DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de glycolipides par extraction liquide/liquide dans lequel la première phase liquide, dite polaire, est une solution constituée principalement d'un alcool et d'eau dans lequel la matière première a été préalablement dissoute, et la seconde phase liquide, dite apolaire, est constituée principalement d'un solvant organique de faible constante diélectrique, par exemple un alcane. L'invention concerne également un mélange de glycolipides obtenus par ce procédé.

ETAT DE LA TECHNIQUE

L'essor des biotechnologies blanches présente de nombreuses opportunités pour le développement d'une nouvelle chimie et de nouvelles applications basées sur la transformation de matières premières renouvelables. Les biotensioactifs formés à partir de matières premières simples telles qu'huiles végétales ou sucres offrent des performances similaires voire supérieures à celles des tensio-actifs d'origine fossile, tout en présentant un impact environnemental et une toxicité plus faibles, et une meilleure biodégradabilité. C'est donc tout naturellement que les acteurs du domaine présentent depuis plusieurs années de nouveaux résultats sur la synthèse de ces biotensioactifs par voie fermentaire ou enzymatique, et sur la caractérisation de leurs performances à l'état purifié, que ce soit pour des applications en cosmétique, agriculture, environnement, ou pharmaceutiques.

Entre ces deux aspects relatifs à la synthèse d'une part et à l'application d'autre part, la purification des biotensioactifs est un maillon indispensable mais paradoxalement négligé à date. Les travaux connus rappelés ci-après ne font état d'aucun procédé de purification applicable à une échelle industrielle, qui offre à la fois un rendement et une qualité élevés, qui soit associé à des solvants dont les contraintes d'utilisation sont acceptables par les réglementations sanitaires et environnementales, et qui soit basé sur l'utilisation de technologies de séparation capacitives et robustes. Cela est pourtant le résultat indispensable pour permettre le développement économique de ces biotensioactifs.

La purification des glycolipides est d'une complexité technique élevée, du fait de la présence d'autres lipides à séparer, tels que acides gras, triglycérides, esters d'acides gras, avec une faible différence entre les propriétés physico-chimiques des impuretés lipidiques et des glycolipides. Cette complexité est d'autant plus grande que le procédé de synthèse de la matière première brute riche en glycolipides est le résultat d'un procédé de transformation enzymatique ou de fermentation, ce qui occasionne la formation de nombreux co-produits, notamment responsables de couleur, et nécessite la présence de sels, de divers nutriments, et de biomasse. Les techniques disponibles pour le fractionnement des lipides comptent notamment l'évaporation et en particulier l'évaporation sous très grand vide, comme la distillation court trajet, les procédés membranaires tels que la nanofiltration, la cristallisation ou la précipitation, les techniques basées sur la chromatographie et l'extraction liquide- liquide. L'exploitation de l'extraction liquide-liquide est compliquée par les propriétés tensio- actives des glycolipides, et par le caractère hydrophobe de la molécule. Dans ces conditions un simple mélange d'eau et de solvant organique ne peut pas être utilisé, car il ne mènerait à aucun fractionnement visible entre les différentes classes de lipides, voire en fonction des quantités impliquées pourrait aboutir à la formation de deux phases liquides émulsionnées difficilement séparables. Il est donc nécessaire de définir deux compositions de phases liquides qui ne soient pas miscibles et soient facilement séparables malgré la présence d'une quantité importante de biotensioactifs, pour assurer une séparation sélective entre les lipides et garantir l'absence d'émulsion stable.

L'extraction de lipides à partir de biomasse complexe avec un alcool est connu de l'état de la technique. Par exemple, EP 1 813 664 EP décrit la préparation d'une huile enrichie en glycosphingolipides ou de US 201 1/019073 pour extraire les lipides d'une masse de microalgues sans les détériorer. Ces procédés sont complexes, avec des étapes de chauffage de la matière première. Les produits obtenus sont des huiles complexes enrichies en glycolipides, mais ne permettent pas d'obtenir des glycolipides purifiés, essentiellement des glycolipides (au moins 90%) et des triglycérides et acides gras en très faibles proportions (moins de 1 % et moins de 5% respectivement).

L'extraction des lipides grâce à l'utilisation de deux solvants organiques non miscibles est décrite à l'échelle du laboratoire notamment pour la caractérisation d'échantillons de tissus ou produits naturels, notamment la méthode dite de Folch (Folch J. et al., A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues). Mais la complexité du procédé qui comporte de nombreuses étapes d'extraction et la nature et les quantités de solvants employés (plus de 20 fois la masse de lipides à extraire) ne permet pas d'envisager une exploitation industrielle.

L'extraction de lipides polaires par séparation liquide/liquide avec un mélange éthanol/eau (ratio massique éthanol/eau supérieur à 6) et de l'éther de pétrole est également connue (Galanos D.S. et al. Isolation of polar lipids from triglycéride mixtures). Toutefois, ce procédé décrit à l'échelle du laboratoire ne permet pas une purification des lipides polaires acceptable pour une exploitation industrielle, avec une pureté de 50 à 75 % environ (Hartman L., Comparison of two methods for the séparation of polar from nonpolar lipids).

Plus spécifiquement pour la purification des glycolipides, l'extraction liquide-liquide a été décrite dans la plupart des cas avec un solvant de polarité intermédiaire, tel l'acétate d'éthyle ou le Methyl-ter-Butyl Ether (MTBE), pour extraire les glycolipides du moût de fermentation. Des exemples sont donnés par U. Rau et al. (« Downstream processing of Mannosylerythritol lipids produced by Pseudozyma aphidis »), Smyth T.J.P. et al. (« Isolation and Analysis of Low Molecular Weight Microbial Glycolipids), et Hubert J. et al. (« New perspectives for microbial glycolipid fractionation and purification processes »). Ces procédés de laboratoire restent complexes, nécessitant de nombreuses étapes, avec notamment l'élimination nécessaire du solvant d'extraction avant de pouvoir procéder à la purification, voire l'emploi de technologies trop complexes pour un procédé industriel, comme la chromatographie de partage centrifuge (Hubert J. et al.). En outre, les rendements obtenus sont très faibles, limité à 8% pour Rau & al. (2005a), ce qui exclut toute extrapolation à échelle industrielle.

La demande WO 2004/020647 décrit un procédé de préparation de mannosylérythritol lipides (MELs) dans lequel l'isolation du produit à partir de la biomasse se fait par simple dissolution dans l'éthanol à partir des fractions solides préalablement obtenues par chauffage à plus de 100°C et liquides susceptibles de contenir les MELs, puis évaporation de l'éthanol, c'est à dire sans purification particulière pour éliminer des impuretés hydrophobes résiduelles comme les triglycérides ou les acides gras. De même, la demande JP 2007-252280 décrit un procédé d'isolation de MELs sous formes de billes solides à partir du moût de fermentation et une teneur en acides gras élevée dans le produit récupéré. Un procédé d'extraction de glycolipides à partir d'une huile végétale est décrit dans la demande EP 1 027 413. Là aussi, la teneur en lipides polaires dans l'extrait obtenu ne dépasse pas 50%, dont moins de 80% de glycolipides. Enfin les techniques de fractionnement de glycolipides par extraction au dioxyde de carbone dans des conditions supercritiques sont décrites dans la demande EP 1 222 009. La méthode comprend toutefois un nombre d'étapes trop important pour la purification industrielle de biosurfactants purifiés, et la phase extraite est très diluée, à moins de 1 % de solutés, malgré une pression opératoire extrêmement élevée de 250 bar.

Il existe un besoin de pouvoir disposer d'un procédé robuste et efficace pour l'obtention de glycolipides de haute pureté, susceptible d'être exploité industriellement.

EXPOSE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de glycolipides par extraction liquide/liquide à partir d'une matière première comprenant les glycolipides à purifier et des impuretés hydrophobes de type triglycérides et acides gras ou dérivés d'acides gras, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives de i. dissoudre la matière première dans une phase polaire comprenant au moins un alcool en C2-C3 et de l'eau pour dissoudre les glycolipides et les impuretés hydrophobes, puis

ii. mise en contact de la phase polaire avec une phase apolaire comprenant un solvant organique apolaire non miscible à la phase polaire pour permettre le transfert des impuretés hydrophobes dans la phase apolaire, puis

iii. séparation des phases polaires et apolaires et récupération de la phase polaire purifiée, puis

iv. isolation des glycolipides de la phase polaire purifiée,

le rapport pondéral alcool/eau dans la phase polaire allant de 2/1 à 5/1 .

