抗除草剂基因及其应用 技术领域

本发明属于植物基因工程领域， 具体的说， 本发明涉及抗烟嘧磺隆、 硝磺草酮、 2,4D 等多种除草剂的基因及其编码的蛋白质。 这种基因可以用来在植物中表达而使植物对除 草 剂的抗性增强。 本发明可以运用在作物的育种、 植物细胞培养的筛选等领域。

背景技术

农作物种植过程中需要防治杂草。 如果一种农作物获得能够对广谱除草剂的抗性 能 力， 那么这种农作物的杂草在出苗以后就可以通过 喷施广谱除草剂进行防治。 这种杂草 防治方法简单、 高效， 低成本， 并且对农作物安全。

农作物可以通过基因工程改良而获得对除草剂 的抗性。 例如， 农作物可以通过转基 因表达农杆菌 4gratocten'M tumefaciens sp CP4)的抗性 5-烯醇丙酮莽草酸 -3-磷酸合成酶 (EPSPS ) 而获得抗草甘膦的能力。 表达这种酶的转基因抗草甘膦植物已在生产中 应用 ( 美国专利 453590， 4769061， 5094945 ) 。 为了控制杂草对除草剂抗性的发生， 提高转 基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样 性， 发展抗草甘膦以外的其他除草剂的抗性 转基因农作物在生产上十分有用。

细胞色素 P450是一个大的基因家属。通常一种植物中的 P450基因往往可以有 200个 以上。 以前的研究发现， 部分 P450基因是能够降解除草剂基因。 例如一种动物的细胞色素 P450基因 P4507A1和一种酵母的 NADPH-细胞色素 P450基因的杂交分子可以抗除草剂 (Shiota et al. 1994 Plant Physiol. 106: 17) 。 CYP71A10 是一种从大豆中分离到的细胞色素 P450基因， 在烟草中表达这种基因可以提高转基因烟草对 除草剂利谷隆 (Linuron)和绿麦隆 (chlortoluron)抗性水平的提高 （ Siminszky et al., 1999 Proc Natl Acad Sci USA

96: 1750 - 1755; Siminszky et a, 2000, Weed Sci 48:291 - 295 ) 。 玉米中的一种细胞色素 P450基因 （多核苷酸序列为 SEQ ID: 5， 氨基酸序列为 SEQ ID: 6) 被发现具有抗烟嘧磺 隆等除草剂的能力 （中国专利， 申请号 200610155661 ; 美国专利 US 20080052798 A1 ) 。 水稻中一种细胞色素 P450基因也具有抗苯达松和磺酰脲类除草剂 （Pan et al., Plant Molecular Biology, 2006, 61： 933-943 ) 。 其他一些不同来源细胞色素 P450基因也具有抗除 草剂的功能， 可以被用于获得抗除草剂的转基因植物。 例如， Didierjean et al. (2002) Plant Physiol. 130: 179-189; Morant et al. (2003) Opinion in Biotechnology 14: 151-162。

本发明提供了一种抗几种高效除草剂的基因和 利用这种基因获得转基因抗除草剂 植物的方法。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种具有抗除草 剂性能的基因。

狗牙根 ynodon dactylon) 是一种能够耐烟嘧磺隆、 硝磺草酮等除草剂的植物。 因此有希望从这种植物中克隆到抗除草剂的基 因， 并且应用于培育抗除草剂转基因农作 物。 本发明从狗牙根中克隆到了一种能够明显抗多 种除草剂的基因。 这些除草剂分别属 于： 乙酰乳酸合成酶（ALS)抑制剂类除草剂； 抗原卟啉原氧化酶（PP0)抑制剂类除草剂； 对羟苯基丙酮酸盐双氧化酶 （HPPD) 抑制剂类除草剂； 光系统 II抑制型除草剂； 合成生长 素 （auxin) 类除草剂等。 本发明提供了这个基因以及利用这个基因获得 转基因抗除草剂 农作物的方法。

本发明具体如下：

本发明提供了一种具有抗除草剂性能的基因。 这种基因的多核苷酸序列所编码的蛋 白质为 SEQ ID NO: 1， 或者与 SEQ ID NO: 1相比具有至少 80%， 85%, 90% 或者 95% 的氨基酸序列相同性。 氨基酸的相同性可以通过现有的方法获得。 如 Karlin和 Altschul

