本发明属於组织工程领域的假体材料或假体被 覆材料， 特别涉及一 种用于组织修复的颗粒状生物材料及其制备方 法。 背景技术

在皮肤组织修复领域中， 如何利用患者有限的正常皮肤组织， 尽量扩大 组织移植范围， 是大面积皮肤缺损修复治疗中需要改进的重要 问题。 将正常 皮肤组织或假体被覆材料颗粒化，釆用喷撒、 播撒的方式可以达到上述目的， 现已广泛应用于大面积烧伤患者的治疗。 可注射或可填充的颗粒化组织生物 材料也广泛应用在整形美容外科、 神经外科、 泌尿外科、 口腔領面外科领域， 以期用最小创伤达到最佳的修复效果。 目前， 组织修复与再生研究的热点也 在为组织工程种子细胞寻找合适的颗粒状组织 生物材料作为载体， 进行组织、 器官的细胞移植的治疗， 比如将皮肤、 神经、 软骨和心肌的细胞或干细胞负 载于颗粒状组织生物材料进行相应的组织修复 等。 可见， 如何制备出适合不 同组织修复需要、 大小均匀的组织生物材料颗粒一直是研发组织 修复与再生 材料的关注焦点。

将生物材料颗粒化的方法， 公诸于世的现有技术报道比较少。 美国

LifeCell公司有一件 2008年 4月 15公开的发明专利，公开号为 US7， 358, 284, 其制备方法摘要如下： 将干燥的 AlloDerm釆用改造后 Zimmer 网状皮制备器 碾切成细条， 然后在超低温下釆用勾浆机将细条绞碎， 绞成颗粒后在低温下 应用不同的筛网将其分开， 最后将颗粒冻干处理， 包装， 消毒； 其制备的颗 粒分布集中度为 68%, 粒径范围为 58 μπι ~ 593 μ m [Sclafani AP, Romo T， Jacono A. Evaluation of acel lular dermal graft in sheet (AlloDerm) and injectable (micronized AlloDerm) forms for soft tissue augmentation: clinical observations and histological analysis. Arch Facial Plast Surg 2000; 2: 130- 6. ]。 还有一件 2008年 6月 11 日公开的 CN101195044A, 它是将脱细胞真皮基质经低温冷冻、 反复冻融后粉碎成颗粒， 过筛后的大小 为 50 μ πι ~ 500 μ m。 但上述现有技术仍存在着以下缺点： （1 )制备条件苛 刻，需超低温和低温； ( 1 )制备操作步骤繁多，需经低温冷冻、反复冻� �； ( 3 ) 制备的颗粒外形不规整； （4 )制备的颗粒即使经过过筛， 其粒径分布仍不集 中； （ 5 )粒径过小的颗粒 (小于 52微米 )将会对机体的免疫细胞产生损伤。 发明内容

本发明的目的就是针对现有技术存在的缺陷， 提供一种用于组织修 复的颗粒状生物材料及其制备方法， 使之制备条件温和， 制备方法简单， 制 备的颗粒形态规整， 可制备的粒径范围大， 单一规格的粒径分布集中， 不仅 适用于直接应用， 也可以负载相应组织细胞或促进组织再生的相 关分子， 以 满足多种组织或器官修复的需要。

本发明的总体构思是： 利用机械切割参数的可控性， 通过设置不同的切 割参数来控制所制备颗粒的尺寸大小， 从而使得制备某一尺寸颗粒的粒径范 围可控、 分布相对集中， 而且可切割的颗粒粒径范围大； 进而实现将膜片状 生物材料于常温下直接切割成颗粒状生物材料 ， 满足多种组织或器官修复的 需要。

为实现本发明的目的， 所釆取的技术方案如下。

一种用于组织修复的颗粒状生物材料， 原料是脱细胞组织基质 （例如脱 细胞真皮支架）、 胶原、 硫酸软骨素、 透明质酸、 壳聚糖、 聚乳酸、 聚羟基乙 酸、 藻酸盐中任一种或至少两种组合而制备的膜片 状生物材料； 成品颗粒的 形态规整， 外形呈立方体或长方体； 颗粒的粒径范围为 60 μ πΓ6000 μ πι; 单一 规格的颗粒粒径分布集中度≥ 85 %。

它的制备方法由膜片状生物材料的冻干、 细条状生物材料制备、 颗粒状 生物材料制备三步过程组成。

1)膜片状生物材料的冻干

将膜片状生物材料置于冻干机中， 在真空为 0. 04 mbar - 0. 4 mbar , 温 度为— 30 °C ~ _ 70 °C条件下冻干 3小时〜 1 2小时，使其去除水分，完全干燥。