La méthode selon l'invention est particulièrement appropriée pour la purification de mannosylerythritol lipides (MELs) comme glycolipides, en particulier obtenus par fermentation, plus particulièrement obtenus par fermentation d'huiles végétales, par exemple huile d'arachide, huile de coco, huile de colza, huile d'olive, huile de palme, huile de soja ou huile de tournesol.

L'invention concerne également un mélange de glycolipides obtenus par ce procédé, en particulier dont les caractéristiques sont les suivantes, les teneurs étant exprimées en masse et hors eau :

au moins 90 %, de préférence au moins 95% de glycolipides

- moins de 1 %, de préférence moins de 0.2%, de triglycérides

moins de 5%, de préférence moins de 3%, d'acides gras libres

moins de 1000 ppm, de préférence moins de 100 ppm d'alcool en C2-C3 moins de 50 ppm, de préférence moins de 1 ppm, de solvant organique apolaire. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un nouveau procédé de purification de glycolipides par extraction liquide/liquide à partir d'une matière première comprenant les glycolipides à purifier et des impuretés hydrophobes de type triglycérides et acides gras caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives de

i. dissoudre la matière première dans une phase polaire comprenant au moins un alcool en C2-C3 et de l'eau pour dissoudre les glycolipides et des impuretés hydrophobes, puis

ii. mise en contact de la phase polaire avec une phase apolaire comprenant un solvant organique apolaire non miscible à la phase polaire pour permettre le transfert des impuretés hydrophobes dans la phase apolaire, puis

iii. séparation des phases polaires et apolaires et récupération de la phase polaire purifiée, puis iv. isolation des glycolipides de la phase polaire purifiée.

L'étape i) de dissolution permet d'éliminer à ce stade les solides résiduels tels que des traces de résidus cellulaires ou protéiques.

De manière préférentielle, l'alcool en C2-C3 est choisi parmi l'éthanol, l'isopropanol et leurs mélanges en toutes proportions, avantageusement l'éthanol étant majoritaire dans le mélange éthanol/isopropanol, plus préférentiellement un mélange éthanol/isopropanol comprenant plus de 70% d'éthanol, avantageusement plus de 80 % d'éthanol, préférentiellement plus de 90 % d'éthanol. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'alcool en C2-C3 est de l'éthanol pur.

Sauf indication contraire, les pourcentages sont exprimés en poids.

La phase polaire est donc définie comme la solution constituée au moins par le mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau, ainsi que les glycolipides et les impuretés qu'elle contient suite à la dissolution de la matière première.

Le solvant organique apolaire, ou encore solvant d'extraction apolaire, est défini comme un solvant organique de faible constante diélectrique, le terme inclut par exemple les hydrocarbures mais exclut l'eau et les alcools en C2-C3.

La phase apolaire est donc définie comme la solution constituée principalement par le solvant organique apolaire, ainsi que par les impuretés extraites lors de la mise en contact de la phase apolaire avec la phase polaire. Ainsi la teneur en impuretés dans la phase polaire diminue lors de la mise en contact.

Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté pour une matière première riche en glycolipides dont la teneur en glycolipides représente au moins 25% de la matière sèche, avantageusement au moins 35 % de la matière sèche, généralement de 20 à 60 %, voire plus 60% selon la matière sèche.

De manière avantageuse, la teneur en insolubles dans le solvant polaire est inférieure à la teneur en glycolipides, avantageusement inférieure à 20 % de la matière sèche, préférentiellement inférieure à 15% de la matière sèche

Ces matières premières comprennent généralement, outre les glycolipides à purifier, des impuretés hydrophobes telles que des triglycérides et acides gras, qui peuvent représenter jusqu'à 75% de la matière sèche.

Le rapport pondéral alcool/eau dans la phase polaire va de 2/1 à 5/1 , de préférence de 2,5/1 à 4/1 , avantageusement de 2,5 à 3,5. L'homme du métier saura déterminer la teneur en eau dans la phase polaire employée dans l'étape i. pour permettre à la fois une bonne dissolution des glycolipides, puis pour favoriser un bon transfert des impuretés hydrophobes dans la phase apolaire. Il tiendra compte notamment de la présence éventuelle d'eau dans la matière première. L'étape i. de dissolution des glycolipides entraine également la dissolution d'impuretés hydrophobes comme les triglycérides et les acides gras (dits acides gras libres). Les méthodes de dissolution sont bien connues de l'homme du métier. La dissolution peut être réalisée de façon continue ou de façon discontinue, par ajout du mélange d'alcool et d'eau à la matière première à dissoudre, ou inversement. Le mélange des flux sera mis en œuvre par exemple dans une cuve agitée équipée de mobiles d'agitation assurant un écoulement axial ou radial, mais de préférence axial ou encore plus préférentiellement un écoulement mixte grâce à l'utilisation de mobiles adaptés, par exemple pales inclinées à 45°, ou par l'utilisation de deux mobiles superposés, l'un axial et l'autre radial. La durée sous agitation doit être suffisante pour obtenir en sortie une phase liquide d'apparence homogène, un étagement de l'agitation dans deux cuves successives peut également être considéré pour assurer l'homogénéité et disposer d'une capacité tampon. De façon avantageuse, la matière première à dissoudre est alimentée dans le mélange d'alcool et d'eau sous agitation. De façon encore plus avantageuse si la matière première est présente sous une forme équivalente à un solide, par exemple une pâte visqueuse ou gélifiée, elle sera alimentée sous la forme de particules dont la taille moyenne sera réduite par l'une des méthodes connues par l'homme du métier, telle qu'extrusion ou pompage à travers une conduite de dimension réduite. De préférence, le procédé de synthèse de la matière première riche en glycolipides est conduit de telle manière que la matière première riche en glycolipides soit fluide, voire assimilable à un liquide. De façon encore plus avantageuse, la dissolution de la matière première dans le solvant de dilution est réalisée de façon continue grâce à une technologie de mélange continu en conduite, par exemple la technologie commercialisée par la société SULZER CHEMTECH sous le nom SMI.

La matière première riche en glycolipides et en lipides est diluée dans le mélange d'alcool et d'eau plutôt que dans le solvant organique apolaire avant l'étape d'extraction liquide-liquide, ce qui limite l'exposition au solvant organique apolaire et les risques de rejets de ce solvant. De manière avantageuse, la quantité de mélange d'alcool et d'eau ajouté ne dépasse pas cinq fois la quantité de matière première à traiter, et de préférence ne dépasse pas deux fois la quantité de matière première à traiter. Eventuellement le mélange d'alcool et d'eau contient jusqu'à quelques pourcents de solvant organique apolaire, s'il en est préalablement saturé. C'est notamment le cas lorsqu'il est recyclé et a déjà été utilisé pour l'étape d'extraction. Si nécessaire la phase polaire constituée par la matière première diluée dans le mélange d'alcool et d'eau peut être traitée par centrifugation, filtration, floculation, coagulation ou adsorption, ou toute combinaison de ces techniques, pour éliminer les traces de biomasse résiduelle issue du procédé de synthèse de la matière première, ainsi que si nécessaire tout trouble protéique résiduel dans la solution. Un mode avantageux de mise en œuvre de l'invention consiste à traiter une matière première exempte de biomasse et de protéines grâce à un mode de récolte adapté en fin de synthèse.

Le solvant organique apolaire est avantageusement choisi parmi les alcanes d'une part, ou les hydrocarbures d'origine végétale tels que les terpènes d'autre part. Parmi les alcanes, le solvant organique apolaire est avantageusement choisi parmi le cyclohexane, le n-heptane, le butane ou le pentane sous pression, à l'état liquide. Parmi les hydrocarbures d'origine végétale, le solvant organique apolaire peut être choisi parmi les terpènes, tels que les isomères du limonène, du pinène, ou tout mélange naturel constitué majoritairement par ces espèces. Un mode avantageux de mise en œuvre de l'invention consiste également à utiliser le produit de l'hydrogénation de ces terpènes, par exemple les fractions riches en para-menthane obtenu par hydrogénation de fractions riches en limonène, comme solvant d'extraction apolaire. Le solvant organique apolaire, l'alcool et une partie de l'eau utilisés dans le cadre de l'invention sont recyclés et réutilisés pour leur majeure partie pour le fractionnement de la charge suivante de matière première, le dit fractionnement étant de préférence réalisé de façon continue. Ainsi la consommation de solvant et d'alcool sur le procédé est limitée, de sorte que la quantité totale de solvant et d'alcool consommée soit au moins inférieure à la masse de glycolipides purifiée, de préférence inférieure à un dixième de la masse de glycolipides purifiée.