( 1990) Pore .Natl. Acad. Sci. USA 87： 3364 ； Karlin和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. _o 这个基因的特点是： 在植物中表达这个基因编码的蛋白质多肽能 够导致转基因植物提高对一种或者几种属于如 下一类或者几类的除草剂的抗性： 1 ) 乙酰 乳酸合成酶 （ALS ) 抑制剂类除草剂， 包括但不仅限于磺酰脲类除草剂、 咪唑啉酮类除草 剂、 三唑并嘧啶磺酰胺除草剂、 嘧啶水杨酸类除草剂。 其中常用的除草剂包括烟嘧磺 隆、 玉嘧磺隆、 氯磺隆、 五氟磺草胺 (penoxsulam)等除草剂； 2)抗原卟啉原氧化酶（PP0) 抑制剂类除草剂， 包括但不仅限于二苯醚、 乙羧氟草醚、 乙氧氟草醚、 氟磺胺草醚

( fomesafen) 、 丙炔氟草胺、 氟烯草酸、 三氟羧草醚 （ Acifluorfen) 等； 3 ) 对羟苯基丙 酮酸盐双氧化酶 （HPPD) 抑制剂类除草剂包括但不仅限于硝磺草酮、 甲基磺草酮、 异噁 唑酮等； 4) 光合系统 II抑制型除草剂， 包括但不仅限于莠去津、 百草枯 （paraquat) 、 苯 达松和溴苯腈（bromoxynil) ； 5 )合成生长素 (auxin)类除草剂， 包括但不仅限于 2,4- 滴丁 酯 (2,4D)， 麦草畏 (Dicamba)等。 植物的细胞色素 P450基因非常多。 的基因组中估计有超过

300个的细胞色素 Ρ450基因 （ Werck-Reichhart et al.， Trends in Plant Science 5: 116-123 ) 。 本发明提供抗除草剂基因的氨基酸序列和已经 知道的一系列细胞色素 P450基因具有不同 程度的相同性。 例如， 从基因库中可以发现如下的植物细胞色素 P450基因与本发明提供的 基因的氨基酸序列的相同性比较高：

1) 玉米 Zea mays ACG28028.1 (SEQ ID No: 6), 相同性 76%;

2) 高粱 Sorghum bicolor 基因 XP_002466416 (SEQ ID No: 7)， 相同性 79%;

3) 大麦 (Hordeum vulgare BAJ94385.1 (SEQ ID No: 8), 相同性 75%;

4) 黑麦草 (Lo//"m^W"m) AAK38080.1 (SEQIDNo: 9)， 相同性 73%;

5) 玉米 Zea mays ACG29853.1 (SEQ ID No: 10), 相同性 74%;

6) 玉米 Zea mays P_001142304 (SEQ ID No: 11), 相同性 74%;

7) 玉米 Zea mays ACG27785 (SEQ ID No: 12), 相同性 77%;

8) 水稻 （Or^a tra) ABC69856.1 (SEQIDNo: 13), 相同性 73%。

9) 玉米 Zea mays Zm-513 (SEQ ID No: 14), 相同性 79%。

这些基因的相同性比较高， 在进化上可能是同源的。 根据氨基酸序列的相同性， 它 们的进化上的关系如图 1。 但是， 一种植物的细胞色素 P450基因是否具有抗除草剂的能力 目前是没有办法准确预测的。 例如， 在玉米基因组中与本发明提供的基因非常相似 的一个 细胞色素 P450基因 Zm-513 (氨基酸序列是 SEQIDNO: 14) 并不具有抗除草剂能力。 同样， 从同狗牙根中克隆获得的另外一个高度同源的 细胞色素 P450基因基因 N-Z2 (氨基酸序列 SEQIDNo: 3) ， 也没有表现抗除草剂能力 （实施例 5) 。 因此， 本发明披露的抗除草剂基 因 N-Z1的抗除草剂能力并不能根据其序列及其与� �经知道的抗除草剂基因的相同性而预 本发明也包含利用编码的蛋白质多肽 SEQIDNO: 1的多核苷酸片段通过基因重组技 术而获得的抗除草剂基因。 例如， 通过 DNA shuffling的方法可以从 2个或者多个同源基因 中获得新的重组基因 （US 2002/0058249; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol.272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; and U.S. Pat. Nos.

5,605,793 and 5,837,458) 。 本领域的一般技术人员能够通过这些方法可以 获得仍然具有相 同抗除草剂活性或者改变了抗除草剂性能的变 异体。 此外， 本发明提供的抗除草剂多肽 的 N-端的大约 100-120个氨基酸的多肽是一个导入叶绿体的信� �肽。这个信号肽通常可以被 其他叶绿体信号肽置换而不影响蛋白质抗除草 剂的功能。