2)细条状生物材料制备

常温下， 在 60 μ πι ~ 6000 μ πι的范围内设置宽度切割参数， 将膜片状生物 材料切割成所设置宽度参数的细条状生物材料 。

3 )颗粒状生物材料制备

常温下， 在 60 μ πι ~ 6000 μ πι的范围内设置颗粒粒度切割参数， 将细条状 生物材料切割成所设置颗粒粒度参数的颗粒状 生物材料； 再将获得的颗粒状 生物材料分装成 1 g ~ 100g直接浸泡于 75%乙醇中保存或 PVC抽真空后包装； 最后用 10 kGy ~ 25kGy钴 60辐照处理保存或 PVC抽真空后包装， 环氧乙烷 消毒保存。

本发明的颗粒状生物材料及其制备方法， 具有以下优点： 一是切割条件 为常温， 无需超低温或低温； 二是方法操作简便， 便于生产线操作； 三是获 得的产品形态规整， 外形呈立方体或长方体颗粒； 四是无需过筛， 同一尺寸 的颗粒粒径分布集中度≥ 85 %； 五是颗粒的粒径范围为 60 μ m飞 000 μ m, 不 同尺寸的颗粒之间可以混合使用； 六是不同尺寸的颗粒， 可釆用注射、 喷撒、 播撒、 填塞方法应用于组织或器官修复； 七是原料来源广泛， 可以是脱细胞 组织基质、 胶原、 硫酸软骨素、 透明质酸、 壳聚糖、 聚乳酸、 聚羟基乙酸、 藻酸盐中任一种或至少两种组合而制备的膜片 状生物材料。

本发明制备的颗粒状生物材料适合于直接应用 ， 也可以在负载相应组织 细胞或促进组织愈合与再生的相关分子后使用 ， 可以满足多种组织或器官修 复的需要。 附图说明

图 1 为 1. 2 匪规格脱细胞真皮支架颗粒的大体观察照片。

图 2 为 0. 7 匪规格脱细胞真皮支架颗粒粒径分布检测结果 。

图 3 为 0. 2 匪规格脱细胞真皮支架颗粒粒径分布检测结果 。

图 4为脱细胞真皮支架颗粒上接种人角质形成细� �后 3小时的显微镜下 照片 （ 400 倍）

图 5 为脱细胞真皮支架颗粒复合移植自体断层皮（ STSG+MA丽）术后 20 周创面愈合皮肤的生物力学特性检测。

具体实施方式

下面列举用脱细胞真皮支架为原料制备颗粒状 生物材料的多个实施 例， 来进一步说明本发明的颗粒状生物材料及其制 备方法。 需要强调的是 本发明不局限于所列举的实施例。

实施例 1

规格为 1.2 匪的脱细胞真皮支架颗粒的具体制备方法如下 ：

( 1 )脱细胞真皮支架冻干： 将制备的脱细胞真皮支架置于冻干机中， 真 空 0.1 mbar, 冻干 6小时， 温度一 45°C;

(2) 细条状脱细胞真皮支架制备： 设置切割参数为 1.2 匪， 将冻干后的 脱细胞真皮支架切割成细条（宽度： 1.2 匪）状生物材料；

( 3)颗粒状脱细胞真皮支架制备： 设置切割参数为 1.2 匪， 将制备的宽 度为 1.2 匪 的细条状脱细胞真皮支架切割成颗粒（规格： 1.2 匪）， 所制备 颗粒形态规整， 大小均匀， 平均粒径为 1261 μπι (见图 1 );

(4 ) 包装， 消毒： 制备的脱细胞真皮支架颗粒分装成 1 g, 直接浸泡于 75%乙醇中保存。 实施例 2

规格为 0.7 匪的脱细胞真皮支架颗粒的具体制备方法如下 ：

( 1 )脱细胞真皮支架冻干： 将制备的脱细胞真皮支架置于冻干机中， 真 空 0.1 mbar, 冻干 6小时， 温度一 55 °C;

(2) 细条状脱细胞真皮支架制备： 设置切割参数为 0.7 匪， 将冻干后的 脱细胞真皮支架切割成细条（宽度： 0.7 匪）状生物材料；

( 3)颗粒状脱细胞真皮支架制备： 设置切割参数为 0.7 匪， 将制备的宽 度为 0.7 匪 的细条状脱细胞真皮支架切割成颗粒（规格： 0.7 匪）， 所制备 颗粒形态规整， 大小均匀， 外形呈近立方体状；

(4) 包装， 消毒： 制备的脱细胞真皮支架颗粒分装成 2 g, PVC抽真空后 包装， 环氧乙烷消毒保存；

(5)粒度分析仪检测脱细胞真皮支架颗粒的平均 粒径为 875 μπι, 在 479 μπι~ 1096 μπι粒径范围内的颗粒分布集中度为 90.93% (见图 2)。 结果证明， 所制备的脱细胞真皮颗粒粒径跨度范围小， 且分布度高度集中。 实施例 3:

