Das Endometriumkarzinom ist die häufigste gynäkologische Krebserkrankung in der westlichen Welt. In den meisten Fällen wird ein Endometriumkarzinom in einem frü- hen Stadium diagnostiziert, so daß ein operativer Eingriff oder eine Chemotherapie recht gute Heilungschancen bringen. Steroid-Rezeptor negative Tumore bei älteren Frauen oder spätere Krebsstadien haben sehr ungünstige Prognosen. Bisher exi- stiert keine Therapie um diese ungünstigen Prognosen zu verbessern.

Ovarialtumore treten seltener auf, haben aber sehr viel ungünstigere Prognosen und führen häufig zum Tod. Das Ovarialkarzinom tritt zwar relativ selten auf, verursacht aber mehr Todesfälle als alle übrigen gynäkologischen Karzinome zusammenge- nommen. Effektive Operationstechniken und Chemotherapieverfahren sind zwar eta- bliert, aber für fortgeschrittene Stadien oder für Rückfälle gibt es kaum Heilung- schancen.

Das Mammakarzinom ist eine der häufigsten malignen Erkrankungen der Frau. Etwa 10% aller Frauen erkranken während ihres Lebens an Brustkrebs, was ungefähr 25% aller Krebstodesfälle der Frau entspricht. In den letzten 10 Jahren hat die gesamte Behandlung, sowohl die operative als auch die medikamentöse Therapie eine we- sentliche Veränderung erfahren. Dies führte trotz leicht ansteigender Tendenz der Brustkrebsrate, zwar zu einem Rückgang der Gesamtsterblichkeit dieser Erkrankung, aber für fortgeschrittene Stadien oder für Rückfälle gibt es auch beim Mammakarzi- nom wenig Heilungschancen.

Sowohl für das Endometriumkarzinom, das Ovarialkarzinom als auch für das Mamm-

akarzinom werden neue, gut verträgliche und vor allem effizientere Therapien benö- tigt.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Mittel für die Behandlung der o. a. Tumor- arten zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung eines Nukleinsäurekonstruktes, welches ein therapeutisches Gen, dessen Genprodukt in einer Zelle die Erzeugung eines zytotoxischen Wirkstoffs auslöst, unter Kontrolle eines Nukleus-Faktor-kappa- B- (NFB) -spezifischen Promotors enthält. Bei der Tumorbehandlung wird dieses Konstrukt mit gentherapeutischen Mitteln in Tumorzielzellen eingeschleust, wobei das genaue Verfahren nachfolgend noch näher beschrieben wird.

Über 80% der Endometrium-und Ovarialkarzinome sowie über 50% der Mammakar- zinome exprimieren das Gonadotropin Releasing Hormon (GnRH) und seinen Re- zeptor als Teil eines autokrinen Regulationsmechanismus der Zellproliferation, der Wachstums-und Differenzierungskontrolle. Dagegen exprimieren nur wenige repro- duktive Organe sowie Hypothalamus und Hypophyse den GnRH Rezeptor. Daher eignet sich der GnRH Rezeptor besonders gut als Target für eine tumorzellspezifi- sche Therapie.

Die Signaltransduktion des GnRH Rezeptors in gynäkologischen Tumoren unter- scheidet sich grundsätzlich von derjenigen in Hypothalamus und Hypophyse (Gründ- ker et al. 2002). GnRH und seine Analoga induzieren nur in Endometrium-und Ova- rialkarzinomzellen GnRH Rezeptor vermittelt einen 5-bis 8-fachen Anstieg der Akti- vität des Transkriptionsfaktors Nukleus Faktor B (NFB).

Die GnRH-induzierte NFB Aktivierung wird nun erfindungsgemäß dazu genutzt, ein eingebrachtes Effektorgen (im weiteren auch als therapeutisches Gen bezeichnet) unter Kontrolle eines NFB-abhängigen Promotors tumorzellspezifisch zu exprimieren.

