGCA TGACATGACT CCTGAAAATT TCAAGTGCAA GGACCTACGA 1051 GAAAATT ACT GCCGAAATCC AGATGGGTCT GAATCACCCT GGTGTTTTAC 1101 CACTGATCCA AACATCCGAG TTGGCTACTG CTCCCAAATT CCAAACTGTG

1151 ATATGTCACA T GG AC A AG AT TGTTATCGTG GG A AT GGC A A AAATTATATG 1201 GGC AACTT AT CCCAAACAAG AT CT GG ACT A ACATGTTCAA TGTGGGACAA 1251 G A AC AT GG A A GACTTACATC GTCATATCTT CTGGGAACCA GATGCAAGTA 1301 AGCTGAATGA GAATTACTGC CGAAATCCAG ATGATGATGC TCATGGACCC 1351 TGGTGCTACA CGGGAAATCC ACTCATTCCT TGGGATTATT GCCCTATTTC 1401 TCGTTGTGAA GGTGATACCA CACCTACAAT AGTCAATTTA GACCATCCCG 1451 TAATATCTTG TGCCAAAACG A A AC A ATT GC GAGTTGTAAA TGGGATTCCA 1501 AC AC G A AC A A ACATAGGATG GATGGTTAGT TTGAGATACA G A A AT A A AC A 1551 TATCTGCGGA GGATCATTGA TAAAGGAGAG TTGGGTTCTT ACTGCACGAC 1601 AGTGTTTCCC TTCTCGAGAC TTGAAAGATT ATGAAGCTTG GCTTGGAATT 1651 CATGATGTCC ACGGAAGAGG AG AT GAG A A A TGCAAACAGG TTCTCAATGT 1701 TTCCCAGCTG GTATATGGCC CTGAAGGATC AGATCTGGTT TTAATGAAGC 1751 TTGCCAGGCC TGCTGTCCTG GATGATTTTG TTAGTACGAT TGATTTACCT 1801 AATTATGGAT GCACAATTCC TGAAAAGACC AGTTGCAGTG TTTATGGCTG 1851 GGGCT AC ACT GGACTGATCA ACTACGACGG CCTGCTGCGG GTGGCCCACC 1901 TGTACATCAT GGGAAATGAG AAATGCAGCC AGCATCATCG AGGGAAGGTG 1951 ACTCTGAATG AGTCTGAAAT ATGTGCTGGG GCTGAAAAGA TTGGATCAGG 2001 ACCATGTGAG GGGGATTATG GTGGCCCACT TGTTTGTGAG CAACATAAAA 2051 TGAGAATGGT TCTTGGTGTC ATTGTTCCTG GTCGTGGATG TGCCATTCCA 2101 AATCGTCCTG GTATTTTTGT CCGAGTAGCA TATTATGCAA AATGGATCCA 2151 C A AG AT CAT C CTGACCTACA AGGTGCCACA GTCCTGA

<160> SEQ ID NO:2 <210> 2 <211> 576 <212> ДНК

<213> Кодон-оптимизированная последовательность Homo sapiens (human)

<223 > Нуклеотидная последовательность гена фактора роста эндотелия сосудов (hVEGF165)

<400> 2

1 ATGAACTTTC TGCTGAGCTG GGTCCACTGG TCACTGGCAC TGCTGCTGTA 51 TCTGCATCAC GCAAAATGGT CACAGGCCGC ACCTATGGCC GAGGGCGGAG 101 GGCAGAACCA CCATGAAGTG GTCAAGTTCA TGGACGTGTA CCAGAGATCA 151 TATTGTCACC CTATCGAGAC ACTGGTCGAC ATTTTCCAGG AATACCCAGA 201 TGAGATCGAA TATATCTTCA AGCCAAGCTG CGTGCCACTG ATGCGGTGCG 251 GCGGATGCTG TAACGATGAG GG ACT GG A AT GCGTCCCCAC CGAGGAATCT 301 AATATCACAA TGCAGATCAT GC G A ATT A AG CCTCACCAGG GGCAGCATAT 351 TGGCGAGATG AGTTTCCTGC AGCACAACAA ATGCGAGTGT AGGCCAAAGA 401 AAGACCGAGC TCGACAGGAG AATCCATGTG GACCTTGCTC TGAAAGGAGA 451 AAGCATCTGT TTGTGCAGGA CCCCCAGACT TGC AAGTGT A GCT GCA A A A A 501 TACCGATTCC AGGTGTAAGG CACGGCAGCT GG A ACT G A AT GAGCGGACCT 551 GTCGGTGTGA TAAGCCAAGA AG AT A A