La phase polaire comprenant les glycolipides est mise en contact avec le solvant d'extraction apolaire, dans des conditions telles que le transfert des impuretés hydrophobes de la phase polaire vers la phase apolaire soit facilité (étape ii.). L'homme du métier connaît bien les différentes méthodes de mise en contact de phases liquides non miscibles pour la mise en œuvre industrielle de méthodes de séparation liquide/liquide. Ces méthodes peuvent être réalisées de manière discontinue (ou « batch ») ou encore de manière continue.

Les conditions nécessaires à un transfert efficace d'une phase à l'autre incluent en particulier un mélange intime des phases, pour que la surface de contact entre les deux liquides soit augmentée. Ce mélange intime des phases peut être assuré par agitation mécanique notamment, dans une cuve ou une colonne agitée par exemple, ou par circulation à contre-courant dans une colonne garnie de plateaux perforés, ou de divers éléments de garnissage en vrac, par exemple des anneaux de Raschig, de Pall ou de Nutter, ou des selles de Berl, ou Intalox, ou par des éléments de garnissage structuré constitué d'un assemblage de plaques corruguées aux dimensions de la colonne. Ces éléments seront par exemple constitués de plastique ou de métal, le choix du matériau devant être gouverné par la nature de la phase continue dans la colonne. Le choix de la phase dite continue est effectué grâce à des tests préalables d'agitation sur des échantillons de phase polaire et apolaire. La phase continue est choisie de telle sorte que la vitesse de décantation et de formation d'une interface claire soit minimisée après arrêt de l'agitation. Un descriptif détaillé de ces technologies et de leurs principes de fonctionnement sont décrits par les ouvrages de référence pour l'homme du métier, par exemple par R.E.Treybal (« Liquid Extraction », Seconde édition, Editions Mc-Graw Hill) ou encore par R.H.Perry, L.A.Robbins and R.W.Cusack (Chapitre 15 du Perry's Chemical Engineering Handbook, Huitième édition, également aux Editions Me Graw Hill).

Les conditions de mise en œuvre sont également choisies telles que le volume ou le débit de solvant d'extraction apolaire requis pour atteindre une pureté en glycolipides supérieure à 95% soit minimisé. C'est-à-dire que l'équipement ou la méthode de séparation mis en œuvre assure, ou simule dans le cas d'un procédé discontinu dans une cuve agitée par exemple, un écoulement à contre-courant des deux phases liquides. Dans cette configuration, l'extrait constitué par la phase apolaire en sortie de colonne était en contact avec la phase polaire peu appauvrie de sorte que la teneur en impuretés dans l'extrait est maximisée. Réciproquement, le raffinât constitué par la phase polaire en sortie de colonne était en contact avec la phase apolaire peu enrichie en impuretés, de sorte que la qualité du raffinât est maximisée. L'efficacité d'un écoulement à contre-courant dans un dispositif d'extraction liquide-liquide est dépendant de la technologie mise en œuvre, des conditions opératoires telles que vitesse d'écoulement ou intensité d'agitation, et des propriétés physico-chimiques des phases telles que tension interfaciale et viscosité. L'efficacité d'un équipement donné dans des conditions données est couramment caractérisée par la notion d'étages théoriques de séparation, mesurable par des essais dédiés réalisés sur un système ternaire dont l'équilibre de phases est connu. Dans le cadre de l'invention décrite ici le nombre d'étages théoriques de séparation à mettre en œuvre est choisi entre 2 et 15, de préférence entre 5 et 10. L'intérêt d'un dispositif à contre-courant avec une efficacité élevée est double puisqu'il diminue le débit de solvant d'extraction requis pour atteindre une pureté donnée, mais aussi de fait augmente le rendement en glycolipides car la teneur en glycolipides dans la phase apolaire récupérée dépend elle peu de l'efficacité mise en œuvre. En effet la phase apolaire est en contact dans la colonne avec une phase polaire dont la concentration en glycolipides est relativement constante. Le ratio massique de solvant organique apolaire est de 0.2 à 3 fois la masse de phase polaire à traiter, de préférence de 0.5 à 1 fois. Dans les conditions décrites ci-dessus il est possible d'atteindre une pureté en glycolipides dans la phase polaire, hors alcool, solvant apolaire et eau, supérieure à 95%, et ce avec un rendement supérieur à 90%, c'est-à-dire que moins de 10% des glycolipides sont extraits avec les impuretés. Ces performances sont suffisamment élevées pour considérer une extrapolation d'un procédé de production de glycolipides par voie fermentaire vers une maille de production industrielle. Parallèlement au mélange intime des phases nécessaire au transfert, il est également nécessaire d'autoriser une coalescence des gouttelettes de phase dispersée, de sorte que celle-ci reste séparée de la phase continue par décantation et que l'opération soit stable, sans engorgement de l'équipement d'extraction par sortie d'une phase avec l'autre. Ce point est essentiel pour assurer un procédé robuste et capacitif. Il s'agit donc de définir le niveau de mélange maximal qui peut être atteint avant que les avantages, à savoir un transfert rapide des solutés d'une phase à l'autre, deviennent inférieurs aux inconvénients, à savoir une diminution du débit maximal qui peut être traité dans un équipement de taille donnée avant engorgement avec sortie d'une phase dans l'autre. Ce niveau de mélange optimal se traduit par la définition des conditions opératoires, par exemple vitesse d'agitation dans le cas des technologies agitées, fréquence ou intensité de pulsation sur le débit d'alimentation dans le cas des colonnes puisées, ou vitesses de passage des fluides dans le cas des technologies fixes, l'objectif étant que la phase dispersée subisse des actions équilibrées de division et coalescence. Ces deux actions peuvent être soit successives dans le cas basique d'un procédé discontinu dans une cuve agitée, où la phase de séparation physique des phases par décantation succède à la phase de transfert sous agitation. Ces deux actions peuvent être simultanées mais séparées dans l'espace dans une colonne à plateaux perforés par exemple ou dans une colonne agitée dans une moindre mesure, ou alors elles peuvent être totalement simultanées par exemple dans une colonne à garnissage. Un dernier exemple pour la mise en œuvre d'une extraction liquide-liquide est l'utilisation de technologies centrifuges telles que celles commercialisées par les sociétés ALFA-LAVAL, ROUSSELET-ROBATEL ou B&P PROCESS EQUIPMENTS.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, les étapes ii. et iii. de mise en contact puis de séparation des phases apolaire et polaire sont réalisées de façon simultanée, conjointement, sur un dispositif d'extraction à contre-courant avec circulation continue des deux flux liquides , en particulier sur une colonne d'extraction agitée à contre- courant, ou sur un extracteur centrifuge.

À noter qu'il est possible de considérer l'ajout d'une section de lavage de la phase apolaire en sortie par contre-extraction des glycolipides qu'elle contient, par un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau. Ainsi il est possible de maximiser à la fois le niveau de pureté atteint dans la phase polaire, et le taux de récupération des glycolipides dans cette même phase. Une telle section de lavage peut être mise en œuvre suivant les mêmes principes généraux de l'extraction liquide-liquide décrits précédemment, et de façon avantageuse sont mis en œuvre dans le même équipement que l'étape principale d'extraction des impuretés hydrophobes. Dans ce cas deux alimentations de solutions riches en alcool et en eau sont considérées, l'une en tête de colonne est constituée exclusivement d'alcool et d'eau, et l'autre en un point intermédiaire de la colonne est l'alimentation principale, constituée des glycolipides et des impuretés dissoutes dans un mélange d'alcool et d'eau.

De manière avantageuse, la mise en œuvre de l'étape i) de dissolution et ii) de mise en contact avec la phase apolaire se fait sans chauffage, à température ambiante comprise entre 15 et 30 °C, avantageusement 25 °C. La mise en œuvre du procédé selon l'invention ne nécessite donc pas de chauffage ou de refroidissement pour les étapes i) et ii) ce qui constitue un avantage économique important. Egalement, la plupart des lipides et sous- produits hydrophobes de la fermentation sont extraits lors de cette étape, ils ne sont donc pas exposés aux risques de dégradation thermique qui sont classiques pour les acides gras notamment, et qui peuvent entraîner la formation de sous-produits, notamment responsables de couleur ou d'odeur. Les installations industrielles sont d'ailleurs généralement dans des bâtiments industriels eux même tempérés, à l'abri des grands froids. En cas de grande canicule, les températures élevées susceptibles d'être observées n'ont pas d'impact substantiel sur le résultat obtenu.