Dazu werden die Tumorzellen mit einem Nukleinsäurekonstrukt, das das Effektor- Gen unter Kontrolle des NFB-Promotors vorzugsweise in einem Vektor enthält,

transfiziert. Anschließend kann dieses Gen zielzellspezifisch durch die Aktivierung von NFB durch GnRH-Analoga aktiviert werden, so daß nur in GnRH-Rezeptor tra- genden Tumorzellen ein inaktiver Wirkstoff-Vorläufer (Pro-Drug) zu einem zytotoxi- schen Wirkstoff umgesetzt und somit eine zielzellspezifische zytotoxische Therapie ermöglicht wird.

Der proof of principle für diesen Ansatz konnte erbracht werden. In in vivo Versuchen mit tumortragenden Nacktmäusen, die liposomal mit dem Reportergen LacZ unter Kontrolle des NFB-Promotors intraperitoneal transfiziert wurden, konnte gezeigt wer- den, daß NFB durch das GnRH Analogon Triptorelin nur in GnRH Rezeptor positiven Tumorzellen aktiviert wurde. In Ovar und Uterus war NFB konstitutiv aktiv. Ovar und Uterus werden aber bei entsprechenden Karzinomen vorher entfernt. Alle anderen Organe zeigten keine Aktivierung.

Diese Therapieform kann bei allen GnRH Rezeptor exprimierenden Karzinomen an- gewendet werden. Dazu gehören neben den schon erwähnten Endometrium-, Ovari- al- (> 80% der Tumore exprimieren den GnRH Rezeptor) und Mammakarzinomen (> 50% der Tumore exprimieren den GnRH Rezeptor) auch Prostatakarzinome. Für letztere sind noch keine genaueren Zahlen bekannt, wieviel Prozent dieser Tumore den GnRH-Rezeptor exprimieren.

Grundsätzlich muss das therapeutische Gen innerhalb des erfindungsgmäßen Kon- strukts in der Lage sein, in der Zielzelle die Erzeugung einer zytotoxischen Substanz, d. h. eines zytotoxischen Wirkstoffs auf irgendeine Weise auszulösen. Im allgemeinen wird dies dadurch bewirkt, dass das Genprodukt des therapeutischen Gens ein En- zym ist, welches einen in der Zelle vorhandenen bzw. dieser zugeführten Wirkstoff- Vorläufer in den zytotoxischen Wirkstoff umwandeln kann.

Das therapeutische Gen wird nur in GnRH-Rezeptor-positiven Zellen aktiviert, indem bei Ausschüttung oder Zuführung von GnRH oder eines GnRH-Analogons ein NFB- spezifischer Promotor die Aktivierung des Gens induziert. Der NFB-spezifische Pro-

motor enthält vorzugsweise wenigstens eine Kopie des kappaB-Enhancers, insbe- sondere 4 bis 6 Kopien, fusioniert an einen für die Aktivierung des therapeutischen Gens geeigneten Promotor.

Das der Erfindung zugrunde liegende Prinzip besteht darin, dass ein therapuetisches Gen oder Effektorgen unter Kontrolle des NFB-Promotors steht, der tumorzellspezi- fisch über GnRH (LHRH) oder GnRH-Analoga in GnRH-Rezeptor-positiven Tumor- zellen (Ovar-, Endometrium-, Mamma-und Prostatatumoren) aktiviert wird. Auf das einzelne therapeutische Gen kommt es nicht an, so dass für die Ausführung der Er- findung verschiedene Promotor-GenNorläufer-Wirkstoff-Paare geeignet sind.

Für die Krebstherapie handelt es sich bei den therapeutischen Genen in erster Linie um Suizidgene, die das Absterben der Zielzelle auslösen, wobei therapeutische Ge- ne, die eine echte Therapie der Zielzelle (Rückprogrammierung der Krebszelle) er- möglichen, nicht ausgeschlossen werden.

Eine zusammenfassende Beschreibung zur Zeit gängiger Suizidgene findet sich bei- spielsweise in : G. Coukos,"Gene Therapy for Ovarian Cancer", Oncology 9, 2001, 1197-1207.

