Genetisch veränderte Zellen von Methylobacteriaceae zur fermentativen Produktion von Glycolsäure und Milchsäure aus Cx-Verbindungen

Die vorliegende Erfindung betrifft eine genetisch veränderte Zelle aus der Familie der Methylobacteriaceae umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz, ein Verfahren zur Herstellung der genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle, einen Biokatalysator umfassend die genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, einen Bioreaktor umfassend den Biokatalysator umfassend die genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, ein Verfahren zur Herstellung eines Produkts enthaltend Glycolsäure und ein Verfahren zur Herstellung von Polyglycol säure, Polymilchsäure oder Polylactid-co-Glycolid.

Glycolsäure, auch Hydroxyessigsäure oder Hydroxyethansäure, ist eine organische Carbonsäure mit zwei Kohlenstoffatomen, die als funktionelle Gruppen eine Carboxygruppe und am C2-Atom eine Hydroxygruppe enthält. Glycolsäure findet vielfältige Verwendung in der Textilindustrie, beispielsweise als Färbe- und Gerbmittel, in der Lebensmittelindustrie, beispielsweise als Geschmacks- und Konservierungsmittel oder Verpackungsmaterial sowie in der pharmazeutischen Industrie, beispielsweise als Hautpflegemittel (Salusjärvi, L. et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103(6): p. 2525-2535; im Folgenden Salusjäryi et al.). In der Polymerindustrie kann Glycolsäure zusammen mit Milchsäure zu einem Co-Polymer (Polylactid-co-Glycolid) oder in der Medizintechnik als Polyglycol säure zu einem vom Körper resorbierbaren Nahtmaterial verarbeitet werden (Salusjäryi et al.; Jem, K.J. and B. Tan, Advanced Industrial and Engineering Polymer Research, 2020. 3(2): p. 60-70; im Folgenden Jem et al.). Derzeit wird Glycolsäure industriell nahezu nur petrochemisch aus fossilen Rohstoffen über Formaldehyd, Kohlenstoffmonoxid und Wasser hergestellt. Es wird intensiv nach nachhaltigen Wegen gesucht, wie die wirtschaftlich relevante Verbindung Glycolsäure unabhängig von fossilen Ressourcen aus erneuerbaren Rohstoffen hergestellt werden kann.

Die Produktion von Glycolsäure aus erneuerbaren Substraten, wie D-Glucose, D-Xylose, D- Arabinose, L-Lyxose, L-Arabinose, Acetate oder Ethanol, über mikrobielle Fermentation ist bekannt, aber industriell noch nicht etabliert (Salusjäryi et al., Jem et al., Gädda, T.M. et al., Appita Journal, 2014. 67(1): p. 12). Diese Substrate werden aus biogenen Rohstoffen gewonnen. Daher besteht bei der Nutzung solcher Substrate ein Nachhaltigkeitsrisiko, da Rohstoffe zur chemischen Produktion eingesetzt werden, die auch zur Produktion von Nahrungs- und Futtermitteln verwendet werden können, wie Bioethanol.

Die Synthese von Glycolsäure ist biotechnologisch gut zugänglich aus Substraten wie Hexosen, Pentosen oder beispielsweise Glycolnitril, offenbart in der US 7,198,927 B2, Formaldehyd und Cyanwasserstoff, offenbart in der EP 1 828 393 Bl oder Ethylenglykol, offenbart in der EP 2 025 760 Bl. Im Gegensatz dazu ist die direkte biotechnologische Synthese von Glycolsäure aus CO2 biotechnologisch schwer zugänglich. Dies unter anderem aufgrund der inhärenten Limitierung der Effizienz des photosynthetischen Stoffwechsels beziehungsweise des Gas- Flüssig-Massentransfers der Gasfermentation. Die letztgenannten beiden Ansätze werden weiterhin durch niedrige Ausbeuten und Umsatzraten und die Zahl der dafür verfügbaren und genetisch zugänglichen Mikroorganismen limitiert (Frazäo, C.J.R. and T. Walther, Chemie Ingenieur Technik, 2020. 92(11): p. 1680-1699, sowie Kang, N.K., M. Kim, K. Baek, Y.K. Chang, D.R. Ort, and Y.-S. Jin, Chemical Engineering Journal, 2022. 433: p. 133636).

Biotechnologisch nutzbare Intermediate, wie Methanol oder Ameisensäure, können auf verschiedenen Wegen aus CO2 hergestellt werden (Bohlen, et al., Electrochemistry Communications, 2020. 110: p. 106597; Bowker, M., ChemCatChem, 2019, 11(17): p. 4238- 4246; Lenärd-Istvan Csepei, F.S. et al., F.-G.z.F.d.a.F. e.V., Editor, 2016: Germany) und werden im Folgenden auch als Cx- Verbindungen bezeichnet.

Cx- Verbindung en, beispielsweise Methanol oder Ameisensäure oder auch Mischungen dieser beiden Substrate, können von methylotrophen Mikroorganismen als Energiequelle verwendet werden, um diese für den Aufbau von Biomasse oder Wertprodukten, insbesondere chemischen Produkten zu nutzen. Im zentralen Kohlenstoffmetabolismus von methylotrophen Mikroorganismen werden Cx- Verbindungen wie Methanol oder Ameisensäure als Substrat aufgenommen. In ersten Reaktionsschritten wird beispielsweise Methanol zu Ameisensäure oxidiert. Dabei entstehen die im Metabolismus benötigten Redox-Äquivalente Cytochrom-C in seiner reduzierten Form und NAD(P)H. Nachfolgend kann Ameisensäure entweder zu CO2 oxidiert oder (wie auch Formaldehyd) in den Serinzyklus eingeschleust werden. Der Serinzyklus dient dem methylotrophen Mikroorganismus als Verteilerkreis des Kohlenstoffs und stellt die hauptsächlich benötigten Präkursoren für die Biomasse-Synthese bereit. Außerdem ist der Serinzyklus Anknüpfungspunkt für weitere Stoffwechselwege, die zwingend für das Wachstum auf Cx- Verbindungen benötigt werden. Beispielsweise wird im Serinzyklus durch den angeknüpften Ethylmalonyl-CoA-Stoffwechselweg das Intermediat Glyoxylat regeneriert. Das Serinzyklus-Intermediat Glyoxylat kann durch Reduktion mit NADH oder NADPH gekoppelt an eine Glyoxylat-Reduktase (ghrA) in Glycolsäure überführt werden. Glyoxylat-Reduktasen (ghrA) gehören gemeinsam mit Hydroxypyruvat-Reduktasen (ghrB) zu den Glyoxylat-/Hydroxypyruvat-Reduktasen (ghr).

Es ist bekannt, dass im M. extorquens TK 0001 -Genom eine DNA-Sequenz vorhanden ist, die eine endogene Glyoxylat-Reduktase (EC: 1.1.1.26, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LT962688) codiert. Der Wildtypstamm von M. extorquens TK 0001 produziert trotz Präsenz der endogenen Glyoxlat-Reduktase-DNA- Sequenz und von Glyoxylat als Ausgangsverbindung im Stoffwechsel allerdings keine über HPLC oder GC-MS messbaren Mengen an Glycolsäure.

Wünschenswert ist die Bereitstellung einer fermentativen Produktion von Glycolsäure aus Cx- Verbindungen wie Methanol oder Ameisensäure und von Mitteln dazu, insbesondere methylotrophen Mikroorganismen, die befähigt sind, solche Cx- Verbindungen, beispielsweise Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu Glycolsäure umzusetzen. Wünschenswert ist auch die Bereitstellung eines Verfahrens, gemäß dem Glycolsäure über eine integrierte Prozesskaskade auf vollständig erneuerbare Weise aus CO2 als einzigem Rohstoff gewonnen werden kann, also ohne den Verbrauch fossiler oder biogener Ressourcen.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem liegt daher darin, die vorgenannten Nachteile zu überwinden. Insbesondere liegt das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem darin, eine biologische Zelle bereitzustellen, die es ermöglicht, ein Ausgangsmaterial, im Folgenden auch Edukt genannt, enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure umzusetzen. Insbesondere liegt das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem darin, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die es ermöglichen, solch eine Zelle zu erhalten, insbesondere solche Mittel und Verfahren, die kostengünstig und leicht handhabbar sind. Insbesondere liegt das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem darin, Mittel und Verfahren, insbesondere ein kostengünstiges und leicht handhabbares Verfahren, bereitzustellen, um ein Produkt enthaltend Glycolsäure zu erhalten. Insbesondere liegt das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem darin, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die eine nachhaltige Synthese von Glycolsäure ermöglichen, die nahezu vollständig ohne, insbesondere ohne, die Nutzung fossiler Ressourcen und/oder nahezu vollständig ohne, insbesondere ohne, biogene Rohstoffe auskommt und vorzugsweise von CO2 als einzigem Rohstoff ausgehen. Insbesondere ist es ein technisches Problem der vorliegenden Erfindung, derartige Mittel und Verfahren bereitzustellen, die kostengünstig, umweltschonend und leicht handhabbar sind. Darüber hinaus liegt der vorliegenden Erfindung insbesondere das technische Problem zugrunde, Mittel und Verfahren bereitzustellen, die ein Erhalten von Polyglycol säure, Polymilchsäure oder Polylactid-co-Glycolid ermöglichen.

Das technische Problem wird durch die Lehren der unabhängigen Ansprüche, der abhängigen Ansprüche sowie der Lehre der Beschreibung gelöst, insbesondere durch eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz.

Erfindungsgemäß ist demgemäß vorgesehen, eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae- Zelle bereitzustellen, also eine Zelle, die durch mindestens eine genetische Veränderung vom Methylobacteriaceae-Wildtypstamm abweicht. Weiter ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass die genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle mindestens eine exogene Nucleinsäuresequenz umfasst, wobei die Nucleinsäuresequenz eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codiert. Die genetische Veränderung des Wildtypstamms der Methylobacteriaceae-Zelle ist demgemäß mindestens die genetische Integration mindestens einer exogenen Nucleinsäuresequenz in die Methylobacteriaceae-Zelle, wobei die exogene Nucleinsäuresequenz eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codiert. Die exogene Nucleinsäuresequenz kann synthetischen Ursprungs sein oder natürlicherweise vorkommen, insbesondere in Escherichia. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase codierende Nucleinsäuresequenz, welche natürlicherweise vorkommt oder eine codon-optimierte, insbesondere Methylobacteriaceae-codon-optimierte, insbesondere Methylorubrum-codeon- optimierte oder Methylobacterium-codon-optimierte, insbesondere Methylorubrum extorquens-codon-optimierte, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001-, Methylorubrum extorquens PA1- oder Methylorubrum AMI -codon optimierte Nucleinsäuresequenz.

Überraschenderweise ermöglicht es eine solche erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle eine Cx-Verbindung zu Glycolsäure umzusetzen, insbesondere ein Ausgangsmaterial, nämlich einem Edukt enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere zu über HPLC oder GC-MS messbaren Mengen, umzusetzen. Der Wildtypstamm der Methylobacteriaceae-Zelle, der lediglich eine endogene, eine Glyoxylat- Reduktase codierende Nucleinsäuresequenz aufweist, ist hingegen nicht in der Lage, eine Cx- Verbindung zu Glycolsäure umzusetzen, insbesondere das Ausgangsmaterial, nämlich ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere zu über HPLC oder GC-MS messbaren Mengen, umzusetzen.

Die vorliegende Erfindung stellt also eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle bereit, die in der Lage ist, ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure umzusetzen. Cx- Verbindungen stellen vorteilhafterweise erneuerbare, aber nicht-biogene Substrate für biotechnologische Prozesse dar, die darüber hinaus durch ihren flüssigen Zustand einfach handhabbar und, anders als Gase, nicht im Massentransfer in flüssigen Reaktionsgemischen limitiert sind und werden durch die erfindungsgemäße Lehre für die Glycol säure-Herstellung besonders leicht zugänglich gemacht. Glycolsäure kann so erfindungsgemäß vollständig erneuerbar aus CO2 hergestellt werden, sofern die CO2- Umwandlung zu einer Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, mit erneuerbarer Energie betrieben wird. Auf diese Weise gelingt vorteilhafterweise die Verbindung von PtX-Prozessen (Power-to-X) mit Biotechnologie zu einem beispielhaften PtXtY-Prozess (Power-to-X-to-Y).

Die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle kann demgemäß vorteilhafterweise in einem Verfahren zur Herstellung von Glycolsäure aus mindestens einer Cx- Verbindung, insbesondere zur Herstellung eines Produkts enthaltend Glycolsäure unter Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, eingesetzt werden. Bevorzugt weist das durch die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle erhaltene Produkt enthaltend Glycolsäure zusätzlich neben Glycolsäure Milchsäure auf. Erfindungsgemäß wird ein besonders einfaches, leicht handhabbares und kostengünstiges Herstellungsverfahren für ein Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, bereitgestellt, sodass ein hoher apparativer und kostenbezogener Aufwand vermieden wird. Die vorliegende Erfindung ist auch insofern vorteilhaft, als dass sie die sich häufig an eine Glycolsäure- Bereitstellung, insbesondere Glycolsäure- und Milchsäure-Bereitstellung, anschließende Polymerisation von Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, zur Herstellung von Polyglycol säure, insbesondere Polyglycol säure, Polymilchsäure oder Polylactid-co- Glycolid, ermöglicht, und demgemäß die Herstellung von Polyglycol säure, insbesondere Polygly col säure, Polymilchsäure oder Polylactid-co-Glycolid ermöglicht, ohne dass kostenintensive und umfangreiche Verfahrensschritte durchgeführt werden müssten.

Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, kann durch die in der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle vorhandene, exogene Glyoxylat-Reduktase, codiert durch die mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz im Serinzyklus der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle eine Cx-Verbindung zu Glycolsäure umgesetzt werden, insbesondere ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere in über HPLC oder GC-MS messbare Mengen, umgesetzt werden. Bevorzugt setzt die endogen im Wildtypstamm codierte Glyoxylat-Reduktase der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle im Metabolismus des Wildtypstamms keine über HPLC oder GC-MS messbaren Mengen, insbesondere kein, Edukt enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure um, sodass die Glyoxylat-Reduktase-Aktivität allein durch die erfindungsgemäß vorgesehene Integration der exogenen Glyoxylat-Reduktase codierenden Nucleinsäuresequenz in genomischer oder episomaler Form und deren Expression steuerbar ist.

Die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle ist also durch die enzymatische Aktivität der exogenen Glyoxylat-Reduktase gekennzeichnet, insbesondere ihre durch das Vorhandensein der exogenen Glyoxylat-Reduktase bewirkte Fähigkeit, eine Cx- Verbindung zu Glycolsäure umzusetzen, insbesondere ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, insbesondere in einem Reaktionsmedium, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure umsetzen zu können, insbesondere in einem flüssigen Reaktionsmedium umsetzen zu können, insbesondere diese Reaktion enzymatisch zu katalysieren.

Die genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle zeichnet sich bevorzugt demgemäß dadurch aus, dass sie, insbesondere ihr Genom, dem Wildtypstamm der Methylobacteriaceae- Zelle gleicht, insbesondere identisch zu dieser ist, bis auf das Vorhandensein mindestens einer exogenen, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierenden Nucleinsäuresequenz, die der erfindungsgemäßen Methylobacteriaceae-Zelle die erfindungsgemäß vorteilhafte enzymatische Aktivität verleiht, und gegebenenfalls damit verbundener exogener Nucleinsäuresequenzen eines Expressionsvektors oder einer Expressionskassette. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können in einer erfindungsgemäßen Methyl ob acteriaceae, insbesondere ihrem Genom, zusätzlich zu der mindestens einen, die Glyoxylat-Reduktase codierenden Nucleinsäuresequenz weitere, insbesondere gentechnisch erzeugte genetische Veränderungen im Vergleich zum Wildtypstamm vorliegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Bakterium Escherichia coli, insbesondere E. coli K-12 MGI 655.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Methylobacteriaceae-Zelle eine Methylorubrum-Zelle, insbesondere eine Zelle von Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001, insbesondere Methylorubrum extorquens PA1, Methylorubrum extorquens AMI, Methylorubrum rhodesianum oder Methylorubrum zatmanii.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle eine genetisch veränderte Methylorubrum extorquens AMl-Zelle, genetisch veränderte Methylorubrum extorquens TK 0001-Zelle, oder eine genetisch veränderte Methylorubrum extorquens PA1 -Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus einem Bakterium Escherichia coli, insbesondere E. coli K-12 MGI 655 codierende Nucleinsäuresequenz.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Methylobacteriaceae-Zelle eine Methylobacterium-Zelle, insbesondere eine Zelle von Methyl ob acterium organophilum oder Methyl ob acterium radiotolerans.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Methylobacteriaceae-Zelle eine Methylorubrum-Zelle, insbesondere eine Zelle von Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens AMI, Methylorubrum extorquens TK 0001, Methylorubrum extorquens PA1, Methylorubrum rhodesianum oder Methylorubrum zatmanii, oder eine Methylobacterium-Zelle, insbesondere eine Zelle von Methyl ob acterium organophilum oder Methyl ob acterium radiotolerans.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die exogene Glyoxylat-Reduktase durch eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 oder einem funktionalen Nucleinsäuresequenz-Äquivalent davon codiert, wobei das funktionale Nucleinsäuresequenz -Äquivalent eine Nucleinsäuresequenzidentität von mindestens 30,0 %, bevorzugt 30,0 bis 99,9 %, bevorzugt 40,0 bis 99,9 %, bevorzugt 50,0 bis 99,9 % , bevorzugt 60,0 bis 99,9 %, bevorzugt 70,0 bis 99,9 %, bevorzugt von 76,0 bis 99,9 %, bevorzugt von 80,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,9 %, bevorzugt 95,0 bis 99,9 %, bevorzugt 98,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,0 % zu der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 aufweist und wobei die davon codierte Glyoxylat-Reduktase in der Lage ist, ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure umzusetzen. Bevorzugt beträgt die Nucleinsäuresequenzidentität mindestens 76,0 zu der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung also eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere eine Methylorubrum-Zelle oder Methylobacterium-Zelle, umfassend eine eine exogene Glyoxylat- Reduktase codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung also auch eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere Methylorubrum-Zelle oder Methylobacterium-Zelle, umfassend ein funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der mindestens einen exogenen, eine Glyoxylat-Reduktase codierenden Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3, wobei das funktionale Nucleinsäuresequenz-Äquivalent eine Nucleinsäuresequenzidentität von mindestens 30,0 %, bevorzugt 30,0 bis 99,9 %, bevorzugt 40,0 bis 99,9 %, bevorzugt 50,0 bis 99,9 %, bevorzugt 60,0 bis 99,9 %, bevorzugt 70,0 bis 99,9 %, bevorzugt 76,0 bis 99,9 %, bevorzugt 80,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,9 %, bevorzugt 95,0 bis 99,9 %, bevorzugt 98,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,0 % zu der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 aufweist und wobei die davon codierte Glyoxylat-Reduktase in der Lage ist, ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure umzusetzen.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung weist das funktionale Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 eine Nucleinsäuresequenz mit einer Länge von mindestens 800, bevorzugt mindestens 850, bevorzugt mindestens 900, bevorzugt mindestens 950, bevorzugt mindestens 970 Nucleinsäuren auf. Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Sequenzidentität der Nucleinsäuresequenz des Nucleinsäuresequenz-Äquivalents der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 zu der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 über die gesamte Länge der Nucleinsäuresequenz des Nucleinsäuresequenz-Äquivalents der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 angegeben.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung ist die Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 eine codon-optimierte, insbesondere eine Methylorubrum-, insbesondere Methylorubrum extorquens-, insbesondere Methylorubrum extorquens AMI, Methylorubrum extorquens TK 0001-, insbesondere eine Methylorubrum extorquens PA1 -codon-optimierte Nucleinsäuresequenz der nativen, also natürlicherweise vorkommenden Nucleinsäuresequenz aus Escherichia, insbesondere E. coli, die die Glyoxylat- Reduktase aus Escherichia, insbesondere E. coli codiert. Die native Nucleinsäuresequenz aus Escherichia, die die Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia codiert, weist die Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 auf und stellt ein funktionales Nucleinsäuresequenz- Äquivalent der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 dar.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung weist das funktionale Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 die Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung codiert die exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere gemäß SEQ ID Nr. 3 oder einem funktionalen Nucleinsäuresequenz-Äquivalent davon, zum Beispiel gemäß SEQ ID Nr. 1, eine Glyoxylat-Reduktase umfassend eine, insbesondere bestehend aus einer, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 oder eines funktionalen Aminosäuresequenz-Äquivalents davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die exogene Glyoxylat-Reduktase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 oder eines funktionalen Aminosäuresequenz-Äquivalents davon auf, wobei das funktionale Aminosäuresequenz- Äquivalent eine Aminosäuresequenzidentität von mindestens 30,0 % insbesondere 30,0 bis 99,9 %, bevorzugt 40,0 bis 99,9 %, bevorzugt 50,0 bis 99,9 %, bevorzugt 60,0 bis 99,9 %, bevorzugt 70,0 bis 99,9 %, bevorzugt von 76,0 bis 99,9 %, bevorzugt von 80,0 bis 99,9 %, bevorzugt 85,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,9 %, bevorzugt 95,0 bis 99,9 %, bevorzugt 98,0 bis 99,9 %, zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 aufweist. Bevorzugt beträgt die Aminosäuresequenzidentität mindestens 90,0 % zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere Methylorubrum- Zelle oder Methylobacterium-Zelle, umfassend ein funktionales Aminosäuresequenz- Äquivalent der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2, wobei das funktionale Aminosäuresequenz -Äquivalent eine Aminosäuresequenzidentität von mindestens 30,0 %, insbesondere 30,0 bis 99,9 %, bevorzugt 40,0 bis 99,9 %, bevorzugt 50,0 bis 99,9 %, bevorzugt 60,0 bis 99,9 %, bevorzugt 70,0 bis 99,9 %, bevorzugt 76,0 bis 99,9 %, bevorzugt 80,0 bis 99,9 %, bevorzugt 85,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,9 %, bevorzugt 95,0 bis 99,9 %, bevorzugt 98,0 bis 99,9 %, zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 aufweist und das in der Lage ist, ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycol säure umzusetzen.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung weist das funktionale Aminosäuresequenz-Äquivalent der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 eine Aminosäuresequenz mit einer Länge von mindestens 300, bevorzugt mindestens 310, bevorzugt mindestens 320, bevorzugt mindestens 325 Aminosäuren auf. Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Sequenzidentität der Aminosäuresequenz des Aminosäuresequenz- Äquivalents der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 über die gesamte Länge der Aminosäuresequenz des Aminosäuresequenz- Äquivalents der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 2 angegeben.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Cx-Verbindung eine Cx-Verbindung mit x = 1, 2 oder 4, insbesondere x=l.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Cx-Verbindung Ameisensäure, Methanol, Methan, Methylamin, Essigsäure oder Bernsteinsäure oder eine Mischung davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Cx-Verbindung Methanol.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Cx-Verbindung Ameisensäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Edukt mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere Ameisensäure, Methanol, Methan, Methylamin, Essigsäure oder Bernsteinsäure oder eine Mischung davon, insbesondere besteht das Edukt aus mindestens einer Verbindung davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das durch die Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung erhaltene Produkt Glycolsäure, insbesondere besteht aus dieser.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das durch die Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung erhaltene Produkt Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere besteht aus diesen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Glycolsäure enthaltende Produkt Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere 1 bis 99 Gew.-%, insbesondere 2 bis 98 Gew.-%, insbesondere 10 bis 90 Gew.-%, insbesondere 30 bis 80 Gew.-%, insbesondere 40 bis 70 Gew.-%, insbesondere 50 Gew.-%, insbesondere 60 Gew.-% Glycolsäure und insbesondere 1 bis 99 Gew.-%, insbesondere 2 bis 98 Gew.-% insbesondere 10 bis 90 Gew.-%, insbesondere 20 bis 70 Gew.-%, insbesondere 30 bis 60 Gew.-%, insbesondere 50 Gew.-%, insbesondere 40 Gew.-% Milchsäure (jeweils bezogen auf Gesamttrockengewicht des erhaltenen Produkts) oder besteht aus diesen Anteilen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Wachstumsrate gmax einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, mindestens 0,05 h’ ¹ , mindestens 0,10 h’ ¹ , insbesondere mindestens 0,15 h’ ¹ , insbesondere mindestens 0,18 h’ ¹ , insbesondere mindestens 0,20 h’ ¹ , insbesondere mindestens 0,21 h’ ¹ , insbesondere 0,10 bis 0,30 h’ ¹ , insbesondere 0,15 bis 0,25 h’ ¹ , insbesondere 0,20 bis 0,22 h’ ¹ , insbesondere 0,21 h' ¹ .

