Gentechnisch modifizierte Bakteriophagen, insbesondere zur Bekämpfung von pathogenen Prokaryonten bzw. ihrer pathologi- sehen Wirkung, sowie deren Verwendung und Herstellung

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft gentechnisch veränderte Bakteriophagen und deren Verwendung in einem Verfahren, um, mit Hilfe einer viralen Superinfektion, durch diese gentechnisch veränderten Bakteriophagen und deren Transkriptionsbzw. Expressionsprodukte die pathogene bzw. toxische Wirkung von Phagen-infizierten prokaryontischen Krankheitserregern zu blockieren. Die Erfindung betrifft in einem Aspekt die Ver- wendung von eukaryontischen Transkriptionsfaktoren in Form von artifiziellen Zinkfingerproteinen in prokaryontischen Zellen.

Pathogene Proteine (z.B. Toxine) bildende Bakterien sind von enormer medizinischer und veterinärmedizinischer Bedeutung.

Als Beispiele seien hier Salmonellen, Shigellen oder Escherichia coli als Verursacher von Krankheiten wie STEC oder EHEC genannt. All diesen Erregern gemein ist die Tatsache, dass ihre pathologische Wirkung von einem Virusgenom, einem Bak- teriophagen herührt, der sich nach einer Infektion eines Prokaryonten in das Genom dieser Bakterien integriert hat. Dies wird als Lysogenie bezeichnet. Erst durch diesen getemperten Phagen werden die Bakterien zu Krankheitserregern, indem, ausgelöst durch bestimmte äußere Faktoren (z. B. Stress), der Phage bzw. dessen Genom sich wieder aus dem Bakteriengenom separiert und neue infektiöse Phagenpartikel gebildet werden. Dies ist der Beginn einer lytischen Form des Phagen, der sich so, über die Infektion weiterer Bakterien, exponenziell vermehrt. Ebenso vermehren sich während dieses Geschehens die

Stoffwechselprodukte und die darin eventuell enthaltenen Toxine, die, streng genommen, Proteine des Bakteriophagen sind. Oft besitzen diese Phagenproteine eine direkte toxische oder anderweitig pathogene Wirkung auf den Wirt der Bakterien. Diese manifestieren sich in Krankheiten wie beispielsweise EHEC (Mensch) , der ödemkrankheit (Hausschwein) oder der Bakterienruhr (Mensch) .

Alternativ oder zusätzlich zu der oben beschriebenen Integra- tion des Phagengenoms in das bakterielle Genom ist es auch möglich, dass das Phagengenom als Plasmid im bakteriellen Wirt vorliegt. Auch hier kann das Phagengenom analog zum oben geschilderten Ablauf durch äußere Einflüsse (z.B. Stress) aus dem Plasmid freigesetzt werden und infektiöse Phagenpartikel bilden.

Schon früh nach der Entdeckung der Bakteriophagen durch F. Tword (1915) bzw. F. H. d'Herelle (1917) wurden Ansätze verfolgt, mit Hilfe solcher Bakteriophagen bakteriellen Erkran- kungen entgegen zu wirken. So konnten H. E. Morton und F. B. J. Engley (1945) eine Schutzwirkung durch Phagen an experimentell mit Shigellen infizierten Mäusen aufzeigen. Bis in die frühen vierziger Jahre mit dem Beginn der Antibiotika-ära wurde eine sogenannte "Phagentherapie" auch kommerziell auf- gegriffen und verfolgt um eine Möglichkeit der Bekämpfung von Durchfallerkrankungen zu schaffen. Das Prinzip der "Phagentherapie" wurde auch in der damaligen Sowjetunion aufgegriffen (Babalova et al. 1968) und bis heute in Georgien weiterverfolgt .

In neuerer Zeit wird die sogenannte Phagentherapie wieder propagiert und erforscht (Chibani-Chennoufi et al., 2004) und teilweise medizinisch angewendet (Bruttin und Brüssow, 2005)

Die dort angewandten Verfahren bringen jedoch bis heute nicht die gewünschten Erfolge und beruhen einzig auf dem Prinzip, natürlich vorkommende Phagen zu vermehren, um mit Hilfe einer großen Anzahl solcher Bakteriophagen pathogene Bakterien in ihren Wirten abzutöten.