Beispiele für Suizidgene, die als therapeutische Gene im Rahmen dieser Erfindung zum Einsatz kommen können, sind in Tabelle 1 angegeben.

In einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel ist vorgesehen, dass das the- rapeutische Gen das Herpes simplex Virus (HSV) -Thymidinkinase-Gen ist. Das HSV- TK-Gen wird unter die Kontrolle des HSV-TK-Promotors gestellt. HSV-TK konvertiert nicht-toxisches Ganciclovir und dessen Abkömmlinge in toxisches Ganciclovir- Triphosphat (bzw. dessen Abkömmlinge) (Vorteil : Bystander Effekt).

In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist vorgesehen, dass das therapeutische Gen das Varicella zoster Virus-Thymidinkinase-Gen ist. VZV-TK konvertiert nicht- toxisches 6-Methoxypurin-Arabinonucleosid (araM) in toxisches Adenin-

Arabinonucleosid-Triphosphat (araATP).

In einem anderen Ausführungsbeispiel ist vorgesehen, dass das therapeutische Gen das Echerichia coli-Cytosindeaminase-Gen ist. Bei Aktivierung durch einen geeigne- ten Promotor konvertiert E. coli-CD nicht-toxisches 5-Fluorocytosin in toxisches 5- Fluorouracil (Vorteil : Bystander-Effekt).

In der Regel liegt das Nukleinsäurekonstrukt in einem Plasmid vor. Die Minimalaus- stattung des Plasmids besteht aus mindestens einer Kopie, vorzugsweise 4 bis 6 Kopien, des B-Enhancers, der eine NFB-Bindungsstelle darstellt, fusioniert an einen Promotor, der spezifisch das therapeutische Gen induziert. Durch Fusionieren des KappaB-Enhancers mit dem Promotor erhält man einen NFB-spezifischen Promotor für das therapeutische Gen. Das Konstrukt enthält weiterhin wenigstens eine PolyA- Sequenz.

In Weiterbildung der Erfindung kann das Konstrukt zusätzlich eine Sequenz für die Expression des Wirkstoff-Vorläufers in den Zielzellen enthalten. Diese umfasst i. a. wenigstens eine kodierende Sequenz für den Wirkstoff-Vorläufer und einen geeig- neten Promotor. Ferner ist es auch möglich, für die Zufuhr des Wirkstoff-Vorläufers ein gesondertes Plasmid bzw. Nukleinsäurekonstrukt vorzusehen, welches wenig- stens eine für den Wirkstoff-Vorläufer kodierende Sequenz und einen Promotor ent- hält.

Es besteht die Möglichkeit das Plasmid (Konstrukt) mittels verschiedener nicht-viraler (zB. liposomaler) Techniken in die Zielzellen einzuschleusen. Virale Transfektions- möglichkeiten bestehen ebenfalls, sind aber mit einer Vielzahl von Nebenwirkungen behaftet. Die durch virale Techniken erreichbare gewisse Tumorspezifität (zB.

Transfektion von proliferierenden Zellen) ist bei dem vorgestellten Therapieverfahren nicht notwendig, da über die spezifische Expression des GnRH (LHRH) Rezeptors und zusätzlich über den nur für GnRH-Rezeptor tragende Tumorzellen spezifischen Wirkungsmechanismus [Aktivierung von NFB durch GnRH (LHRH) und seine Analo-

ga] eine sehr viel höhere Tumorspezifität der Therapie gewährleistet ist. Grundsätz- lich ist die Verwendung viraler Vektoren jedoch ebenfalls möglich.

In bevorzugter Ausführungsform wird das Konstrukt in einem liposomalen Vektor in die Tumor-Zielzellen eingeschleust. Kim et al. (Gynecologic Oncology 2002 Band 84 Seiten 85 bis 93) beschreiben beispielsweise ein effizientes auch hier verwendbares liposomales Verfahren, um humane Ovarialkarzinomzellen zu transfizieren.