<160> SEQ ID NO:3 <210> 3 <211> 229 <212> ДНК

<213 > искусственная последовательность: hybrid between chicken b-actin (CBA) and minute virus of mice (MMV) introns

<223 > Нуклеотидная последовательность гибридного (химерного) интрона <400> 3

1 GGAGTCGCTG CGACGCTGCC TTCGCCCCGT GCCCCGCTCC GCCGCCGCCT 51 CGCGCCGCCC GCCCCGGCTC TGACTGACCG CGTTACTCCC ACAGGTGAGC 101 GGGCGGGACG GCCCTTCTCC TCCGGGCTGT AATTAGCTGA GCAAGAGGTA 151 AGGGTTTAAG GGATGGTTGG TTGGTGGGGT ATTAATGTTT AATTACCTGG 201 AGCACCTGCC TGAAATCACT TTTTTTCAG

<160> SEQ ID NO:4 <210> 4 <211 > 82 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность insVEGF-f

<223 > Олигонуклеотид для вставки фосфор илированного дуплекса

<400> 4

1 CAT GAG АС A A TAACCCTGAT AAATGCTTCA ATaatcTCTA GAcacacaTC 51 CGGAGAAGAG CacacacacG CTCTTCAAAT CT

<160> SEQ ID NO:5 <210> 5 <211> 82 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность insVEGF-r

<223 > Олигонуклеотид для вставки фосфор илированного дуплекса

<400> 5

1 CATGAGATTT GAAGAGCgtg tgtgtGCTCT TCTCCGGAtg tgtgTCTAGA 51 gattATTGAA GCATTTATCA GGGTTATTGT CT

<160> SEQ ID NO:6 <210> 6 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 6

1 CCCAAGCTGG CT AGCGGC AT TCCGGTACTG TTGGT AAAGC CACCATGTGG 51 GTGACCAAGC TGCTGCCAGC CCTGCTGCT

<160> SEQ ID NO:7 <210> 7 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f2 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 7

1 GCAGCATGTC CTCCTGCATC TCCTCCTGCT CCCCATCGCC ATCCCCTATG 51 CAGAGGGACA AAGGAAAAGA AGAAATACA

<160> SEQ ID NO:8 <210> 8 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f3 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 8

1 ATTCATGAAT ТСААААААТС AGCAAAGACC ACCCTGATCA AGATCGACCC 51 CGCCCTGAAG ATCAAGACCA AAAAAGTGA

<160> SEQ ID NO:9 <210> 9 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f4 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 9

1 AT ACT GC AG A CCAGTGTGCC A AT AG AT GT A CCAGGAACAA GGGCCTGCCA 51 TTCACTTGCA AGGCTTTTGT TTTTGATAA

<160> SEQ ID NO: 10 <210> 10 <211> 79 <212> Д1Ж

<213> искусственная последовательность hHGFopt-f5 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 10

1 AGCAAGAAAA CAATGCCTCT GGTTCCCCTT C A AT AGC AT G TCAAGTGGAG 51 TGAAAAAAGA ATTTGGCCAT GAATTTGAC

<160> SEQ ID NO: 11 <210> 11 <211> 79 <212> Д1Ж

<213> искусственная последовательность hHGFopt-f6 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 11

1 CTCTATGAAA AC AAAGACT A CATTAGAAAC TGCATCATTG GTAAAGGACG 51 CAGCTACAAG GGAACAGTAT CTATCACTA

<160> SEQ ID NO: 12 <210> 12 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-f7 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 12

1 AGAGTGGCAT CAAATGTCAG CCCTGGAGTT CCATGATACC ACACGAACAC 51 AGCTTTCTGC CTTCCAGCTA CCGGGGCAA

<160> SEQ ID NO: 13 <210> 13 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f8 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 13

1 GGACCTGCAG GAG A ACT ACT GCCGGAACCC TCGAGGGGAA GAAGGGGGAC 51 CCTGGTGTTT CACAAGCAAT CCAGAGGTA

<160> SEQ ID NO: 14 <210> 14 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f9 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 14