本发明提供的多核苷酸以及其编码的蛋白质的 变异体也是本发明保护的一部分。 变 异体指序列高度相似的多核苷酸或者蛋白质。 多核苷酸序列的变异体包括在一个或者多个 位点发生了缺失、 插入或者取代的变异的多核苷酸， 并且这些变异仍然没有改变开放的阅 读表达框，保持了其抗除草剂的能力。一种多 核苷酸序列的变异的来源可以是多个方面的。 一种情况是编码同一个氨基酸的密码子的不同 ， 即编码相同的氨基酸序列的多核苷酸序列 可以是不同的； 另一种情况是广泛存在于生物不同个体或者近 缘种中的天然的多样性； 还 有是通过人为导入的变异。 人为导入变异的方法目前比较多， 本领域的一般技术人员能够 通过现有的技术获得， 例如 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; U.S. Pat. No. 4,873,192; Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York；。

蛋白质多肽变异体包括一个或者多个氨基酸在 一个或者多个位点的缺失、 插入或者 取代的变异体蛋白质。 本发明保护的变异体是仍然保持了其天然基因 的抗除草剂活性的蛋 白质， 即能够导致转基因植物抗除草剂的活性。 这种变异体可以来源于生物的遗传多态性 (genetic polymorphism) 或者人工基因操作改变。 人工基因操作可以实现蛋白质的氨基酸 取代、 删除或者插入。 这些基因操作的方法是已知的， 一般技术人员可以实现。 蛋白质序 列的删除、 取代或者插入变异在许多情况下并不会非常显 著地改变蛋白质的生物活性特 点。 即使人们不能预测这些变异对蛋白质活性的影 响时， 一般本领域的技术人员能够将这 些突变体编码的蛋白质在植物中表达而评价它 们的抗除草剂能力。

本发明提供的多核苷酸也可以用来从其他植物 中克隆相应的基因。 根据本发明提 供的多核苷酸序列， 本领域的技术人员通常可以利用 PCR方法、 DNA杂交方法从一种植物 中克隆到相应的同源基因。 PCR的方法可以根据本发明提供的多核苷酸序列 ， 特别是根据 保守区域的序列设计引物， 通过 PCR方法获得部分或者全部同源基因的序列。 DNA杂交方 法可以通过利用本发明提供的多核苷酸制备探 针，杂交 DNA文库获得同源基因。不仅如此， 本领域的技术人员还利用本发明提供的核酸序 列和蛋白质序列， 通过分子信息学的方法从 基因组库中找出高同源性的基因。如利用 BLAST(www.ncbi.mh. _g o _V )方法， 根据本发明提供 的多核苷酸序列及其编码的蛋白质多肽的氨基 酸序列， 发掘与本发明提供的基因同源性比 较高的基因。 通常蛋白质多肽的氨基酸序列与本发明的抗除 草剂基因至少有 80%， 85%, 90%, 95% 或 99%的相同性的蛋白质可能具有抗除草剂活性， 并且可以通过现在已有的方 法进行确定和验证。 因此本发明的抗除草剂基因包含了这些同源基 因。

本发明提供了利用抗除草剂基因获得能够耐除 草剂的转基因植物的方法。 这种耐 除草剂转基因植物可以避免除草剂对植物的危 害， 为选择性杀灭杂草提供方便、 经济的途 径。 本发明提供的获得转基因抗除草剂植物的方法 包括： 1 ) 构建可以表达本发明抗除草 剂基因的表达框， 即将可以控制表达的多核苷酸序列和抗除草剂 基因功能性连接； 2) 将 能够表达本发明提供的抗除草剂蛋白质多肽的 多核苷酸表达框导入植物细胞； 3 ) 将转化 了的植物细胞培育成为转基因植物； 4) 选择具有抗除草剂能力的转基因植物。 这个领域 的一般技术人员能够根据已经知道的知识以及 利用本发明提供的多核苷酸序列， 构建抗除 草剂基因表达框， 并转化植物从而获得能够抗除草剂的转基因植 物。 抗除草剂转基因植物 是指与非转基因的亲本植物相比， 对除草剂的耐性提高了的转基因植物。 本发明获得的转 基因植物可以抗至少一种属于如下种类的除草 剂： 乙酰乳酸合成酶 （ALS) 抑制剂类除草 剂， 抗原卟啉原氧化酶（PPO)抑制剂类除草剂， 对羟苯基丙酮酸盐双氧化酶（HPPD)抑 制剂类除草剂， 光合系统 II抑制型除草剂， 以及合成生长素类除草剂。 这些种类除草剂 包括但是不限于烟嘧磺隆， 硝磺草酮， 麦草畏 (Dicamba), 2,4- 滴丁酯 (2,4D)等。

表达多核苷酸编码的抗除草剂多肽可以通过构 抗除草剂基因表达框实现。 表达框 由一个或者几个控制表达的多核苷酸序列和抗 除草剂的多核苷酸序列功能性连接而获得。 通常抗除草剂基因表达框构建在质粒载体上。 这个载体可以在细胞中获得大量复制。 表达 框的表达调控序列通常包括启动子和终止子。 通常启动子连接在 5 ' 端， 而终止子连接在 3'端。 所谓功能性地连接指启动子和终止子能够发挥 启动和控制与其连接的多核苷酸的表 达。