Für ein Präparat zur Behandlung von GnRH-Rezeptor-positiven Tumoren kann das Nukleinsäurekonstrukt oder der Vektor gemäß der Erfindung beispielsweise in einer Injektionslösung oder einer Infusionslösung enthalten sein. Dieses Präparat kann zusätzlich den erforderlichen Wirkstoff-Vorläufer enthalten oder für die Co-Applikation mit diesem vorgesehen sein, sofern der Wirkstoff-Vorläufer nicht in der Zelle vorhan- den oder auf dem Nukleinsäurekonstrukt kodiert ist.

Das Präparat mit dem Nukleinsäurekonstrukt oder dem Vektor der dieses Konstrukt enthält wird in zeitlicher Abstimmung mit GnRH oder einem GnRH-Analogon und ge- gebenenfalls dem Wirkstoff-Vorläufer oder einem für den Wirkstoff-Vorläufer kodie- renden Plasmid verabreicht.

Die Tumorbehandlung erfolgt in einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfin- dung nach folgendem Schema : a) Einschleusen des Nukleinsäurekonstrukts oder des Vektors nach einem der An- sprüche 1 bis 9 in Tumor-Zielzellen ; b) Verabreichung von GnRH oder einem GnRH-Analogon in zeitlichem Abstand zu Schritt a) ;. c) Verabreichung eines Wirkstoff-Vorläufers, der durch das Genprodukt des in dem Nukleinsäurekonstrukt enthaltenen therapeutischen Gens in den Wirkstoff umgewan- delt wird, in zeitlichen Abstimmung vor, nach oder mit Schritt b), sofern der Wirkstoff- Vorläufer nicht als natürliche zelluläre Substanz in der Zelle bereits vorhanden ist.

Das GnRH oder das GnRH-Analogon wird in einer vorteilhaften Verfahrensweise 8 bis 48 Stunden nach dem Einschleusen des Konstruktes oder des Vektors in die Zielzellen gegeben. Als GnRH-Analogon wird sehr vorteilhaft Triptorelin gegeben, vorzugsweise systemisch.

Das Einschleusen des nackten Konstruktes oder des Vektors kann durch intraperito- neale Injektion erfolgen. Die behandelbaren Tumore werden so gut erreicht. Die Ver- abreichung von GnRH oder einem GnRH-Analogon erfolgt anschließend vorzugs- weise intraperitoneal oder intravenös. Der Wirkstoff-Vorläufer wird-sofern erforder- lich-nach oder mit dem GnRH oder GnRH-Analogon vorzugsweise intraperitoneal verabreicht. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß der Wirkstoff-Vorläufer zu- sätzlich auf dem Nukleinsäurekonstrukt kodiert ist.

In einem besonders bevorzugten Verfahrensbeispiel wird das Plasmid"pNFB-TK verwendet. Das Plasmid"pNFB-TK"wurde konstruiert, um durch NFB, welches über GnRH (LHRH) und seine Analoga in GnRH (LHRH) Rezeptor positiven Tumor- zellen spezifisch aktiviert wird, das Effektorgen Herpes simplex Virus Thymidinkinase (HSV-TK) zu exprimieren. Das Plasmid"pNFB-TK"enthält 4 Tandemkopien des B Enhancers fusioniert an den Herpes simplex Virus Thymidinkinase Promotor gefolgt vom Herpes simplex Virus Thymidinkinase Gen mit PolyA-Schwanz.

Das Plasmid"pNFB-TK"wird zusammen mit einem Transfektionsreagenz auf Lipo- somenbasis intraperitoneal injiziert. Nach 24 Stunden wird ein GnRH (LHRH) Analo- gon injiziert. Die Bindung des GnRH (LHRH) Analogons an den GnRH (LHRH) Re- zeptor der Tumorzelle führt zur Aktivierung von NFB. Aktiviertes NFB bindet and den B Enhancer des Plasmids"pNFB-TK"und induziert damit die Expression des Herpes simples Virus Thymidinkinase Gens. Das Genprodukt, die Herpes simplex Virus Thymidinkinase phosphoryliert nun den verabreichten Vorläuferwirkstoff Ganciclovir, der durch humane Enzyme nicht umgesetzt werden kann. Dadurch entsteht schließ- lich der zytotoxische Wirkstoff Ganciclovir-Triphosphat, der die Tumorzellen abtötet.