In der internationalen Patentveröffentlichung WO 00/61 804 werden zur Bekämpfung pathogener Bakterien gentechnisch modifizierte Bakteriophagen offenbart, die eine Nukleinsäure- sequenz enthalten, welche ein für ein pathogenes Bakterium toxisches Agens codiert.

Hagens et al., Antimicrob. Agents Chemother. 2004, Bd. 48, S. 3817-3822), offenbaren einen gentechnisch veränderten Pf3- Phagen, der das Gen für die Restriktionsendonuklease BgIII trägt, zur Abtötung des pathogenen Pseudomonas-Wirts mittels irreparabler Spaltung der Wirts-DNA.

Bei der Verwendung solcher transgener Phagen, die für toxi- sehe Agentien codieren, besteht allerdings immer die Gefahr von Nebenwirkungen für das zu behandelnde Individuum.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren für eine solche Phagentherapie und entsprechende modifizierte Bakteriophagen bereitzustellen, welche (s) zur Bekämpfung einer Vielzahl pathogener Prokaryon- ten adaptiert werden kann/können, sehr effektiv und frei oder arm an Nebenwirkungen für das zu behandelnde Individuum ist/sind.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die modifizierten Bakteriophagen gemäß Anspruch 1 und deren Verwendung gemäß den Ansprüchen 5 und 10 sowie das Superinfektionsverfahren gemäß Anspruch 12 und die Verwendung von Zinkfinger-

proteinen nach Anspruch 14. Bevorzugte und spezielle Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der weiteren Ansprüche .

Im Gegensatz zu schon beschriebenen Verfahren zur Erzeugung transgener Phagen (siehe WO/00/61804 und Hagens et al., Anti- microb. Agents Chemother. 2004, Bd. 48, S. 3817-3822), stellen die hier durch gentechnische Veränderung des Phagengenoms erzeugten Proteine keine artifiziell exprimierten Proteine in Form von Antagonisten oder neutralisierende bzw. toxische Proteine (Peptid-/Proteinbinder, (Anti-) Toxine, Liganden, Nukleasen oder andere Enzyme) gegen die entsprechenden Toxine oder andere krankmachende Agenzien von Erregern dar und sind auch selbst keine Toxine, sondern sind artifizielle Trans- kriptionsfaktoren, spezieller artifizielle Zinkfingerpeptide, die intrazellulär an spezifischen Stellen der DNA in den Erregern binden und so bereits in einem sehr frühen Stadium der Proteinbiosynthese eingreifen und die Synthese der RNA entsprechender ausgewählter Proteine bzw. Toxine etc. blockie- ren, insbesondere auch solche RNA-Synthesen, die keiner direkten Transkriptionskontrolle unterliegen. Zinkfinger wie hier im Folgenden beschrieben gibt es natürlicherweise nur bei Eukaryonten, nicht jedoch bei Prokaryonten.

C2H2 (Cys2His2) -Zinkfinger sind eukaryontische Bindemotive, die eine RNA-Synthese beeinflussen, sogenannte Transkriptionsfaktoren. Ihre Bindefähigkeit an doppelsträngiger DNA in artifiziellen in-vivo-Systemen (Human zinc fingers as buil- ding blocks in the construction of artificial transcription factors. (2003) Kwang-Hae Bae et al. Nature Biotechnology

21:275-280) und außerhalb des eukaryontischen Systems konnte bereits anhand vollsynthetischer Zinkfinger in in-vitro- Versuchen auf Biochips gezeigt werden (Chemically synthesized zinc finger molecules as nano-addressable probes for double-

stranded DNAs. (2005) Markus von Nickisch-Rosenegk et al. J Nanobiotechnology 3:5, 1-6).