1 CGCTACGAAG TCTGTGACAT TCCTCAGTGT TCAGAAGTTG AATGCATGAC 51 CTGCAATGGG GAGAGTTATC GAGGTCTCA

<160> SEQ ID NO: 15 <210> 15 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-flO <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 15

1 TGGATCATAC AGAATCAGGC AAGATTTGTC AGCGCTGGGA TCATCAGACA 51 CCACACCGGC ACAAATTCTT GCCTGAAAG

<160> SEQ ID NO: 16 <210> 16 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fll <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 16

1 ATATCCCGAC AAGGGCTTTG ATGATAATTA TTGCCGCAAT CCCGATGGCC 51 AGCCGAGGCC ATGGTGCTAT ACTCTTGAC

<160> SEQ ID NO: 17 <210> 17 <211> 79 <212> Д1Ж

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl2 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 17

1 ССТСАСАССС GCTGGGAGTA CTGTGCAATT AAAACATGCG CTGACAATAC 51 TATGAATGAC ACTGATGTTC CTTTGGAAA

<160> SEQ ID NO: 18 <210> 18 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl3 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 18

1 CAACTGAATG CATCCAAGGT CAAGGAGAAG GCTACAGGGG CACTGTCAAT 51 ACCATTTGGA ATGGAATTCC ATGTCAGCG

<160> SEQ ID NO: 19 <210> 19 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl4 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 19

1 TTGGGATTCT CAGTATCCTC ACGAGCATGA CATGACTCCT GAAAATTTCA 51 AGTGCAAGGA CCTACGAGAA AATTACTGC

<160> SEQ ID NO:20 <210> 20 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl5 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 20

1 CGAAATCCAG ATGGGTCTGA ATCACCCTGG TGTTTTACCA CTGATCCAAA 51 CATCCGAGTT GGCTACTGCT СССАААТТС

<160> SEQ ID NO:21 <210> 21 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl6 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 21

1 CAAACTGTGA TATGTCACAT GGACAAGATT GTTATCGTGG GAATGGCAAA

51 AATTATATGG GCAACTTATC CCAAACAAG <160> SEQ ID NO:22

<210> 22 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl7 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 22

1 AT СТ GG ACT A ACATGTTCAA TGTGGGACAA G A AC AT GG A A GACTTACATC 51 GTCATATCTT CTGGGAACCA GATGCAAGT

<160> SEQ ID NO:23 <210> 23 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl8 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 23

1 AAGCTGAATG AG A ATT ACT G CCGAAATCCA GATGATGATG CTCATGGACC 51 CTGGTGCTAC ACGGGAAATC CACTCATTC

<160> SEQ ID NO:24 <210> 24 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-fl9 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 24

1 CTTGGGATTA TTGCCCTATT TCTCGTTGTG AAGGTGAT AC CACACCTACA 51 ATAGTCAATT TAGACCATCC CGTAATATC

<160> SEQ ID NO:25 <210> 25 <211> 79 <212> ДНК <213> искусственная последовательность hHGFopt-f20 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 25

1 TTGTGCCAAA АС G А А АС A AT TGCGAGTTGT AAATGGGATT CCAACACGAA 51 CAAACATAGG ATGGATGGTT AGTTTGAGA

<160> SEQ ID NO:26 <210> 26 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- 121 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 26

1 Т АС AG A A AT A AACATATCTG CGGAGGATCA TTGATAAAGG AGAGTTGGGT 51 TCTTACTGCA CGACAGTGTT ТСССТТСТС

<160> SEQ ID NO:27 <210> 27 <211 > 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f22 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 27

1 GAGACTTGAA AGATT ATGAA GCTTGGCTTG G A ATT CAT G A TGTCCACGGA 51 AGAGGAGATG AGAAATGCAA ACAGGTTC

<160> SEQ ID NO:28 <210> 28 <211> 78 <212> Д1Ж

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f23 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 28

1 TCAATGTTTC CCAGCTGGTA TATGGCCCTG AAGGATCAGA TCTGGTTTTA 51 ATGAAGCTTG CCAGGCCTGC TGTCCTGG

<160> SEQ ID NO:29 <210> 29 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-f24 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 29