An normalen Zellen, die keine GnRH (LHRH) Rezeptoren exprimieren, kann GnRH (LHRH) und seine Analoga den NFB nicht aktivieren. Außerdem ist der Mechanismus der NFB Aktivierung durch GnRH (LHRH) und seine Analoga auf Tumore reprodukti- ver Organe beschränkt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben und es wird auf Figuren Bezug genommen. Im Einzelnen zeigen : Fig. 1 schematische Darstellung des Funktionsprinzips der Erfindung GnRH (LHRH) oder GnRH Analoga binden an den GnRH Rezeptor an der Zelloberfläche der Tumorzelle. Dadurch wird tumorspezifisch Nukleus Faktor kappa B (NFKB) aktiviert. Aktiviertes NFKB bindet an die KB-Bindungstelle des Plasmids und induziert dadurch die Expression des Effektorgens (z. B. Herpes simplex Virus Thymidinkinase Gen). Das Genprodukt ist ein Enzym (z. B. Her- pes simplex Virus Thymidinkinase), welches die Umwandlung des Wirkstoff- vorläufers (z. B. Ganciclovir) in einen Wirkstoff (z. B. Ganciclovir-Triphosphat) katalysiert. Dieser führt zum Tod der Tumorzelle.

Fig. 2 schematische Darstellung des Plasmids pNFB-TG - TG = therapeutisches Gen = Effektorgen (hier als Beispiel Herpes simples Vi- rus Thymidinkinase) - B4-TK= 4 Kopien des kappa B Enhancers fusioniert an einen für die Aktivie- rung des therapeutischen Gens geeigneten Promotors (hier TK = Thymidinki- nase Promotor).

- SV40 poly A = Poly A Sequenz - Resistenzgen

EXPERIMENTALTEIL Nachweis von GnRH-Rezeptoren in Zellinie und Tumorgewebe Um die Frequenz der Expression des GnRH Rezeptors in Endometrium-und Ovari- alkarzinomen zu ermitteln, wurden verschiedene Endometrium-und Ovarialkarzi- nomzellinien sowie 40 Endometrium-und Ovarial-Primärkarzinome mittels eines spezifischen Radiorezeptorassays sowie mittels RT-PCR auf die Expression von GnRH-Bindungsstellen untersucht. Bei den meisten Ovarial- (EFO-21, EFO-27, NIH : Ovcar-3, BG-1) und Endometriumkarzinomzellinien (Ishikawa, HEC-1A, HEC-1B, KLE, AN-3-CA) konnte jeweils eine hochaffine Bindungsstelle für das GnRH Analo- gon Triptorelin (Kd 1,5-8, 2 nmol/L) nachgewiesen werden. Die beiden Ovarialkarzi- nomzellinien SK-OV-3 und SW 626 und die Endometriumkarzinomzellinie MFE 296 reagierten negativ. Bei der Untersuchung der Primärtumore zeigten mehr als 80 % der Ovarial-und der Endometriumkarzinome hochaffine Bindungsstellen (Kd 0,1-90 nmol/L) für GNRH. Aufgrund dieser doch hohen Frequenz der GNRH Rezeptor Ex- pression eignet sich der GnRH Rezeptor gut als Target für eine zielzellspezifische Therapie.

