Genetische Transformation von Ciliatenzellen durch Microcarrier-Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression einer heterologen DNA in einem neuen Expressionssystem bzw. Wirt.

Ciliaten sind einzellige, tierische Eukaryonten. Sie besitzen fast alle typischen Eigenschaften eukaryontischer Zellen und bieten gleichzeitig den Vorteil, daß sie ähnlich wie Prokaryonten kultiviert werden können. Das bedeutet, daß man genetisch identische Klone ausgehend von einzelnen Zellen durch vegetative Vermehrung heranziehen kann. Dabei sind bei einigen Arten sehr hohe Zelldichten in kontinuierlicher oder Batch-Kultur erzielbar. Zudem können sich Ciliaten wie die meisten Eukaryonten sexuell fortpflanzen. Die sexuelle Fortpflanzung, bei den Ciliaten Konjugation genannt, kann man induzieren, indem man Zellen unterschiedlichen Paarungstyps (Paarungstypen sind "multiple Geschlechter") unter geeigneten Bedingungen zusammenbringt. Diese Eigenschaft bietet den Vorteil, daß man Ciliaten wie höhere Eukaryonten kreuzen kann und dadurch z.B. Stämme erzeugen kann, die für ausgewählte Merkmale homozygot sind.

Zusätzlich zu den für die meisten Eukaryonten typischen Merkmalen besitzen Ciliaten eine Anzahl von strukturellen und funktioneilen Besonderheiten, die sie sowohl für die zellbiologische Grundlagenforschung als auch für biotechnologische Anwendungen besonders geeignet machen. So findet man in fast allen Ciliatenzellen zwei unterschiedlich differenzierte Typen von Zellkernen: kleine, transkriptionsinaktive, meist diploide Mikronuclei und meist sehr große, DNA-reiche Makronuclei. Die Mikronuclei haben hauptsächlich generative Funktionen, das heißt, im Verlauf der Konjugation entstehen aus ihnen durch Meiose haploide Gametenkerne. Die Gametenkerne von zwei Konjugationspartnern können zu Zygotenkernen verschmelzen und eine neue Zellgeneration mit genetisch rekombinierten Mikronucleusgenomen entstehen lassen. Aus den Zygotenkernen

der neuen Generation gehen durch Teilung durch neue Makronuclei hervor. Die Makronuclei steuern alle somatischen Vorgänge der Zellen. Ihr Genom wird permanent transkribiert. Im Verlauf der Makronucleusentwicklung laufen vielfach drastische Eliminations- und Reorganisationsvorgänge im Genom ab. Bei einigen Arten werden bis zu 98 % des Mikronucleusgenoms eliminiert, intervenierende Sequenzen werden aus Genen herausgeschnitten und codierende Regionen können völlig neu rearrangiert werden ("gane scrambling"). Bei allen daraufhin untersuchten Ciliaten liegen die Gene im Makronucleus mehr oder weniger stark amplifiziert vor. Die Kopieπzahlen können je nach betrachtetem Gen und Ciliatenart bis zu mehreren Millionen betragen.

Die molekularbiologischen Besonderheiten der Ciliatengenome haben in der jüngsten Vergangenheit zu einigen aufsehenerregenden Entdeckungen geführt. So wurden z.B. die selbst-spleißenden Introns (Ribozyme) zuerst in hochamplifizierten Ciliatengenen gefunden (Cech, T.R., B.L. Bass (1986): Ann. Rev. Biochem. 55, 599- 629). Ebenso wurde die Struktur von Telomeren, den Endstrukturen linearer DNA- Moleküle und der sie synthetisierenden Telomeraseπ zuerst bei Ciliaten aufgeklärt (Blackbum, E.H. (1991 ): Nature 350, 569-573). Es zeigte sich später, daß diese grundlegenden Vorgänge und Strukturen, die aufgrund der besonderen Genomstruktur zunächst bei Ciliaten entdeckt wurden, auch für fast alle anderen Eukaryonten charakteristisch sind, dort nur viel schwerer zu entdecken und zu untersuchen sind.

Die skizzierten Besonderheiten der Ciliaten lassen ihre Verwendung auch für biotechnologische Zwecke besonders lohnend erscheinen. Kurz zusammengefaßt stützen die folgenden Gründe diese Annahme:

1. Ciliaten sind einzellige Eukaryonten, die sich in klonalen Kulturen wie prokaryontische Mikroorganismen in hoher Zelldichte bei relativ kurzen Generationszeiten heranziehen lassen.