Die Fähigkeit von artifiziell erzeugten, natürlich vorkommen- den Zinkfingern sowie vollkommen artifiziellen Zinkfingern (artifizielle Aminosäuresequenz und artifizielle Synthese) zur Transkriptionskontrolle wurde in unterschiedlichen Anwendungen bereits hinreichend beschrieben (Regulation of cancer- related growth factor expression by artificial zinc-finger proteins. (2006) Tomoaki Mori et al. Nucleic Acids Symposium Series No. 50:291-292; Artificial zinc finger fusions targeting Spl-binding sites and the trans-activator- responsive element potently repress transcription and replication of HIV-I. (2005) Kim YS et al. J Biol Chem 280(22) :21545-52.

Sie wurde allerdings noch nie in transgenen Bakteriophagen generiert, die anschließend als solche für eine Infektion von pathogenen Prokaryonten verwendet wurden, um dort spezifisch bestimmte RNA-Synthesen zu kontrollieren.

Dieses hier beschriebene Verfahren ist aus der Sicht der Erfinder der erste und wahrscheinlich beste Weg, kodierende Sequenzen für die anschließende Steuerung der RNA-Synthese aus- gewählter Proteine von Prokaryonten durch Zinkfinger in pro- karyontischen Krankheitserregern selbst mit Hilfe transgener Bakteriophagen zu applizieren.

Hauptziel dieser Ansatzes ist die Kontrolle bzw. Blockade der RNA-Synthese von ausgewählten Proteinen in Prokaryonten auf

DNA-Niveau, durch artifizielle Transkriptionsfaktoren mittels eines artifiziellen Carriers in Form von gentechnisch veränderten Bakteriophagen, welche die zu Grunde liegende Fremd- DNA für die Kodierung der RNA-Synthese-kontrollierenden Zink-

finger in die Zellen schleusen, also ein mit artifizieller Zinkfinger-kodierender DNA transfizierter Bakteriophage (Zinkfingerphage) , dessen exprimiertes Zingfingerpeptid die RNA-Synthese bestimmter, gewählter Proteinprodukte (z.B. Vi- rulenzfaktoren bei bakteriellen Erregern) auf Grund seiner artifiziellen, spezifischen Sequenz, die an der kodierenden DNA bindet, spezifisch hemmt.

Der hier vorgestellte Ansatz zur Bekämpfung der pathogenen prokaryontischen Keime beruht auf dem gleichen Prinzip, wodurch die Bakterien selbst überhaupt erst ihre pathogene Wirkung entwickeln, nämlich durch eine Infektion mit Bakteriophagen. Der Unterschied hier (Erfindung) beruht auf einer ar- tifiziellen Infektion der Bakterien mit gentechnisch verän- derten Viren. Das krankmachende System wird quasi mit seinen eigenen Waffen geschlagen ("Beat it with its own game").

Hierfür werden geeignete gentechnisch modifizierte Bakteriophagen verwendet, um die pathogene Prokaryonten zu infizie- ren . Diese rekombinanten Phagen dienen als Vehikel, um in den entsprechenden Bakterien Proteine oder Nukleinsäuren zu erzeugen, die in der Lage sind, die zellinternen physiologischen Kaskaden, die an der Enstehung des pathogenen Geschehens beteiligt sind, zu blockieren.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden infektiöse Bakteriophagen (z. B. phiVIO, Lambda, STX-Phagen, weitere Beispiele siehe unten) gentechnisch durch Einführung eines in diesen Phagen nicht natürlich vorkommenden Gens oder Genfrag- ments in der Weise verändert, dass sie nach Induktion in bekannter Weise (z.B. durch Stress wie Hitze oder änderung anderer Umweltbedingungen) Proteine, z.B. Zinkfingerpeptide, exprimieren, die als Transkriptionsfaktoren essentielle Gene des pathogenen Bakteriophagen oder Gene der Phagenreplikation

oder Synthese von Toxinen oder anderen pathogenen Proteinen oder die Synthese von Vorläufergenen und/-oder Hilfsproteinen blockieren bzw. die bakterielle Transkriptionsmaschinerie blockieren, die der ursprüngliche Pathogenitätsphage vor der Infektion mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Phagen für seine viralen Prozesse okkupiert.