1 ATGATTTTGT TAGTACGATT GATTTACCTA ATTATGGATG CACAATTCCT 51 GAAAAGACCA GTTGCAGTGT TTATGGCT

<160> SEQ ID NO:30 <210> 30 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f25 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 30

1 GGGGCTACAC TGGACTGATC AACTACGACG GCCTGCTGCG GGTGGCCCAC 51 CTGTACATCA TGGGAAATGA GAAATGCA

<160> SEQ ID NOG 1 <210> 31 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f26 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 31

1 GCCAGCATCA TCGAGGGAAG GTGACTCTGA ATGAGTCTGA AATATGTGCT 51 GGGGCTGAAA AGATTGGATC AGGACCAT

<160> SEQ ID NO:32 <210> 32 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-f27 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 32

1 GTGAGGGGGA TTATGGTGGC CCACTTGTTT GTGAGCAACA Т AAAATGAGA 51 ATGGTTCTTG GTGTCATTGT TCCTGGTC

<160> SEQ ID NO:33 <210> 33 <211 > 80 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- 128 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 33

1 GTGGATGTGC САТТССАААТ CGTCCTGG TATTTTTGTC CGAGTAGCAT 51 ATT AT GC A A A ATGGATCCAC AAGATCATCC

<160> SEQ ID NO:34 <210> 34 <211 > 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt- f29 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 34

1 TGACCTACAA GGTGCCACAG TCCTGACTTA AGCTTGGTAC CGAGCTCGGA 51 TCCGCCCCTC ТСССТССССС ССССТАА

<160> SEQ ID NO:35 <210> 35 <211 > 39 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 35 1 TTAGGGGGGG GGGAGGGAGA GGGGCGGATC CGAGCTCGG

<160> SEQ ID NO:36 <210> 36 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r2 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 36

1 TACCAAGCTT AAGTCAGGAC TGTGGCACCT TGTAGGTCAG GATGATCTTG 51 TGGATCCATT TTGCATAATA TGCTACTCG

<160> SEQ ID NO:37 <210> 37 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r3 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 37

1 GAC АААААТ A CCAGGACGAT TTGGAATGGC ACATCCACGA CCAGGAACAA 51 TGACACCAAG ААССАТТСТС ATTTTATGT

<160> SEQ ID NO:38 <210> 38 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r4 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 38

1 TGCTCACAAA CAAGTGGGCC АССАТААТСС CCCTCACATG GTCCTGATCC 51 ААТСТТТТСА GCCCCAGCAC ATATTTCAG

<160> SEQ ID NO:39 <210> 39 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r5 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 39

1 ACTCATTCAG AGTCACCTTC CCTCGATGAT GCTGGCTGCA ТТТСТСАТТТ 51 CCCATGATGT ACAGGTGGGC CACCCGCAG

<160> SEQ ID NO:40 <210> 40 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-гб <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 40

1 CAGGCCGTCG TAGTTGATCA GTCCAGTGTA GCCCCAGCCA TAAACACTGC 51 AACTGGTCTT TTCAGGAATT GTGCATCCA

<160> SEQ ID NO:41 <210> 41 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r7 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 41

1 TAATTAGGTA AATCAATCGT ACT А АС A AAA TCATCCAGGA CAGCAGGCCT 51 GGCAAGCTTC АТТААААССА GATCTGATC

<160> SEQ ID NO:42 <210> 42 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r8 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 42 1 CTTCAGGGCC ATATACCAGC TGGGAAACAT TGAGAACCTG TTTGCATTTC

51 TCATCTCCTC TTCCGTGGAC ATCATGAAT

<160> SEQ ID NO:43 <210> 43 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r9 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 43

1 TCCAAGCCAA GCTTCATAAT CTTTCAAGTC TCGAGAAGGG A A AC ACT GT C 51 GTGCAGTAAG AACCCAACTC TCCTTTATC

<160> SEQ ID NO:44 <210> 44 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rlO <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 44

1 AATGATCCTC CGCAGATATG TTTATTTCTG TATCTCAAAC TAACCATCCA 51 TCCTATGTTT GTTCGTGTTG GAATCCCAT

<160> SEQ ID NO:45 <210> 45 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rll <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 45

1 TTACAACTCG CAATTGTTTC GTTTTGGCAC A AG AT ATT AC GGGATGGTCT 51 AAATTGACTA TTGTAGGTGT GGTATCACC

<160> SEQ ID NO:46 <210> 46 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl2 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 46