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt der Titer eines Reaktionsmediums enthaltend das Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, der nach der Umsetzung von einem Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol durch eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ Edukt, insbesondere nach 40 h Reaktionszeit, erhalten wird mindestens 0,01 g L’ ¹ , mindestens 0,10 g L’ ¹ , insbesondere mindestens 0,15 g L’ ¹ , insbesondere mindestens 0,20 g L’ ¹ , insbesondere mindestens 0,25 g L’ ¹ , insbesondere mindestens 0,50 g L- ¹ , insbesondere mindestens 0,75 g L’ ¹ , insbesondere mindestens 1,00 g L’ ¹ und insbesondere 1,50 g L' ¹ (jeweils bezogen auf Gewicht des Produkts pro Liter Reaktionsmedium). In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ des Edukts mit einer Biotrockenmasse-Substrat- Ausbeute (Yx/s) von mindestens 10 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 50 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 100 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 150 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 200 mg g’ ¹ , insbesondere 10 bis 350 mg g’ ¹ , insbesondere 50 bis 320 mg g’ ¹ , insbesondere 100 bis 300 mg g’ ¹ , insbesondere 200 bis 300 mg g’ ¹ , insbesondere 280 mg g' ¹ um (jeweils bezogen auf Biotrockenmasse erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle pro Gramm des Edukts).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sinkt die Biotrockenmasse- Substrat-Ausbeute (Yx/s) einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle in Relation zu der Biotrockenmasse-Substrat-Ausbeute (Yx/s) des Wildtypstamms bei der Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ des Edukts auf weniger als 95 %, insbesondere weniger als 90 %, insbesondere weniger als 80 %, insbesondere weniger als 70 %, insbesondere auf 68 %.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ des Edukts, mit einer Produkt-Substrat- Ausbeute (Yp/s) von mindestens 10 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 50 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 80 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 100 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 110 mg g’ ¹ , insbesondere 10 bis 200 mg g’ ¹ , insbesondere 50 bis 180 mg g’ ¹ , insbesondere 80 bis 150 mg g’ ¹ , insbesondere 100 bis 130 mg g’ ¹ , insbesondere 120 mg g' ¹ um (jeweils bezogen auf Gewicht des Produkts pro Gramm Edukt).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ des Edukts mit einer Produkt-Biotrockenmasse- Ausbeute (Yp/x) von mindestens 0,10 g g’ ¹ , insbesondere mindestens 0,20 g g’ ¹ , insbesondere mindestens 0,30 g g’ ¹ , insbesondere mindestens 0,40 g g’ ¹ , insbesondere mindestens 0,50 g g’ ¹ , insbesondere 0,10 bis 0,80 g g’ ¹ , insbesondere 0,20 bis 0,70 g g’ ¹ , insbesondere 0,30 bis 0,60 g g’ ¹ , insbesondere 0,40 bis 0,50 g g’ ¹ , insbesondere 0,50 g g’ ¹ um (jeweils bezogen auf Gewicht des Produkts pro Gramm Biotrockenmasse erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz, welche natürlicherweise vorkommt oder eine codon-optimierte, insbesondere Methylobacteriaceae-codon-optimierte Nucleinsäuresequenz, insbesondere eine Methylobacterium-, insbesondere Methylorubrum-, insbesondere Methylorubrum extorquens-, insbesondere Methylorubrum extorquens AMI, Methylorubrum extorquens TK 0001 -oder Methylorubrum extorquens PAI -codon optimierte Nucleinsäuresequenz.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere aus mindestens einem Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337, und Rhodobacter sphaeroides, insbesondere Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle eine genetisch veränderte Methyl ob acteriacea- Zelle, insbesondere eine Methylorubrum extorquens AMI, Methylorubrum extorquens PA1, Methylorubrum extorquens TK 0001 -Zelle, umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus einem Bakterium Escherichia coli, insbesondere E. coli K-12 MG1655, codierende Nucleinsäuresequenz und mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl- CoA-codierende Nucleinsäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere eine Methylorubrum extorquens AMI, Methylorubrum extorquens PA1, Methylorubrum extorquens TK 0001 -Zelle, umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus einem Bakterium Escherichia coli K- 12 MGI 655 codierende Nucleinsäuresequenz und mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus einem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende Nucleinsäuresequenz.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere eine Methylorubrum extorquens AMI, Methylorubrum extorquens PA1, Methylorubrum extorquens TK 0001 -Zelle, umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus einem Bakterium Escherichia coli K- 12 MGI 655 codierende Nucleinsäuresequenz und mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus einem Bakterium Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 codierende Nucleinsäuresequenz.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung also auch eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, die mindestens zwei verschiedene exogene Nucleinsäuresequenzen umfasst, also eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, die neben der mindestens einen exogenen, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz mindestens eine weitere exogene Nucleinsäuresequenz umfasst, welche eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codiert.

Überraschenderweise ermöglicht eine solche erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle eine erhöhte Glycolsäureausbeute, insbesondere Glycolsäure- und Milchsäureausbeute, im Vergleich zu der Glycolsäureausbeute, insbesondere Glycolsäure- und Milchsäureausbeute, erhalten durch die Umsetzung von einem Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, durch eine erfindungsgemäße Methylobacteriaceae-Zelle, umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz, die keine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz aufweist, insbesondere keine aus mindestens einem Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337, und Rhodobacter sphaeroides, insbesondere Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, codierende Nucleinsäuresequenz. Die Erfindung erhöht daher besonders überraschend nicht nur die Glycolsäureausbeute, sondern auch die Milchsäureausbeute.

Bevorzugt ist der Umsatz von Cx- Verbindungen zu Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, durch eine erfindungsgemäße Methylobacteriaceae-Zelle, umfassend zusätzlich die mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere aus mindestens einem Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337, und Rhodobacter sphaeroides, insbesondere Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, höher als der Umsatz durch eine erfindungsgemäße Methylorubrum-Zelle ohne diese mindestens eine zusätzliche exogene Nucleinsäuresequenz.

Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, wird durch die in der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle vorhandene exogene Ethylmalonyl-CoA- Mutase die Menge an Glyoxylat im Serinzyklus der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle erhöht, welches durch die in der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle vorhandene exogene Glyoxylat-Reduktase umgesetzt wird. Dies führt bevorzugt zu einer verbesserten Glycolsäureausbeute im Vergleich zu der Glycolsäureausbeute erhalten durch eine erfindungsgemäße Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz, die keine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA- Mutase codierende Nucleinsäuresequenz aufweist. Die ebenfalls beobachtete erhöhte Milchsäureausbeute beruht möglicherweise, ohne an die Theorie gebunden zu sein, auf einem komplexen Zusammenspiel mit dem Metabolismus einer Reduktionsäquivalent-Bereitstellung und einer erhöhten Verfügbarkeit des Metaboliten Pyruvat, dem Vorläufermolekül der Milchsäure.

In einer besonders bevorzugten Ausführung betrifft die vorliegende Erfindung eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend eine codon- optimierte Nucleinsäuresequenz einer Nucleinsäuresequenz aus Rhodobacter sphaeroides codierend eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase, insbesondere eine Methylobacteriaceaea-, insbesondere Methylobacterium-, insbesondere eine Methylorubrum-, insbesondere Methylorubrum extorquens-, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001, insbesondere Methylorubrum extorquens AMI, insbesondere Methylorubrum extorquens PAl-codon- optimierte Nucleinsäuresequenz, insbesondere weist sie die SEQ ID Nr. 8 auf. In einer besonders bevorzugten Ausführung betrifft die vorliegende Erfindung eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend eine codon- optimierte Nucleinsäuresequenz einer Nucleinsäuresequenz aus Methylorubrum extorquens codierend eine Ethylmalonyl -Co A-Mutase, insbesondere eine Methylobacteriaceae-, insbesondere Methylobacterium-, insbesondere Methylorubrum-, insbesondere Methylorubrum extorquens-, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001, insbesondere Methylorubrum extorquens AMI, insbesondere Methylorubrum extorquens PAl-codon- optimierte Nucleinsäuresequenz, insbesondere weist sie die SEQ ID Nr. 13 auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend ein funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent einer Nucleinsäuresequenz codierend eine Ethylmalonyl- CoA-Mutase gemäß SEQ ID Nr. 8 oder 13.

Die nativen Nucleinsäuresequenzen der Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus Methylorubrum oder Rhodobacter gemäß SEQ ID Nr. 4 und 6 werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch als funktionale Äquivalente der davon abgeleiteten, codon-optimierten Nucleinsäuresequenzen verstanden, insbesondere stellt die native Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 ein funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der codon-optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 8 und die native Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 ein funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der codon-optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 13 dar.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Ethylmalonyl- CoA-Mutase durch eine codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 13 oder 8) einer nativen Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 oder 6 oder einem funktionalen Äquivalent davon, insbesondere der nativen Nucleinsäuresequenz selbst, also eine Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 oder 6 , codiert, wobei das funktionale Nucleinsäuresequenz-Äquivalent, eine Nucleinsäuresequenzidentität von mindestens 30,0 %, bevorzugt 30,0 bis 99,9 %, bevorzugt 40,0 bis 99,9 %, bevorzugt 50,0 bis 99,9 %, bevorzugt 60,0 bis 99,9 %, bevorzugt 70,0 bis 99,9 %, bevorzugt 76,0 bis 99,9 %, bevorzugt 80,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,9 %, bevorzugt 95,0 bis 99,9 %, bevorzugt 98,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,0 % zu der codon-optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 13 oder 8 aufweist, wobei das funktionale Äquivalent die enzymatische Aktivität einer Ethylmalonyl-CoA-Mutase aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung also auch eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend ein funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der mindestens einen exogenen, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierenden codon-optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 13 oder 8, also zum Beispiel einer nativen Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 oder 6, wobei das funktionale Nucleinsäuresequenz-Äquivalent eine Nucleinsäuresequenzidentität von mindestens 30,0 %, bevorzugt 30,0 bis 99,9 %, bevorzugt 40,0 bis 99,9 %, bevorzugt 50,0 bis 99,9 %, bevorzugt 60,0 bis 99,9 %, bevorzugt 70,0 bis 99,9 %, bevorzugt 76,0 bis 99,9 %, bevorzugt 80,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,9 %, bevorzugt 95,0 bis 99,9 %, bevorzugt 98,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,0 % zu der codon-optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 13 oder 8 aufweist und wobei die veränderte Methylobacteriaceae-Zelle in der Lage ist, ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure umzusetzen.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung weist das funktionale Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der codon-optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 8 die native Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 auf.

In einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung weist das funktionale Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der codon-optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 13 die native Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Ethylmalonyl- CoA-Mutase eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 oder 7 oder eines funktionalen Äquivalents davon auf, wobei das funktionale Aminosäuresequenz-Äquivalent eine Aminosäuresequenzidentität von mindestens 30,0 %, insbesondere 30,0 bis 99,9 %, bevorzugt 40,0 bis 99,9 %, bevorzugt 50,0 bis 99,9 %, bevorzugt 60,0 bis 99,9 %, bevorzugt 70,0 bis 99,9 %, bevorzugt 76,0 bis 99,9 %, bevorzugt 80,0 bis 99,9 %, bevorzugt 85,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,9 %, bevorzugt 95,0 bis 99,9 %, bevorzugt 98,0 bis 99,9 %, zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 oder 7 und die enzymatische Aktivität einer Ethylmalonyl-CoA-Mutase aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend ein funktionales Aminosäuresequenz-Äquivalent der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 5 oder 7, wobei das funktionale Aminosäuresequenz -Äquivalent eine Aminosäuresequenzidentität von mindestens 30,0 %, insbesondere 30,0 bis 99,9 %, bevorzugt 40,0 bis 99,9 %, bevorzugt 50,0 bis 99,9 %, bevorzugt 60,0 bis 99,9 %, bevorzugt 70,0 bis 99,9 %, bevorzugt 76,0 bis 99,9 %, bevorzugt 80,0 bis 99,9 %, bevorzugt 85,0 bis 99,9 %, bevorzugt 90,0 bis 99,9 %, bevorzugt 95,0 bis 99,9 %, bevorzugt 98,0 bis 99,9 %, zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 5 oder 7 aufweist und wobei die veränderte Methylobacteriaceae-Zelle in der Lage ist, ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, umzusetzen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt die Wachstumsrate pimax einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ , insbesondere 10 g L' ¹ , eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, mindestens 0,05 h’ ¹ , mindestens 0,10 h’ ¹ , insbesondere mindestens 0,12 h’ ¹ , insbesondere mindestens 0,14 h’ ¹ , insbesondere mindestens 0,16 h’ ¹ , insbesondere 0,10 bis 0,25 h’ ¹ , insbesondere 0,12 bis 0,22 h’ ¹ , insbesondere 0,15 bis 0,20 h’ ¹ , insbesondere 0,16 h’ ¹ , insbesondere 0, 19 h' ¹ .

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beträgt der Titer eines Reaktionsmediums enthaltend das Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, der nach der Umsetzung von einem Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, durch eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ , insbesondere 10 g L' ¹ ’ des Edukts, insbesondere nach 40 h Reaktionszeit, erhalten wird mindestens 0,10 g L’ ¹ , insbesondere mindestens 0,20 g L’ ¹ , insbesondere mindestens 0,30 g L’ ¹ , insbesondere mindestens 0,40 g L’ ¹ , insbesondere 0,10 bis 80 g L’ ¹ , insbesondere 0,20 bis 70 g L’ ¹ , insbesondere 0,30 bis 60 g L’ ¹ , insbesondere 0,40 bis 55 g L’ ¹ , insbesondere 0,49 g L’ ¹ , insbesondere 0,52 g L' ¹ (jeweils bezogen auf Gewicht des Produkts pro Liter Reaktionsmedium).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Titer, der durch die Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, durch die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz, in einem Reaktionsmedium, aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ des Edukts, insbesondere nach 40 h Reaktionszeit, im Vergleich zu dem Titer erhalten durch die Umsetzung mittels der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle ohne die mindestens eine exogene eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz um mindestens 10 %, insbesondere mindestens 30 %, insbesondere mindestens 50 %, insbesondere mindestens 60 %, insbesondere 69 %, insbesondere 79 %, erhöht.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L’ ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , des Edukts mit einer Biotrockenmasse-Substrat- Ausbeute (Yx/s) von mindestens 10 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 50 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 100 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 150 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 200 mg g’ ¹ , insbesondere 10 bis 350 mg g’ ¹ , insbesondere 50 bis 320 mg g’ ¹ , insbesondere 100 bis 300 mg g’ ¹ , insbesondere 200 bis 300 mg g’ ¹ , insbesondere 210 mg g’ ¹ , insbesondere 270 mg g' ¹ um (jeweils bezogen auf Biotrockenmasse erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae- Zelle pro Gramm des Edukts).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sinkt die Biotrockenmasse- Substrat-Ausbeute (Yx/s) einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl- CoA codierende Nucleinsäuresequenz in Relation zu der Biomasse-Substrat-Ausbeute (Yx/s) des Wildtypstamms bei der Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , des Edukts, auf weniger als 95 %, insbesondere weniger als 90 %, insbesondere weniger als 80 %, insbesondere weniger als 70 %, insbesondere auf 68 %, insbesondere auf 51 %.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sinkt die Biomasse- Substrat-Ausbeute (Yx/s) einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl- CoA-codierende Nucleinsäuresequenz in Relation zu der Biomasse-Substrat-Ausbeute (Yx/s) der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle ohne die mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl -Co A-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz bei der Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , des Edukts auf weniger als 99 %, insbesondere weniger als 97 %, insbesondere auf 96 %, insbesondere auf 75 %.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Biomasse-Substrat- Ausbeute (Yx/s) einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Rhodobacter sphaeroides, insbesondere Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, codierende Nucleinsäuresequenz in Relation zu der Biomasse-Substrat- Ausbeute (Yx/s) einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337, codierende Nucleinsäuresequenz bei der Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , des Edukts um mindestens 5 %, insbesondere mindestens 10 %, insbesondere mindestens 20 %, insbesondere mindestens 25 %, insbesondere 28 % erhöht.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L’ ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , des Edukts mit einer Produkt-Substrat- Ausbeute (Yp/s) von mindestens 10 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 50 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 80 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 100 mg g’ ¹ , insbesondere mindestens 140 mg g’ ¹ , insbesondere 10 bis 250 mg g’ ¹ , insbesondere 50 bis 200 mg g’ ¹ , insbesondere 80 bis 180 mg g’ ¹ , insbesondere 100 bis 160 mg g’ ¹ , insbesondere 150 mg g' ¹ um (bezogen auf Gewicht des Produkts pro Gramm Edukt).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steigt die Produkt- Substrat- Ausbeute (Yp/s) einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz in Relation zu der Produkt-Substrat-Ausbeute (Yp/s) der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle ohne die mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz bei der Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend bis zu 10 g L' ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , des Edukts um mindestens 10 %, insbesondere mindestens 15 %, insbesondere mindestens 20 %, insbesondere 25 %.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung setzt die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz ein Edukt enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L’ ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , des Edukts mit einer Produkt-Biotrockenmasse-Ausbeute (Yp/x) von mindestens 0, 10 g g’ ¹ , insbesondere mindestens 0,30 g g’ ¹ , insbesondere mindestens 0,40 g g’ ¹ , insbesondere mindestens 0,50 g g’ ¹ , insbesondere mindestens 0,60 g g’ ¹ , insbesondere 0, 10 bis 0,99 g g’ ¹ , insbesondere 0,30 bis 0,90 g g’ ¹ , insbesondere 0,40 bis 0,80 g g’ ¹ , insbesondere 0,50 bis 0,75 g g’ ¹ , insbesondere 0,70 g g’ ¹ , insbesondere 0,71 g g' ¹ um (jeweils bezogen auf Gewicht des Produkts pro Gramm Biotrockenmasse erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle).