Der Begriff „nicht natürlich vorkommendes Gen oder Genfragment" wie hier in der Beschreibung und den Ansprüchen verwen- det, umfasst ein vollständig synthetisch hergestelltes oder artifizielles Gen oder Genfragment mit einer gewünschten Sequenz, ein aus einem anderen Organismus, z.B. einem anderen Mikroorganismus (z.B. Virus, Bakterium, Hefe), stammendes Gen oder Genfragment, oder ein aus dem gleichen oder einem ande- ren Organismus, insbesondere Mikroorganismus, stammendes, jedoch durch Mutation modifiziertes Gen oder Genfragment.

Eine große Anzahl von Zinkfingerpeptiden aus einer Reihe von Organismen sind im Stand der Technik bekannt und ihre Amino- säure- und kodierenden DNA-Sequenzen sind in der Literatur beschrieben und in allgemein zugänglichen Datenbanken enthalten (z.B. WO 2006/103106) . Zur Herstellung der erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Bakteriophagen können diese bekannten Sequenzen als solche oder in einer nach Wunsch mo- difizierten Form, z.B. durch stellenspezifische Mutagenese oder PCR-Mutagenese oder durch die Ligation vollsynthetischer komplementär hybridisierender Oligonukleotid-Fragmente, in das Genom des Ausgangsbakteriophagen eingebaut werden. Diese Modifizierung kann bis zur Herstellung vollständig artifi- zieller Sequenzen (z.B. unter Berücksichtigung von Consensus- Sequenzen) gehen. Die Sequenzen richten sich nach den Zielsequenzen der jeweiligen Gene oder Promotoren, an die sie binden sollen, und werden bindungsfähig daran angepasst. Ein

spezielles, nicht beschränkendes Zinkfingerpeptid für die vorliegende Erfindung ist im folgenden Beispiel angegeben.

Wichtig und/oder vorteilhaft ist in bestimmten Ausführungs- formen, dass die Zinkfinger-Gene zeitnah "eingeschaltet" werden oder durch die aus viraler Aktivität direkt oder indirekt entstehenden Folgeprodukte aktiviert werden.

Als Zielgene für die Blockierung durch die erfindungsgenäßen Bakteriophagen kommen prinzipiell alle essentiellen Gene des pathogenen Bakteriophagen, z.B. Gene der Phagenreplikation oder der Synthese von Toxinen oder anderen pathogenen (krank- heits-verursachenden) Proteinen, oder Gene von Hilfsproteinen oder Komponenten der bakteriellen Transkriptionsmaschinerie, die der ursprüngliche Pathogenitätsphage vor der Infektion mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Phagen für seine viralen Prozesse okkupiert, in Frage. Ein große Anzahl solcher geeigneten Zielgene ist im Stand der Technik bekannt, in der Literatur und allgemein zugänglichen Datenbanken beschrieben und kann vom Fachmann unschwer ermittelt werden.

Als erfindungsgemäße rekombinante Phagen kommen grundsätzlich alle Bakteriophagen in Frage, die in der Lage sind, einen Iy- sogenen Entwicklungsgang auszuführen, d. h. sich in das Pro- karyontengenom integrieren können, und/oder als Plasmid im bakteriellen Wirt existieren können. Spezielle, nicht-beschränkende Beispiele sind Lambda, phivlO-Phage, STX-Phage, M13, PM2, phiβ, Mac-1, SSV-I, PRD-I, fd-Coliphage, MS2- Coliphage, Qbeta-Coliphage, phiX174-Coliphage, T4-Coliphage, T7-Coliphage, Acholeplasma-Phage, Spiroplasma-Phage, Ther- moproteus-Phage .

Als Ziel-Prokaryonten kommen grundsätzlich alle Prokaryonten mit einem integrierten (bzw. als Plasmid vorliegenden) Bak-

teriophagen, insbesondere pathogene Proteine (z.B. Toxine oder die Iminunabwehr schwächende Proteine) bildende Bakterien wie Salmonellen, Shigellen, Escherichia coli, Staphylococcus, Lactobacillus, Helicobacter, Camphylobacter, Streptococcus, Legionella, Listeria, Borrelia, Yersinia, Bacillus und Vibrio in Frage. Ein spezielles, nicht-beschränkendes Beispiel sind Shigatoxin bildende E. coli.