Die meisten Normalgewebe exprimieren keine GnRH-Rezeptoren : Voraussetzung für eine zielzellspezifische Tumortherapie via GnRH Rezeptor ist, daß Normalgewebe gar keine oder nur in einer geringen Frequenz GnRH Rezeptoren exprimieren. Durch RT-PCR und Radioliganden Assays konnte gezeigt werden, daß nur sehr wenige Normalgewebe den GnRH-Rezeptor exprimieren. GnRH-Rezeptor Expression wurde außer in Hypophyse und Hypothalamus ausschließlich in den re- produktiven Organen Ovar, Myometrium, Endometrium, Tube und Zervix sowie in der Plazenta und der Mamma gefunden (Kakar et al. 1994 und eigene unpublizierte Da- ten). Alle nicht-reproduktiven Organe einschließlich des lymphatischen und des blut- bildenden Systems waren GnRH-Rezeptor negativ. Hypothalamus und Hypophyse werden durch eine lokale Therapie via GNRH Rezeptor (intrperitoneale Applikation) nicht tangiert. Desweiteren wird NFB in hypophysären GnRH Rezeptor positiven

Zellen nicht aktiviert (siehe unter den nächsten beiden Abschnitten). Außerdem wür- de aktiviertes NFB in diesen nicht proliferierenden Zellen nicht toxisch sein. Die re- produktiven Organe wie Uterus und Ovar werden bei entsprechenden Karzinomen entfernt. Das Brustgewebe wird genauso wie Hypophyse und Hypothalamus nicht tangiert. Dadurch daß die überwiegende Mehrheit der Endometrium-und Ovarialkar- zinome GnRH Rezeptoren exprimieren, aber nur sehr wenige Normalgewebe GnRH Rezeptoren besitzen scheint ein Targeting via GnRH-Rezeptor besonders für eine zielzellspezifische Therapie geeignet zu sein.

Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors im Tumor : Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Unterschiede zwischen der Signaltransduktion in Hypophyse und Hypothalamus sowie in gynäkologischen Tu- moren aufzuzeigen. Es wurden verschiedene Schlüsselstellen der Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors, die in Hypophyse und Hypothalamus durch GnRH aktiviert werden, analysiert. Obwohl Phospholipase C (PLC), Protein Kinase C (PKC) oder Adenylatcyclase in den Tumorzellen pharmakologisch aktiviert werden konnten, hat- ten GnRH und seine Analoga keinen Einfluß auf PLC, PKC oder Adenylatcyclase.

Das deutet darauf hin, daß in den Tumorzellen ein anderer Signaltransduktionsme- chanismus vorliegen muß. Anders, als in Hypophyse und Hypothalamus, wird das Signal der GnRH-Rezeptor Aktivierung in den Tumorzellen durch G-Protein i und nicht durch G-Protein q weitergeleitet. Ein wichtiger Mechanismus ist die Interaktion des GnRH-Rezeptors mit der durch Wachstumsfaktoren vermittelten mitogenen Si- gnaltransduktion. Mittels eines p42/p44 MAP-Kinase Assays konnte gezeigt werden, daß die durch EGF induzierte MAP-Kinase Aktivität durch GnRH-Analoga komplett unterdrückt werden kann. Quantitative RT-PCR zeigte, daß GnRH-Analoga in der Lage sind, die EGF-induzierte Expression des immediate early response genes c-fos dosisabhängig in allen untersuchten Ovarial-und Endometriumkarzinomzellinien mit GnRH-Rezeptor Expression zu inhibieren. Nanomolare Konzentration reichen aus, die c-fos Expression auf ein basales Niveau nicht proliferierender Zellen zu drücken.

GnRH steuert das Wachstum der Tumorzellen durch Interaktion des GnRH- Rezeptors mit der mitogenen Signaltransduktion der Wachstumsfaktoren.

Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFB durch GnRH-Analoga in Ovarial- und Endometriumkarzinomzellen : In den Ovarialkarzinomzellinien EFO-21, EFO-27 (Gründker et al. 2000) und NIH : OVCAR-3 sowie in den Endometriumkarzinomzellinien Hec-1A, Hec-1B und Is- hikawa wurde zum ersten Mal beobachtet, daß GnRH-Analoga in der Lage sind, den Transkriptionsfaktor NFB rezeptor-vermittelt zu aktivieren. Dabei erhöht sich die Akti- vität von NFB um das 5-bis 8-fache. Diese Aktivierung wird über das G-Protein i vermittelt und ist durch Pertussis Toxin hemmbar. In Kontrollexperimenten mit Zelli- nien ohne GnRH-Rezeptor Expression wird NFB durch GNRH nicht aktiviert. Uns stehen zwei verschieden Klone der SK-OV-3 Zellinie zur Verfügung, von denen nur einer den GnRH-Rezeptor exprimiert. Nur in diesem Klon läßt sich NFB durch GnRH aktivieren.

Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFB durch GnRH-Analoga in Normal- zellen : Der Nachweis, daß NFB in den GnRH Rezeptor positiven gonadotropen Hypophy- senzellen durch GnRH Analoga nicht aktiviert werden kann wurde mit der immortal- sierten Maus Hypophysenzellinie T3-1 geführt. Da sich die Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors in der Hypophyse sich grundsätzlich von derjenigen in den Tumor- zellen unterscheidet, gehen wir daher davon aus, daß GnRH Analoga in den Hypo- physenzellen keine Wirkung auf NFB besitzt. In der 3T3 Fibroblastenzellinie ohne GnRH Rezeptor Expression wurde NFB niemals durch GnRH-Analoga aktiviert. Nur in den GnRH Rezeptor positiven Tumorzellen nicht aber in GnRH Rezeptor positiven wie negativen Normalzellen ist NFB durch GnRH aktivierbar. Diese Tatsache läßt das Therapiekonzept, über den GnRH Rezeptor NFB zu aktivieren um dessen Kon- trolle ein therapeutisches Gen zu aktivieren, vielversprechend aussehen.

In vivo Transfektion mit NFB-LacZ und Aktivierung des Transkriptions-faktors NFB durch GnRH-Analoga in vivo : Mit den folgenden Experimenten sollte gezeigt werden, daß die Expression eines

eingebrachten Effektorgens unter Kontrolle des NFB Response Elementes in vivo in GnRH Rezeptor positiven Tumoren durch GnRH Analoga induziert werden kann.

Gleichzeitig sollten die Experimente zeigen, daß in Normalgeweben keine NFB ver- mittelt Expression des Effektorgens induziert wird. Immundefizienten Nacktmäusen wurden Hec-1B Endometrium-karzinomzellen intraperitoneal verabreicht. Nach An- wachsen der Tumorzellen wurde den Mäusen das Reportergen Plasmid NFB-LacZ in Kombination mit dem Transfektionsreagenz Lipofect intraperitoneal appliziert. Nach 24 Stunden wurde den Kontrollmäusen Kochsalzlösung und den Versuchsmäusen der GnRH-Agonist Triptorelin intravenös injiziert. Weitere 24 Stunden später wurden die Tiere getötet, die Organe sowie die Tumore entnommen und anschließend mit X- Gal gefärbt. Nur Tumore aus Mäusen mit Triptorelin-Behandlung waren blau gefärbt.

Ohne Triptorelin wurde NFB-LacZ nicht aktiviert. Ovar und Uterus waren sowohl mit als auch ohne Triptorelin blau gefärbt. Alle anderen Organe (Gehirn, Herz, Lunge, Milz, Leber, Niere, Magen, Darm) wurden weder mit noch ohne Triptorelin angefärbt.

Dieses Ergebnis zeigt, daß GnRH-Analoga das NFB nur in den Endometriumkarzi- nomzellen aktivieren. In Ovar und Uterus scheint NFB konstitutiv aktiv zu sein. Dies ist aber vernachlässigbar, da diese Organe bei Ovar-und Endometriumkarzinom oh- nehin entfernt werden. In alle anderen untersuchten Organen wird NFB nicht akti- viert, solange Entzündungen dieser Organe vermieden werden. Allein durch liposo- male Transfektion NFB-vermittelt konnte das Reportergen LacZ im Tumor exprimiert werden. Alle anderen Organe mit Ausnahme von Ovar und Uterus zeigten keine Ex- pression. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß das angestrebte Therapie- konzept auch in vivo funktionieren wird.