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung steigt die Produkt- Biotrockenmasse-Ausbeute (Yp/x) einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle umfassend zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl- CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz in Relation zu der Produkt-Biotrockenmasse- Ausbeute (Yp/x) der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle ohne die mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz bei der Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere bestehend aus Methanol, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere in einem Reaktionsmedium aufweisend eine Anfangskonzentration von bis zu 10 g L' ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , des Edukts um mindestens 10 %, insbesondere mindestens 20 %, insbesondere mindestens 30 %, insbesondere mindestens 35 %, insbesondere 40 %, insbesondere 42 %.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Methylobacteriaceae-Zelle eine Zelle von Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001 und insbesondere Methylorubrum extorquens PA1.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase codierende Nucleinsäuresequenz im Chromosom der Methylobacteriaceae-Zelle integriert oder liegt extrachromosomal vor, insbesondere liegt in der Zelle in einem episomalen Expressionsvektor oder Minichromosom integriert vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase codierende Nucleinsäuresequenz im Chromosom der Methylobacteriaceae-Zelle stabil integriert oder liegt stabil extrachromosomal vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegen im Genom der Methylobacteriaceae-Zelle mehr als eine Kopie, insbesondere 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Kopien der exogenen, eine Glyoxylat-Reduktase codierenden Nucleinsäuresequenz, vorzugsweise stabil im Chromosom integriert, oder, vorzugsweise stabil, extrachromosomal vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz im Chromosom der Methylobacteriaceae-Zelle integriert oder liegt extrachromosomal vor, insbesondere liegt in der Zelle in einem episomalen Expressionsvektor oder Minichromosom integriert vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz im Chromosom der Methylobacteriaceae-Zelle stabil integriert oder liegt stabil extrachromosomal vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegen im Genom der Methylobacteriaceae-Zelle mehr als eine Kopie, insbesondere 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Kopien der exogenen, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierenden Nucleinsäuresequenz, vorzugsweise stabil im Chromosom integriert, oder, vorzugsweise stabil, extrachromosomal vor. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle die Methylorubrum -Zelle Methylorubrum extorquens Mea-GAl, Methylorubrum extorquens Mea-GA2 oder Methylorubrum extorquens Mea-GA3, jeweils hinterlegt am 10. Juni 2022 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter den Hinterlegungsnummern DSM 34286, DSM 34287 und DSM 34288. Sämtliche Hinterlegungen erfolgten gemäß des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylorubrum extorquens TK 0001 -Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MG1655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz, insbesondere Zellen des Stamms Methylorubrum extorquens Mea-GAl hinterlegt am 10. Juni 2022 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34286.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylorubrum extorquens TK 0001 -Zelle umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA- Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende Nucleinsäuresequenz insbesondere Zellen des Stamms Methylorubrum extorquens Mea-GA2 hinterlegt am 10. Juni 2022 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34287.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylorubrum extorquens TK 0001 -Zelle umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA- Mutase aus dem Bakterium Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere Zellen des Stamms Mea-GA3 hinterlegt am 10. Juni 2022 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34288.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle eine Zelle des Stammes Methylorubrum rhodesianum Mrh-GA4 (DSM 34697), Methylorubrum rhodesianum Mrh-GA5 (DSM 34698), Methylorubrum zatmanii Mza-GA14 (DSM 34701), Methylorubrum extorquens Mea-GA17 (DSM 34702), Methyl ob acterium radiotolerans Mra-GA12 (DSM 34700) oder Methyl ob acterium organophilum Mor-GA8 (DSM 34699) jeweils hinterlegt am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland. Sämtliche Hinterlegungen erfolgten gemäß des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon - optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3), insbesondere Zellen des Stamms Methylorubrum zatmanii Mza-GA14 (M. zatmanii DSM 5688 + pTE1887-ghrA _eC o) hinterlegt am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34701.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) des Stamms Methylorubrum extorquens Mea-GA17 (M. extorquens PA1 DSM 23939 + pTE1887-ghrA _eC o) hinterlegt am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34702.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) des Stamms Methylorubrum rhodesianum Mrh-GA4 (M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887-ghrA _eC o) hinterlegt am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34697.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl- CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende native Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4), des Stamms Methylorubrum rhodesianum Mrh- GA5 (M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887-ghrA _e co-ecm _m ea) hinterlegt am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34698.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) des Stamms Methyl ob acterium organophilum Mor-GA8 (M. organophilum DSM 18172 + pTE1887-ghrA _e co-ecm _m ea) hinterlegt am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34699.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl- CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende native Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4), des Stamms Methyl ob acterium radiotolerans Mra- GA12 (M. radiotolerans DSM 760 + pTE1887-ghrA _e co-ecm _m ea) hinterlegt am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34700.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft diese die konkret hinterlegten Methylobacteriaceae-Zellen, insbesondere die konkret hinterlegten Methylorubrum-Stämme sowie jeweilige Derivate davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz funktional mit zusätzlich mindestens einer regulatorischen Einheit unter Ausbildung einer Expressionskassette verbunden, insbesondere einem Promoter, insbesondere einem induzierbaren, dereprimierbaren oder konstitutiven Promoter, einem Enhancer, einer ribosomalen Bindestelle und/oder einem Terminator.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus mindestens einem Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337, und Rhodobacter sphaeroides, insbesondere Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, codierende Nucleinsäuresequenz, funktional mit zusätzlich mindestens einer regulatorischen Einheit unter Ausbildung einer Expressionskassette verbunden, insbesondere einem Promoter, insbesondere einem induzierbaren, dereprimierbaren oder konstitutiven Promoter, einem Enhancer, einer ribosomalen Bindestelle und/oder einem Terminator.

In bevorzugter Ausführungsform liegt die Expressionskassette in einem Vektor, insbesondere Expressionsvektor, insbesondere episomalen Expressionsvektor, insbesondere pTE1887, vor.

In besonders bevorzugter Ausführungsform kann die die mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase codierende Nucleinsäuresequenz und die die mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz auf dem gleichen Expressionsvektor oder auf verschiedenen Expressionsvektoren vorliegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Promoter ein induzierbarer Promoter, insbesondere ein IPT G-induzierbarer Promoter, insbesondere der PL/O4/AI -Promoter.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle, umfassend die Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere einer Wildtypzelle, und eines Expressionsvektors oder eines Genomeditierungssystems umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere eine diese Nucleinsäuresequenz umfassende Expressionskassette, b) Transformieren der Methylobacteriaceae-Zelle mit dem Expressionsvektor oder dem Genomeditierungssystem unter Bedingungen, die die Aufnahme und, vorzugsweise stabile, anschließende Integration der mindestens einen exogenen Nucleinsäuresequenz in die Methylobacteriaceae-Zelle, ermöglichen, und c) Erhalten der mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz aufweisenden genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle.

In besonders bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein vorgenanntes Verfahren, wobei in Verfahrensschritt a) zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierende Nucleinsäuresequenz, insbesondere aus mindestens einem Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methylorubrum extorquens, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337, und Rhodobacter sphaeroides, insbesondere Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029, insbesondere eine diese Nucleinsäuresequenz umfassende Expressionskassette oder Genomeditierungssystem bereitgestellt wird, in Verfahrensschritt b) die Methylobacteriaceae-Zelle mit der exogenen, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierenden Nucleinsäuresequenz, insbesondere der diese umfassenden Expressionskassette, transformiert und in Verfahrensschritt c) eine mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aufweisende genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, die zusätzlich mindestens eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA- Mutase codierende Nucleinsäuresequenz aufweist, erhalten wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Transformieren gemäß Verfahrensschritt b) mittels chemischer, physikalischer und/oder elektrischer Transformationsverfahren, insbesondere Elektroporation, durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, die mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbar ist, insbesondere hergestellt wurde.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, wobei die Zelle lebend, tot, lyophilisiert, in Form eines Zelllysats oder eines Zellextrakts, vorliegt, und wobei das Zelllysat oder der Zellextrakt, insbesondere Proteinextrakt, gewonnen wurde aus einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die gegebenenfalls tot, lyophilisiert oder in Form eines Zelllysats oder eines Zellextrakts vorliegende erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle die erfindungsgemäß bereitgestellte Eigenschaft aufweist, mindestens eine Cx-Verbindung in einem Reaktionsmedium zu Glykolsäure und optional Milchsäure umzusetzen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung katalysiert die lebend, tot, lyophilisiert oder in Form eines Zelllysats oder eines Zellextrakts vorliegende Zelle zumindest die Umsetzung von mindestens einer Cx-Verbindung zu Glycolsäure, insbesondere die Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Biokatalysator umfassend eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle oder eine tot, lyophilisiert oder in Form eines Zelllysats oder eines Zellextrakts vorliegende erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle, wobei diese auf einem Träger angeordnet, insbesondere immobilisiert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Träger ein organischer Träger oder ein anorganischer Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Träger einen in der Natur vorkommenden organischen Träger, insbesondere besteht aus diesem, insbesondere wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Chitin, Agar, Agarose, Alginat, Carrageenan und einer Kombination davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Träger einen synthetischen organischen Träger, insbesondere besteht aus diesem, insbesondere wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polyvinylalkohol (PVA), Polyurethan, Acrylamid, Polypropylenammonium und einer Kombination davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Träger einen anorganischen Träger, insbesondere besteht aus diesem, insbesondere wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aktivkohle, Zeolith, Keramik, Ton, Anthrazit, porösem Glas und einer Kombination davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Träger eine Kompositmischung eines organischen Trägers und eines anorganischen Trägers, insbesondere umfassend oder bestehend aus Polyvinylalkohol-Natriumalginat (PVA-NA), Polyvinylalkoholguargummi (PVA-GG) oder beiden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung katalysiert der erfindungsgemäße Biokatalysator zumindest die Umsetzung von mindestens einer Cx- Verbindung zu Glycolsäure, insbesondere die Umsetzung eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere bestehend daraus, zu einem Produkt enthaltend Glycolsäure, insbesondere Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere bestehend daraus. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Bioreaktor umfassend eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle oder einen erfindungsgemäßen Biokatalysator, wobei die genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle oder der erfindungsgemäße Biokatalysator insbesondere in einem Reaktionsmedium im Bioreaktor vorliegt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Glycolsäure aus mindestens einer Cx- Verbindung, insbesondere eines Produkts enthaltend Glycolsäure aus einem Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, wobei x vorzugsweise = 1, 2 oder 4 ist, umfassend die Verfahrensschritte: x) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle oder eines erfindungsgemäßen Biokatalysators, eines Reaktionsmediums und mindestens einer Cx- Verbindung, insbesondere eines Edukts enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung, y) Umsetzen der mindestens einen Cx- Verbindung, insbesondere des Edukts, in dem Reaktionsmedium unter Bedingungen, die die Bildung von Glycolsäure aus der Cx-Verbindung ermöglichen, und z) Erhalten von Glycolsäure, insbesondere des Produkts, enthaltend Glycolsäure, aus dem Reaktionsmedium.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die in Verfahrensschritt x) bereitgestellte erfindungsgemäße Methylobacteriaceae-Zelle oder der in Verfahrensschritt x) bereitgestellte erfindungsgemäße Biokatalysator in im Reaktionsmedium suspendierter Form oder immobilisierter Form vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte und oder in Verfahrensschritt y) eingesetzte Reaktionsmedium eine wässrige salzhaltige Lösung, insbesondere ein Kulturmedium, insbesondere ein Minimalmedium, insbesondere ein Minimalmedium bestehend pro Liter Reaktionsmedium aus bis zu 10 g einer Cx Verbindung, insbesondere Methanol, Methan, Ameisensäure, Methylamin, Essigsäure oder Bernsteinsäure oder einer Mischung davon, 1 g Ammoniumsulfat, 450 mg Magnesiumsulfat- Heptahydrat, 3,2 mg Calciumchlorid-Dihydrat, 7,4 mg Trinatriumcitrat-Dihydrat, 190 pg Zinksulfat-Heptahydrat, 110 pg Manganchlorid-Tetrahydrat, 2,75 mg Eisensulfat-Heptahydrat, 1,36 mg Ammoniumheptamolybdat-Tetrahydrat, 140 pg Kupfersulfat-Pentahydrat, 260 pg Cobaltchlorid-Hexahydrat, 390 pg Natriumwolframat, 30 pg Borsäure, 2,02 g Kaliumdihydrogenphosphat und 4,14 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte Reaktionsmedium das Edukt enthaltend mindestens eine Cx- Verbindung auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte Reaktionsmedium zu Beginn von Verfahrensschritt y) das Edukt enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung in einer Konzentration von 1 bis 100 g, insbesondere 5 bis 90 g, insbesondere 6 bis 80 g, insbesondere 7 bis 70 g, insbesondere 8 bis 40 g, insbesondere 9 bis 30 g, insbesondere 10 bis 20 g Cx-Verbindung pro Liter Reaktionsmedium auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte Reaktionsmedium Coenzym B 12 auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäß eingesetzte Edukt, enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, die einzige Kohlenstoffquelle im Reaktionsmedium. Demgemäß wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Reaktionsmedium eingesetzt, das als einzige Kohlenstoffquelle für die Methylobacteriaceae- Zellen das eingesetzte Edukt, enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, aufweist.

Bevorzugt ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass das Umsetzen in Verfahrensschritt y) unter kontinuierlicher oder batchweiser Zugabe von Glyoxylat erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Cx-Verbindung des in Verfahrensschritt x) bereitgestellten und in Verfahrensschritt y) umgesetzten Edukts Ameisensäure, Methanol, Methan, Methylamin, Essigsäure, Bernsteinsäure oder eine Mischung davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Edukt aus Ameisensäure, Methanol, Methan, Methylamin, Essigsäure, Bernsteinsäure oder einer Mischung davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist x = 1 bei der Cx- Verbindung des in Verfahrensschritt x) bereitgestellten und in Verfahrensschritt y) umgesetzten Edukts enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Cx-Verbindung des in Verfahrensschritt x) bereitgestellten und in Verfahrensschritt y) umgesetzten Edukts Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Edukt aus Methanol, Ameisensäure oder einer Mischung davon.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das in

Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Edukt aus Methanol.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das in

Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Edukt aus Ameisensäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Edukt Methanol und Ameisensäure, insbesondere 1 bis 99 Gew.-%, insbesondere 2 bis 98 Gew.-%, insbesondere 10 bis 90 Gew.-%, insbesondere 30 bis 70 Gew.-%, insbesondere 40 bis 60 Gew.-%, insbesondere 50 Gew.-%, Methanol und insbesondere 1 bis 99 Gew.-%, insbesondere 2 bis 98 Gew.-% , insbesondere 10 bis 90 Gew.-%, insbesondere 30 bis 70 Gew.-%, insbesondere 40 bis 60 Gew - %, insbesondere 50 Gew.-% Ameisensäure (jeweils bezogen auf Gesamtgewicht des Edukts bereitgestellt in Verfahrensschritt x)) oder besteht aus diesen Anteilen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte Edukt enthaltend mindestens eine Cx-Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, insbesondere Methanol, zu Beginn von Verfahrensschritt y) in einer Anfangskonzentration von 1 bis 20 g L’ ¹ , insbesondere 3 bis 17 g L’ ¹ , insbesondere 5 bis 15 g L’ ¹ , insbesondere 7 bis 13 g L’ ¹ , insbesondere 9 bis 11 g L’ ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , in dem Reaktionsmedium vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Verfahrensschritt x) bereitgestellte Edukt Methanol und liegt zu Beginn von Verfahrensschritt y) in einer Anfangskonzentration von 1 bis 20 g L’ ¹ , insbesondere 3 bis 17 g L’ ¹ , insbesondere 5 bis 15 g L’ ¹ , insbesondere 7 bis 13 g L’ ¹ , insbesondere 9 bis 11 g L’ ¹ , insbesondere 10 g L’ ¹ , in dem Reaktionsmedium vor.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die in Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Cx-Verbindung, insbesondere CI -Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder eine Mischung davon, aus CO2, CO oder einer Mischung in einem Verfahrensschritt w) hergestellt, insbesondere einem Verfahrensschritt w), der mit erneuerbarer Energie betrieben wird, insbesondere elektrischer Strom aus Sonnen-, Wind-, geothermischer oder Wasserkraft- Energie.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die in Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, Ameisensäure oder Mischungen davon, aus CO2, insbesondere Synthesegas umfassend eine Mischung aus CO2, CO und H2, in einem Verfahrensschritt w) hergestellt, insbesondere mittels eines heterogen-katalytischen chemischen Verfahrens, insbesondere elektrochemischen Verfahrens.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die in Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Cx- Verbindung, insbesondere Essigsäure, aus CO2, insbesondere Synthesegas umfassend eine Mischung aus CO2, CO und H2, in einem Verfahrensschritt w) mittels Gasfermentation hergestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die in Verfahrensschritt x) bereitgestellte und in Verfahrensschritt y) umgesetzte Cx- Verbindung, insbesondere Methanol, aus CO2, insbesondere Synthesegas umfassend eine Mischung aus CO2, CO und H2, oder CO2, H2O und elektrischem Strom, oder CO2 und H2, in einem Verfahrensschritt w) mittels eines elektrochemischen Verfahrens, biochemischen Verfahrens, bioelektrochemischen Verfahrens oder Gasfermentation hergestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das in Verfahrensschritt w) verwendete CO2, insbesondere Synthesegas durch chemische Konversion, insbesondere thermo-katalytische Konversion, von organischen Stoffen oder Materialien, insbesondere von Klärschlamm und anderen biogenen Rest- und Abfall stoffen, hergestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das in

Verfahrensschritt w) verwendete Synthesegas aus Klärschlamm hergestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das in

Verfahrensschritt w) verwendete CO2 aus der Atmosphäre oder aus industriellen Abgasen gewonnen.

In bevorzugter Ausführungsform ist es also durch die vorliegende Erfindung möglich eine nachhaltige Synthese von Glycolsäure und Milchsäure zu ermöglichen, die kostengünstig umweltschonend und leicht handhabbar ist und die nahezu vollständig ohne, insbesondere ohne, die Nutzung fossiler Ressourcen und/oder nahezu vollständig ohne, insbesondere ohne, biogene Rohstoffe auskommt. Erfindungsgemäß bevorzugt wird also vorteilhafterweise Glycolsäure und Milchsäure über eine integrierte Prozesskaskade auf vollständig erneuerbare Weise aus CO2 als einzigem Rohstoff gewonnen, also ohne den Verbrauch fossiler oder biogener Ressourcen. Erfindungsgemäß bevorzugt wird also vorteilhafterweise durch die vorliegende Erfindung Glycolsäure vollständig erneuerbar aus CO2 hergestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Reaktionsmedium in Verfahrensschritt y) eine Temperatur von 20 bis 40 °C, insbesondere 22 bis 38 °C, insbesondere 24 bis 36 °C, insbesondere 28 bis 32 °C, insbesondere 30 °C, auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Verfahrensschritt y) in einer Wasserdampf-gesättigten Atmosphäre durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Reaktionsmedium zu Beginn des Verfahrensschritts y) einen pH-Wert von pH 4 bis 8, insbesondere 5 bis 7, insbesondere 6, insbesondere 6,8 auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Reaktionsmedium nach 40 h Reaktionszeit des Verfahrensschritt y) einen pH-Wert von pH 0 bis 6, insbesondere 0 bis 4, insbesondere 0 bis 3, insbesondere 1 bis 2, auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Umsetzen gemäß Verfahrensschritt y) unter mechanischer Agitation, insbesondere Schütteln oder Rühren, durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird in Verfahrensschritt y) ein Rühren bei 50 bis 1000 rpm, insbesondere 50 bis 500 rpm, insbesondere 50 bis 250 rpm, insbesondere 100 bis 200 rpm, insbesondere 150 rpm (rpm: Umdrehungen pro Minute) durchgeführt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das in Verfahrensschritt z) erhaltene Reaktionsmedium das Produkt, enthaltend mindestens Glycolsäure, auf.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das in Verfahrensschritt z) im Reaktionsmedium erhaltene Produkt, enthaltend Glycolsäure, Glycolsäure oder ein Glycolsäure und Milchsäure enthaltendes Produkt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das in Verfahrensschritt z) erhaltene Produkt Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere 1 bis 99 Gew.-%, insbesondere 2 bis 98 Gew.-%, insbesondere 10 bis 90 Gew.-%, insbesondere 30 bis 80 Gew.-%, insbesondere 40 bis 70 Gew.-%, insbesondere 50 %, insbesondere 60 Gew.-% Glycolsäure und insbesondere 1 bis 99 Gew.-%, insbesondere 2 bis 98 Gew.-% insbesondere 10 bis 90 Gew.-%, insbesondere 20 bis 70 Gew.-%, insbesondere 30 bis 60 Gew.-%, insbesondere 50 %, insbesondere 40 Gew.-% Milchsäure (jeweils bezogen auf Gesamtgewicht des in Verfahrensschritt z) erhaltenen Produkts) oder besteht aus diesen Anteilen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das in

Verfahrensschritt z) erhaltene Produkt aus Glycolsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das in