Die erfindungsgemäßen gentechnisch modifizierten Bakteriopha- gen können zur Bekämpfung von pathogenen Phagen-infizierten Prokaryonten eingesetzt werden. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Bakteriophagen zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhütung einer durch pathogene Phagen-infizierte Prokaryonten verursachten Krankheit bei ei- nem Menschen oder einem anderen Wirbeltier, z.B. einem Säugetier wie Schwein, Rind, Pferd, Schaf, Hund, Katze etc. oder einem Vogel wie Huhn, Ente, Gans, Truthahn etc., verwendet werden.

Einige nicht-beschränkende Beispiele für solche Prokaryonten sind die im vorherigen Absatz aufgeführten. Spezielle, nichtbeschränkende Beispiele für Krankheiten, die von solchen pathogen Prokaryonten verursacht werden und für eine therapeutische oder prophylaktische Behandlung unter Verwendung der erfindungsgemäßen gentechnisch modifizierten Bakteriophagen in Frage kommen, sind EHEC, Bakterienruhr, „Lime Disease", Legionärskrankheit und Magengeschwüre beim Menschen und ödemkrankheit, Ferkelruß und Milzbrand bei Tieren.

Das folgende prinzipielle Beispiel und die entsprechende schematische Darstellung in Fig. 1 dienen nur zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung und soll diese in keiner Weise darauf beschränken.

Der Lambda-Phage wurde hier gewählt, da er als gentechnischer Sicherheitsvektor in transgener Form innerhalb der Molekularbiologie bestens etabliert ist und die Funktion dieses Systems in Fachkreisen allgemein bekannt ist.

Der geschulte Fachmann wird erkennen, dass die vorliegende Erfindung ein allgemeines Prinzip beschreibt und nicht auf bestimmte individuelle Beispiele von Genen, Mikroorganismen und Sequenzen beschränkt ist, da der Fachmann anhand der vor- liegenden technischen Lehre und seiner allgemeinen Fachkenntnis unschwer weitere Variationen der hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen erkennen und in die Praxis umsetzen kann.

BEISPIEL 1

Artifizielle Repressoren (Zinkfingerpeptide) des bakteriellen recA-Genes und der viralen Promotoren R und L des Lambda-Phagen

Eine Möglichkeit, nach dem erstgenanntem Prinzip zu intervenieren, beinhaltet die Herstellung einer doppelsträngigen DNA-Sequenz (z. B. hybridisierte, komplementäre synthetische Oligonukleotide) , die für ein Zinkfingerpeptid kodiert, das den Promotor des bakteriellen recA-Genes blockiert, sowie ein cI-Repressor-Analogon, das die viralen Promotoren L und R blockiert (siehe Fig. 1). Diese DNA-Moleküle werden über entsprechende in den Oligonukleotiden festgelegte Schnittstellen auf bekannte Weise in das Genom von Phage-Lambda in- tegriert (Ligation) .

Hierzu stehen wieder diverse Möglichkeiten zur Verfügung. In einem speziellen Beispiel werden die obengenannten doppelsträngigen DNA-Fragmente, jeweils mit einem zusätzlichen (be-

züglich des Phagengenoms) vorangestellten R- bzw. L-Promotor des Lambda-Phagen, in das virale Genom integriert. Nach erfolgter Infektion der pathogenen Bakterien ruht das erfindungsgemäß modifizierte (artifizielle) Genom parallel zu dem pathogenitätsauslösenden Phagengenom in lysogener Form im Genom der bakteriellen Wirtszelle.