La phase apolaire collectée après l'étape iii. est ensuite avantageusement concentrée notamment par évaporation ou distillation, ou encore par des procédés membranaires tels que nanofiltration et particulièrement nanofiltration avec une membrane dont le matériau résiste aux solvants utilisés. Une telle étape de concentration vise à obtenir d'une part un résidu concentré en impuretés hydrophobes qui peut être éliminé du procédé, et d'autre part un solvant organique apolaire régénéré et débarrassé des impuretés, qui peut être recyclé. De manière avantageuse cette concentration est réalisée par évaporation sous une pression supérieure à la pression atmosphérique pour faciliter la condensation des vapeurs de solvant, ou sous une pression inférieure à la pression atmosphérique pour assurer de canaliser toute fuite éventuelle de solvant sur le procédé, tout en limitant le risque de dégradation thermique des produits qui constituent le résidu après évaporation. De préférence, la récupération du solvant apolaire par évaporation est réalisée sous pression réduite. La pression est choisie de préférence entre 900 et 50 mbar absolus, et de préférence entre 500 et 200 mbar absolus. De façon avantageuse, le rendement de récupération du solvant organique apolaire est supérieur à 95%, et de façon encore plus avantageuse la teneur résiduelle en solvant organique apolaire dans le résidu est inférieure à 5 000 ppm. Il est possible que deux phases liquides soient obtenues par la condensation des vapeurs générées. Dans ce cas, les deux phases sont séparées, par exemple par décantation, et seule la phase la plus riche en solvant organique apolaire est recyclée en tant que solvant d'extraction. La phase la moins riche en solvant apolaire est riche en alcool et en eau, et est recyclée en tant qu'appoint pour la dilution de la matière première. Si nécessaire tout ou partie du flux recyclé peut également être traité par une étape supplémentaire de purification, par exemple distillation ou filtration membranaire telle que nanofiltration et particulièrement nanofiltration avec une membrane dont le matériau résiste aux solvants utilisés, voire une fraction du flux peut être purgée, pour éliminer du procédé tout contaminant à l'état de trace susceptible de s'accumuler. La solution retenue pouvant être appliquée de façon continue ou périodique, quelle qu'elle soit.

La phase polaire collectée après l'étape iii. peut éventuellement être traitée par des étapes supplémentaires de purification avant l'étape iv. d'isolation des glycolipides de la phase polaire. Par exemple, la phase polaire peut être soumise à une étape d'adsorption sur des adsorbants tels que résines polymères, greffées ou non, charbons actifs, gels de silice, zéolites, ou terres décolorantes telles que bentonites, ou encore filtration membranaire telle que nanofiltration et particulièrement nanofiltration avec une membrane dont le matériau résiste aux solvants utilisés. L'objectif de cette étape facultative est d'éliminer sélectivement une impureté non extraite par le solvant apolaire ou encore présente à l'état de trace. Toute purification supplémentaire envisagée à ce stade n'influe pas de façon significative sur la teneur massique en glycolipides vis-à-vis des autres impuretés organiques de type lipides. Elle n'impacte que des teneurs inférieures à 1000 ppm en impuretés et ne vise qu'à améliorer les caractéristiques telles que couleur, odeur, ou teneurs en sels, du produit fini. Une telle étape d'adsorption peut être réalisée en continu sur un filtre constitué d'un lit fixe de particules d'adsorbants, ou en discontinu suivant une première étape de mélange de la phase polaire avec l'adsorbant, puis une seconde étape de séparation de la phase polaire purifiée et de l'adsorbant solide. De manière avantageuse, la phase polaire collectée après l'étape iii. est passée sur un lit fixe de résine polymère adsorbante ou de charbon actif.

L'étape iv. consiste à isoler les glycolipides de la phase polaire, ce qui signifie que l'alcool et l'eau qui constituent majoritairement la phase polaire sont récupérés. L'homme du métier connaît les méthodes industrielles permettant d'isoler les glycolipides de la phase polaire, notamment évaporation ou distillation, ou encore des procédés membranaires tels que nanofiltration et particulièrement nanofiltration avec une membrane dont le matériau résiste aux solvants utilisés. De manière avantageuse, les glycolipides sont isolés de la phase polaire par distillation de l'alcool, des traces éventuelles de solvant organique apolaire, et d'une fraction de l'eau, puis par évaporation de l'eau résiduelle.

L'évaporation ou la distillation sont réalisées de préférence à une pression réduite pour éviter la dégradation des glycolipides et la formation de produits secondaires notamment responsables de couleur. De manière avantageuse l'évaporation ou la distillation est réalisée à une pression comprise entre 900 et 50 mbar absolus, de préférence à une pression comprise entre 500 et 100 mbar absolus. De même l'évaporation ou la distillation est réalisée à une température comprise entre 40 et 200°C, de préférence à une température comprise entre 50 et 120°C. La distillation consiste à alimenter la phase polaire dont les glycolipides doivent être isolés sur une colonne garnie d'éléments de garnissage vrac ou structuré identiques à ceux qui ont été décrits pour l'étape d'extraction liquide-liquide, ladite colonne étant équipée d'un évaporateur à son pied et d'un condenseur à sa tête, et l'alimentation étant réalisée de façon homogène sur la section. La colonne et notamment la section basse peut également être équipée de plateaux équipés de cloches, de perforations ou de clapets mobiles ou fixes. De manière avantageuse la section basse est équipée de plateaux dont la conception minimise les risques de moussage, par exemple les technologies commercialisées par les sociétés KOCH-GLITSCH ou UOP, sous les noms ULTRA-TRAY ou MD, respectivement. Le taux de reflux en tête de colonne est réglé pour atteindre une composition cible dans le distillât, et notamment sur le ratio entre eau et alcools. De manière avantageuse, l'étape iv. d'isolation des glycolipides de la phase polaire est réalisée en deux étapes, la première étape consistant à éliminer l'alcool et les traces éventuelles de solvant organique apolaire par distillation puis la seconde étape, facultative, consistant à éliminer l'eau résiduelle par décantation ou évaporation. À l'issue de la première étape de distillation un distillât riche en alcool est obtenu et est recyclé pour la dilution de la matière première riche en glycolipides et en impuretés, en vue de sa purification par extraction liquide-liquide dans les conditions décrites dans l'invention. Si nécessaire tout ou partie du flux recyclé peut également être traité par une étape supplémentaire de purification, par exemple distillation ou filtration membranaire, voire une fraction du flux peut être purgée, pour éliminer du procédé tout contaminant à l'état de trace susceptible de s'accumuler. La solution retenue pouvant être appliquée de façon continue ou périodique, quelle qu'elle soit.

L'évaporation éventuelle de l'eau résiduelle pour obtenir les glycolipides déshydratés est réalisée dans les mêmes gammes de pression et de température que la distillation. Elle est cependant réalisée avantageusement sur une technologie d'évaporation qui minimise le temps de séjour du produit, par exemple sur un évaporateur à film tombant ou à couche mince. De façon encore plus avantageuse, l'évaporation de l'eau résiduelle est réalisée sur une technologie résistante à la présence de mousse, et qui tolère les produits dont la viscosité est élevée. Le terme de viscosité élevée désigne ici une gamme de viscosité qui peut atteindre de 10 à 1 000 Pa.s, ou plus, jusqu'à 5 000 Pa.s, dans les conditions de travail notamment température et taux de cisaillement. De telles technologies d'évaporation indiquées pour la déshydratation des glycolipides sont les évaporateurs à couche mince ou à film raclé, ou les technologies telles que la technologie commercialisée par APV sous le nom PARAVAP. De manière avantageuse, l'étape finale de déshydratation est réalisée sur un évaporateur à couche mince. L'eau récupérée par condensation des vapeurs peut être recyclée sur le procédé si besoin, en remplaçant avantageusement une consommation d'eau extérieure, ou purgée en tant qu'effluent aqueux. L'étape iv. d'isolation des glycolipides peut également inclure une étape de décantation en fonction de la teneur en eau, en alcool et en glycolipides. Une phase aqueuse pauvre en glycolipides peut être formée sous des conditions précises de teneur en alcool, en eau et en glycolipides. Dans ce scénario, la phase aqueuse pauvre en glycolipides est préférentiellement séparée par une technique telle que décantation, hydrocyclone ou centrifugation, et purgée. Si nécessaire, une quantité supplémentaire d'eau peut être ajoutée à tout moment de la séquence d'isolation des glycolipides, mais avant cette étape de décantation de préférence et au plus tard pendant cette étape. Ainsi la quantité de phase aqueuse pauvre en glycolipides à éliminer est augmentée, mais cet effluent peut éliminer des traces de contaminants hydrophiles tels que des sels.