Verfahrensschritt z) erhaltene Produkt aus Glycolsäure und Milchsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nach Verfahrensschritt z) in einem Verfahrensschritt zl) das Produkt, enthaltend Glycolsäure und optional Milchsäure, aus dem Reaktionsmedium isoliert, insbesondere von dem Reaktionsmedium und der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle oder dem erfindungsgemäßen Biokatalysator abgetrennt, insbesondere durch Dekantieren, Aussalzen mit einer Base, insbesondere NaOH oder KOH, Filtrieren, insbesondere Membranfiltration oder Säulenfiltration, oder lonenaustauschchromatographie in Kombination mit HPLC, Extrahieren oder/und Destillieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung eines Produkts enthaltend Glycolsäure ein kontinuierliches Verfahren.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Polyglycol säure, Polymilchsäure oder Polylactid-co-Glycolid, umfassend das Durchführen eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Glycolsäure, insbesondere eines Produkts, enthaltend Glycolsäure und optional Milchsäure, und anschließendes Polymerisieren der aus diesen Verfahren erhaltenen Glycolsäure, Milchsäure oder Glycolsäure und Milchsäure.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „erfindungsgemäßer genetisch veränderter Methylobacteriaceae-Zelle“ eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle verstanden, die bevorzugt dem Wildtypstamm der Methylobacteriaceae-Zelle gleicht, insbesondere identisch dazu ist, mit Ausnahme des Vorhandenseins mindestens einer exogenen, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierenden Nucleinsäuresequenz, die der erfindungsgemäßen Methylobacteriaceae-Zelle die erfindungsgemäß vorteilhafte enzymatische Glyoxylat-Reduktase-Aktivität verleiht, und gegebenenfalls damit verbundener exogenen Nucleinsäuresequenzen eines Expressionsvektors oder einer Expressionskassette sowie optional der mindestens einen exogenen, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierenden Nucleinsäuresequenz und gegebenenfalls damit verbundener exogenen Nucleinsäuresequenzen eines Expressionsvektors oder einer Expressionskassette.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „einer“ genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle eine, zwei, mehrere, viele oder eine zahlenmäßig nicht näher definierbare Anzahl an Methylobacteriaceae-Zellen verstanden. In bevorzugter Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Methylobacteriaceae-Zelle auch als Methylobacteriaceae-Stamm, insbesondere Methylorubrum extorquens-, insbesondere Methylorubrum rhodesianum-, insbesondere Methylorubrum zatmanii-, insbesondere Methylorubrum extorquens TK 0001-, insbesondere Methylorubrum extorquens AMI-, insbesondere Methylorubrum extorquens PA1-, insbesondere Methylobacterium organophilum-, insbesondere Methylobacterium radiotolerans-Stamm zu verstehen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Derivat“ einer hinterlegten Methylobacteriaceae-Zelle oder eines hinterlegten Methylobacteriaceae-Stammes, insbesondere eines hinterlegten Methylorubrum-Stammes oder -Zelle oder eines hinterlegten Methylobacterium-Stammes oder -Zelle eine Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere ein Methylobacteriaceae-Stamm, insbesondere eine Methylorubrum-Zelle insbesondere ein Methylorubrum-Stamm, oder eine Methylobacterium-Zelle, insbesondere ein Methylobacterium-Stamm, verstanden, die sich durch die Anwesenheit der erfindungsgemäß vorgesehenen Merkmale, insbesondere die Integration der exogenen Glyoxylat-Reduktase codierende Nucleinsäuresequenz, auszeichnet und aus einer hinterlegten Methylobacteriaceae- Zelle gewonnen und deren Genom unter Beibehaltung der erfindungsgemäßen Merkmale abgewandelt wurde.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „exogenen Nucleinsäuresequenz“ eines Organismus, insbesondere eines Mikroorganismus, insbesondere eines Bakteriums, eine mittels rekombinanter, also gentechnischer Mittel, Verfahrensschritte in einen Empfängerorganismus eingebrachte Nucleinsäuresequenz verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird in bevorzugter Ausführungsform unter einer „exogenen Nucleinsäuresequenz“ eines Organismus, insbesondere eines Mikroorganismus, insbesondere eines Bakteriums, eine von einem anderen Mikroorganismus- Stamm, insbesondere einer anderen Organismusart, insbesondere einer anderen Bakteriumart, stammende, also nicht endogene, und damit nicht native beziehungswiese nicht im Wildtypstamm oder Wildtypart vorkommende Nucleinsäuresequenz verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Glyoxylat-Reduktase“ ein Enzym verstanden, das fähig ist die Umsetzung von Glyoxylat enzymatisch zu katalysieren, insbesondere zu Glycolsäure, insbesondere unter Verwendung eines Cofaktors, insbesondere NADH oder NADPH.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung weist eine „Glyoxylat-Reduktase“ (ghrA) der vorliegenden Erfindung in bevorzugter Ausführungsform einen KM-Wert von höchstens 2,0, insbesondere höchstens 1,5, insbesondere höchstens 1,0, insbesondere höchstens 0.6 mM, insbesondere 0,6 mM, für Glyoxylat auf.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung weist eine „Glyoxylat-Reduktase“ (ghrA) der vorliegenden Erfindung in bevorzugter Ausführungsform einen KM-Wert von mindestens 0,9, insbesondere mindestens 1,0 mM, insbesondere 1,0 mM, für Hydroxypyruvat auf.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung weist eine „Glyoxylat-Reduktase“ (ghrA) der vorliegenden Erfindung in bevorzugter Ausführungsform einen KM-Wert von höchstens 2,0, insbesondere höchstens 1,5, insbesondere höchstens 1,0, insbesondere höchstens 0.6 mM, insbesondere 0,6 mM für Glyoxylat und einen KM-Wert von mindestens 0,9, insbesondere mindestens 1,0 mM, insbesondere 1,0 mM, für Hydroxypyruvat auf.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung weist eine „Glyoxylat-Reduktase“ (ghrA) der vorliegenden Erfindung in bevorzugter Ausführungsform einen KM-Wert von höchstens 2,0 für Glyoxylat und einen KM-Wert von mindestens 0,9 für Hydroxypyruvat auf.

Bevorzugt ist die Glyoxylat-Reduktase NADPH-abhängig.

Demgegenüber weist eine „Hydroxypyruvat-Reduktase“ (ghrB) einen KM-Wert von mindestens 3,0, insbesondere mindestens 4,0, insbesondere mindestens 5,0, insbesondere mindestens 6,0 mM, insbesondere mindestens 6,6 mM, insbesondere 6,6 mM für Glyoxylat auf. Insbesondere weist eine Hydroxypyruvat-Reduktase (ghrB) einen KM-Wert von höchstens 0,6, insbesondere höchstens 0,7 mM, insbesondere 0,7 mM, für Hydroxypyruvat auf.

Insbesondere weist eine „Hydroxypyruvat-Reduktase“ (ghrB) einen KM-Wert von mindestens 3,0, insbesondere mindestens 4,0, insbesondere mindestens 5,0, insbesondere mindestens 6,0 mM, insbesondere mindestens 6,6 mM, insbesondere 6,6 mM für Glyoxylat und einen KM-Wert von höchstens 0,6, insbesondere höchstens 0,7 mM, insbesondere 0,7 mM, für Hydroxypyruvat auf.

Bevorzugt ist die Hydroxypyruvat-Reduktase NADH-abhängig.

Für die Definition der Michaelis-Menten-Konstante, KM, die als die Substratkonzentration definiert ist bei der die halbmaximale Umsatzrate eines spezifischen Enzyms unter festen Reaktionsbedingungen erreicht ist, wird als Berechnungsmethode die Lineweaver-Burk- Auswertungsmethode bevorzugt, beschrieben in Lineweaver, H. and Burk, D. (1934) Determination of the enzyme dissociation constants. J. Am. Chem. Soc. 56, 658-666.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung weist eine „Glyoxylat-Reduktase“ der vorliegenden Erfindung in bevorzugter Ausführungsform eine höhere Enzymaktivität bei einer NADPH-abhängigen Umsetzung von Glyoxylat zu Glycolat als bei einer NADH-abhängigen Umsetzung von Glyoxylat zu Glycolat auf, insbesondere eine mindestens 3 -fach höhere Enzymaktivität, insbesondere unter Bedingungen wie in dem Enzymassay gemäß Beispiel 5 angegeben.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Zelle eines methylotrophen Bakteriums“ insbesondere eine Zelle verstanden, die zu der Familie der Methylobacteriaceae zählt. Insbesondere sind diese Zellen befähigt, den Serinzyklus durchzuführen (https://doi.org/10.1002/9781118960608. gbm02024, https://doi.org/10.l l l l/1462-2920.12736, https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.740610).

Der Serinzyklus ist ein methylotropher Stoffwechselweg der die Assimilation von CI Substraten, wie Methanol, Formiat/ Ameisensäure, Methylamine im mikrobiellen Stoffwechsel ermöglicht für die Bildung von Biomasse oder chemischen Produkten/Intermediaten dieses Stoffwechsels. Es handelt sich um eine definierte Abfolge enzymatisch katalysierter Reaktionen.

Der Zyklus startet mit Glycin. In einem ersten Schritt wird aus dem CI assimilierten Kohlenstoff (sprich Methanol, Ameisensäure, etc.) in Form von 5,10-Methylenetetrahydrofolat und einem Molekül Wasser und Glycin durch eine Glycin-Hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.1) die namensgebende Aminosäure L-Serin gebildet. Dabei wird Tetrahydrofolat abgespalten welches für eine neue Kohlenstoffassimilation vorbereitet wird. Das L-Serin wird im Serinzyklus in nachfolgenden Schritten durch eine Transaminase desaminiert zu Hydroxypyruvat. Das abgespaltene NH3 -Äquivalent wird für eine Transaminierung von Glyoxylat zu Glycin genutzt, um den Zyklus am Laufen zu halten. Das vorig genannte Hydroxypyruvat wird durch eine Hydroxypyruvat Reduktase mit NAD(P)H reduziert zu Glycerat, welches durch eine Kinase phosphoryliert wird zu 3-Phosphoglycerat. In zwei aufeinander folgenden Reaktionsschritten wird eine Umwandlung des 3-Phosphoglycerat in Phosphoenolpyruvat durchgeführt durch eine Phosphoglyceromutase (EC 5.4.2.11) und eine wasserab spaltende Enolase (EC 4.2.1.11). Das Phosphoenolpyruvat wird carboxyliert zu Oxalacetat durch Phosphoenolpyruvat Carboxylase (EC 4.1.1.31) unter Nutzung von Hydrogencarbonat/gelöstem CO2. Das Phosphoenolpyruvat wird schließlich über L-Malat zu L-Malyl-CoA mit Aufwendung von NADH und ATP sowie einem Cofaktor A (CoA) Molekül umgewandelt. Anschließend wird Acetyl-CoA abgespalten und es entsteht Glyoxylat. Mit dieser Reaktion, die durch eine Malyl-CoA Lyase (EC 4.1.3.24) durchgeführt, schließt sich der Zyklus und eine weitere Assimilation eines einzelnen Kohlenstoffs kann beginnen. (Anthony, C. W. (2011). "How half a century of research was required to understand bacterial growth on Cl and C2 compounds; the story of the serine cycle and the ethylmalonyl-CoA pathway." Science progress 94 Pt 2: 109-137).

Der Serinzyklus lässt sich nachweisen durch das Vorkommen des Metaboliten Hydroxypyruvat. Daneben kann mit 13C-markiertem Cl-Substrat und unmarkiertem CO2 in Markierungs-Studien die charakteristische Markierung von Glycin, Serin und Glyoxylat gemessen werden (https://doi.org/10.1186/1752-0509-5-189).

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „M. extorquens“ Methylorubrum extorquens, unter „M. rhodesianum“ Methylorubrum rhodesianum, unter „M. zatmanii“ Methylorubrum zatmanii, unter „M. organophilum“ Methyl ob acterium organophilum, unter „M. radiotolerans“ Methylobacterium radiotolerans verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „pTE1887“ ein bestimmter Expressionsvektor verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „ghrA _eC o“ eine Nucleinsäuresequenz codierend die Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia coli K-12 MG1655 verstanden. Diese Nucleinsäuresequenz kann die native („ghrA _eC o-nativ“) oder eine codon- optimierte („ghrA _eC o-c-optimiert“) Nucleinsäuresequenz sein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „pTE1887-ghrA _eC o“ ein Expressionsvektor verstanden, der die Nucleinsäuresequenz codierend die Glyoxylat- Reduktase aus Escherichia coli K-12 MG1655 enthält. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „ecm _me a“ die Nucleinsäuresequenz codierend die Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus M. extorquens TK 0001 DSM 1337 verstanden. Diese Nucleinsäuresequenz kann die native oder eine codon-optimierte Nucleinsäuresequenz sein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „pTE1887- ghrA _e co-ecm _m ea“ ein Expressionsvektor verstanden, der die Nucleinsäuresequenz codierend die Glyoxylat- Reduktase aus Escherichia coli K-12 MG1655 und die Nucleinsäuresequenz codierend die Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus M. extorquens TK 0001 DSM 1337 enthält.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „ecm _rs h“ die Nucleinsäuresequenz codierend die Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 verstanden. Diese Nucleinsäuresequenz kann die native oder eine codon- optimierte Nucleinsäuresequenz sein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „pTE1887- ghrAeco-ecm _rs h“ ein Expressionsvektor verstanden, der die Nucleinsäuresequenz codierend die Glyoxylat- Reduktase aus Escherichia coli K-12 MG1655 und die Nucleinsäuresequenz codierend die Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 enthält.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „funktionales Nucleinsäuresequenz -Äquivalent“ ein Nucleinsäuresequenz-Äquivalent einer eine Glyoxylat- Reduktase beziehungsweise eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase codierenden Nucleinsäuresequenz verstanden, wobei das Nucleinsäure-Äquivalent mindestens einen Unterschied an mindestens einer Nucleotidposition zu der Nucleinsäuresequenz aufweist, das heißt weist mindestens ein zusätzliches Nucleotid, also ein insertiertes Nucleotid oder mindestens ein fehlendes Nucleotid, also ein deletiertes Nucleotid, auf oder weist mindestens ein ausgetauschtes Nucleotid auf, und wobei das Nucleinsäure-Äquivalent eine Aminosäuresequenz mit der enzymatischen Aktivität einer Glyoxylat-Reduktase beziehungsweise einer Ethylmalonyl-CoA-Mutase codiert. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „codon-optimiert“ verstanden, dass die Nucleinsäuresequenz eines Genes eines Wildtyps, die als exogene Nucleinsäuresequenz in eine Methylobacteriaceae-Wirtszelle integriert werden soll, insbesondere aus E. coli, vor der Integration durch gentechnisch bewirkten Austausch von Codons für eine Expression, also Transkription und Translation in der Wirtszelle optimiert wird, und insbesondere zwar von solchen Codons, die in der exogenen Nucleinsäuresequenz gewöhnlich nicht oder nicht optimal vom Translationssystem der Wirtszelle, also der Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere Methylorubrum extorquens-, insbesondere Methylorubrum extorquens AMI, Methylorubrum extorquens TK 0001, insbesondere Methylorubrum extorquens PAl-Zelle genutzt werden. Durch zum Beispiel in-vitro-Mutagenese werden statt dessen die entsprechenden Methylobacteriaceae-bevorzugten Codons eingebaut, ohne dass sich die durch die Nucleinsäuresequenz codierte Aminosäuresequenz verändert. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine codon-optimierte Nucleinsäuresequenz also eine für die Expression in einer Methylobacteriaceae-Zelle optimierte Nucleinsäuresequenz. Gegebenenfalls kann eine Codon-Optimierung auch vorgenommen werden, wenn die exogene Nucleinsäuresequenz aus der gleichen Bakterienart stammt wie die Wirtszelle, gleichwohl aber eine Expressionsverbesserung angestrebt wird. Bevorzugt kann die Codon-Optimierung gemäß folgender Übersicht durchgeführt werden (Tabelle 1):

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent einer codon-optimierten Nucleinsäure“ auch, aber nicht allein, die native, natürlicherweise vorkommende Nucleinsäure verstanden.

Tabelle 1 : Codon-Optimierung Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „funktionales Aminosäuresequenz-Äquivalent“ ein Aminosäuresequenz-Äquivalent einer Aminosäuresequenz einer Glyoxylat-Reduktase beziehungsweise einer Ethylmalonyl-CoA- Mutase verstanden, wobei das Aminosäure-Äquivalent mindestens einen Unterschied an mindestens einer Aminosäureposition zu der Aminosäuresequenz aufweist, das heißt weist mindestens eine zusätzliche Aminosäure, also eine insertierte Aminosäure oder mindestens eine fehlende Aminosäure, also eine deletierte Aminosäure, auf oder weist mindestens eine ausgetauschte Aminosäure auf, und wobei das Aminosäure-Äquivalent die enzymatische Aktivität einer Glyoxylat-Reduktase beziehungsweise einer Ethylmalonyl-CoA-Mutase aufweist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter der „Identität von Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen“ ein durch einen Sequenzvergleich ermittelter Grad an Identität in % verstanden. Dieser Sequenzvergleich basiert grundsätzlich auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. z.B. Altschul et al. (1990) "Basic local alignment search tool", J. Mol. Biol. 215:403-410, und Altschul et al. (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nucleotiden oder Aminosäuren in den Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. z.B. Chenna et al. (2003) "Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs", Nucleic Acids Res. 31 :3497-3500), T-Coffee (vgl. Z.B. Notredame et al. (2000) "T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments", J. Mol. Biol. 302:205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. Ferner möglich sind Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern, dessen AlignX- Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert. Soweit nicht anders angegeben, wird die hierin angegebene Sequenzidentität mit dem NCBI Constraint-based Multiple Allignment- Tool (COBALT) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, Stand 26.01.2022) bestimmt, wobei die SEQ ID Nr. 1 bis 8 jeweils als Referenz für die Bestimmung der prozentualen Sequenzunterschiede verwendet wurden. Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird vorliegend in Prozent „Identität“, das heißt dem Anteil der identischen Nucleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Identitätsangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Identische Bereiche von verschiedenen Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nucleotide oder Aminosäuren umfassen. Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich Identitätsangaben in der vorliegenden Lehre auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nucleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Aminosäuresequenz“ eine Abfolge linear verbundener Aminosäuren verstanden, insbesondere ein Protein, insbesondere ein Polypeptid.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Nucleinsäuresequenz“ eine Abfolge linear verbundener Nucleotide, insbesondere eine Nucleinsäure-Molekül, verstanden, insbesondere ein Gen, insbesondere ein Protein-codierender Bereich eines Gens. In besonders bevorzugter Ausführungsform ist die Nucleinsäuresequenz eine DNA-Sequenz.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Ethylmalonyl-CoA-Mutase“ ein im Ethylmalonyl-CoA-Stoffwechsel für die Umsetzung von Ethylmalonyl-CoA zu Methylsuccinyl-CoA verantwortliches Coenzym Bl 2-abhängiges, Enzym mit intramolekularer Isomerase-Aktivität verstanden, welches vorzugsweise die EC -Klassifizierung EC 5.4.99.63 aufweist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Cx-Verbindung“ eine chemische Kohlenstoff (C)-, Wasserstoff (H)- und Sauerstoff (O)-haltige Verbindung verstanden, die x Kohlenstoffatome enthält, wobei x bevorzugt eine natürliche Zahl ist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist x = 1, 2 oder 4, insbesondere 1. Vorzugsweise weist die Cx- Verbindung allein C-, H- und O-Atome und demgemäß keine anderen Atome auf.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter Ameisensäure auch Formiat, unter Essigsäure auch Acetat und unter Bernsteinsäure auch Succinat verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Integration einer exogenen Nucleinsäurensequenz in eine Methylobacteriaceae-Zelle“ oder unter einem „Vorliegen einer exogenen Nucleinsäurensequenz in einer Methylobacteriaceae-Zelle“ verstanden, dass die jeweilige in Bezug genommene Nucleinsäurensequenz chromosomal oder extrachromosomal, vorzugsweise chromosomal, im Genom der Zelle vorliegt.

In bevorzugter Ausführungsform liegt die exogene Nucleinsäuresequenz stabil integriert vor, wobei eine stabile Integration einer Nucl einsäure eine solche Integration ist, die zumindest über mindestens 2, 3, 5, 10, 20 oder 50 Generationen des Mikroorganismus im Mikroorganismus nachweisbar und expressionsfähig ist.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „maximaler Wachstumsrate“ (gmax) die Rate der Zellteilung, also des mikrobiellen Wachstums, der erfindungsgemäßen Methylobacteriaceae-Zelle in Reaktionsmedium, insbesondere flüssigem Kulturmedium, verstanden. Die Berechnung von p _max basiert auf den Messwerten der Optischen Dichte des Kulturmediums bei 600 nm Wellenlänge, gemessen im Photometer (ODeoo) über den zeitlichen Verlauf des Verfahrensschrittes. Die Berechnung von p _max kann mit Gleichung 1 durchgeführt werden, unter Berücksichtigung der Messwerte der ODeoo im Wachstumsintervall des schnellsten zu beobachteten Wachstums. (Gleichung 1)

Gleichung 1 mit t _y - t _x als Zeitintervall des Wachstumsintervall des schnellsten zu beobachteten Wachstums und t _y > t _x . Das Zeitintervall wird typischerweise in Stunden (h) angegeben. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Biotrockenmasse-Substrat- Ausbeute“ (Yx/s) die Masse an mikrobieller Biotrockenmasse (Biomasse vollständig getrocknet bis zur Gewichtskonstanz) im Reaktionsmedium, insbesondere flüssigem Kulturmedium, angegeben in einer Gewichtseinheit wie beispielsweise Gramm (X, gx), verstanden, die vom spezifischen mikrobiellen Stamm aus einem Gramm der Cx-Verbindung (S, gcx) gebildet werden kann. Die Berechnung erfolgt graphisch mit linearer Regression der Änderungen der Messwerte der Biotrockenmasse (AX(t) in Abhängigkeit von der Masse der Cx-Verbindung (ACx(t)) im zeitlichen Verlauf im Verfahrensschritt nach Gleichung 2. Nach Gleichung 2 ist Yx/s somit die Steigung der zeitlich linear korrelierenden Änderung der Biotrockenmasse X in Abhängigkeit der Änderung der Masse der Cx-Verbindung. Die Einheit von Yx/s wird typischerweise in gx pro gcx angegeben. (Gleichung 2) Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Produkt-Substrat-Ausbeute“ (Yp/s) die Masse an Produkt, angegeben in einer Gewichtseinheit wie beispielsweise Gramm (P, gp), verstanden, die vom spezifischen mikrobiellen Stamm aus einem Gramm der Cx- Verbindung (S, gcx) gebildet werden kann. Die Berechnung erfolgt graphisch mit linearer Regression der Änderungen der Messwerte der Produktmasse (AP(t) in Abhängigkeit von der Masse der Cx-Verbindung (ACx(t)) im zeitlichen Verlauf im Verfahrensschritt nach Gleichung 3. Nach Gleichung 3 ist Yp/s somit die Steigung der zeitlich linear korrelierenden Änderung der Produktmasse P in Abhängigkeit der Änderung der Masse der Cx-Verbindung. Die Einheit von Yp/s wird typischerweise in gp pro gcx angegeben. (Gleichung 3)

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Produkt-Biotrockenmasse- Ausbeute“ (Yp/x) die Masse an Produkt, angegeben in einer Gewichtseinheit wie beispielsweise Gramm (P, gp), verstanden, die vom spezifischen mikrobiellen Stamm pro Gramm gebildeter Biotrockenmasse (X, gx) gebildet wird während des mikrobiellen Wachstums. Die Berechnung erfolgt graphisch mit linearer Regression der Änderungen der Messwerte der Produktmasse (AP(t) in Abhängigkeit von der Biotrockenmasse (AX(t)) im zeitlichen Verlauf im Verfahrensschritt nach Gleichung 4. Nach Gleichung 4 ist Yp/x somit die Steigung der zeitlich linear korrelierenden Änderung der Produktmasse P in Abhängigkeit der Änderung der gebildeten Biotrockenmasse. Die Einheit von Yp/x wird typischerweise in gp pro gx angegeben.