Wird nun im Falle der Induktion durch äußere Faktoren die Produktion von recA im Bakteriengenom ausgelöst, wird der vi- rale cI-Repressor auf den L- und R-Promotoren abverdaut und somit die Transkription auch auf den artifiziellen Genen des rekombinanten Phagen gestartet, d. h. es werden Proteine exprimiert, die sowohl die recA-Produktion blockieren, als auch die zuvor abverdauten cI-Repressoren substituieren. Da- mit wird die den lytischen Virenzyklus auslösende Kaskade unterbunden. Die Folgen sind ein Unterbleiben der exponenziel- len Vermehrung der pathogenen Keime einhergehend mit dem Ausbleiben der pathologischen Begleiterscheinungen, d. h. einer Erkrankung.

Ein Zinkfingerprotein, das auf der Repressorsequenz des Promotors für recA bindet, bzw. die zugehörige zu klonierende DNA-Sequenz lautet beispielsweise wie folgt: TAC TGT ATG AGC ATA CAG TAT (aus EcoCyc-Datenbank: Bindedomä- ne des recA-Repressors in der Promotorregion des Genes: Nuc- leic Acids Research 33:D334-7 2005) (SEQ-ID-Nr. 1).

Der hier passende Zinkfinger besteht aus 7 aneinander ligier- ten C2H2-Zinkfingerpeptiden, die jeweils ein DNA-Triplett binden. In der folgenden Abbildung sind einzelne Zinkfinger- peptide mit ihren spezifischen Erkennungsmotiven (fett, unterstrichen) für das jeweilige Nukleinsäuretriplett der DNA- Sequenz als ligiertes Peptid mit einer zusammenhängenden Ami- nosäuresesequenz dargestellt (one-letter-code) . Die Aminosäu-

ren X, die nicht Bestandteil der jeweiligen Erkennungssequenzen bzw. Zinkf inger-Consensussequenzen sind, können ohne Funktionsverlust durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Die Aminosäure Z steht für eine hydrophobe Aminosäure (L, I, V, M, F, Y, W, C) .

X Z X C X X X C X X X Z X D S G N L Q T H X X X H X X X X

X Z X C X X X C X X X Z X E S S H L Q T H X X X H X X X X

X Z X C X X X C X X X Z X R S D S L Q N H X X X H X X X X

X Z X C X X X C X X X Z X D S S H L Q N H X X X H X X X X

X Z X C X X X C X X X Z X Q S D S L Q lT H X X X H X X X X

X Z X C X X X C X X X Z X R S G N L Q E H X X X H X X X X

X Z X C X X X C X X X Z X E S G N L Q T H X X X H X X X X

(SEQ-ID-Nr. 2)

Hieraus ergibt sich ein zu klonierendes DNA-Fragment von 609 Basenpaaren, die für 203 Aminosäuren kodieren, die dann als Zinkfinger exprimiert werden.

Die folgende Sequenz-Abbildung zeigt die Nukleinsäuresequenz des Zinkfingerproteins aus den DNA-Sequenzmotiven von 7 Zink- fingerpeptiden (N= G, A, T oder C) :

NNNTGTNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNGACAGTGGTAATCTTCAA ACT- CACNNNNNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNN TGTNNNGAAAGTAGTCATCTTCAAACTCACNNNNNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGT NNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNCGTTCTGATTCTCTTCAAAATCACNNN NNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNN GATTCTTCTCATCTTCAAAATCACNNNNNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGT NNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNCAATCTGATTCTCTTCAAAATCACNNNNNNNNN -

CACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNCGT TCT GGTAATCTTCAAGAACACNNNNNNNNNCACNNNNNNNNNNNNNNNTGTNNNTGTNNNNNN NNNTGTNNNNNNNNNTGTNNNGAATCTGGTAATCTTCAAACTCACNNNNNNNNNCACNNN

NNNNNNNNN (SEQ-ID-Nr. 3)

Die entsprechenden Gensequenzen bzw. Aminosäuresequenzen der Zinkfingerproteine für die R- und L-Promotoren leiten sich analog zu o. g. Beispiel von ihrer jeweiligen DNA-Sequenz für den dort bindenden Zinkfinger logisch ab (vgl. EP 1707575 (Al)).