2. Ihre Zellen weisen fast alle eukaryontischen Eigenschaften auf, die Prokaryonten fehlen, z.B. im Bereich der DNA-Repiikation, der Transkription und des Processings, der Translation, der Cytoskelett- und Membranstrukturen, der Endo- und Exocytosevorgänge u.a..

3. Da Ciliaten hochentwickelte, spät vom gemeinsamen Stammbaum abzweigende Eukaryonten sind, weisen ihre Enzyme, Struktur- und Membranproteine sowie ihre Stoffwechselwege viel höhere Ähnlichkeit mit den entsprechenden Strukturen und Vorgängen bei vielzelligen Eukaryonten (z.B. Mensch) auf als das bei vergleichbaren Strukturen und Vorgängen von Prokaryonten (Bakterien) der Fall ist, sofern homologe Elemente dort überhaupt vorkommen.

4. In den somatischen Makronucleusgenomen der meisten Ciliatenarten liegen alle Gene mehr oder weniger stark amplifiziert vor, was zu einer hohen Expressionsrate schon unter normalen Bedingungen führt. Der Grad der Amplifikation mancher Gene kann durch geeignete Maßnahmen erhöht werden.

Das biotechnologische Potential, das die Ciliaten für die Gewinnung zelleigener oder heterologer Produkte bieten können, ist bisher noch kaum erkannt und Versuche zu seiner Nutzung sind noch in der Labortestphase. Erste, erfolgsversprechende Ansätze zur Produktion und Gewinnung zelleigener Stoffe aus Ciliaten in größerem Maßstab wurden erst vor kurzem publiziert (Kiy, T., A. Tiedtke (1991 ): Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 14-18; Kiy, T., G. Scheidgen- Kleybold, A. Tiedtke (1996): Enzyme and Microbial Technology 18, 268-274).

Die Expression heterologer Gene oder modifizierter, arteigener Gene scheiterte bisher hauptsächlich daran, daß die üblichen Methoden, die zur Transformation von Eukaryonten zu Verfügung stehen, bei Ciliaten nur in wenigen Ausnahmefällen zu ausreichend hohen Transformationsraten führten (Gaertig, J., M. Goravsky (1992): Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 9196-9200). Außerdem standen bisher kaum geeignete Selektionsmarker für Transformationsversuche mit Ciliaten zu Verfügung,

da einige Markersysteme, die allgemein für Eukaryontentransformationen erfolgreich eingesetzt werden, sich bei Ciliaten offenbar nicht anwenden ließen (Wünning, I.U., Lipps, H.J. (1983): EMBO J.2, 1753-1757; Meyers, G., E. Helftenbein (1988): Gene 63, 31-40).

Ein Grund für die Schwierigkeiten, Ciliaten erfolgreich zu transformieren, liegt vermutlich darin, daß die Zellen von einer komplexen und stabilen Cortexstruktur umgeben sind.

Seit kurzem ist es bekannt, daß man Pflanzenzellen, die von einer festen und starren Zellwand umgeben sind, mit der Methode des Microcarrierbombardements sehr effektiv transformieren kann (Boynton, J.E., N.W. Gillham, E.H. Harris, J.P. Hosler, A.M. Johnson, A.R. Jones, B.L. Randolp-Anderson, D. Robertson, T.M. Klein, K.B. Shark, J.C. Sanford (1988): Science 240, 1534-1537; Klein, T.M., L. Kornstein, J.C. Sanford, M.E. Fromm (1989): Plant Physiol. 91 , 440-444; Klein, T.M., E.D. Wolf, R. Wu, J.C. Sanford (1987): Nature 327, 70-73). Diese biolistische Methode ist mittlerweile optimiert worden (Sanford, J.C, F.D. Smith, J.A. Russell (1993): Meth. Enzymol. 217, 483-509) und wurde auch erfolgreich zur Transformation von Säugerzellen (Fitzpatrick-McElligott, S. (1992): Bio/Technology 10, 1036-1040) und Seeigeleiern (Akasaka, K., A. Nishimura, K. Hijikata, Y. Luchi, J. Morokuma, M. Takahashi, H. Morikawa, H. Shimada (1995): Molecular Marine Biology and Biotechnology 4(3), 255-261) eingesetzt. Die Besonderheit dieser Transformationsmethode erlaubt es sogar, intrazelluläre Kompartimente wie z.B. Chloroplasten oder Mitochondiren zu transformieren (Boynton, J.E., N.W. Gillham, E.H. Harris, J.P. Hosler, A.M. Johnson, A.R. Jones, B.L. Randolph-Anderson, D. Robertson, T.M. Klein, K.B. Shark, J.C. Sanford (1988): Science 240, 1534-1537; Johnston, S.A., P.Q. Anziano, K. Shark, J.C. Sanford, R.A. Butow (1988) Science 240, 1538-1541 ).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Expression einer heterologen DNA in einem neuen Expressionssystem bzw. Wirt bereitzustellen.