规格为 0.2 匪 的脱细胞真皮支架颗粒的具体制备方法如下： ( 1 )脱细胞真皮支架冻干： 将制备的脱细胞真皮支架置于冻干机中， 真 空 0.1 mbar, 冻干 6小时， 温度一 50°C;

(2) 细条状脱细胞真皮支架制备： 设置切割参数为 0.2 匪， 将冻干后的 脱细胞真皮支架切割成细条（宽度： 0.2 匪）状生物材料；

( 3)颗粒状脱细胞真皮支架制备： 设置切割参数为 0.2 匪， 将制备的宽 度为 0.2 匪 的细条状脱细胞真皮支架切割成颗粒（规格： 0.2 匪）；

(4) 包装， 消毒： 制备的脱细胞真皮支架颗粒分装成 2 g, PVC抽真空后 包装， 环氧乙烷消毒保存；

( 5 )粒度分析仪检测脱细胞真皮支架颗粒的平均� �径为 323 μ m,在 182 μ m~ 417 μπι粒径范围内的颗粒分布集中度为 87.86% (见图 3)。 结果证明， 所 制备的颗粒粒径跨度范围明显小于 AlloDerm颗粒的 58 μπΓ593 μπι,而颗粒分 布集中度高于 AlloDerm颗粒（68%)近二十个百分点。 实施例 4:

负载人角质形成细胞脱细胞真皮支架颗粒的制 备， 具体操作步骤如下：

(1 )脱细胞真皮支架颗粒的准备： 将保存的脱细胞真皮支架颗粒 20 mg, 用生理盐水浸泡后清洗 3遍。 将颗粒置于 1.5 ml的无菌离心管中， 加入细胞 培养液 1 ml浸泡 6小时后弃去培养液备用。

(2)人角质形成细胞的准备： 无菌条件下， 将培养的人角质形成细胞用 0.25%胰蛋白酶于 37°C消化 5 min后进行吹打； 将含有人角质形成细胞的培养 液离心 1000 rpm, 5 min; 弃去上清； 加入培养液后混匀细胞， 计数。

( 3 )负载人角质形成细胞脱细胞真皮支架颗粒的� �养：加入含有 2 X 10 ⁶ 个 /ml人角质形成细胞的培养液 0.5 ml与备用的 20 mg颗粒载体混合于 5ml的无 菌离心管， 于 37°C 5%C0 ₂ 孵箱静置孵育 3小时。

(4) 负载人角质形成细胞脱细胞真皮支架颗粒的显 微镜下观察： 弃去培 养液， 用生理盐水清洗负载人角质形成细胞脱细胞真 皮支架颗粒 2 遍。 显微 镜下观察可见人角质形成细胞已附着在颗粒支 架上， 表明脱细胞真皮支架很 容易负载人角质形成细胞（见图 4)。 实施例 5:

脱细胞真皮支架颗粒用于皮肤缺损创面修复的 动物实验， 具体操作步骤 ^口下：

(1 )皮肤缺损模型的制作： 在 SD 大鼠（雄性， 220—260 g)麻醉（ 1%戊 巴比妥， 40mg/kg, 腹腔注射）， 固定后背部正中剪取 4 cm X 6 cm的全厚皮片。

( 2 )制备自体断层皮：将 4 cm X 6 cm的自体全厚皮制成自体断层皮（ STSG ), 用 PBS溶液湿润的纱布包裹待用。

( 3) 脱细胞真皮支架颗粒的准备： 将浸泡于 75%酒精中的脱细胞真皮支 架颗粒（规格： 0.5 匪， 面积扩张比例为 2: 1 ) 置于加有滤纸的漏斗中， 用 PBS溶液冲洗数次， 洗去酒精。

(4) 自体断层皮（STSG)与脱细胞真皮支架颗粒的复� ��移植： 将洗净的 脱细胞真皮支架颗粒均勾的播撒在 STSG的真皮面上， 然后将其覆盖创面， 缝 合时皮片边缘距离缝线 1 匪 〜 2匪。 创面术后油纱包扎、 固定（绷带 2周）。

(5) 术后 20周剪取已愈合创面皮肤检测其生物力学特性� ��见图 5), 结 果表明， 与未加脱细胞真皮颗粒的自体断层皮移植大鼠 （STSG)相比， 脱细 胞真皮颗粒复合自体断层皮移植大鼠（STSG+MA� �）的已愈合创面皮肤具有更 高的皮肤拉伸强度。