Y _P/ x = i™ [g] (Gleichung 4)

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Biotrockenmasse“ die Masse X(t) an mikrobieller Biotrockenmasse (Biomasse vollständig getrocknet bis zur Gewichtskonstanz) im Reaktionsmedium, insbesondere flüssigem Kulturmedium mit dem Volumen v(t) zum Zeitpunkt t, angegeben in einer Gewichtseinheit wie beispielsweise Gramm (X, gx), verstanden. Die Biotrockenmasse X lässt sich aus den Messwerten der ODeoo bestimmen mit dem Korrelationsfaktor z nach Gleichung 5, wobei z = 0,305 gx pro 1 ODeoo definiert ist.

X(t) = 0,305 * ODeoo(t) * v [gx] (Gleichung 5) Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter der Abkürzung „NAD“ Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „NADH“ die reduzierte Form von NAD verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter der Abkürzung „NADP“ Nicotinsäureamid-Adenin- Dinucleotid-Phosphat verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „NADPH“ die reduzierte Form von NADP verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „NADH/NADPH-Analogon“ eine chemische Verbindung zum Beispiel Thionicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid (S-NAD), Nicotinsäure-Adenin- Dinucleotid (O-NAD), Nicotinsäureamid-Hypoxanthin-Dinucleotid (NHD), Nicotinsäureamid-Guanin-Dinucleotid, oder weitere Verbindungen, die eine ähnliche, bevorzugt gleiche Aktivität wie NADH und/oder NADPH aufweisen, verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Edukt“ ein Ausgangsmaterial verstanden, insbesondere mindestens eine Cx- Verbindung, insbesondere eine Cx-Verbindung oder zwei oder mehrere oder viele Cx- Verbindungen, insbesondere eine Zusammensetzung von Cx-Verbindungen.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Produkt“ mindestens die Glycolsäure, insbesondere allein Glycolsäure, vorzugsweise Glycolsäure und Milchsäure, insbesondere eine Zusammensetzung von Verbindungen, enthaltend Glycolsäure verstanden, insbesondere bestehend aus den Verbindungen Glycolsäure und Milchsäure.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Umsetzung“ eine chemische Reaktion, insbesondere eine katalysierte chemische Reaktion, insbesondere eine enzymatische katalysierte Reaktion verstanden.

In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem „Reaktionsmedium“ ein flüssiges Medium, insbesondere ein flüssiges wässriges Medium verstanden, in dem eine Umsetzung, insbesondere eine enzymatisch katalysierte Umsetzung stattfinden kann, insbesondere eine durch Mikroorganismen oder Bestandteile von Mikroorganismen bewirkte Umsetzung, insbesondere ein Kulturmedium, insbesondere ein Minimalmedium.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Erhalten eines Produkts“ verstanden, dass das in einem vorhergehenden Verfahrensschritt durch Umsetzung von dem Edukt, also einem Ausgangsmaterial, gewonnene Produkt aus dem jeweiligen Reaktionsmedium, insbesondere Kulturmedium oder Lösungsmittel, heraus verfügbar gemacht wird, insbesondere aus diesem isoliert wird. Insbesondere ist ein Erhalten eines Produkts daher als ein Aufkonzentrieren, insbesondere Isolieren, des Produkts zu verstehen. Die dazu eingesetzten Verfahren können physikalische, chemische und/oder biologische Verfahren sein.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter „Verbindung“ ein Molekül oder mehrere identische Moleküle verstanden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine Zusammensetzung enthaltend Glycolsäure das Produkt einer erfindungsgemäßen Umsetzung in Verfahrensschritt b).

Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung quantitative Angaben, insbesondere Prozentangaben, von Komponenten eines Produktes oder einer Zusammensetzung angegeben sind, addieren diese, sofern nicht explizit anders angegeben oder fachmännisch ersichtlich, zusammen mit den anderen explizit angegeben oder fachmännisch ersichtlichen weiteren Komponenten der Zusammensetzung oder des Produktes auf 100 % der Zusammensetzung und/oder des Produktes auf.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „mindestens eine“ eine Mengenangabe verstanden, die eine Anzahl von 1 oder 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 oder 8 oder 9 oder 10 und so weiter ausdrückt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann die Bezeichnung „mindestens eine“ genau die Anzahl 1 darstellen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Begrifflichkeit „mindestens eine“ auch 2 oder 3 oder 4 oder 5 oder 6 oder 7 bedeuten.

Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein „Vorhandensein“, ein „Enthalten“, ein „Aufweisen“ oder ein „Gehalt“ einer Komponente ausdrücklich erwähnt oder impliziert wird bedeutet dies, dass die jeweilige Komponente vorhanden ist, insbesondere in messbarer Menge vorhanden ist.

Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein „Vorhandensein“, ein „Enthalten“ oder ein „Aufweisen“ einer Komponente in einer Menge von 0 [Einheit], insbesondere mg/kg, pg/kg oder Gew.-%, ausdrücklich erwähnt oder impliziert wird, bedeutet dies, dass die jeweiligen Komponenten nicht in messbarer Menge vorhanden, insbesondere nicht vorhanden ist.

Die Zahl der angegebenen Nachkommastellen entspricht der Präzision der jeweils angewandten Messmethode. Sofern im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung für eine Zahl die erste und zweite Nachkommastelle oder die zweite Nachkommastelle nicht angegeben sind/ist, sind/ist diese als Null zu setzen.

Unter dem Begriff „und/oder“ wird in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verstanden, dass alle Mitglieder einer Gruppe, welche durch den Begriff „und/oder“ verbunden sind, sowohl alternativ zueinander als auch jeweils untereinander kumulativ in einer beliebigen Kombination offenbart sind. Dies bedeutet für den Ausdruck „A, B und/oder C“, dass folgender Offenbarungsgehalt darunter zu verstehen ist: a) A oder B oder C oder b) (A und B), oder c) (A und C), oder d) (B und C), oder e) (A und B und C).

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter den Begriffen „umfassend“ und „aufweisend“ verstanden, dass zusätzlich zu den von diesen Begriffen explizit erfassten Elementen noch weitere, nicht explizit genannte Elemente hinzutreten können. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter diesen Begriffen auch verstanden, dass allein die explizit genannten Elemente erfasst werden und keine weiteren Elemente vorliegen. In dieser besonderen Ausführungsform ist die Bedeutung der Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „bestehend aus“. Darüber hinaus erfassen die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ auch Zusammensetzungen, die neben den explizit genannten Elementen auch weitere nicht genannte Elemente enthalten, die jedoch von funktioneller und qualitativ untergeordneter Natur sind. In dieser Ausführungsform sind die Begriffe „umfassend“ und „aufweisend“ gleichbedeutend mit dem Begriff „im Wesentlichen bestehend aus“.

Die Bezeichnung „DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland“ steht für „Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig“.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die Erfindung wird nachstehend ohne Einschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens anhand von Beispielen und dazugehöriger Figuren näher beschrieben.

Das Sequenzprotokoll zeigt: SEQ ID Nr. 1 stellt die native Nucleinsäuresequenz codierend eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli (K-12 MG1655) dar, insbesondere auch bezeichnet als, ghrAeco-nativ, also ein funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 3.

SEQ ID Nr. 2 die durch SEQ ID Nr. 1 und 3 codierte Aminosäuresequenz.

SEQ ID Nr. 3 stellt eine Methylobacteriaceae-codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (ghrA _eco - c-optimiert) der nativen Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 codierend eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli (K-12 MG1655) dar.

SEQ ID Nr. 4 stellt die native Nucleinsäuresequenz codierend eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens (TK 0001 DSM 1337) dar, insbesondere auch bezeichnet als ecm _me a, also ein funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der codon- optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 13.

SEQ ID Nr. 5 die die durch SEQ ID Nr. 4 und 13 codierte Aminosäuresequenz.

SEQ ID Nr. 6 stellt die native Nucleinsäuresequenz codierend eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) dar, insbesondere auch bezeichnet als ecmrsh also ein funktionales Nucleinsäuresequenz-Äquivalent der codon-optimierten Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 8.

SEQ ID Nr. 7 die durch SEQ ID Nr. 6 und 8 codierte Aminosäuresequenz.

SEQ ID Nr. 8 stellt eine Methylobacteriaceae-codon-optimierte Nucleinsäuresequenz der nativen Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 6 codierend eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029) dar.

SEQ ID Nr. 9 stellt die Nucleinsäuresequenz des Expressionsvektors pTE1887 dar, wobei in Figur 8 die zugehörige Plasmidkarte gezeigt ist.

SEQ ID Nr. 10 stellt die Nucleinsäuresequenz des Expressionsvektors pTE1887-ghrA _eC o dar, wobei in Figur 9 die zugehörige Plasmidkarte gezeigt ist.

SEQ ID Nr. 11 stellt die Nucleinsäuresequenz des Expressionsvektors pTEl 887-ghrA eco-CCnimea dar, wobei in Figur 10 die zugehörige Plasmidkarte gezeigt ist. SEQ ID Nr. 12 stellt die Nucleinsäuresequenz des Expressionsvektors pTE1887- EcoGoxRed l-ecmrsh dar, wobei in Figur 11 die zugehörige Plasmidkarte gezeigt ist.

SEQ ID Nr. 13 stellt eine Methylobacteriaceae-codon-optimierte Nucleinsäuresequenz der nativen Nucleinsäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 codierend eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens (TK 0001 DSM 1337) dar.

Die Figuren zeigen:

Figur 1 das Screeningergebnis zur Glycol säure-Produktion in rekombinanten, also genetisch veränderten, M. extorquens TK 0001 Stämmen, die codon-optimierte Gene der Glyoxylat-Reduktasen aufweisen und exprimieren (A), Screeningergebnisse gemäß 1A in (B und C), wobei Enzym-Aktivitäten der Glyoxylat-Reduktasen aus der gemäß 1(A) verwendeten Biomasse exprimiert mit dem Expressionsvektor pTE1887 im Stammhintergrund M. extorquens TK 0001 mit NADH (B) und NADPH (C) als Cofaktor dargestellt werden,

Figur 2 eine HPLC-Chromatogramm-Gegenüberstellung der Kultivierungsproben (22 bis 24 h nach Induktion) der genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zellen M. extorquens TK 0001 Glyoxylat-Reduktase Stämme, die codon-optimierte Gene der Glyoxylat-Reduktasen aufweisen und exprimieren,

Figur 3 ein GC -MS-Chromatogramm und Massenspektren des Glycol säure-Peaks (Retentionszeit: 7,22 min) eines 100 mg L' ¹ Glycol säure- Standards, einer Probe des Reaktionsmediums zum Zeitpunkt t = 0 h, einer Probe der M. extorquens TK 0001 + pTE1887-Leervektor-Kultivierung nach der Induktion, und einer erfindungsgemäßen Probe der + pTE1887-ghrA _eC o-c-optimiert (M. extorquens GAI) Kultivierung nach der Induktion,

Figur 4 ein GC -MS-Chromatogramm und Massenspektren des Milchsäure-Peaks (Retentionszeit: 6,88 min) eines 100 mg L' ¹ Milchsäuresäure-Standards, einer Probe des Reaktionsmediums zum Zeitpunkt t = 0 h, einer Probe der M. extorquens TK 0001 + pTE1887-Leervektor Kultivierung 22 - 24h nach der Induktion, und einer erfindungsgemäßen Probe der M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrAeco-c-optimiert (M. extorquens GAI) Kultivierung 22 bis 24h nach der Induktion, Figur 5 eine Detailansicht der Massenspektren des Glycol säure-Peaks (A) und des Milchsäure-Peaks (B) einer Probe der M. extorquens GAI -Kultivierung 22 bis 24h nach der Induktion und Datenbanknachweis der Glycol säure-Identität (A) und der Milchsäure-Identität (B) in der M. extorquens GAI Probe,

Figur 6 den Wachstumsverlauf (OD600), den pH-Wert und die Methanol-, Glyoxylat-, Glycolsäure- und Milchsäurekonzentrationen von M. extorquens TK 0001 + pTE1887 (A+C) und erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrAeco-c-optimiert (M. extorquens GAI) (B+D) in Reaktionsmedium, nämlich Minimalmedium, wobei als Kohlenstoffquelle 8 g L' ¹ Methanol (A+B) oder 9 g L' ¹ Methanol + 1.5 g L' ¹ Glyoxylat (C+D) zugegeben wurde,

Figur 7 den Wachstumsverlauf (OD600), pH-Wert, Methanol- und die Glycolsäure- und Milchsäure-Konzentrationen von M. extorquens TK 0001 + pTE1887 (A), erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o-c-optimiert (M. extorquens GAI) (B), erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrAeco-c-optimiert-eemmea (M. extorquens GA2) (C) und erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _e co-c-optimiert-ecm _r sh (M. extorquens GA3) (D) in Reaktionsmedium mit 9 g L' ¹ Methanol als alleiniges Substrat,

Figur 8 die Plasmidkarte des Expressionsvektors pTE1887,

Figur 9 die Plasmidkarte des Expressionsvektors pTE1887-ghrA _eC o-c-optimiert,

Figur 10 die Plasmidkarte des Expressionsvektors pTE1887-ghrA _e co-c-optimiert-ecm _m ea,

Figur 11 die Plasmidkarte des Expressionsvektors pTE1887-ghrA _eC o-c-optimiert-ecm _r sh,

Figur 12 die Ergebnisse der Glyoxylat-Reduktase-Enzymaktivitätstests von ghrA _eco und ghrBeco in nativer und codon-optimierter DNA-Sequenz exprimiert mit dem Expressionsvektor pTEl 887 im Stammhintergrund M. extorquens TK 0001,

Figur 13 die Taxonomische Einordnung der mit den erfindungsgemäßen Expressionsvektoren getesteten methylotrophen Mikroorganismen,

Figur 14 das Screeningergebnis zur Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion 22 h bis 28 h nach Induktion der Genexpression in rekombinanten, also genetisch veränderten, M. rhodesianum DSM 5687 Stämmen, die codon-optimierte Gene der Glyoxylat-Reduktasen und in einigen Stämmen zusätzlich Ethylmalonyl- CoA-Mutasen aufweisen und exprimieren,

Figur 15 das Screeningergebnis zur Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion 22 h bis 28 h nach Induktion der Genexpression in rekombinanten, also genetisch veränderten, M. zatmanii DSM 5688 Stämmen, die das erfindungsgemäße codon-optimierte Gen der Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia und in einem Stamm zusätzlich ein codon-optimiertes Gen der Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 aufweisen und exprimieren,

Figur 16 das Screeningergebnis zur Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion 22 h bis 28 h nach Induktion der Genexpression in einem rekombinanten, also genetisch veränderten, M. radiotolerans DSM 760 Stamm, der die erfindungsgemäße Kombination des codon-optimierten Gens der Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia und zusätzlich einem nativen Gen der Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus M. extorquens TK 0001 DSM 1337 aufweist und exprimiert,

Figur 17 das Screeningergebnis zur Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion 22 h bis 28 h nach Induktion der Genexpression in rekombinanten, also genetisch veränderten, M. organophilum DSM 18172 Stämmen, die codon-optimierte Gene der Glyoxylat-Reduktasen und in einigen Stämmen zusätzlich Ethylmalonyl-CoA-Mutasen aufweisen und exprimieren,

Figur 18 das Screeningergebnis zur Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion 22 h bis 28 h nach Induktion der Genexpression eines rekombinanten, also genetisch veränderten, M. extorquens PA1 DSM 23939 Stammes, der erfindungsgemäß das codon-optimierte Gen der Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia coli K12 1655 aufweist und exprimiert,

Figur 19 das Screeningergebnis zur Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion 22 h bis 28 h nach Induktion der Genexpression in rekombinanten, also genetisch veränderten, M. extorquens AMlAcel (basierend auf dem Stamm DSM 1338) Stämmen, die codon-optimierte Gene der Glyoxylat-Reduktasen aufweisen und exprimieren. Beispiele

Beispiel 1: Herstellung genetisch veränderter Methylobacteriaceae-Zellen

Es wurden mit bioinformati sehen Methoden unter Nutzung der KEGG-Datenbank (www.genome.jp/kegg/) und der Brenda Enzymes-Datenbank (https ://www.brenda- enzymes.org/) 12 verschiedene exogene Glyoxylat-Reduktasen identifiziert und die zugehörigen DNA- und Aminosäuresequenzen extrahiert. Hierbei wurden nur Glyoxylat- Reduktasen berücksichtigt, die in Prokaryoten oder Saccharomyces cerevisiae vorkommen. Auch die native Glyoxylat-Reduktase aus M. extorquens TK 0001 wurde ausgewählt. Eine Übersicht über die 13 ausgewählten Glyoxylat-Reduktasen ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Insbesondere die Glyoxylat-Reduktase aus Thermococcus litoralis wurde als NADH- abhängiges Enzym identifiziert (Ohshima, et al., European Journal of Biochemistry, 2001, 268(17): p. 4740-4747). Der Einfluss des spezifischen Redox-Äquivalents auf die Glycolsäure- Produktion kann substanziell sein, je nach Verfügbarkeit des spezifischen Redox-Äquivalents im Cytosol und die Adaption des metabolischen Netzwerks an die getätigte Intervention (Überexpression der Glyoxylat-Reduktase).

Tabelle 2: Zusammenfassung der getesteten Enzyme

Die heterologen Enzyme aus Pseudomonas fluorescens PfO-l, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus DSM 3638, Saccharomyces cerevisiae, Thermus thermophilus HB27, Escherichia coli K-12 MG1655 und Acetobacter aceti wurden durch synthetische Gene in für Methylobacteriaceae codon-optimierter Form codiert (BioCat GmbH, Heidelberg, Deutschland, Tabelle 1), um eine bestmögliche Genexpression zu unterstützen. Da das homologe Gen aus M. extorquens (SEQ ID Nr. 1) das Startcodon „TTG“ aufwies, wurde über PCR das Startcodon zu „ATG“ geändert (Kozak, M., Gene, 1999, 234(2): p. 187-208). Im weiteren Verlauf wurden beide Genvarianten der SEQ ID Nr. 1 und 3 getestet. Somit ergeben sich 14 Varianten der getesteten Glyoxylat Reduktasen.

Die synthetischen Gene wurden in codon-optimierter Form mit Hilfe von Gibson- Assembly auf den episomalen Expressionsvektor pTE1887 (Carrillo, M. et al., ACS Synthetic Biology, 2019, 8(11): p. 2451-2456) unter Kontrolle des PL/O4/AI -Promotors (IPTG-induzierbar) kloniert (Figur 8). Figur 8 zeigt den Vektor mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart^PL/O4/A I Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), Lambda TO Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mobL Regulatory protein RepA, Origin of replication colEl.

Für diese Klonierung wurde der Expressionsvektor mit dem Restriktionsenzym Ncol geschnitten. Die Sequenzidentität und Korrektheit der Konstrukte konnten durch Sequenzierung sichergestellt werden. Anschließend wurden die hergestellten Konstrukte und eine Wildtypstamm-Methylobacteriaceae-Zelle, insbesondere M. extorquens TK 0001 -Zellen und insbesondere M. extorquens PA1, gemäß Verfahrensschritt a) bereitgestellt, und gemäß Verfahrensschritt b) mit Hilfe von Elektroporati on jeweils in die Methylobacteriaceae-Zellen transformiert und eine genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle gemäß Verfahrensschritt c) erhalten. Klone der Methylobacteriaceae-Zellen, also genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, die die individuell hergestellten Konstrukte, enthaltend die synthetischen Gene in codon-optimierter Form, tragen, wurden auf Minimalmedium- Agarplatten, mit Kanamycin als Selektionsmarker, selektiert. Über Kolonie-PCR ist die Anwesenheit der Expressionsvektoren und die jeweils erwartete Sequenzgröße des PCR- Produkts, welches das klonierte Gen repräsentiert, in den erhaltenen individuellen Klonen geprüft worden. Die verifizierten Stämme sind bei -80 °C als Kryokulturen sichergestellt worden.

Um die Fähigkeit der genetisch modifizierten Methylobacteriaceae-Stämme auf Glycolsäure- Produktion zu testen, wurden die Stämme, ein Minimalmedium als Reaktionsmedium, insbesondere auch als Kulturmedium bezeichnet, und als Edukt eine Cx-Verbindung mit x=l, nämlich Methanol (Cui, L.-Y. et al., Biochemical Engineering Journal, 2017, 119: p. 67-73) bereitgestellt (erfindungsgemäßer Verfahrensschritt x)), in schikanierten Schüttelkolben (250 mL Kolbenvolumen, 50 mL Kulturvolumen) bei 30 °C, 150 RPM (Umdrehungen pro Minute) und Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre kultiviert (erfindungsgemäßer Verfahrensschritt y)) (New Brunswick™ Innova 44, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) und in dem Reaktionsmedium ein Produkt enthaltend Glycolsäure erhalten (Verfahrensschritt z)). Analog ist eine Kultivierung unter anderem auch mit Ameisensäure möglich, die ebenso als Edukt für die Glycol säure-Produktion genutzt werden kann.