Les glycolipides susceptibles d'être extraits par le procédé selon l'invention sont des produits d'origine naturelle, généralement des produits de fermentation d'huiles végétales ou obtenus par conversion enzymatique d'huiles végétales. On citera en particulier les rhamnolipides, les sophorolipides, les cellobiolipides, les tréhalose lipides, et les mannosylerythritol lipides.

De manière avantageuse, la matière première est un produit de fermentation d'huiles végétales, par exemple huile d'arachide, huile de coco, huile de colza, huile d'olive, huile de palme, huile de soja ou huile de tournesol.

La méthode selon l'invention est particulièrement appropriée pour la purification de mannosylerythritol lipides (MELs) comme glycolipides. Les MELs sont bien connus de l'homme du métier, et comprennent plusieurs molécules identifiées notamment comme MEL-A, MEL-B et MEL-C, suivant leur degré d'acétylation.

La préparation de MELs par fermentation est bien connue de l'homme du métier, en particulier les procédés fermentaires discontinus et les procédés fermentaires semi continus. On peut citer Kitamoto et al. (1990) qui produisent des MELs à partir d'huile de soja comme substrat principal, on peut citer Accorsini et al. (2012) qui produisent des Mels par fermentation d'huile de soja et de glycérol comme substrats principaux, on peut citer Kitamoto et al. (2001 ) qui produisent des MELs à partir d'alcanes comme substrats principaux. On peut encore citer la demande de brevet WO 2014/185805 qui décrit la production de MELs à partir d'une biomasse lignocellulosique. Les procédés discontinus, utilisés par les auteurs précédents, consistent à mélanger la totalité ou la quasi-totalité des éléments du milieu de fermentation dans le réacteur et à fermenter ces éléments avec le microorganisme inoculé.

Les procédés semi continus ou discontinus alimentés consistent en l'ajout au cours de la fermentation de certains des éléments du milieu de fermentation. On peut citer le travail de Rau et al. (2005b) qui réalisent des apports d'huile de soja, de glucose et de nutriments au cours de la production des MELs. Dans la présente invention, le mode de fermentation utilisé, les sources de carbone utilisées, les conditions de fermentation utilisées, la souche du microorganisme utilisé importent peu. Par exemple, la souche utilisée peut être la souche Pseudozyma aphidis DSMZ 70725, une souche des espèces Pseudozyma aphidis, Pseudozyma antartica, Pseudozyma tsukubaiensis, une souche du genre Pseudozyma ou tout autre souche apte à produire des MELs. De même, le milieu de fermentation pour produire les surfactants peut être un milieu de fermentation dont la composition aura été ajustée pour produire les MELs. Ce milieu contiendra une ou plusieurs sources d'azote dont des sources organiques telles que l'extrait de levure et des sources minérales telles que des sels de nitrate, des sels d'ammonium, de l'urée. Le milieu contiendra des sources de carbone telles que des graisses et des huiles telles que huile d'arachide, huile de coco, huile de colza, huile d'olive, huile de palme, huile de soja ou huile de tournesol, d'autres sources de carbone insolubles autres tel que la paraffine ou les alcanes, des sources de carbone solubles tels que le glucose, le fructose, le glycérol, ou toute combinaison de ces sources de carbone. Le milieu contient également des sources de vitamines et minéraux.

De même le pH et la température peuvent être ajustés par l'homme du métier de façon à favoriser la production des MELs. De même, l'agitation et l'aération peuvent être ajustés par l'homme du métier de façon à favoriser la production des MELs. De même, le mode de fermentation peut être un procédé discontinu ou discontinu alimenté, voire un procédé continu.

En fin de fermentation, la phase riche en glycolipides, tels que les rhamnolipides, les sophorolipides, les tréhaloses lipides ou les MELs, en particulier les MELs peut être isolée par tout procédé de séparation solide/liquide, tel que tamisage ou filtration, ou par tout procédé de séparation liquide/liquide, tel que décantation ou centrifugation, selon l'état physique de la phase riche en MELs. L'état physique de la phase riche en MELs dépend notamment du ratio pondéral entre MELs et impuretés telles que les acides gras, mais également d'autres conditions opératoires telles que température et pH, conformément à ce qui est décrit dans la littérature notamment par Rau et al. (2005a) ou dans la demande JP 2007-252280 La phase riche en MELs ainsi isolée constitue la matière première qui peut être traité par le procédé selon l'invention.

Les glycolipides isolés par le procédé selon l'invention ont de manière avantageuse les caractéristiques suivantes, les teneurs étant exprimées en masse et hors eau :

- au moins 90 %, de préférence au moins 95% de glycolipides

- moins de 1 %, de préférence moins de 0.2%, de triglycérides

- moins de 5%, de préférence moins de 3%, d'acides gras libres

- moins de 1000 ppm, de préférence moins de 100 ppm d'alcool en C2-C3

- moins de 50 ppm, de préférence moins de 1 ppm, de solvant organique apolaire. En particulier, les glycolipides sont des MELs. La proportion relative en MELs (A, B ou C) dépendra en particulier de la méthode de fermentation, du substrat de départ et de la souche employée. Ainsi, la composition ci-dessus peut comprendre essentiellement du Mel- A ou du Mel-B ou du Mel-C comme glycolipides. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention la composition ci-dessus comprend une teneur en MELs de 50% à 60 % de MEL- A, 10% à 40 % de MEL-B et 5% à 35% de MEL-C, le pourcentage étant exprimé par rapport au total des MELs dans la composition.

L'invention concerne également un mélange de glycolipides, en particulier de MELs, susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il a la composition telle que précisée précédemment.

DESCRIPTION DES FIGURES

La figure 1 représente le schéma de principe de l'étape d'extraction liquide-liquide, dans le cas le plus courant où le solvant organique apolaire a une densité inférieure à celle de la phase polaire. Le flux (1 ) représente la matière première riche en glycolipides et en impuretés, dissoute et diluée dans le mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau, et constitue la phase polaire alimentée. Le flux (1 ) est ainsi alimenté sur une colonne d'extraction liquide- liquide (2) qui assure un écoulement à contre-courant des deux phases liquides, et une séparation des deux phases après transfert des solutés, le schéma indiqué ne préjugeant pas du type de contacteur utilisé ni du mode de séparation des phases ainsi que cela a été décrit dans la description détaillée de l'invention. La seconde alimentation liquide (3) est constituée par le solvant organique apolaire. Plus précisément elle est constituée par le mélange du solvant organique apolaire recyclé (4) et d'un appoint en solvant organique apolaire pur (5). De façon avantageuse, le débit du flux recyclé (4) est très supérieur au débit requis pour le flux d'appoint (5). Dans le cas le plus courant où le solvant organique apolaire a une densité inférieure à celle de la phase polaire, il remonte dans la colonne (2) par gravité, à contre-courant de la phase polaire, plus lourde. La phase raffinât (6) constitue la phase polaire purifiée car appauvrie en impuretés hydrophobes, elle est récupérée en pied de la colonne (2) après un temps de décantation suffisant pour prévenir tout entraînement de solvant d'extraction apolaire (3). La phase extrait (7) est constituée par le solvant d'extraction apolaire saturé en alcool et en eau du fait du contact avec la phase polaire, et enrichi par les solutés extraits. De façon avantageuse dans les conditions de l'invention, les solutés extraits sont très majoritairement des impuretés hydrophobes, et de façon minoritaire des glycolipides. Dans l'une des configurations de l'invention, la phase extrait (7) est alimentée sur un évaporateur (8), qui génère des vapeurs riches en solvant organique apolaire (9) qui sont récupérées dans un état liquide après condensation et refroidissement sur le condenseur (10). Les vapeurs condensées (4) constituent alors le flux de recyclage en solvant apolaire. La fraction non évaporée (1 1 ) de la phase extrait (7) constitue le résidu de l'opération, il est riche en impuretés hydrophobes et est éliminé du procédé. De façon avantageuse, le rendement de récupération du solvant organique apolaire du flux (7) vers le flux (4) est supérieur à 95%.