1 TTCACAACGA G A A AT AGGGC AATAATCCCA AGGAATGAGT GGATTTCCCG 51 TGTAGCACCA GGGTCCATGA GCATCATCA

<160> SEQ ID NO:47 <210> 47 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl3 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 47

1 TCTGGATTTC GGCAGTAATT CTCATTCAGC TTACTTGCAT CTGGTTCCCA 51 GAAGATATGA CGATGTAAGT CTTCCATGT

<160> SEQ ID NO:48 <210> 48 <211> 79 <212> Д1Ж

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl4 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 48

1 TCTTGTCCCA CATTGAACAT GTTAGTCCAG ATCTTGTTTG GGATAAGTTG 51 CCCATATAAT TTTTGCCATT CCCACGATA

<160> SEQ ID NO:49 <210> 49 <211> 79 <212> Д1Ж

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl5 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 49

1 ACAATCTTGT CCATGTGACA TATCACAGTT TGGAATTTGG GAGCAGTAGC 51 CAACTCGGAT GTTTGGATCA GTGGTAAAA

<160> SEQ ID NO:50 <210> 50 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl6 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 50

1 CACCAGGGTG ATTCAGACCC ATCTGGATTT CGGCAGTAAT TTTCTCGTAG 51 GTCCTTGCAC TTGAAATTTT CAGGAGTCA

<160> SEQ ID NO:51 <210> 51 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl7 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 51

1 TGTCATGCTC GTGAGGATAC TGAGAATCCC AACGCTGACA TGGAATTCCA 51 TTCCAAATGG TATTGACAGT GCCCCTGTA

<160> SEQ ID NO:52 <210> 52 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl8 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 52

1 GCCTTCTCCT TGACCTTGGA TGCATTCAGT TGTTTCCAAA GGAACATCAG 51 TGTCATTCAT AGTATTGTCA GCGCATGTT

<160> SEQ ID NO:53 <210> 53 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-rl9 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 53

1 TTAATTGCAC AGTACTCCCA GCGGGTGTGA GGGTCAAGAG TATAGCACCA 51 TGGCCTCGGC TGGCCATCGG GATTGCGGC

<160> SEQ ID NO:54 <210> 54 <211> 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r20 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 54

1 ААТ ААТТ АТС ATCAAAGCCC TTGTCGGGAT ATCTTTCAGG CAAGAATTTG 51 TGCCGGTGTG GTGTCTGATG ATCCCAGCG

<160> SEQ ID NO:55 <210> 55 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r21 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 55

1 CTGACAAATC TTGCCTGATT CTGTATGATC CATGAGACCT CGATAACTCT 51 CCCCATTGCA GGTCATGCAT ТСААСТТСТ

<160> SEQ ID NO:56 <210> 56 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r22 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 56

1 GAACACTGAG GAATGTCACA GACTTCGTAG CGTACCTCTG GATTGCTTGT 51 GAAACACCAG GGTCCCCCTT СТТССССТС

<160> SEQ ID NO:57 <210> 57 <211 > 79 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r23 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 57

1 GAGGGTTCCG GCAGTAGTTC TCCTGCAGGT CCTTGCCCCG GTAGCTGGAA 51 GGCAGAAAGC TGTGTTCGTG TGGTATCAT

<160> SEQ ID NO:58 <210> 58 <211 > 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r24 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 58

1 GGAACTCCAG GGCTGACATT TGATGCCACT CTTAGTGATA GATACTGTTC 51 CCTTGTAGCT GCGTCCTTTA CCAATGAT

<160> SEQ ID NO:59 <210> 59 <211 > 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r25 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 59 1 GCAGTTTCTA ATGTAGTCTT TGTTTTCATA GAGGTCAAAT TCATGGCCAA

51 ATTCTTTTTT CACTCCACTT GACATGCT

<160> SEQ ID NO:60 <210> 60 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r26 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 60

1 ATTGAAGGGG AACCAGAGGC ATTGTTTTCT TGCTTTATCA AAAACAAAAG 51 CCTTGCAAGT GAATGGCAGG CCCTTGTT

<160> SEQ ID NO:61 <210> 61 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r27 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 61