BEISPIEL 2

Artifizieller Zinkfinger als Transkriptionsfaktor für die Blockade der RNA-Synthese eines erp-Gens von Borrelia burgdorferi

Die erp-Gene sind auf einem Prophagengenom von Borrelia burgdorferi kodiert. Die Expressionsprodukte finden sich bei Bor- rellien als Membranproteine wieder. Diese können den sog.

Faktor-H binden, der das Complement-System (Teil des Immunsystems) inhibiert. Dies ist der Mechanismus mit dem sich Borrelia im Wirtsorganismus "tarnt" und so einer Immunabwehr, d.h. letztlich einer Phagozytose, entzieht. Durch die Blocka- de der Expression der erp-Gene wären die Erreger im Wirtsorganismus für die Immunabwehr wieder zugänglich und könnten so durch körpereigene Mechanismen wieder aus dem System entfernt werden.

Um die RNA-Synthese der erp-Gene zu blockieren, wird ein

Zinkfinger benötigt, der sich in der Promotorregion der erp- Gene an die DNA anheftet und so die Polymerase daran hindert, entsprechende mRNA zu transkribieren. Die als Anheftungsregi-

on ausgewählte genomische DNA-Sequenz für den hier verwendeten spezifischen Zinkfinger ist ein 18-Basenpaarfragment :

Promotorsequenz von erpA aus B.burgdorferi (Zinkfingerbinde- stelle in Großbuchstaben, unterstrichen)

aaatcctctccttgaaggtgttacttttaaattaagtaaaagtaataaaaatagata aa- aatagtaatttatattgtaccaaaaacgaaaaattttagtcaaattttgtgagttct- cattgcatgagaaatttgggttgtagggaggctgttataaatagaatgggcattttct- gagggtgteggetaagaaagactacataetttagetaatatatageaaagaetttga- aatttaatttgtatgtgttttatagtcttttgtaatgagtagtgcatttgcaatggaga- gattttggggagttgtttaaaattacatttgcgttttgttaaaatgtaacagctgaatg- taacaaaattatatatttaAATCTTTGAAATATTGCAtttattatgtattgtggtatga ttaggacttatggagaaattt (SEQ-ID-Nr. 4)

Die sich hieraus ergebende Aminosäuresequenz für den artifi- ziellen Zinkfinger (Bindedomäne unterstrichen) stellt sich wie folgt dar:

MLEPGEKPYKCPECGKSFSQSGDLRRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSHKNALQNH QRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGNLTVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQAGHLAS HQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGALTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGNLTV HQRTHTGKKTS (SEQ-ID-NR. 5)

Die Aminosäuren, die nicht Bestandteil der jeweiligen Erkennungssequenzen bzw. Zinkfinger-Consensus-Sequenzen sind, können ohne Funktionsverlust auch durch andere Aminosäuren ersetzt werden.

Daraus ergibt sich die zu klonierende Nukleinsäuresequenz z.B. als ein 531-Basenpaarfragment wie folgt:

atgctggaaccgggtgaaaagccgtacaaatgtccggaatgtgggaaatcgttctca ca gtctggcgatttacgccgtcaccaacgcacccataccggtgagaaaccctacaaatgtc ccgaatgcggaaagagcttctctcacaaaaatgccctccagaaccatcagcgcacacat

accggcgaaaagccgtataagtgcccagagtgtgggaagagcttctcaaccaccggc aa tctgacggttcaccagcggacacacaccggcgaaaaaccgtacaaatgcccggaatgtg gcaagagcttttcgcaagcaggtcatctggcgagtcatcagcgtactcacactggtgag aaaccgtataaatgcccagaatgcggtaaatcgtttagcaccactggtgctttgaccga acaccagcgtacccatacgggagagaaaccttataagtgccctgaatgcgggaaatcct tttccacgacaggcaacctgacggtgcatcaacgcactcatacgggcaagaaaacgagt (SEQ-ID-Nr. 6)

Für die Klonierung des erp-sequenzspezifischen Zinkfingers bzw. dessen kodierender DNA-Sequenz wird der Borellien- spezifische Phage phiBB-1 verwendet .