Die Aufgabe wird gelost durch die unabhängigen Ansprüche 1 und 17 und im besonderen durch die bevorzugten Ausgestaltungen der Unteranspruche 2 bis 16

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression einer heterologen DNA in einem Expressionsystem, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionssystem transformierte Ciliatenzellen verwendet werden

2 Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe DNA- Sequenz ein Gen ist

3 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Sequenz menschlichen Ursprungs ist

4 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA tierischen Ursprungs ist

5 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA pflanzlichen Ursprungs ist

6 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA bakteriellen Ursprungs ist

7 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA pilzlichen Ursprungs ist

8 Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, bestehend unter anderem aus den Schritten

a) Herstellung eines Expressionsvektors, der die folgenden DNA-Teilsequenzen enthalt

i) einen Promotor, der in Ciliaten aktiv ist und die Transkription der zu exprimierenden heterologen DNA bewirkt;

ii) die mit dem Promotor in sens-Orientierung verbundene zu exprimierende heterologe DNA;

iii) ein die Transkription beendendes Terminierungssignal, das in Ciliaten aktiv ist;

iv) wahlweise einen geeigneten ori (origin of relication = Ursprung der Replikation), der die Vermehrung des Vektors in der Wirtszelle bewirkt; und

b) Transformation der Ciliatenzellen mit dem Expressioπsvektor gemäß Schritt

(a).

9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ciliatenzellen mittels der Methode des Microcarrier- Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln transformiert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transformation der Ciliatenzellen das Plasmid pRT103gus verwendet wird, welches die heterologe DNA enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaic-Virus, die kodierende Region der heterologen DNA und ein Polyadenylierungssignal enthält.

12. Verfahren nach einem oder mehreren r<er Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Ciliatenzellen ausgewählt sind aus der Gruppe Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia und Suctoria.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Ciliatenzellen

ausgewählt sind aus der Gruppe Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Colpoda, Glaucoma, Platyophrya, Vorticella, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia

14 Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Expressionssystem Zellen der Ciliatenart Stylonychia lemnae verwendet werden

15 Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die heterologe DNA in vitro modifiziert wurde

16 Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Expessionsprodukt ein Protein ist

17 Ciliat, erhältlich durch Transformation mit heterologer DNA

18. Ciliat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mittels der Methode des Microcarrier-Bombardement mit DNA beladenen Goldpartikeln durchgeführt wurde

19 Ciliat nach Anspruch 17 oder 18, erhaltlich durch die folgenden Verfahrensschritte

a) Herstellung eines Expressionsvektors, der die folgenden DNA-Teilsequenzen enthalt

i) einen Promotor, der in Ciliaten aktiv ist und die Transskription der zu expπmierenden heterologen DNA bewirkt,

n) die mit dem Promotor in sens-Oπentierung verbundene zu expπmierende heterologe DNA,

in) ein die Transskription beendendes Termmierungssignal, das in Ciliaten aktiv ist,

iv) wahlweise einen geeigneten ori (origin of relication = Ursprung der

Replikation), der die Vermehrung des Vektors in der Wirtszelle bewirkt; und

b) Transformation der Ciliatenzellen mit dem Expressionsvektor gemäß Schritt (a).

20. Ciliat nach einem oder mehreren der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß er mit dem die heterologen DNA enthaltendenPlasmid pRT103gus transformiert wurde.

21. Ciliat nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid den 35-S- Promotor des Cauliflower-Mosaic-Virus, die kodierende Region der heterologen DNA und ein Polyadenylierungssignal enthält.

22. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor zusätzlich noch eine Signalsequenz enthält, welche zum Ausschleusen des Genprodukts aus der Zelle führt.

23. Ciliat nach nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor zusätzlich noch eine Signalsequenz enthält, welche zum Ausschleusen des Genprodukts aus der Zelle führt.