La figure 2 représente une version améliorée de l'étape d'extraction liquide-liquide, où une étape de lavage de la phase extrait par un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau est mise en œuvre pour maximiser le taux de récupération des glycolipides. Cette figure 2 est également réalisée pour le cas le plus courant où le solvant organique apolaire a une densité inférieure à celle de la phase polaire. Le descriptif et les références données pour la figure 1 restent valables pour cette figure 2, mais la colonne d'extraction liquide-liquide (2) est également alimentée dans le cas de la figure 2 par un flux supplémentaire de mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau (12) en tête de colonne. L'alimentation polaire globale est donc constituée d'une part par le flux (1 ) qui représente la matière première riche en glycolipides et en impuretés, dissoute et diluée dans un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau, et par le flux (12) qui est constitué d'un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau sans glycolipides ni impuretés. Ainsi la principale étape d'extraction des impuretés est réalisée sur la section basse (13) de façon analogue au cas général décrit par la figure 1 , mais une seconde étape de séparation est réalisée sur la section haute (14) qui consiste à laver la phase apolaire avant sa récupération en tête de colonne. Sur cette section haute (14) les glycolipides éventuellement présents dans la phase apolaire ascendante au niveau de l'alimentation principale (1 ) sont à nouveau extraits dans la phase polaire de lavage (12), ce qui assure une teneur minimale en glycolipides dans l'extrait (7) qui est récupéré en tête de colonne (2). Dans cette configuration optimisée il est possible d'atteindre un rendement et une qualité supérieurs à 98%. La phase polaire de lavage issue de (12) et l'alimentation polaire principale (1 ) se mélangent spontanément au niveau de l'alimentation principale (1 ), et une phase raffinât unique (6) est récupérée en pied de colonne (2).

La figure 3 représente le principe général de mise en œuvre de l'invention. La matière première (1 ) riche en glycolipides et en impuretés est dissoute lors de l'étape i. par mélange avec un mélange d'alcool en C2-C3 et d'eau (2). La solution obtenue est alors éventuellement mais non obligatoirement clarifiée lors d'une étape A, avant d'être mise en contact avec le solvant d'extraction apolaire (3) lors de l'étape ii. Les deux phases liquides, l'une polaire et l'autre apolaire, sont séparées lors de l'étape iii. La phase apolaire récupérée (4) est alors éventuellement concentrée lors d'une étape B, pour obtenir un solvant d'extraction régénéré qui peut être recyclé en (3). Le résidu (5) constitue un déchet pour le procédé, où sont éliminées les impuretés avec une teneur réduite en glycolipides. La phase polaire purifiée (6) récupérée à l'issue de l'étape iii. est alors éventuellement traitée par des étapes complémentaires mais non obligatoires de purification, lors d'une étape C. Les glycolipides purifiés (7) sont alors isolés de la phase polaire purifiée lors de l'étape iv., à l'issue de laquelle sont également récupérés l'alcool et une partie de l'eau (8) qui peuvent être recyclés en (2), et éventuellement de l'eau excédentaire (9) qui peut être purgée. La figure 8 représente le mode de mise en œuvre privilégié de l'étape iv. d'isolation des glycolipides à partir de la phase polaire, c'est-à-dire la succession d'une étape de distillation de l'alcool et des traces éventuelles de solvant organique apolaire, d'élimination après décantation de la phase d'eau excédentaire, et d'évaporation de l'eau résiduelle.

La figure 4 représente un exemple de procédé mis en œuvre pour l'étape iv. d'isolation des glycolipides. La phase polaire purifiée (1 ) est alimentée sur une colonne de distillation (2), éventuellement avec une quantité d'appoint d'eau pure (3). De l'énergie est apportée au procédé au niveau du rebouilleur (4) et des vapeurs riches en solvant sont récupérées en tête de colonne et condensées sur le condenseur (5). Le distillât obtenu est réparti entre un reflux (6) vers la colonne, et une collecte (7) d'un mélange d'alcool en C2- C3 et d'eau purifié qui peut être recyclé pour l'étape i. du procédé. Le résidu liquide (8) est collecté au niveau du rebouilleur (4), et éventuellement refroidi et décanté sur l'équipement (9). L'eau excédentaire éventuelle (10) est séparée, et est soit recyclée vers l'alimentation (1 ) soit purgée du procédé pour aboutir à l'effluent aqueux (1 1 ). La phase riche en glycolipides (12) est alors alimentée sur un évaporateur (13). Les vapeurs (14) sont essentiellement constituées d'eau mais contiennent encore des traces d'alcool. Elles sont condensées sur (15) pour produire un distillât (16), qui est soit recyclé sur la colonne (2) soit purgé pour aboutir à un second effluent aqueux (17).

La figure 5A présente le chromatogramme HPLC obtenu lors de l'analyse de la matière première riche en glycolipides et en impuretés, utilisée comme produit de départ pour l'invention. L'abscisse représente le temps d'élution en minutes. L'ordonnée est masquée et indiquée en unités arbitraires spécifiques à l'appareil d'analyse utilisé, les quantifications sont réalisées avec l'aide d'un étalonnage externe. Les pics sont identifiés par les acronymes TAG, FFA, Ul, et MELs qui renvoient respectivement aux triglycérides (Tri Acyl Glycerides), aux acides gras (Free Fatty Acids), à d'autres impuretés non identifiées, et aux glycolipides (Mannosyl Erythritol Lipids dans le cadre de cet exemple). La teneur totale en glycolipides quantifiée à partir de ce chromatogramme est 43 % en masse. La pureté en glycolipides par rapport aux lipides totaux est de 65% en masse, sans compter les impuretés non identifiées.

La figure 5B présente le chromatogramme HPLC obtenu lors de l'analyse d'un échantillon de glycolipides purifiés selon l'invention. Les conditions d'analyse ainsi que les références d'affichage sont rigoureusement identiques à celles de la figure 5A. e la matière première riche en glycolipides et en impuretés, utilisée comme produit de départ pour l'invention. Les pics sont identifiés par les acronymes TAG, FFA, Ul, et MELs qui renvoient respectivement aux triglycérides (Tri Acyl Glycerides), aux acides gras (Free Fatty Acids), à d'autres impuretés non identifiées, et aux glycolipides (Mannosyl Erythritol Lipids dans le cadre de cet exemple). La teneur totale en glycolipides quantifiée à partir de ce chromatogramme est 96.5 % en masse. La pureté en glycolipides par rapport aux lipides totaux est également de 96.5% en masse, la principale impureté résiduelle quantifiable étant les acides gras.

La figure 6 présente la sélectivité de l'extraction liquide-liquide, définie comme étant le rapport du coefficient de partage des acides gras (FFA - Free Fatty Acids) par le coefficient de partage des glycolipides (MEL - Mannosyl Erythritol Lipids dans le cadre de cet exemple), en fonction du rapport pondéral éthanol/eau dans la phase polaire telle que constituée avant l'étape d'extraction. Le coefficient de partage K d'une espèce est lui-même défini par le rapport de la concentration de l'espèce dans la phase apolaire (extrait) par la concentration de l'espèce dans la phase polaire (raffinât) à l'équilibre. Les valeurs de ces coefficients de partage sont prises à l'équilibre entre les deux phases, et les essais réalisés pour les obtenir sont décrits dans les exemples 2 et 6. La figure 6 illustre bien d'une part que la sélectivité pour les impuretés (FFA) vis-à-vis des glycolipides (MEL) est nettement supérieure à 1 dans l'ensemble des conditions testées, ce qui démontre l'effet purifiant de l'extraction sur la phase polaire, et d'autre part que la sélectivité est très nettement supérieure dans les conditions proposées dans l'invention concernant le rapport pondéral alcool/eau. En effet les valeurs minimales, où l'extraction des impuretés est tout de même sept fois plus efficace que l'extraction des glycolipides, sont obtenues lorsque le rapport est soit de 2, soit de 4. Lorsque le rapport est de 3 environ, les sélectivités obtenues dépassent 20 et atteignent parfois 100.