In vitro Evaluation des Therapiekonzeptes mit dem therapeutischen Konstrukt NFB-Tymidinkinase (TK) und dem Wirkstoff (Prodrug) Ganciclovir : Mit den folgenden Experimenten sollte gezeigt werden, daß die Expression eines eingebrachten therapeutischen Gens unter Kontrolle des NFB Response Elementes in vitro in GnRH Rezeptor positiven Tumorzellen durch GnRH Analoga induziert wer- den kann. In den GnRH Rezeptor-positiven Ovarialkarzinomzellinien EFO-21, EFO- 27 und NIH : OVCAR-3 sowie in den GnRH Rezeptor-positiven Endometriumkarzi-

nomzellinien Hec-1A, Hec-1B und Ishikawa konnte gezeigt werden, daß in NFB-TK transfizierten Tumorzellen durch Triptorelin die Thymidinkinase exprimiert und akti- viert wird. Die Thymidinkinase phosphoryliert dann Ganciclovir, welches anschlie- ßend von zellulären Enzymen weiter phosphoryliert wird. Erst dadurch wird Ganciclo- vir toxisch. Dies hatte zur Folge, daß die mit NFB-TK transfizierten GnRH Rezeptor positiven Tumorzellen nach Gabe von Triptorelin (Aktivierung) und Ganciclovir (Pro- drug) starben. Ohne Triptorelin oder ohne Ganciclovir zeigte sich kein Effekt. GnRH Rezeptor-negative Zellen wurden durch diese Therapie nicht geschädigt.

Literatur : Gründker C, Schulz K, Günthert AR, Emons G (2000) Luteinizing hormone-releasing hormone induces nuclear factor B-activation and inhibits apoptosis in ovarian cancer cells. Journal of Clinical Endocrinologyand Metabolism 85 : 3815-3820 Gründker C, Günthert AR, Westphalen S, Emons G (2002) Biology of GnRH systems in human gynecological cancers. European Joumal of Endocrinology 146 : 1-14 Tabelle 1 Suizidgene für die Gentherapie Transgen Prodrug toxischer Metabolit Herpes-simplex-Virus-Ganciclovir Ganciclovir-Triphosphat Thymidinkinase Acyclovir Acyclovir-Triphosphat AraT AraT-Triphosphat IVDU IVDU-Triphosphat AIU AIU-Triphosphat Beta-Glucuronidase Doxorubicin-Glucuronid Doxorubicin Beta-Glucosidase Amygdalin Cyanid Beta-Lactamase Doxorubicin-Cephalosporin Doxorubicin Beta-Galactosidase Cytosinarabinosid-5'-Galactosid Cytosinarabinosid Cytochrom P 450 2B1 Cyclophosphamid 4-Hydroxycyclophosphamid Thymidinphosphorylase 5'-Deoxy-5-fluorouridin 5-Fluorouracil Alkaline Phosphatase Doxorubicinphosphat Doxorubicin Mitomycinphosphat Mitomycin-C Etoposidphosphat Etoposid Penicillinamidase Doxorubicinphenoxyacetamid Doxorubicin Melphalan-Phenoxyacetamid Melphalan Cytosindeaminase 5-Fluorocytosin 5-Fluorouracil Xanthinoxidase Hypoxanthin Wasserstoffperoxid, OH, 02- Radikale Carboxypeptidase A Methotrexat-Alanin Methotrexat Xanthin-Guanin-6-Thioxanthin 6--Thioguanosin-Monophosphat Phosphoribosyltransferase Varicella-zoster-Virus-6-Methoxypurin-Arabinosid 6-Methoxypurin-Arabinosid- Thymidinkinase Monophosphat Purinnukleosid-Phosphorylase 6-Methylpurin-2'-6-Methylpurin deoxyribonukleotid Nitroreduktase 5- (Aziridin-1-yl)-2, 4-dinitro- 5- (Aziridin-1-yl)-4- benzamid (CB 1954) hydroxylamino-2-nitrobenzamid AraT = 1-beta-D-Arabinofuranosylthymin ; AIU = 5-lodo-5'-amino-2', 5'-dideoxyuridin ; IVDU = (E)-5- (2-lodovinyl)-2'-Deoxyuridin.