Mit dem nachfolgend beschriebenen Versuchsansatz wurde die Methode des Microcarrier-Bombardements mit DNA beladenen Goldpartikeln zum ersten Mal zur Transformation von Ciliatenzellen angewendet. Die Versuchsergebnisse zeigen, daß mit dieser Methode, angewendet mit dem Heliumgas-betriebenen Gerät der Fa. Biorad, eine sehr einfache und effektive Transformation von Ciliatenzellen möglich ist. Der Versuch zeigt außerdem, daß das verwendete heterologe Gen nach der Transformation in den Ciliatenzellen zu einem funktionsfähigen Genprodukt exprimiert wurde. Damit bietet diese Methode die Möglichkeit, Ciliaten wirkungsvoll für biotechnologische Zwecke sowohl mit heterologen ("fremden") als auch mit ggf. gentechnisch veränderten homologen Genen zu transformieren. Daraus folgt, daß durch die Anwendung dieser Transformationstechnik die eingangs erwähnten,

vorteilhaften molekularbiologischen Besonderheiten der Ciliaten erstmals in größerem Maßstab für biotechnologische Anwendungen ausgenutzt werden können.

Beispiele:

1. DNA-Präzipitation auf die Microcarrierpartikel

Goldpartikel (1 ,6 μm Durchmesser) werden zu 40 mg/ml in Wasser suspendiert. Von der Partikelsuspension werden 25 μl mit 5 μl DNA-Lösung (Konz. 1 μg/μl in TE-Puffer), 25 μl 2,5 M CaCI ₂ -Lösung, 20 μl 0,1 M Spermidinlösung unter Vortaxen gemischt. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min werden die Partikel durch Zentrifugieren in der Minifuge (12000 rpm) sedimentiert. 50 μl des Überstandes werden abgenommen und verworfen, der Rest wird resuspendiert. Davon werden 3 μl auf die Membran (rupture disk) für das Bombardement pipettiert.

2. Verwendetes Markerplasmid

Für die Transformation wurde das Plasmid pRT103gus benutzt. Es trägt eine Ampicillinresistenz, den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaic-Virus, die codierende Region des ß-Glucuronidase-Gens von E. coli und ein Polyadenylierungssignal und wird erfolgreich zur Transformation von Pflanzen eingesetzt.

3. Transformation und verwendeter Organismus

Die Transformation wurde mit dem BIOLISTIC Particle Delivery System (PDS-1 000/He) der Firma BIO-RAD durchgeführt.

Für die Transformationsexperimente wurden Zellen der Ciliatenart Stylonychia lemnae (Ciliate, Hypotrichida), Stamm Do-6/E benutzt. Die Zellen hatten vor dem Experiment einen Tag lang gehungert. Sie wurden auf Nylongaze mit 30 μm Maschenweite konzentriert und mit der geringstmöglichen Menge Kulturmedium (Pringsheim's Lösung) unmittelbar vor dem Versuch in eine Plastikpetrischale gespült. Die Schale mit den

konzentrierten Zellen wurde auf den Boden der Kammer des Transformationsgeräts gestellt. Das Bombardement erfolgte aus dem größtmöglichen Abstand, den das Gerät erlaubt. Es wurde ein Burst-Druck von 450 psi und die entsprechende "rupture disk" verwendet. Sofort nach dem Bombardement wurden die Zellen in Kulturmedium verdünnt und schwach mit Futterorganismen (Chlorogonium elongatum) angefüttert.

4. Nachweis der Glucuronidase-Aktivität

Als Substrat für die Glucuronidase werden 25 mg 5-Brom-4-chlor-3-indolyl- glucuronid in 4 ml DMSO und 40 ml 10 mM EDTA, 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 7.0, 0,1 % Triton gelöst. Die transformierten Ciliatenzellen wurden zwei Tage nach dem Transformationsexperiment durch Filtration auf einem Filter gesammelt. Die Filter mit den Ciliatenzellen wurden in der Substratlösung bei 32°C inkubiert. Durch die Triton-haltige Lösung werden die Zellen partiell lysiert. Zellen, die das transformierte Glucuronidase-Gen exprimieren, sind nach kurzer Zeit an einer deutlichen Blaufärbung zu erkennen. Nicht-transformierte, aber ansonsten gleich behandelte Kontrolzellen zeigen auch nach mehrstündiger Inkubation keine Blaufärbung.