Die Inokulation der Hauptkulturen erfolgte aus unter gleichen Bedingungen angezogenen Vorkulturen (End-ODeoo zwischen 3 bis 5) zu einer Start-ODeoo von 0,05. Nachdem die Kulturen eine ODeoo von 1,0 erreicht hatten, wurde mit 1 mM IPTG (Endkonzentration im Kulturvolumen) die Genexpression der codon-optimierten Glyoxylat-Reduktase Gene induziert. Um die Produktion von Glycolsäure nachzuweisen, wurde ein Probevolumen von 1 mL des Minimalmediums vor der Inokulation und jeweils ein Probenvolumen von 1 mL aller Kulturen vor der Induktion, direkt nach der Induktion und rund 20 Stunden nach der Induktion dem Kulturvolumen entnommen. Nach Abtrennung der Biomasse über Zentrifugation vom Reaktionsmedium wurden die Proben mit Hilfe der Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie (HPLC) und Refraktär-Index-Detektion (RID) hinsichtlich der enthaltenen Konzentrationen von Methanol, Ameisensäure, Glyoxylat, Glycolsäure und Milchsäure analysiert. Die HPLC- Messung erfolgte zur Auftrennung der Analyten mit einer Synergi™ 4 pm Hydro-RP 80A, LC- Säule 250 x 4,6 mm (Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA) und 20 mM K2HPO4 (pH 1.5) als Eluent bei 30 °C und 0,5 mL min' ¹ Flussrate für 20 Minuten pro Probe. Die Identifikation und Quantifizierung der Analyten erfolgten mit externen Standards bekannter Konzentration. Der eindeutige Nachweis von Glycolsäure in den Kulturproben erfolgte durch Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS) unter Verwendung eines Glycol säure- Standards (100 mg L' ¹ ). Hierfür sind die in den Kulturproben und im Standard enthaltenen -OH bzw. -NH-Gruppen durch Derivatisierung in die korrespondierenden tert- Butyldimethylsilyl-Ether (TBDMS) umgesetzt worden. Dafür wurde ein Volumen von 50 pL Standard bzw. 50 pL Probe durch Lyophilisierung gefriergetrocknet und anschließend in 50 pL DMF+0,1 % (v/v) Pyridin resuspendiert. Die Derivatisierung wurde mit 50 pL N-Methyl-N- tert-butyldimethylsilyltrifluoracetamid (MBDSTFA, Macherey-Nagel) und Inkubation bei 80 °C für 30 Minuten durchgeführt. Entstandene Präzipitationen wurden durch Zentrifugation entfernt und die Proben anschließend über GC-MS analysiert. Die GC -Methode wurde festgelegt mit einem Trägergas-Strom von 1,7 mL min' ¹ , einer Inlet-Temperatur von 250 °C, einer Interface-Temperatur von 230 °C und einer Quadrupol-Temperatur von 150 °C. Die Auftrennung der Analyten erfolgte durch einen Temperaturgradienten: 120 °C (2 min), Rampe 8 °C min' ¹ bis 200 °C und 10 °C min' ¹ bis 325 °C. Über das MS wurden die Analyten im Scan- Modus (m/z 50 bis 750) qualifiziert.

Genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) des Stamms Methylorubrum extorquens Mea-GAl wurden am 10. Juni 2022 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34286 hinterlegt.

Beispiel 2: Screening funktionaler Glyoxylat-Reduktasen in M. extorquens TK 0001

Die in Tab. 2 aufgeführten Glyoxylat-Reduktase-codierenden Nucleinsäuresequenzen in codon-optimierter Form wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in den pTE1887- Expressionsvektor kloniert und die korrespondierenden genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Stämme konstruiert. Als Referenzstamm wurde der Stamm M. extorquens TK 0001 enthaltend den pTE 1887- Vektor verwendet, der kein rekombinantes Plasmid trägt, sondern den pTE1887-Leervektor.

In einem ersten experimentellen Schritt sind diese initial konstruierten Stämme, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf ihre Fähigkeit zur Glycolsäure-Produktion untersucht worden. Die Ergebnisse sind in Figur 1 zusammengefasst.

Figur 1A zeigt ein Balkendiagramm, wobei auf der x-Achse die genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zellen wiedergegeben sind und die y-Achse die Konzentration von Glycolsäure (schwarz ausgefüllter Balken) in g L' ¹ im Reaktionsmedium zeigt. Alle Probenentnahmezeitpunkte liegen 22 bis 24 Stunden nach Induktion der Genexpression mit 1 mM IPTG. Um die aufgenommene Menge an Methanol zu bestimmen, wurde das Reaktionsmedium zum Zeitpunkt t = 0 h vermessen. Alle Konzentrationen sind in g L' ¹ angegeben, bestimmt durch HPLC, Refraktärindex-Detektion und externen Standards.

Figur 1A zeigt das Screeningergebnis der Glycol säure-Produktion in rekombinanten M. extorquens TK 0001 -Stämmen, die Glyoxylat-Reduktasen exprimieren, ausgehend von den korrespondierenden codon-optimierten Genen. Als Expressionsvektor wurde pTE1887 genutzt, der in Form des Leervektors im Referenzstamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887 auch als Negativkontrolle dient (erster Eintrag von links auf der x-Achse).

Überraschenderweise zeigten sowohl der Referenzstamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887 (erster Eintrag von links) als auch die genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zellen keine Glycolsäure-Produktion (Einträge von links: 2 und 3 und 5 bis 15), mit Ausnahme der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle umfassend M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (in codon-optimierter Nucleinsäure-Form nach SEQ ID Nr. 3), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 4, zeigt als einziger Eintrag einen schwarzen Balken). Figur 9 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylorubrum-Zellen verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eC o-c-optimiert, Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Figur IB zeigt ein Balkendiagramm, wobei auf der x-Achse die genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zellen wiedergegeben sind und die y-Achse die Enzym Aktivität in mU mg' ¹ wiedergibt (weißer, nicht ausgefüllter Balken: NADH als Cofaktor).

Figur IC zeigt ein Balkendiagramm, wobei auf der x-Achse die genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zellen wiedergegeben sind und die y-Achse die Enzym Aktivität in mU mg' ¹ wiedergibt (grau ausgefüllter Balken: NADPH als Cofaktor).

Figur 1B und IC zeigen das Screeningergebnis eines Enzym Assays mit rekombinanten M. extorquens TK 0001 -Stämmen, die Glyoxylat-Reduktasen exprimieren, ausgehend von den korrespondierenden codon-optimierten Genen. Der Enzym Assay wurde analog zu Beispiel 5 durchgeführt. Es wurde die Biomasse verwendet, die in 1 A eingesetzt wurde. Im Fall von 1B wurde der Enzym Assay mit NADH als Redox-Cofaktor durchgeführt. Im Fall von IC wurde der Enzym Assay mit NADPH als Redox-Cofaktor durchgeführt.

Im Fall von 1B zeigen alle getesteten Methylobacteriaceae-Zellen enthaltend rekombinante Glyoxylat-Reduktasen keine messbare Glyoxylat-Reduktase Enzymaktivität mit NADH als Cofaktor mit Ausnahme der nicht-erfindungsgemäßen Methylobacteriaceae-Zelle enthaltend die Glyoxylat-Reduktase ghrB _eco (Eintrag von links: 5).

In Figur IC zeigt der Referenzstamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887 (erster Eintrag von links), sowie mehrere getestete Methylobacteriaceae-Zellen enthaltend rekombinante Glyoxylat-Reduktasen (Einträge von links: 2, 8 und 9, 11 bis 15) keine messbare Glyoxylat- Reduktase Enzymaktivität mit NADPH als Cofaktor. Nur die genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zellen (Einträge von links: 3 bis 7 und 10) zeigten eine erhöhte Glyoxylat- Reduktase Enzymaktivität, wobei die erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zellen von M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (in codon- optimierter Nucleinsäure-Form nach SEQ ID Nr. 3), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz, eine hohe Glyoxylat-Reduktase Enzymaktivität aufwiesen (Eintrag von links: 4).

Eine Enzymaktivität der Glyoxylat-Reduktase Tiit war nicht messbar und auch nicht assoziiert mit einer Glycolsäure-Produktion. Allein die Enzymaktivität von ghrA _eC o, also die erfindungsgemäße Glyoxylat-Reduktase aus /:. coli, ist mit einer Glycolsäure-Produktion verbunden.

Die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o-c-optimiert weist demgemäß NADPH-, nicht aber NADH-Abhängigkeit auf.

Figur 2 zeigt HPLC-Chromatogramme der Kultivierungsproben gemäß Figur 1 (22 bis 24 Stunden nach Induktion) der genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zellen M. extorquens TK 0001 Glyoxylat-Reduktase-Stämme. Es ist deutlich erkennbar, dass einzig die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (in Figur 2 als M. extorquens GAI bezeichnet, enthaltend die codon- optimierte Form des ghrA _eco Gens) als einziger Stamm die Mischung aus Glycolsäure und Milchsäure (Glycol säure-Retentionszeit = 6,20 min und Milchsäure-Retentionszeit = 9,1 min) produziert (Vergleich Standards - Spur 1 und Spur 2 - mit M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrAeco, M. extorquens GAI - Spur 7 in 1 A und Spur 5 in 1B). Die fehlende Glycolsäure- (und Milchsäure-Produktion bei Einsatz der nicht-erfindungsgemäßen Glyoxylat Reduktasen deutet auf fehlende Funktionalität hin. Es könnte sich bei diesen Enzymen um Hydroxypyruvat- Reduktasen handeln, die das im Serinzyklus ebenfalls anfallende Hydroxypyruvat in Abhängigkeit von NAD(P)H zu D-Glycerat reduzieren. In diesem Fall wäre, wie in Figur 1 und Figur 2 gezeigt, keine Akkumulation von Glycolsäure zu beobachten.

Im Vergleich zu externen Standards wurde diese Probe mit Hilfe der GC-MS vermessen, um die Anwesenheit von Glycolsäure und Milchsäure in der Probe zu bestätigen und somit die Glycolsäure-Produktion und die überraschende Milchsäure-Produktion durch Expression des ghrAeco-Enzym zu verifizieren. Weitere Peaks: Glyoxylat (Retentionszeit = 5,40 min), Methanol (Retentionszeit = 7,6 min), hier nicht näher beschriebene Peaks (Retentionszeit = 6,50 min und 8,00 min).

Bei der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle konnten in der HPLC-Messung etwa 0,6 g L' ¹ der Mischung aus Glycolsäure und Milchsäure nachgewiesen Werden (

In den meisten Kultivierungen war nach ungefähr 22 bis 24 h Dauer nach der Induktion die initiale Methanolkonzentration von 8 g L' ¹ aufgebraucht. Einzig der Stamm M. extorquens GAI zeigte eine deutlich messbare Methanol -Konzentration zum Probenahmezeitpunkt (Figur 1 A Spur 7 und Figur 1B Spur 5). Dies kann auf ein Ungleichgewicht im Stoffwechsel durch die Genexpression der Glyoxylat-Reduktase hindeuten. Zum einen kann die Enzymexpression an sich das Wachstum der Stämme reduzieren. Aber auch eine erhöhte Enzymaktivität einer Glyoxylat-Reduktase kann grundsätzlich einen Abzug des Glyoxylats aus dem Serinzyklus in Richtung Glycolsäure verursachen. Dadurch fehlt dem Mikroorganismus Glyoxylat zum Aufbau der Biomasse. Dieser Mangel kann das Wachstum verlangsamen und dazu führen, dass die Kohlenstoffquelle nicht komplett aufgebraucht wird.

Um die Anwesenheit von Glycolsäure und Milchsäure in der erfindungsgemäßen ghrA _eco Probe im Vergleich zu externen Standards (je 100 mg L' ¹ Milchsäure und Glycolsäure) zu bestätigen, wurde diese Probe wie in Beispiel 1 beschrieben, mit einer GC -MS-Messung untersucht (Figur 3 bis Figur 5).

Figur 3 zeigt ein GC -MS-Chromatogramm und Massenspektren eines 100 mg L' ¹ Glycolsäure Standards, einer Probe des Mediums zum Zeitpunkt t = 0 h, einer Probe der M. extorquens TK 0001 + pTE1887-Leervektor-Kultivierung 22 - 24h nach der Induktion und einer erfindungsgemäßen Probe der M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (in Figur 3 als M. extorquens GAI bezeichnet, enthaltend die codon-optimierte Form des ghrA _eco Gens) Kultivierung 22 bis 24h nach der Induktion. Figur 4 zeigt diesselben Proben, mit Ausnahme des Standards, der gegen einen 100 mg L' ¹ Milchsäure-Standard getauscht wurde. Die Messungen belegen, dass im Vergleich mit dem Glycolsäure-Standard (Retentionszeit = 7,22 min) in der erfindungsgemäßen Kultivierungsprobe von M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrA _eC o (M. extorquens GAI) eindeutig Glycolsäure gebildet wurde. Das Massenspektrum des erhaltenen Peaks in der erfindungsgemäßen M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o-Probe stimmt eindeutig mit dem Massenspektrum des Glycolsäure-Standards überein (Figur 5A). Damit kann die Existenz von Glycolsäure in der erfindungsgemäßen M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o-Probe belegt und somit die Produktion von Glycolsäure durch diesen Stamm bewiesen werden. Im Vergleich kann in der Probe des M. extorquens TK 0001 + pTE1887- Leervektor-Stammes keine Glycolsäure nachgewiesen werden. Überraschenderweise zeigte sich auch die Bildung von Milchsäure (Retentionszeit = 6,88 min) ausschließlich in der Probe der erfindungsgemäßen M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o Kultivierung. Auch hier stimmt das Massenspektrum mit dem des Milchsäure-Standards überein (Figur 5B)

Diese Vorgehensweise konnte eindeutig belegen, dass Glycolsäure durch die erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylorubrum-Zelle M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o produziert wurde. Überraschenderweise konnte außerdem gezeigt werden, dass dieser Stamm eine Mischung aus Glycolsäure und Milchsäure produziert (siehe Figur 5). Figur 5 zeigt Detailaufnahmen der Massenspektren im Vergleich von einer identischen Probe der erfindungsgemäßen M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (in Figur 5 als M. extorquens GAI bezeichnet, enthaltend die codon-optimierte Form des ghrA _eco Gens) Kultivierung 22 bis 24h nach der Induktion mit Datenbanknachweis der Glycol säure-Identität in der M. extorquens GAI Probe (A) und der Milchsäure-Identität in der M. extorquens GAI Probe (B).

Es konnte überraschenderweise in der Kultivierung von M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrAeco per GC-MS sowohl die Produktion von Glycolsäure (Retentionszeit = 7,22 min) und auch Milchsäure (Retentionszeit = 6,88 min) nachgewiesen werden (Figur 3 bis Figur 5). Der Peak mit einer Retentionszeit von 6,88 min in dieser Probe konnte durch Vergleich mit einem externen Standard und im Datenbankabgleich des Massenspektrums mit einer 89-91 % Wahrscheinlichkeit als Milchsäure 2xTBDMS (Derivat von Milchsäure mit MBDSTFA) identifiziert werden (Figur 5B).

Diesen Phänotyp zeigte der Kontrollstamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887 nicht: Weder Glycolsäure noch Milchsäure konnten mit der GC-MS als Produkte detektiert werden. Ohne an die Theorie gebunden sein zu wollen, verändern die Änderungen im Redoxhaushalt den Metabolismus der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Methylobacteriaceae-Zelle M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o so, dass Milchsäure als ein mögliches Nebenprodukt der Glycolsäure-Produktion synthetisiert wird. Für diese Milchsäure-Bildung könnte eine NADH-abhängige Lactat Dehydrogenase (KEGG-Datenbank: Mex_lp4794) verantwortlich sein, die Pyruvat als Substrat nutzt. Eine alternative Möglichkeit ist, dass die Glyoxylat-Reduktase eine unspezifische Substratnutzung aufweist, die es dem Enzym ermöglicht, Pyruvat als Akzeptor zu nutzen. Auch ist grundsätzlich der Ablauf des Methylglyoxal-Stoffwechselwegs denkbar.

Es kann also gezeigt werden, dass die erfindungsgemäßen M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrAeco Zellen, enthaltend die codon-optimierte Form des ghrA _eco Gens, eine Mischung aus Glycolsäure und Milchsäure herstellen, welche als Ausgangspunkt für die Polymerisation zu Polyglycolsäure, Polymilchsäure oder Polylactid-co-Glycolid dienen können.

Beispiel 3: Wachstumsexperimente

Weiterhin wurden Wachstumsexperimente mit M. extorquens TK 0001 + pTE1887 und erfindungsgemäß mit dem Stamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (M. extorquens GAI) in Minimalmedium (Reaktionsmedium) mit 10 g L' ¹ Methanol als Edukt und einer Mischung von 10 g L' ¹ Methanol + 1.5 g L' ¹ Glyoxylat als weiteres Edukt durchgeführt (Figur 6).

Figur 6 A bis D zeigen Diagramme, bei denen auf den y-Achsen der Wachstumsverlauf (ODeoo, Kreise, schwarz gefüllt), der pH-Wert (Dreiecke, Spitze unten) und die Methanol-(Vierecke, ungefüllt), Glyoxylat-(Rauten, ungefüllt) und Glycolsäurekonzentrationen (Rauten, dunkelgrau gefüllt) sowie Milchsäurekonzentrationen (Dreiecke, grau gefüllt, Spitze oben) von M. extorquens TK 0001 + pTE1887 (A+C) und erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (codon-optimiert) (B+D) im Minimalmedium und auf der x-Achse die Zeit angegeben sind. Als Kohlenstoffquelle (Edukt), also Cx-Verbindung, wurde 10 g L' ¹ Methanol (A+B) oder 10 g L' ¹ Methanol + 1.5 g L' ¹ Glyoxylat (C+D) zugegeben. Die Messung der Methanol-, Glyoxylat- und der Glycol Säurekonzentration erfolgte mit HPLC, Refraktärindex- Detektion und externen Standards. Alle Konzentrationen sind in g L' ¹ angegeben. Die Daten repräsentieren drei unabhängige biologische Replikate.

Das Glyoxylat wurde zum Zeitpunkt der Induktion der Genexpression zugegeben und dient als Test, ob eine in vivo Erhöhung der Glyoxylat-Versorgung zu einer Erhöhung der Glycolsäure- Produktion führt. In Figur 6A ist zu erkennen, dass der Referenzstamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887 mit 10 g L' ¹ Methanol als Edukt keine Glycolsäure produzierte und eine gleichmäßige Biomassebildung aufweist bis zu einer maximalen ODeoo von ca. 9 nach 40 h Kultivierungsdauer. Auffällig ist die deutliche Erniedrigung des pH-Wertes auf unter 6.5 im Laufe der Fermentation. Im Vergleich führt in einer Kultivierung mit M. extorquens TK 0001 + pTE1887 die Zufütterung von Glyoxylat zu einem leicht verzögerten Wachstum und einer leicht höheren maximalen ODeoo von ca. 10 nach rund 42 h. Auch in diesem Fall wurde keine Glycolsäure produziert (Figur 6C). Allerdings konnte der pH-Wert in dieser Kultivierung beim initialen pH-Wert von rund 7.0 gehalten werden, was wahrscheinlich auf die Glyoxylat- Fütterung zurückzuführen ist.

Es konnte gezeigt werden, dass der erfmdungsgemäße rekombinante Stamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o, enthaltend die codon-optimierte Form des ghrA _eco Gens, aus 10 g L’ ¹ Methanol die Produkte Glycolsäure und Milchsäure in erhöhten Konzentrationen (-0,35 g L’ ¹ respektive 0,25 g L' ¹ in 40 h) bildete. Nachdem das Methanol abgebaut ist, werden im weiteren Verlauf der Kultivierung die Produkte wieder vollständig abgebaut. Die Bildung von Glycolsäure und Milchsäure geht einher mit einer deutlichen Verlangsamung des Biomassewachstums auf eine maximale ODeoo von 6,7 in 44 h. Außerdem sinkt der pH-Wert der Kulturbrühe vermutlich in diesem Fall durch die zusätzliche Glycolsäure-Bildung auf bis zu 6,2 und steigt durch Abbau der Glycolsäure auf einen zum Referenzstamm vergleichbaren Wert auf knapp 6,5 (Figur 6B).

Im Experiment mit erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o, enthaltend die codon-optimierte Form des ghrA _eco Gens, und Zufütterung von Glyoxylat konnte eine deutliche Steigerung der Glycolsäure-Produktion auf bis zu 1,0 g L' ¹ in 44 h erreicht werden. Die gebildete Menge an Milchsäure verhielt sich vergleichbar zur Kultivierung ohne Glyoxylat- Zufütterung (6B). Damit konnte gezeigt werden, dass Glyoxylat als Prekursor der Glycolsäure- Bildung eine wichtige Rolle spielt, und die Erhöhung der in vivo Konzentration von Glyoxylat eine verbesserte Glycolsäure-Produktion bewirkt. Auch in diesem Experiment wurde die gebildete Glycolsäure und Milchsäure verstoffwechselt, nachdem das Methanol verbraucht worden ist. Die in diesem Versuch gesteigerte Produktbildung führte erneut zu einer weiteren Erniedrigung des Biomassewachstums, wobei eine maximale ODeoo von rund 4,5 erreicht wurde. Im Gegensatz zum Referenzstamm ist in diesem Fall eine deutliche Erniedrigung des pH-Wertes trotz Glyoxylat-Zugabe zu beobachten, da Glycolsäure und Milchsäure produziert wurden. Analog zu beobachten ist aber auch die Erhöhung des pH-Wertes beim Abbau der gebildeten Glycolsäure und Milchsäure nachdem das Methanol aufgebraucht ist (Figur 6D). Zusammenfassend sind die aus den Daten abgeleiteten stammspezifischen Kultivierungs- Parameter wie p (spezifische Wachstumsrate), Yx/s (Biotrockenmasse-Substrat-Ausbeute), qs (spezifische Substrataufnahmerate), Yp/s (Produkt-Substrat-Ausbeute) und qp (spezifische Produktbildungsrate) in Tabelle 3 für die Stämme M. extorquens TK 0001 + pTE1887 und erfindungsgemäßem M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrA _eco , enthaltend die codon- optimierte Form des ghrA _eco Gens, zusammengefasst worden. Diese Daten legen nahe, dass die Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion mit einer deutlichen Verringerung der Biotrockenmasse-Substrat-Ausbeute (70 % des Referenzstammes und 70 % des Referenzstammes mit Glyoxylat-Fütterung) einhergeht und mehr Kohlenstoff in das Produkt umgesetzt wird oder zur Aufrechterhaltung des Redoxhaushalts verwendet werden muss. Auch ist ersichtlich, dass Glyoxylat die Wachstumsrate reduziert und somit ist ein potenzieller toxischer Effekt des Precursors möglich. Diese Toxizität von Glyoxylat kann durch eine optimale Ausbalancierung des in vivo Glyoxylat-Pools vermieden werden.