EXEMPLES

Exemple 1 - Production de MELs par fermentation

La souche Pseudozyma aphidis DSM 70725 est conservée sur un milieu gélosé PDA (Potatoe Dextrose Agar). Elle a été transférée à l'oese dans un milieu de préculture et cultivée stérilement pendant 2 jours à 30°C et 200 rpm dans une fiole d'erlenmeyer remplie au 1 /5. Cette première étape de propagation a ensuite été transférée stérilement dans une seconde étape de propagation avec un taux de transfert de 10% vol/vol. Cette seconde étape de propagation a été ensuite transférée dans une troisième étape de propagation avec un taux de transfert de 10% vol/vol. La composition du milieu de préculture est donnée dans le tableau suivant :

Le tout est dissout dans de l'eau distillée et est stérilisé à 121 °C pendant 20 minutes. Le volume du milieu liquide est limité à 1/5 du volume total de la fiole pour une oxygénation optimale. La culture de propagation a été incubée pendant 2 jours à 30 °C et 200 rpm. Elle a ensuite été transférée dans un fermenteur instrumenté de 7L total équipé de sondes température, pH, p02 et mousse préalablement calibrées selon les règles habituelles pour l'homme du métier.

La composition du milieu de fermentation est donnée dans le tableau suivant :

Produit Concentration en g/L

NH4N03 2

KH2P04 0,2

MgS04 x 7H20 0,2

Extrait de levure 1

Concentration

Produit

en % volume/volume

Huile de colza 8% Les ingrédients du milieu ont été dissouts dans de l'eau désionisée et le milieu a été stérilisé dans le fermenteur à 121 °C pendant 30-40 minutes. Le volume de milieu préparé a été de 4.32L. Le volume de transfert du milieu de propagation a été de 10% vol/vol. La fermentation a été régulée à 37°C, la p02 a été régulée de façon à être supérieure à 0 par l'agitation et l'aération.

Au cours de la fermentation, la phase organique contenant l'huile de soja, les acides gras issus de l'hydrolyse des triglycérides de l'huile et les MELs ont été séparés de la phase aqueuse. Cette séparation a été réalisée par centrifugation discontinue et la phase organique a été récupérée pour séparation des MELs et des autres composés.

En fin de fermentation, des billes de gel contenant l'huile de soja, les acides gras issus de l'hydrolyse des triglycérides de l'huile de soja et les MELs ont été séparés de la phase aqueuse par séparation solide/liquide sur un tamis de 200 μηι.

Des matières premières enrichies en MELs peuvent être obtenues de manière similaire par la fermentation d'autres huiles végétales, comme les huiles d'arachide, de coco, de colza, d'olive, de palme ou de tournesol ou des mélanges d'huile et d'autres substrats carbonés tels que du glucose ou du glycérol.

Exemple 2 - Extraction sélective de lipides neutres avec le cyclohexane

Un produit brut riche en MELs (matière première) a été produit dans des conditions similaires à celles décrites dans l'exemple 1. La composition du produit brut telle que mesurée par HPLC était de 43 w% en MELs (dont 22.7 w% de MEL-A, 5.1 w% de MEL-B, 15.2 w% de MEL-C), 35 w% en eau et le complément constitué d'impuretés hydrophobes, acides gras pour la majeure partie. Ce produit brut est dilué dans une solution d'eau et d'éthanol dans les proportions décrites dans le tableau ci-dessous. La solution obtenue est filtrée sur papier filtre WHATMAN™ GF/F (0.7 μηη) pour éliminer les traces de solides tels que biomasse résiduelle et protéines responsable de trouble. Elle est ensuite mise en contact avec du cyclohexane dans les proportions décrites dans le tableau ci-dessous.

Soit ratio Ratio massique

Teneur en eau

Ratio massique massique entre

Essai dans le mélange

(éthanol+eau) éthanol/eau dans cyclohexane et

N° d'éthanol et d'eau

/produit brut la phase polaire phase polaire ajouté

(chargée) (chargés)

1 10% 2,0 3,27 1 ,0

2 10% 1 ,0 2,00 1 ,0 3 25% 2,0 1 ,76 1 ,0

4 18% 2,0 2,31 3,0

5 18% 4,0 3,07 4,5

6 18% 8,0 3,66 4,5

Pour chaque essai, la cellule contenant les deux phases liquides est agitée pendant 8 heures à l'aide d'un barreau aimanté pour assurer un temps de contact suffisant pour les phases et l'atteinte des concentrations en solutés à l'équilibre dans chacune des phases. La cellule est également double-enveloppée et thermostatée à 25°C pour assurer une température constante et maîtrisée sur toute la durée de l'essai. Après arrêt de l'agitation, un temps de repos de 5 heures est appliqué pour assurer une séparation parfaite des phases liquides par décantation. Chacune des deux phases est alors prélevée et analysée par HPLC, pour la quantification des teneurs massiques en MEL A et en impuretés. Seuls les MEL A sont quantifiés car il s'agit de la forme avec le degré d'acylation le plus élevé parmi les formes de MELs, donc la plus susceptible d'être extraite dans la phase apolaire parmi les formes A, B et C. Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous indiquent clairement un coefficient de partage, c'est-à-dire un ratio de la concentration en phase apolaire par la concentration en phase polaire, nettement supérieur pour les acides gras que pour les MELs. Surtout, les teneurs en triglycérides ne sont pas indiquées car les teneurs résiduelles en triglycérides dans la phase polaire étaient systématiquement sous la limite requise pour une quantification fiable, et notamment non détectés pour les essais 5 et 6 ce qui signifie que la teneur en triglycérides était inférieure à 100 ppm environ pour ces essais.

Composition phase Composition phase

Coefficients de partage

Essai polaire apolaire

N° MEL A, Acides MEL A, Acides Acides

MEL A

w% gras, w% w% gras, w% gras

1 6,28% 1 ,60% 0,73% 3,25% 0,12 2,03

2 8,17% 1 ,56% 2,88% 3,76% 0,35 2,41

3 5,32% 0,61 % 1 ,78% 3,04% 0,33 4,98

4 7,04% 0,55% 0,15% 1 ,21 % 0,02 2,20

5 4,01 % 0,14% < 0.15% 0,52% 0,04 3,71

6 2,15% 0,05% < 0.15% 0,15% 0,07 3,00 Exemple 3 - Extraction sélective de lipides neutres avec les terpènes

Les essais d'extraction liquide-liquide décrits dans l'exemple 2 ont été reproduits strictement à l'identique pour les essais 1 , 2 et 3, notamment en ce qui concerne la régulation de la température à 25°C, la seule différence étant que le solvant apolaire utilisé a été du Dipentene 38, mélange de terpènes commercialisé par la société D.R.T., à la place du cyclohexane. Le Dipentene 38 contient notamment 40% de dipentène, mélange racémique des isomères d-limonène et l-limonène, 20% de alpha-terpinène, 10% de gamma-terpinène, et 20% de terpinolène. Les conditions des essais sont décrites dans le tableau ci-dessous.

Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous confirment que des performances similaires au cyclohexane sont obtenues avec le mélange de terpènes. Le coefficient de partage des MELs est très nettement en faveur de la phase polaire, tandis que le coefficient de partage des acides gras est très nettement en faveur de la phase apolaire.

Exemple 4 - Purification de MELs par extraction liquide-liquide continue - 1

Un produit brut riche en MELs a été produit dans des conditions similaires à celles décrites dans l'exemple 1 . La composition du produit brut telle que mesurée par HPLC était de 39.3 w% en MELs, et de 21 .5 w% en impuretés de type lipides, acides gras ou triglycérides (figure 5A). La teneur en eau est de l'ordre de 35% en masse. Ce produit brut a l'apparence d'une pâte visqueuse, et est dilué par un mélange constitué de 85% d'éthanol et 15% d'eau, dans un premier temps avec un ratio de 0.5 masse de mélange d'alcool et d'eau par masse de produit de départ. Le ratio ethanol/eau est proche de 1 dans la solution liquide obtenue à l'issue de cette première dilution. La solution est centrifugée à 4000 G pendant 30 min sur une centrifugeuse ROTINA 380R. Le liquide surnageant est récupéré par surverse et filtré sur papier filtre WHATMAN™ GF/F (0.7 μηη) pour éliminer le trouble. Une seconde dilution par le même mélange à 85% d'éthanol et 15% d'eau est alors réalisée, avec un ratio de 2.35 masses de mélange d'alcool et d'eau par masse de solution clarifiée. À l'issue de cette seconde dilution le ratio massique éthanol/eau dans la solution liquide est donc de 3.6. La seconde solution obtenue est utilisée comme alimentation polaire pour l'étape d'extraction liquide-liquide continue à suivre. Une colonne d'extraction mécaniquement agitée, de technologie KUHNI commercialisée par la société SULZER, de diamètre interne 32 mm et de hauteur agitée 900 mm, est alimentée d'une part en tant que phase lourde la phase polaire décrite précédemment, et d'autre part en tant que solvant d'extraction apolaire par du cyclohexane pur à 99.9%. Les débits d'alimentation de chaque phase sont réglés à 4.5 kg/h pour la phase polaire et à 2.6 kg/h pour le solvant d'extraction apolaire, de sorte que le ratio massique des deux débits soit de 0.58. La température est régulée à 25°C sur toute la hauteur de la colonne grâce à une double-enveloppe avec circulation d'eau. La vitesse d'agitation est réglée à 100 tours par minute, et après une durée de stabilisation d'une heure les débits et compositions des flux de sortie sont mesurés. Le point de fonctionnement obtenu est décrit par le tableau suivant. Ce point de fonctionnement est encore maintenu pendant plus de deux heures de façon stable, et n'a été interrompu que pour cause d'épuisement des produits à alimenter.