1 CCTGGTACAT CTATTGGCAC ACTGGTCTGC AGTATTCACT TTTTTGGTCT 51 TGATCTTCAG GGCGGGGTCG ATCTTGAT

<160> SEQ ID NO:62 <210> 62 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r28 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 62

1 CAGGGTGGTC TTTGCTGATT TTTTGAATTC ATG AATTGT A TTTCTTCTTT 51 TCCTTTGTCC CTCTGCATAG GGGATGGC

<160> SEQ ID NO: 63 <210> 63 <211> 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r29 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 63

1 GATGGGGAGC AGGAGGAGAT GCAGGAGGAC ATGCTGCAGC AGCAGGGCTG 51 GCAGCAGCTT GGTCACCCAC ATGGTGG

<160> SEQ ID NO:64 <210> 64 <211> 39 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hHGFopt-r30 <223 > Олигонуклеотид для сборки hHGFopt <400> 64

1 СТТТАССААС AGTACCGGAA TGCCGCTAGC CAGCTTGGG

<160> SEQ ID NO:65 <210> 65 <211 > 55 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<223 > Праймер для амплификации С AG- промотора

<400> 65

1 CCACCGtcta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 51 gctga

<160> SEQ ID NO: 66 <210> 66 <211> 74 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<223 > Праймер для амплификации С AG- промотора <400> 66

1 CCACCGTCCG GAATGCCctg aaaaaaagtg atttcaggca ggtgctccag 51 gtaattaaac attaataccc cacc

<160> SEQ ID NO:67 <210> 67 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-fl <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 67

1 CCACCAGCTC TTCCCGGTAC TGTTGGTAAA GCCACCATGA ACTTTCTGCT 51 GAGCTGGGTC CACTGGTCAC TGGCACTG

<160> SEQ ID NO:68 <210> 68 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-f2 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 68

1 CTGCTGTATC TGCATCACGC AAAATGGTCA CAGGCCGCAC CT ATGGCCGA 51 GGGCGGAGGG CAGAACCACC ATGAAGTG

<160> SEQ ID NO: 69 <210> 69 <211> 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-f3 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 69

1 GTCAAGTTCA TGGACGTGTA CCAGAGATCA TATTGTCACC CTATCGAGAC

51 ACTGGTCGAC ATTTTCCAGG AATACCCA <160> SEQ ID NO:70

<210> 70 <211> 78 <212> ДНК

<213 > искусственная последовательность hVEGF165-f4 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 70

1 GATGAGATCG ААТАТАТСТТ CAAGCCAAGC TGCGTGCCAC TGATGCGGTG 51 CGGCGGATGC TGTAACGATG AGGGACTG

<160> SEQ ID NO:71 <210> 71 <211 > 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-f5 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 71

1 GAATGCGTCC CCACCGAGGA АТСТААТАТС ACAATGCAGA TCATGCGAAT 51 TAAGCCTCAC CAGGGGCAGC ATATTGGC

<160> SEQ ID NO:72 <210> 72 <211 > 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-f6 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 72

1 GAGATGAGTT TCCTGCAGCA CAACAAATGC GAGTGTAGGC CAAAGAAAGA 51 CCGAGCTCGA CAGGAGAATC CATGTGGA

<160> SEQ ID NO:73 <210> 73 <211 > 78 <212> ДНК <213> искусственная последовательность hVEGF165-f7 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 73

1 CCTTGCTCTG AAAGGAGAAA GCATCTGTTT GTGCAGGACC CCCAGACTTG 51 CAAGTGTAGC TGCAAAAATA CCGATTCC

<160> SEQ ID NO:74 <210> 74 <211 > 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-f8 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 74

1 AGGTGTAAGG CACGGCAGCT GGAACTGAAT GAGCGGACCT GTCGGTGTGA 51 TAAGCCAAGA AGATAAGTTT AAACCCG

<160> SEQ ID NO:75 <210> 75 <211 > 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-f9 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 75

1 CTGATCAGCC TCGACTTCGA GCAGACGCTT CGAGCAGACA TGATAAGATA 51 CATTGATGAG TTTGGACAAA ССАСААС

<160> SEQ ID NO:76 <210> 76 <211 > 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-fl0 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 76