Tabelle 1. Zusammenfassung der Kultivierungs-Parameter von M. extorquens TK 0001 + pTE1887 und erfindungsgemäßem AT. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (M. extorquens GAI), enthaltend die codon-optimierte Form des ghrAeco Gens, in Minimalmedium mit 10 g L’ ¹ Methanol oder zusätzlich + 1.5 g L ^-1 Glyoxylate. Abkürzungen: p, spezifische Wachstumsrate MeOH, Methanol; GS, Glycolsäure; BTM, Biotrockenmasse.

¹ Ausbeuten sind geschätzt durch die kumulierte Substratnutzung von Methanol und Glyoxylat.

Beispiele 1 bis 3 zeigen, dass erfindungsgemäß Glycolsäure und Milchsäure mit M. extorquens GAI aus Cx- Verbindungen in einem methylotrophen Fermentationsprozess produziert werden kann.

Es ist insbesondere hervorzuheben, dass die erfindungsgemäße Glycolsäure-Produktion in M. extorquens GAI deutlich durch eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration von Glyoxylat gesteigert werden kann, wie in Beispiel 3 gezeigt wurde. In diesem Fall wurden 185 % mehr Glycolsäure gebildet im Vergleich zu der Kultivierung ohne Glyoxylat-Fütterung.

Beispiel 4: Experimentelle Daten der fermentativen Glycolsäure-Milchsäure-Herstellung aus Methanol

Das experimentelle Vorgehen ist gemäß Beispiel 1 durchgeführt worden. Der verwendete Stamm ist der Wildtypstamm Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337.

Folgende Expressionsvektoren (1 bis 4) wurden verwendet:

1.) pTE1887 (Expressionsvektor, auch Leervektor genannt; Plasmidkarte: Figur 8)

2.) pTE1887-ghrA _eC o (Expressionsvektor, der die Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia coli K- 12 MG1655 codon-optimiert codiert; mit SEQ ID Nr. 3, Plasmidkarte: Figur 9) (erfindungsgemäß) 3.) pTE1887-ghrAeco-ecm _m ea (Expressionsvektor, der die Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia coli K-12 MGI 655 (codon-optimiert) und die Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus M. extorquens TK 0001 DSM 1337 nativ codiert; Plasmidkarte: Figur 10) (erfindungsgemäß)

4.) pTE1887- ghrAeco-eemrsh (Expressionsvektor, der die Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia coli K-12 MGI 655 (codon-optimiert) und die Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 codon-optimiert; Plasmidkarte: Figur 11) (erfindungsgemäß).

Mittels der Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben wurden genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen hergestellt.

Figur 10 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung der Methylobacteriaceae-Zellen exprimierend die ghrA _e co-ecm _m ea verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eco (codon-optimiert), ecm _me a (nativ), Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Figur 11 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae- Zellen exprimierend die ghrA _eC o-ecm _r sh verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eco (codon-optimiert), rsh-ecm (codon-optimiert), Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Genetisch veränderte Methylorubrum extorquens TK 0001 -Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl- CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende native Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4), des Stamms Methylorubrum extorquens Mea- GA2 wurden am 10. Juni 2022 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34287 hinterlegt.

Genetisch veränderte Methylorubrum extorquens TK 0001 -Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl- CoA-Mutase aus dem Bakterium Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 codierende codon- optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 8), des Stamms Methylorubrum extorquens Mea- GA3 wurden am 10. Juni 2022 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34288 hinterlegt.

Es wurden Fermentationsversuche in Kulturmedium als Reaktionsmedium und Methanol (Edukt) als einziger Kohlenstoffquelle durchgeführt.

In Figur 7 ist der zeitliche Verlauf der Biomassekonzentration (ODeoo) und des Medium pH- Wertes über den Verlauf der Kultivierung dargestellt. Zeitgleich wurden Kulturüberstandsproben mit Hochleistungs-Chromatographie vermessen, um die Substrat- und Produkt-Konzentration und deren Änderungen über den zeitlichen Verlauf darzustellen.

Figur 7 zeigt auf der x-Achse die Zeit in Stunden und auf den y-Achsen den Wachstumsverlauf (ODeoo, Kreise, schwarz gefüllt), pH-Wert (Dreiecke, Spitze unten), Methanol-(Vierecke, ungefüllt) und Glycolsäure- (Rauten, dunkelgrau gefüllt) sowie Milchsäurekonzentrationen (Dreiecke, grau gefüllt, Spitze oben) von M. extorquens TK 0001 + pTE1887 (A), erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrAeco (codon-optimiert) (M. extorquens GAI) (B), erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrAeco-ecm _me a (ghrAeco: codon-optimiert; ecm _me a: nativ) (M. extorquens GA2) (C) und erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o-ecm _r sh (beide Gene codon-optimiert) (M. extorquens GA3) (D) in Kulturmedium mit 10 g L' ¹ Methanol als alleiniges Edukt, also als Cx-Verbindung.

Es konnte erneut gezeigt werden, dass das Enzym ghrAeco, eine Produktion von Glycolsäure im Stammhintergrund M. extorquens TK 0001 erlaubt. Hierbei wird ebenso Milchsäure produziert. Im Vergleich zeigt der Wildtypstamm, der den Leervektor pTE1887 enthält, keine Produktion von Glycolsäure oder Milchsäure. In diesen Versuchen wurden ca. 250 mg L' ¹ Glycolsäure und ca. 200 mg L' ¹ Milchsäure hergestellt mit einer Produkt-Substratausbeute von rund 50 mg gMethanoi' ¹ (Glycolsäure + Milchsäure). Es ist zu beobachten, dass die initiierte Glycolsäure- Synthese die Biotrockenmasse-Substrat-Ausbeute (Yx/s) des erfindungsgemäßen Stammes M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrAeco (M. extorquens GAI) auf 70 % im Vergleich zum Leervektor-Stamm senkt. Die Produktausbeute bezogen auf die Biotrockenmasse (Yp/x) liegt bei 0,27 g gBiotrockenmasse (Tabelle 4). Überraschenderweise führt die zusätzliche Implementierung der exogenen Ethylmalonyl-CoA- Mutasen zu einer signifikanten Verbesserung der Glycolsäure-Produktionsleistung im Vergleich zum erfindungsgemäßen Stamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o. Das Wachstum des erfindungsgemäßen Stammes M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o- ecmmea war mit einer gemessenen Wachstumsrate (p) von 0,10 h' ¹ verzögert im Vergleich zum Leervektorstamm (0,17 h' ¹ ). Der Einsatz des ecm-Gens aus M. extorquens TK 0001 DSM 1337 führte zu einer Erhöhung des Glycolsäure-Titers um 18 % nach 40 h Kultivierungsdauer im Vergleich zum erfindungsgemäßen Stamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (0,26 g L' ¹ versus 0,22 g L’ ¹ , Tabelle 4). Ebenfalls ist die Biotrockenmasse-Substrat-Ausbeute im Vergleich zum Leervektorstamm um 49 % und im Vergleich zum erfindungsgemäßen Stamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC oum 27 % reduziert.

Eine leichte Änderung ist bei der Produktausbeute bezogen auf die Biotrockenmasse (Yp/x) zu beobachten. Im Vergleich zum erfindungsgemäßen Stamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o konnte eine Erhöhung dieser Ausbeute um 11 % erzielt werden (Tabelle 4).

Der Einsatz des exogenen codon-optimierten ecm _rs h-Gens führte im Vergleich zum erfindungsgemäßen Stamm, umfassend das exogene ecm _me a-Gen, zu den aus Tabelle 4 ersichtlichen überraschenden Abweichungen der Kultivierungs-Parameter. Hier konnte der höchste gemessene Milchsäure-Titer von 0,37 g L' ¹ beobachtet werden. Eine markante Änderung betrifft die Biotrockenmasse-Substrat-Ausbeute (Yx/s), die im Vergleich zum erfindungsgemäßen Stamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _e co-ecm _m ea um 26 % erhöht ist (0,24 g gBiotrockenmasse )•

Es konnte demonstriert werden, dass die Glycolsäure-Produktion aus Methanol möglich ist. Der jeweilige Einsatz zweier exogener Ethylmalonyl-CoA-Mutase-Enzyme aus zwei verschiedenen prokaryotischen Stämmen erhöhte die Produktionsleistung der erfindungsgemäßen Produktionsstämme im Vergleich zum erfindungsgemäßen Stamm, umfassend ghrA _eco ohne eine exogene Ethylmalonyl-CoA-Mutase. Insbesondere führt der Einsatz der Ethylmalonyl- Coa-Mutase ecm _rs h überraschend zu einer deutlich erhöhten und selektiveren Milchsäure- Produktion.

Tabelle 4: Zusammenfassung der Kultivierungs-Parameter von M. extorquens TK 0001 + pTE1887 und erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o (codon- optimiert) (M. extorquens GAI), erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887- ghrAeco-ecnimea (ghrA _eco : codon-optimiert; ecm _me a: nativ) (M. extorquens GA2) und erfindungsgemäßer M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o-ecm _r sh (beide Gene codon- optimiert) (M. extorquens GA3) in Kulturmedium mit 10 g L' ¹ Methanol. Abkürzungen: p, spezifische Wachstumsrate; MeOH, Methanol; GS, Glycolsäure; BTM, Biotrockenmasse.

Beispiel 5: Experimentelle Daten des Nachweises der Enzym aktivität der erfindungsgemäß exprimierten Glyoxylat-Reduktase (ghrA _ec0 ) und eines Vergleichsenzyms, nämlich einer E. coli Hydroxypyruvat-Reduktase (ghrB _ec0 ):

Zur Erbringung des experimentellen Nachweises der Anwesenheit der Enzymaktivität der exprimierten Glyoxylat-Reduktase ghrA _eco und der Hydroxypyruvat-Reduktase ghrB _eco (Nunez, M.F., M.T. Pellicer, J. Badia, J. Aguilar, and L. Baldoma, Biochem J, 2001. 354(Pt 3): p. 707-15, Datenbankeintrag für ghrA: https://biocyc.org/gene?orgid=ECOLI&id=G6539, Datenbankeintrag für ghrB: https://biocyc.org/gene?orgid=ECOLI&id=EG12272) im Stammhintergrund Methylorubrum extorquens TK 0001 wurden Enzymassays durchgeführt. Es wurden von beiden Genen die native Form der DNA-Sequenzen (wie in Escherichia coli K- 12 MG1655 vorkommend) sowie die für die Expression in Methylobacteriaceae codon- optimierten synthetischen DNA-Sequenzen (c-optimiert) getestet, um den Einfluss der Codon- Optimierung auf die Genexpression und die resultierende Enzymaktivität zu evaluieren.

Die Vorgehensweise der Durchführung sowie die Ergebnisse sind im Folgenden zusammengefasst.

Um ausreichend Biomasse der genetisch modifizierten M. extorquens TK 0001 Stämme enthaltend pTE1887-ghrA _eC o-c-optimiert (SEQ ID Nr. 3), pTE1887-ghrB _eC o-c-optimiert, pTE1887-ghrA _eC o-nativ (SEQ ID Nr.l) und pTE1887-ghrB _eC o-nativ für einen Zellaufschluss zu gewinnen, wurde folgendes Anzuchtprotokoll angewendet. Als Negativkontrolle wurde der Stamm M. extorquens TK 0001 + pTE1887, den Leervektor enthaltend, mitgeführt. Alle Stämme wurden als drei unabhängigen biologische Replikate kultiviert, geerntet und aufgeschlossen.

Die Stämme wurden für eine erste dreitägige Vorkultur (in Minimalmedium mit Methanol (siehe Beispiel 1) in schikanierten Schüttelkolben (250 mL Kolbenvolumen, 50 mL Kulturvolumen) bei 30 °C, 150 RPM und Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre kultiviert (New Brunswick™ Innova 44, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland). Anschließend wurde aus der bewachsenen ersten Vorkultur eine zweite Vorkultur inokuliert in Minimalmedium mit Methanol in schikanierten Schüttelkolben (250 mL Kolbenvolumen, 50 mL Kulturvolumen). Hierbei entsprach die eingesetzte initiale Biomassekonzentration für die Inokulation einer Optischen Dichte bei 600 nm (ODeoo) von 0,1. Die darauffolgende Kultivierung erfolgte bei 30 °C, 150 rpm und Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre. Am nächsten Tag, Dienstag, wurden mit den bewachsenen zweiten Vorkulturen die Hauptkulturen inokuliert (50 mL Minimalmedium mit Methanol in 250 mL schikanierten Schüttelkolben, initiale ODeoo = 0,05) und bei 30 °C, 150 rpm und unter Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre inkubiert. Nachdem die Kulturen eine ODeoo von 0, 9-1,0 erreicht hatten, wurde mit 1 mM IPTG (Endkonzentration im Kulturvolumen) die Genexpression der Glyoxylat-Reduktasen induziert. Anschließend wurde die Biomasse bis zu einer finalen OD600 von ca. 4-7 angezogen.

Für die eigentliche Ernte der Biomasse wurden konische Zentrifugationsgefäße mit einem Volumen von 50 mL leer, gewogen, mit jeweils den bewachsenen 50 mL Hauptkultur befüllt und abschließend bei 4.200 rpm für 15 Min. bei 4 °C zentrifugiert. Nach dem Zentrifugationsschritt wurde der Überstand verworfen und die erhaltenen Biomassepellets mit jeweils 20 mL 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) Puffer gewaschen. Danach erfolgte eine erneute Zentrifugation unter den vorherigen Bedingungen gefolgt von der sorgfältigen Abnahme des Überstands mit einer Pipette. Die erhaltenen Biomassepellets wurden gewogen und in jeweils 50 mM MOPS-Puffer (pH 6,6) resuspendiert. Hierfür wurde pro 1 g Nasspellet ein Puffervolumen von 7 mL verwendet.

Der Zellaufschluss zur Gewinnung von Proteinrohextrakten, enthaltend die exprimierten Glyoxylat- bzw. Hydroxypyruvat-Reduktasen, erfolgte in 2,0 mL Reaktionsgefäßen. Hierfür wurden jeweils 1,5 mL der Zellsuspension in diese Reaktionsgefäße überführt und anschließend im Eiswasserbad sechsmal für jeweils 30 Sek. bei einer Amplitude von 60 per Ultraschall aufgeschlossen. Jeweils zwischen den sechs Aufschlusszyklen wurden die Proben für 1 Min. auf Eis gekühlt. Abschließend, zur Gewinnung des Proteinrohextrakts, folgte eine Zentrifugationsschritt bei 21.500 rpm für 15 Min bei 4 °C. Der erhaltene proteinhaltige Überstand wurde in 1,5 mL Reaktionsgefäße überführt. Um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse des Enzymassays zu gewährleisten, wurde die Proteinkonzentration der jeweiligen Proteinrohextrakte bestimmt mit Hilfe eines NanoDrop™. Der Rohextrakt mit der niedrigsten gemessenen Konzentration wurde als Zielkonzentration für die Verdünnung der anderen Rohextrakte mit 50 mM MOPS-Puffer (pH 6,6) verwendet. Somit konnte sichergestellt werden, dass alle Proteinrohextrakte im Enzymassay die gleiche Gesamtproteinkonzentration enthalten. Des Weiteren wurden diese vorverdünnten Proteinrohextrakte ein weiteres Mal verdünnt (1 :5) mit 50 mM MOPS-Puffer (pH 6,6) und anschließend im Enzymassay eingesetzt.

Der Enzymassay wurde in 96 Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Dafür wurden 160 pL der verdünnten Proteinrohextrakte mit 20 pL 50 mM Glyoxylat als Substrat und 20 pL 2 mM Cofaktor-Stocklösung (NADH oder NADPH, Endkonzentration im Assay 0,2 mM) versetzt. Die experimentellen Ansätze sind in drei technischen Replikaten ausgeführt. Die Enzymaktivität wurde gemessen als Änderung der Absorption von NADH bei 340 nm bei 37 °C für bis zu 30 Min. Für die Auswertung wurde die maximale Änderung der Absorption über die Zeit im linearen Bereich der Reaktion bestimmt und mit dem Verdünnungsfaktor von fünf multipliziert vor Berechnung der Enzymaktivität in U mL’ ¹ .

Die Enzymaktivität wurde mit Hilfe der Gleichung 6 berechnet und den angegebenen Koeffizienten. (Gleichung 6) Mit Enzymaktivität: Gemessen in molsubstrat Min.' ¹ , Vproteinrohextrakt- Assay: Im Assay eingesetztes Volumen des Proteinrohextraktes (0,00016 L), S: Um den Verdünnungsfaktor von fünf korrigierte Änderung der Absorption bei 340 nm über die Zeit im linearen Bereich der Reaktion (Abs.34o Min.' ¹ ), VAssa _y : Gesamtvolumen des Assays (0,0002 L), s : Extinktionskoeffizient von NADH/NADPH bei 340 nm (6220 L mol' ¹ cm' ¹ ), d: Schichtdicke des absorbierenden Reaktionsansatzes (0,53 cm).

Für eine Umrechnung der Enzymaktivität von molsubstrat min' ¹ in die konventionelle Einheit für Enzymaktivität mU mL' ¹ (1 U = 1 pmolsubstrat min' ¹ ) wird das berechnete Ergebnis mit dem Faktor 10 ⁶ multipliziert.

Die erhaltenen Enzymaktivitäten wurden den jeweiligen Expressionsstämmen und den eingesetzten Cofaktoren NADH oder NADPH zugeordnet für einen graphischen Vergleich.

Die erhobenen Daten für die Enzymaktivitäten von ghrA _eC o-c-optimiert, ghrB _eC o-c-optimiert, ghrAeco-nativ, ghrB _eC o-nativ und der Negativkontrolle (pTE1887-Leervektor) sind in Figur 12 zusammengefasst. Die Messungen und die jeweils angezeigte Standardabweichung basiert auf drei biologischen Replikaten mit jeweils drei technischen Replikaten des Assays.

Wie zu erwarten, zeigt der Leervektor nur eine geringfügige Hintergrundaktivität. Diese wurde von allen weiteren Messwerten subtrahiert, um die stattfindende Hintergrundreaktion zu korrigieren.

Die in Figur 12A und 12B dargestellten Enzymaktivitäten in Hinblick auf den Umsatz von Glyoxylat zu Glycolsäure zeigen, dass lediglich die beiden erfindungsgemäß eingesetzten Enzyme ghrA _eC o-c-optimiert und ghrA _eC o-nativ (also ghrA _eco ) eine insbesondere für eine großtechnische Produktion ausreichende Aktivität zeigen. Es können zudem deutliche Unterschiede in der Enzymaktivität in Abhängigkeit vom verwendeten Cofaktor nachgewiesen werden. Im Assay zeigt sich, dass eine eindeutige Cofaktor-Abhängigkeit von ghrA _eco und ghrBeco besteht. Unter Verwendung von NADH als Cofaktor (Figurl2 A) wird die höchste Enzymaktivität mit ghrB _eC o-c-optimiert erzielt (10,53 ± 1,50 mU mL' ¹ ). Die Enzymaktivität, verursacht durch das Gen ghrA _eC o-c-optimiert, ist mit 0,49 ± 2,34 mU mL' ¹ im Vergleich mit ghrBeco-c-optimiert deutlich reduziert. Hier konnte eine Reduktion der Enzymaktivität um rund 95 % gemessen werden. Die Enzymaktivität der NADH-Assays mit den nativen Genen liegt in einem ähnlichen Bereich: 4,61 ± 1,61 mU mL' ¹ versus 2,45 ± 0,67 mU mL' ¹ für ghrA _eC o-nativ und ghrBeco-nativ. Die Codon-Optimierung von ghrB _eco führte zu einer Steigerung der Aktivität um 329 %. Zusammenfassend lässt sich eine eindeutige Abhängigkeit des ghrB _eco Enzyms von NADH als Cofaktor erkennen.

Im Gegensatz dazu zeigte sich bei der Verwendung von NADPH als Cofaktor ein anderes Bild (Figur 12 B).

Hier können mit ghrA _eC o-c-optimiert und ghrAe _C0 -nativ (33,86 ± 1,29 mU mL’ ¹ und21,76 ± 1,49 mU mL’ ¹ ) die mit Abstand höchsten in den vorliegenden Tests gemessenen Enzymaktivitäten erreicht werden. Die Steigerung durch die Codon-Optimierung beträgt 55 % (21,76 ± 1,49 versus 33,86 ± 1,29 mU mL’ ¹ ). Es kann zudem eindeutig belegt werden, dass das ghrA _eco Enzym eine NADPH-Abhängigkeit aufweist. Dies wird unterstrichen durch die geringfügige gemessene Aktivität von ghrB _eco . In diesem Fall wurde sowohl beim Einsatz der codon- optimierten Variante des Gens (ghrB _eC o-c-optimiert) als auch mit der nativen Variante des Gens (ghrBeco-nativ) lediglich eine Enzymaktivität von 3, 17 ± 0,29 respektive 0,81 ± 0,30 mU mL’ ¹ gemessen (Figur 12 B), was zeigt, daß ghrBeco nicht nur hinsichtlich der beobachteten sehr geringen NADPH-Abhängigkeit, sondern primär auch hinsichtlich der geringen Enzymaktivität beim Umsatz von Glyoxylat zu Glycolsäure deutlich von ghrA unterscheidbar ist.