Le bouclage du bilan massique est proche de 100% pour les MELs et pour les triglycérides et esters gras. Un écart de 15% non négligeable est relevé pour les acides gras, mais reste dans la marge d'incertitude cumulée des analyses et des mesures de débits. Le rendement de récupération des MELs dans la phase raffinât est supérieur à 95%. Une masse de 1 066 grammes de phase polaire purifiée est concentrée par évaporation sur un évaporateur rotatif, référence R-200 commercialisé par la société Buchi, à une pression de 250 mbar et à une température de chauffe de 75°C, jusqu'à obtenir une concentration par un facteur 5. À ce stade 213 grammes d'eau déminéralisée sont ajoutés et l'évaporation est reprise. La pression est descendue jusqu'à 1 mbar en fin d'opération, avec une température de chauffage maximale de 90°C, pour limiter le temps de l'opération réalisée en batch. Une masse de 89 grammes de résidu est obtenue. Le résidu est fortement visqueux, de couleur orange et limpide. Il contient une concentration totale en MELs de 95.6 w%. Les teneurs résiduelles en acides gras et en triglycérides ou esters gras sont quantifiées à 3.35 w% et à 0.35 w% respectivement (figure 5B). La teneur totale en eau est mesurée par analyse Karl-Fischer à 2 w%, tandis que les teneurs résiduelles en alcool et en solvant apolaire sont confirmées à moins de 1000 ppm en éthanol et moins de 1 ppm en cyclohexane par analyse GC-MS.

Exemple 5 - Purification de MELs par extraction liquide-liquide et adsorption

Cet exemple décrit une façon avantageuse de mettre en œuvre l'invention, en incluant également une étape de décoloration sur charbon actif. Une masse totale de 7.57 kg de la phase polaire purifiée produite dans les conditions de l'exemple 4, sont passés sur une colonne de 25 mm de diamètre intérieur, et 25 cm de haut, garnie de charbon actif fourni par la société CECA CARBON sous la référence ECA 14 076. Plusieurs essais sont réalisés avec des vitesses superficielles comprises entre 1 et 4 m/h pour la phase liquide. La masse totale de charbon actif utilisée est de 123 grammes. Le liquide récupéré après passage sur charbon est ensuite fractionné par distillation discontinue à 250 mbar sur une colonne de distillation de 25 mm de diamètre intérieure, garnie sur une hauteur de 1 m par du garnissage métallique vrac Pro-Pak™. Une masse de 1.25 kg de solution est traitée à chaque opération alimentée en continu pendant l'essai pour garder un colume constant d'environ 300 à 400 g dans le bouilleur, et 250 g d'eau déminéralisée sont ajoutés en fin d'essai jusqu'à élimination des de l'alcool en tête de colonne. Le résidu de la distillation est refroidi et décanté, une masse de 445 grammes d'eau excédentaire est séparée. La teneur en MEL dans cette eau excédentaire est inférieure à 1 %. Une masse de 1.07 kg de phase inférieure riche en MEL et en eau est concentrée sur évaporateur rotatif dans les mêmes conditions que décrites dans l'exemple 4. Une masse de 393 grammes de résidu est obtenue. Le résidu est fortement visqueux, de couleur jaune à jaune orangé et limpide. Il contient une concentration totale en MELs mesurée à 100.8 w%. Mais compte tenu de l'incertitude analytique ce résultat peut être normalisé avec les teneurs résiduelles en acides gras et en triglycérides ou esters gras qui sont quantifiées à 3.35 w% et à 0.35 w% respectivement, pour aboutir à une pureté relative en glycolipides par rapport aux lipides totaux de 96.5%, identique à l'échantillon obtenu en fin d'exemple 4. La teneur totale en eau est mesurée par analyse Karl-Fischer à 0.14 w%, tandis que les analyses des teneurs résiduelles en alcool et en solvant par GC-MS donnent un résultat comparable pour l'éthanol et proche de 0.1 ppm pour le cyclohexane.

Exemple 6 - Purification de MELs par extraction liquide-liquide continue - 2

Les conditions de l'exemple 4 ont été reproduites à l'identique jusqu'à l'étape d'extraction liquide-liquide, ce qui avait eu pour effet de produire une solution polaire riche en glycolipides et en lipides, dans laquelle le ratio massique éthanol/eau était de 3.6. Un second point de fonctionnement a été réalisé en ajustant les débits d'alimentation de chaque phase à 4.1 kg/h pour la phase polaire et à 2.8 kg/h pour le cyclohexane, de sorte que le ratio massique des deux débits soit de 0.68. La température est régulée à 25°C sur toute la hauteur de la colonne grâce à une double-enveloppe avec circulation d'eau. La vitesse d'agitation est réglée à 100 tours par minute, et après une durée de stabilisation d'une heure les débits et compositions des flux de sortie sont mesurés. Le point de fonctionnement obtenu est décrit par le tableau suivant

Le bouclage du bilan massique est proche de 100% pour les MELs. Des écarts de 5 et 10% sont relevés pour les acides gras et pour les triglycérides ou esters gras respectivement, mais restent dans la marge d'incertitude cumulée des analyses et des mesures de débits. Le rendement de récupération des MELs dans la phase polaire purifiée reste supérieur à 95% quoique légèrement dégradé par rapport aux résultats de l'exemple 4. La pureté des MELs en revanche dans la phase polaire purifiée est augmentée puisque les glycolipides représentent 97.5% du total des lipides quantifiés. Augmenter le débit de solvant d'extraction sur un équipement donné permet donc d'augmenter le niveau de pureté atteint, avec une diminution acceptable du rendement dans les conditions décrites.

Exemple 7 - Effet d'une teneur insuffisante en eau dans la phase polaire

Les essais d'extraction liquide-liquide décrits dans l'exemple 2 ont été reproduits strictement à l'identique pour les essais 10, 1 1 et 12, notamment en ce qui concerne la régulation de la température à 25°C, la seule différence étant que la matière première testée provenait d'un lot de production dont la composition était significativement différente de l'exemple 2 : en effet la composition du produit brut était de 35.24 w% en MELs (dont 21 .62 w% de MEL-A, 3.96 w% de MEL-B, 10.12 w% de MEL-C), 35.5 w% de FFA, et 18.9 w% d'eau. Les ratios massiques pour les différentes dilutions ont été modifiés et sont décrits dans le tableau ci-dessous.

Les résultats présentés dans le tableau ci-dessous confirment que des sélectivités très importantes, supérieures à 30 dans les deux cas comme indiqué par le Figure 6, sont obtenues lorsque le ratio massique ethanol/eau est proche de 3, malgré les variations de qualité de matière première et de ratios de dilutions. Cependant cette sélectivité tend à diminuer pour l'essai n°1 1 où le ratio massique éthanol/eau est de 4. Dans ce cas l'extraction des acides gras reste performante car la concentration dans la phase apolaire est deux fois plus élevée que dans la phase polaire, mais la sélectivité diminue du fait d'une extraction plus importante des glycolipides. La sélectivité pour ce point reste satisfaisante car elle est de 7, mais elle montre qu'une augmentation excessive de la teneur en eau a pour effet de diminuer la sélectivité de l'extraction.

Essai Composition phase Composition phase

Coefficients de partage

N° polaire apolaire Acides Acides Acides

MELs, w% MELs, w% MEL

gras, w% gras, w% gras0 3,50% 0,41 % 0,13% 1 ,16% 0,04 2,831 4,68% 3,01 % 1 ,61 % 7,00% 0,34 2,332 5,93% 0,74% 0,59% 2,83% 0,10 3,82

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