1 TAGAATGCAG TGAAAAAAAT GCTTTATTTG TGAAATTTGT GATGCTATTG 51 CTTTATTTGT AACCATTATA AGCTGCA

<160> SEQ ID NO:77 <210> 77 <211> 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-fll <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 77

1 AT А А АС A AGT Т А АС А АС А АС AATTGCATTC ATTTTATGTT TCAGGTTCAG 51 GGGGAGATGT GGGAGGTTTT TTAAAGC

<160> SEQ ID NO:78 <210> 78 <211 > 76 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-fl2 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 78

1 AACACGTGCT ААААСТТСАТ ТТТТААТТТА AAAGGATCTA GGTGAAGATC 51 CTTTTTGATA ATAGAAGAGC TGGTGG

<160> SEQ ID NO:79 <210> 79 <211 > 39 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-rl <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 79

1 CCACCAGCTC ТТСТАТТАТС AAAAAGGATC TTCACCTAG

<160> SEQ ID NO:80 <210> 80 <211 > 78 <212> ДНК <213> искусственная последовательность hVEGF165-r2 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 80

1 АТССТТТТАА ATT A A A A AT G AAGTTTTAGC ACGTGTTGCT ТТ А А А А А АСС 51 ТСССАСАТСТ CCCCCTGAAC CTGAAACA

<160> SEQ ID NO:81 <210> 81 <211 > 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-r3 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 81

1 TAAAATGAAT GCAATTGTTG TTGTTAACTT GTTTATTGCA GCTTATAATG 51 GTTACAAATA AAGCAATAGC АТСАСААА

<160> SEQ ID NO:82 <210> 82 <211 > 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-r4 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 82

1 ТТТСАСАААТ AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA 51 ААСТСАТСАА TGTATCTTAT CATGTCTG

<160> SEQ ID NO:830 <210> 83 <211 > 78 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-r5 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 83

1 CTCGAAGCGT CTGCTCGAAG TCGAGGCTGA TCAGCGGGTT ТАААСТТАТС 51 TTCTTGGCTT ATCACACCGA CAGGTCCG

<160> SEQ ID NO:84 <210> 84 <211> 76 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-r6 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 84

1 CTCATTCAGTTC CAGCTGCCGT GCCTTACACC TGGAATCGGT ATTTTTGCAG 51 CTACACTTGC AAGTCTGGGG GTCCTG

<160> SEQ ID NO:85 <210> 85 <211> 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-r7 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 85

1 CACAAACAGA TGCTTTCTCC TTTCAGAGCA AGGTCCACAT GGATTCTCCT 51 GTCGAGCTCG GTCTTTCTTT GGCCTAC

<160> SEQ ID NO:86 <210> 86 <211> 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-r8 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 86

1 ACTCGCATTT GTTGTGCTGC AGGAAACTCA TCTCGCCAAT ATGCTGCCCC 51 TGGTGAGGCT TAATTCGCAT GATCTGC

<160> SEQ ID NO:87 <210> 87 <211> 77 <212> ДНК

<213 > искусственная последовательность hVEGF165-r9 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 87

1 ATTGTGATAT TAGATTCCTC GGTGGGGACG CATTCCAGTC CCTCATCGTT 51 ACAGCATCCG CCGCACCGCA TCAGTGG

<160> SEQ ID NO:88 <210> 88 <211 > 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-rl0 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 88

1 CACGCAGCTT GGCTTGAAGA TATATTCGAT CTCATCTGGG TATTCCTGGA 51 AAATGTCGAC CAGTGTCTCG ATAGGGT

<160> SEQ ID NO:89 <210> 89 <211 > 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-rll <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 89

1 GACAATATGA TCTCTGGTAC ACGTCCATGA ACTTGACCAC TTCATGGTGG 51 TTCTGCCCTC CGCCCTCGGC CATAGGT

<160> SEQ ID NO:90 <210> 90 <211 > 77 <212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-rl2 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 90 1 GCGGCCTGTG ACCATTTTGC GTGATGCAGA TACAGCAGCA GTGCCAGTGA

51 CCAGTGGACC CAGCTCAGCA GAAAGTT

<160> SEQ ID NO:91 <210> 91 <211> 39

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность hVEGF165-rl3 <223 > Олигонуклеотид для сборки hVEGF165 <400> 91 1 CATGGTGGCT ТТ ACC А АС AG TACCGGGAAG AGCTGGTGG