Die erhöhte Enzymaktivität mit NADPH als Cofaktor ausgelöst durch die Expression von ghrAeco-c-optimiert zeigt, dass die Glycolsäure-Produktion durch M. extorquens durch die Expression dieses Enzyms möglich wird. Die sowohl mit NADPH als auch mit NADH deutlich reduzierte Enzymaktivität, die im Zusammenhang mit ghrB _eC o-c-optimiert gemessen wurde, reicht nicht aus, um in vivo die Glycolsäure-Produktion in M. extorquens zu ermöglichen.

Die mit M. extorquens TK 0001 + pTE1887-ghrA _eC o-c-optimiert beobachtete Glycolsäure- Produktion scheint in Abhängigkeit mit der Verfügbarkeit von NADPH als Cofaktor zu stehen. Diese Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse aus Beispiel 2.

Überraschenderweise führt die Einbringung der DNA-Sequenz des ghrA _eC o Enzyms, insbesondere der codon-optimierten DNA-Sequenz, zu einer Glycolsäure-Produktion sowie zu einer überraschenden Produktion von Milchsäure.

Beispiel 6:

Expression von exogener, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierender Nucleinsäuresequenz in Zellen von weiteren Methylobacteriaceae (Erfindung) sowie anderen Mikroorganismen (Vergleich) Es wurden weitere Gattungen der Familie der Methyl ob acteriaceae (Alphaproteobacteria) nach Beispiel 1 genetisch modifiziert. Figur 13 zeigt beispielhaft die untersuchten Mikroorganismen. Insbesondere stellvertretend untersucht für die Methyl ob acteriaceae wurden Methylorubrum, insbesondere M. zatmanii DSM 5688, insbesondere M. extorquens TK 0001 DSM 1337 (Beispiele 2 bis 5), insbesondere M. extorquens PA1 DSM 23939, insbesondere M. rhodesianum DSM 5687, ein Derivat von M. extorquens AMI DSM 1338 mit einer Deletion eines Cellulase-Gens (M. extorquens AMlAcel: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0062957), und Methylobacterium-Zellen, insbesondere M. organophilum DSM 18172, insbesondere M. radiotolerans DSM 760.

Zusätzlich wurden Methylomonas methanica DSM 25384 (Gammaproteobacteria), Methylophilus methylotrophus DSM 6330 (Betaproteobacteria) und Bacillus methanolicus DSM 16454 (Firmicutes) als nicht in die Familie der Methyl ob acteriaceae gehörende Negativbeispiele untersucht. Die vorgenannten Mikroorganismen sind ebenfalls in der Lage Methanol zu verstoffwechseln und wurden getestet auf die erfindungsgemäße Glycolsäure- und/oder Milchsäure-Produktion.

Folgende Expressionsvektoren (1 bis 4) wurden verwendet:

1.) pTE1887 (Expressionsvektor, auch Leervektor genannt; Plasmidkarte: Figur 8)

2.) pTE1887-ghrA _eC o (Expressionsvektor, der die Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia coli K- 12 MG1655 codon-optimiert codiert; mit SEQ ID Nr. 3, Plasmidkarte: Figur 9) (erfmdungsgemäß)

3.) pTE1887-ghrAeco-ecm _m ea (Expressionsvektor, der die Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia coli K-12 MGI 655 (codon-optimiert) und die Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus M. extorquens TK 0001 DSM 1337 nativ codiert; Plasmidkarte: Figur 10) (erfmdungsgemäß)

4.) pTE1887-ghrAeco-ecm _r sh (Expressionsvektor, der die Glyoxylat-Reduktase aus Escherichia coli K-12 MGI 655 (codon-optimiert) und die Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 codon-optimiert; Plasmidkarte: Figur 11) (erfmdungsgemäß).

Genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) des Stamms Methylorubrum zatmanii Mza-GA14 (M. zatmanii DSM 5688 + pTE1887-ghrA _eC o) wurden am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34701 hinterlegt.

Genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) des Stamms Methylorubrum extorquens Mea-GA17 (M. extorquens PA1 DSM 23939 + pTE1887-ghrA _eC o) wurden am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34702 hinterlegt.

Genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) des Stamms Methylorubrum rhodesianum Mrh-GA4 (M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887-ghrA _eC o) wurden am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34697 hinterlegt.

Genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende native Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4), des Stamms Methylorubrum rhodesianum Mrh-GA5 (M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887-ghrA _e co-ecm _m ea) wurden am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34698 hinterlegt.

Genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) des Stamms Methyl ob acterium organophilum Mor-GA8 (M. organophilum DSM 18172 + pTE1887-ghrA _e co-ecm _m ea) wurden am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34699 hinterlegt.

Genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zellen, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende native Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4), des Stamms Methyl ob acterium radiotolerans Mra-GA12 (M. radiotolerans DSM 760 + pTE1887-ghrA _e co-ecm _m ea) wurden am 19. Juli 2023 bei der DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 34700 hinterlegt.

Um die Erfindung mit den vorgenannten Stämmen zu untersuchen, wurde nach Beispiel 2 verfahren. Abweichend zu Beispiel 2 wurden die Kultivierungen mit den verwendeten Methylobacteriaceae-Zellen M. rhodesianum (Figur 14) DSM 5687, M. zatmanii DSM 5688 (Figur 15), M. radiotolerans DSM 760 (Figur 16), M. organophilum DSM 18172 (Figur 17), M. extorquens PA1 DSM 23939 (Figur 18) mit einer reduzierten Menge an Edukt (Cx- Verbindung, 4 g L' ¹ Methanol) gestartet und zwischen zehn und zwölf Stunden nach Induktion zusätzliches Edukt zugefüttert (Fed-Batch, kumuliert bis zu 15 g L' ¹ ). Außerdem wurden die Proben zur Bestimmung der Glycolsäure-, Milchsäure- und Methanol-Konzentration nach 22 - 28 h nach Induktion der Genexpression mit 1 mM IPTG entnommen.

Die Figuren 14 bis 19 zeigen auf der x-Achse die genetisch veränderten Methylobacteriaceae- Zellen und auf der y-Achse die Konzentration von Methanol (weißer, nicht ausgefüllter Balken) beziehungsweise die Konzentration der Mischung aus gebildeter Glycolsäure und Milchsäure (schwarzer, ausgefüllter Balken) in g L' ¹ im Reaktionsmedium. Alle Probenentnahmezeitpunkte liegen 22 bis 28 Stunden nach Induktion der Genexpression mit 1 mM IPTG. Alle Konzentrationen sind in g L' ¹ angegeben, bestimmt durch HPLC, Refraktärindex-Detektion und externen Standards.

Figur 14 zeigt das Screeningergebnis der Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion mit rekombinanten M. rhodesianum DSM 5687-Stämmen, die Glyoxylat-Reduktasen exprimieren, ausgehend von den korrespondierenden codon-optimierten Genen. Der erste Eintrag von Links zeigt die Methanolkonzentration im Minimalmedium zum Beginn der Kultivierung. Als Expressionsvektor wurde pTE1887 genutzt, der in Form des Leervektors im Referenzstamm M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887 auch als Negativkontrolle dient (zweiter Eintrag von links auf der x-Achse).

Überraschenderweise zeigten sowohl der Referenzstamm M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887 (zweiter Eintrag von links) als auch die genetisch veränderten Methylobacteriaceae- Zellen keine Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion (Einträge von links: 3 bis 10 und 12 bis 16), mit Ausnahme (schwarze, ausgefüllte Balken in Figur 14) der erfindungsgemäßen genetisch veränderten -Zellen von M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887-ghrA _eC o (in codon- optimierter Nucleinsäure-Form nach SEQ ID Nr. 3), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 11) und der genetisch veränderten Zellen M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887-ghrA _eC o- ecmmea, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MG1655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende native Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 17) und der genetisch veränderten Zellen M. rhodesianum DSM 5687 + pTE1887-ghrA _eC o-ecm _r sh, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 8), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 18).

Figur 9 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae-Zellen verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter - 33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrAeco-c-optimiert, Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Figur 10 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung der Methylobacteriaceae-Zellen exprimierend die ghrA _e co-ecm _m ea verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eco (codon-optimiert), ecm _me a (nativ), Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Figur 11 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae- Zellen exprimierend die ghrA _eC o-ecm _r sh verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eco (codon-optimiert), rsh-ecm (codon-optimiert), Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Es konnten mit den erfindungsgemäß gentechnisch veränderten Zellen von M. rhodesianum DSM 5687Mischungen von Glycolsäure und Milchsäure enthaltend eine Gesamtkonzentration von Glycolsäure plus Milchsäure bis 0,85 g L' ¹ (M. rhodesianum DSM5687 + pTE1887- ghrAeco-eemmea), wenigstens 0,82 g L' ¹ (M. rhodesianum DSM5687 + pTE1887-ghrA _eC o), wenigstens 0,09 g L' ¹ (M. rhodesianum DSM5687 + pTE1887-ghrA _eC o-ecm _r sh) produziert werden.

Diese experimentellen Daten demonstrieren, dass eine erfindungsgemäße Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion innerhalb der Familie der Methyl ob acteriaceae möglich ist.

Figur 15 zeigt das Screeningergebnis der Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion mit rekombinanten M. zatmanii DSM 5688-Stämmen, die erfindungsgemäß das Gen der Glyoxylat- Reduktase aus Escherichia und in einem Fall zusätzlich das Gen einer Ethylmalonyl-CoA- Mutase aus Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 exprimieren, ausgehend von den korrespondierenden codon-optimierten Genen. Der erste Eintrag von Links zeigt die Methanolkonzentration im Minimalmedium zum Beginn der Kultivierung. Als Expressionsvektor wurde pTE1887 genutzt, der in Form des Leervektors im Referenzstamm M. zatmanii DSM 5688 + pTE1887 auch als Negativkontrolle dient (zweiter Eintrag von links auf der x-Achse).

Überraschenderweise zeigte der Referenzstamm M. zatmanii DSM 5688 + pTE1887 (zweiter Eintrag von links) keine Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion, im Gegensatz zu (schwarze, ausgefüllte Balken in Figur 15) den erfindungsgemäßen genetisch veränderten Zellen von M. zatmanii DSM 5688 + pTE1887-ghrA _eC o (in codon-optimierter Nucleinsäure-Form nach SEQ ID Nr. 3), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 3) und der genetisch veränderten Zellen M. zatmanii DSM 5688 + pTE1887-ghrA _eC o-ecm _r sh, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 8), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 4).

Figur 9 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae-Zellen verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter - 33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrAeco-c-optimiert, Lambda TO Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Figur 11 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae- Zellen exprimierend die ghrA _eC o-ecm _r sh verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eco (codon-optimiert), rsh-ecm (codon-optimiert), Lambda TO Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Es konnten mit den erfindungsgemäß gentechnisch veränderten Zellen von M. zatmanii DSM 5688 Mischungen von Glycolsäure und Milchsäure enthaltend eine Gesamtkonzentration von Glycolsäure plus Milchsäure bis 0,56 g L' ¹ (M. zatmanii DSM 5688 + pTE1887-ghrA _eC o), wenigstens 0,48 g L' ¹ (M. zatmanii DSM 5688 + pTE1887-ghrA _eC o-ecm _r sh) produziert werden. Diese experimentellen Daten demonstrieren, dass die erfindungsgemäße Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion innerhalb der Familie der Methylobacteriaceae, möglich ist.

Figur 16 zeigt das Screeningergebnis der Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion eines rekombinanten M. radiotolerans DSM 760-Stammes. Der erste Eintrag von Links zeigt die Methanolkonzentration im Minimalmedium zum Beginn der Kultivierung. Als Expressionsvektor wurde pTE1887 genutzt, der in Form des Leervektors im Referenzstamm M. radiotolerans DSM 760 + pTE1887 auch als Negativkontrolle dient (zweiter Eintrag von links auf der x-Achse).

Überraschenderweise zeigte der Referenzstamm M. radiotolerans DSM 760 + pTE1887 (zweiter Eintrag von links) keine Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion im Gegensatz zu den erfindungsgemäßen genetisch veränderten Zellen von M. radiotolerans DSM 760 + pTE1887-ghrAeco-ecm _m ea, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende native Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 3) (schwarzer ausgefüllter Balken in Figur 16). Die Kombination von ghrA _eco und ecm _me a (eine erfindungsgemäße Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus M. extorquens TK 0001 DSM 1337) führte zu einer erfindungsgemäßen Glycol säure- und Milchsäure-Produktion.

Figur 10 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung der Methylobacteriaceae-Zellen exprimierend die ghrA _e co-ecm _m ea verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eco (codon-optimiert), ecm _me a (nativ), Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Es konnten mit den erfindungsgemäß gentechnisch veränderten Zellen von M. radiotolerans DSM 760 Mischungen von Glycolsäure und Milchsäure enthaltend eine Gesamtkonzentration von Glycolsäure plus Milchsäure bis 0,39 g L' ¹ (M. radiotolerans DSM 760 + pTE1887- ghrAeco-eemmea) produziert werden.

Diese experimentellen Daten demonstrieren, dass die erfindungsgemäße Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion innerhalb der Familie der Methylobacteriaceae, möglich ist.

Figur 17 zeigt das Screeningergebnis der Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion mit rekombinanten M. organophilum DSM 18172-Stämmen, die Glyoxylat-Reduktasen exprimieren, ausgehend von den korrespondierenden codon-optimierten Genen. Der erste Eintrag von Links zeigt die Methanolkonzentration im Minimalmedium zum Beginn der Kultivierung. Als Expressionsvektor wurde pTE1887 genutzt, der in Form des Leervektors im Referenzstamm M. organophilum DSM 18172 + pTE1887 auch als Negativkontrolle dient (zweiter Eintrag von links auf der x-Achse).

Überraschenderweise zeigten sowohl der Referenzstamm M. organophilum DSM 18172 + pTE1887 (zweiter Eintrag von links) als auch die genetisch veränderten Methylobacteriaceae- Zellen keine Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion (Einträge von links: 3 bis 10 und 12 bis 18), mit Ausnahme (schwarze, ausgefüllte Balken in Figur 17) der erfindungsgemäßen genetisch veränderten Zellen von M. organophilum DSM 18172 + pTE1887-ghrA _eC o (in codon- optimierter Nucleinsäure-Form nach SEQ ID Nr. 3), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 11) und der genetisch veränderten Zellen M. organophilum DSM 18172 + pTE1887-ghrA _eC o- ecmmea, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MG1655 codierende codon-optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA-Mutase aus dem Bakterium Methylorubrum extorquens TK 0001 DSM 1337 codierende native Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 17) und der genetisch veränderten Zellen M. organophilum DSM 18172 + pTE1887-ghrA _eC o-ecm _r sh, umfassend eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia coli K-12 MGI 655 codierende codon - optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 3) und eine exogene, eine Ethylmalonyl-CoA- Mutase aus dem Bakterium Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 codierende codon- optimierte Nucleinsäuresequenz (SEQ ID Nr. 8), also eine erfmdungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat- Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 18).

Figur 9 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae-Zellen verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter - 33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrAeco-c-optimiert, Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Figur 10 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung der Methylobacteriaceae-Zellen exprimierend die ghrA _e co-ecm _m ea verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eco (codon-optimiert), ecm _me a (nativ), Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Figur 11 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae- Zellen exprimierend die ghrA _eC o-ecm _r sh verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter -33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrA _eco (codon-optimiert), rsh-ecm (codon-optimiert), Lambda T0 Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Es konnten mit den erfindungsgemäß gentechnisch veränderten Zellen von M. organophilum DSM 18172 Mischungen von Glycolsäure und Milchsäure enthaltend eine Gesamtkonzentration von Glycolsäure plus Milchsäure bis 0,13 g L' ¹ (M. organophilum DSM 18172 + pTE1887-ghrA _eC o), wenigstens 0, 10 g L' ¹ (M. organophilum DSM 18172 + pTE1887- ghrAeco-ecirimea), wenigstens 0,04 g L' ¹ (M. organophilum DSM 18172 + pTE1887-ghrA _eC o- ecmrsh) produziert werden.

Diese experimentellen Daten demonstrieren, dass die erfindungsgemäße Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion innerhalb der Familie der Methylobacteriaceae, möglich ist.

Figur 18 zeigt das Screeningergebnis der Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion mit rekombinanten M. extorquens PA1 DSM 23939-Stämmen. Der erste Eintrag von Links zeigt die Methanolkonzentration im Minimalmedium zum Beginn der Kultivierung. Als Expressionsvektor wurde pTE1887 genutzt, der in Form des Leervektors im Referenzstamm M. extorquens PA1 DSM 23939 + pTE1887 auch als Negativkontrolle dient (zweiter Eintrag von links auf der x-Achse).

Überraschenderweise zeigte der Referenzstamm M. extorquens PA1 DSM 23939 + pTE1887 (zweiter Eintrag von links) keine Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion, im Gegensatz zu den erfindungsgemäßen genetisch veränderten Zellen von M. extorquens PA1 DSM 23939 + pTE1887-ghrA _eC o (in codon-optimierter Nucleinsäure-Form nach SEQ ID Nr. 3), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (schwarzer ausgefüllter Balken in Figur 18) (Eintrag von links: 3).

Figur 9 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae-Zellen verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter - 33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrAeco-c-optimiert, Lambda TO Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Es konnte mit den erfindungsgemäß gentechnisch veränderten Zellen von M. extorquens PA1 DSM 23939 Mischungen von Glycolsäure und Milchsäure enthaltend eine Gesamtkonzentration von Glycolsäure plus Milchsäure bis 1,50 g L' ¹ (M. extorquens PA1 DSM 23939 + pTE1887-ghrA _eC o) (M. extorquens GA17) produziert werden.

Diese experimentellen Daten demonstrieren, dass die erfindungsgemäße Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion innerhalb der Familie der Methylobacteriaceae, möglich ist.

Figur 19 zeigt das Screeningergebnis der Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion mit rekombinanten M. extorquens AMlAcel-Stämmen, die Glyoxylat-Reduktasen exprimieren, ausgehend von den korrespondierenden codon-optimierten Genen. Der erste Eintrag von Links zeigt die Methanolkonzentration im Minimalmedium zum Beginn der Kultivierung. Als Expressionsvektor wurde pTE1887 genutzt, der in Form des Leervektors im Referenzstamm M. extorquens AMlAcel + pTE1887 auch als Negativkontrolle dient (zweiter Eintrag von links auf der x-Achse).

Überraschenderweise zeigte der Referenz stamm M. extorquens AMlAcel + pTE1887 (zweiter Eintrag von links) keine Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion, mit Ausnahme (schwarzer ausgefüllter Balken in Figur 19) der erfmdungsgemäßen genetisch veränderten -Zellen von M. extorquens AMlAcel + pTE1887-ghrA _eC o (in codon-optimierter Nucleinsäure-Form nach SEQ ID Nr. 3), also eine erfindungsgemäße genetisch veränderte Methylobacteriaceae-Zelle umfassend mindestens eine exogene, eine Glyoxylat-Reduktase aus dem Bakterium Escherichia codierende Nucleinsäuresequenz (Eintrag von links: 11).

Figur 9 zeigt die Karte des Vektors, der für die Generierung dieser Methylobacteriaceae-Zellen verwendet wurde mit folgenden Elementen: lacl Gen, lacl Promoter, PL/O4/A1 Promoter - 33 Region -10 Region Transkriptionsstart, PL/O4/A1 Promoter Ribosomale Bindestelle (RBS), ghrAeco-c-optimiert, Lambda TO Terminator, Kanamycin Resistenz, Mobilisation Gene mobS und mob, Regulatory protein RepA. Origin of replication colEl.

Es konnte mit den erfindungsgemäß gentechnisch veränderten Zellen von M. extorquens AMlAcel Mischungen von Glycolsäure und Milchsäure enthaltend eine Gesamtkonzentration von Glycolsäure plus Milchsäure bis 0,60 g L' ¹ (M. extorquens AMlAcel + pTE1887-ghrA _eC o) produziert werden.

Diese experimentellen Daten demonstrieren, dass die erfindungsgemäße Glycolsäure- und Milchsäure-Produktion innerhalb der Familie der Methylobacteriaceaemöglich ist. Eine Deletion des Cellulase Gens (Acel) wirkt sich nicht auf den Glyoxylat-Glycolsäure-Milchsäure- Stoffwechsel aus.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 5 (nachstehend) zusammengefasst.

Es wurden weitere Untersuchungen an methylotrophen Mikroorganismen durchgeführt, die nicht zu der Familie der Methylobacteriaceae gehören. Zu diesem Zweck wurden die Stammkonstruktionsverfahren gemäß Beispiel 1 zur Erzeugung gentechnisch veränderter Stämme von Methylomonas methanica DSM 25384 (Gammaproteobacteria), Methylophilus methylotrophus DSM 6330 (Betaproteobacteria) und Bacillus methanolicus DSM 16454 (Firmicutes) durchgeführt. Dies war in allen Fällen nicht möglich mit den verwendeten Stämmen. Die untersuchten Stämme zeigten für sämtliche eingesetzte Vektoren pTE1887, pTE1887-ghrA _eC o, pTE1887-ghrA _e co-ecm _m ea und pTE1887-ghrA _eC o-ecm _r sh kein Wachstum während des in Beispiel 1 beschriebenen Stammkonstruktionsverfahrens (Tabelle 5).

Tabelle 5: Zusammenfassung der erreichten Glycolsäure- und Milchsäure-Titer von getesteten Stämmen der Familie der Methyl ob acteriaceae und Vergleichsbeispielen (nicht zu der Familie der Methyl ob acteriaceae gehörenden Mikroorganismen). Abkürzungen: GS, Glycolsäure; MS, Milchsäure.

¹ Bei Wachstumstest verwendete Temperaturen: Methylophilus methylotrophus DSM 6330 (37

°C), Bacillus methanolicus DSM 16454 (45 °C).