控制基因表达启动子是本领域的技术人员都已 经知道的技术。 Potenza等的综述详细 介绍和总结了有关启动子的研究 （Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40: 1-22) 。 启动子包括组成型表达的启动子、 组织特别表达启动子、 可以诱导表达的启动 子等。 本发明提供的基因的天然启动子也可以用来控 制抗除草剂基因的表达。 而组成型表 达启动子用于抗除草剂基因的控制比较广泛。 组成型表达启动子是指能够在不同植物组织 中在整个生长发育期间都可以表达的启动子。 例如 CaMV 35S 启动子 （Odell et al. 1985 Nature 313:810-812); 水稻肌动蛋白启动子 (McElroy et al. 1990 Plant Cell 2: 163-171); 玉米 ubiquitin 启动子 (Christensen et al. 1989 Plant Mol. Biol. 12:619-632 禾 P Christensen et al. 1992 Plant Mol. Biol. 18:675-689)。 这些启动子都可能用来控制本发明提供的基因 在植物中 的表达， 从而获得转基因的抗除草剂植物。

控制基因表达的终止子可以是提供基因的天然 终止子， 也可以是来自植物的其他基 因的终止子， 或者其他在植物中具有终止子功能的多核苷酸 片段。 常用的终止子包括来源 于农杆菌的 Octopine合成酶终止子， nopaline合成酶终止子， CaMV植物病毒的 35S基因终 止子。参考文献包括： Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 : 151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

为了提供基因在目标植物中表达水平， 基因的多核苷酸序列可以进一步修饰和改变。 这些改变包括删除内含子、 清除一些可能影响正常表达的序列， 如非成熟的 PolyA信号序 列等。 根据目标植物的密码子使用情况， 编码相同蛋白质多肽的多核苷酸序列可以优化 ， 以提高在目标植物中的表达量。 在基因表达框的构建时， 5 ' 端的非编码区序列也可以增 加翻译增强序列。例如， picornavirus的增强序列； TEV (Tobacco Etch Virus) 增强序列 (Gallie et al. 1995 Gene 165:233-238)等。

本发明提供的基因的表达框的载体也可以同时 包含一个选择标记基因表达框。 这个 选择标记基因可以用来选择转化了的细胞。 常用的选择标记基因包括抗生素抗性基因， 如 抗潮霉素基因 (HPT)， 如抗草甘膦基因， 抗草丁膦基因等。 其他选择标记基因同样可以用 作本发明转化的选择基因。

本发明提供的基因可以导入植物从而获得转基 因的抗除草剂植物， 这些植物包括但 不限于玉米、 小麦、 大麦、 高粱、 水稻、 大豆、 胡萝卜、 马铃薯、 棉花、 向日葵、 油菜、 橡树、 草坪草、 牧草。

植物的转基因方法目前比较成熟。 目前本领域的一般技术人员能够利用已经有的 技 术将本发明提供的多核苷酸导入到多种植物中 表达。 比较常用的方法是基因枪方法 (Klein et al, 1987, Nature (London) 327:70-73; U.S. Pat. No. 4,945,050)) 或农杆菌介导方法 (De Blaere et al, 1987, Meth. Enzymol. 143:277)。 但是本发明不限于这些方法。

不同植物的转化的方法和步骤有所不同。 但是， 通常通过农杆菌或基因枪导入植物 的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原 生质体。然后用相应的筛选培养基筛选培养。 再进行分化而获得转化芽，经过生根培养基培 养就可以获得可以种植的转基因苗。进一步， 抗除草剂转基因植物可以通过喷施除草剂筛选 ， 例如喷施烟嘧磺隆可以杀灭非转基因的水 稻。 本发明涉及的植物包括但不限于玉米、 小麦、 大麦、 高粱、 水稻、 大豆、 胡萝卜、 马 铃薯、 棉花、 向日葵、 油菜、 橡树、 草坪草、 牧草。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一 步详细说明。

图 1 : 部分已知的细胞色素 P450基因的氨基酸序列相同性分析。

进化关系图是利用 VectorNT ( 7.0 ) 的程序获得的。 N-Z1 : 本发明从狗牙根中分离获 得的一种细胞色素 P450基因 （氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1 ) ； N-Z2: 从狗牙根中分离获 得的另一种细胞色素 P450基因（氨基酸序列为 SEQ ID NO: 3 )； AAK38080:黑麦草（Jo/ M rigidum ) 的细胞色素 P450基因的基因库编号 （氨基酸序列为 SEQ ID NO: 9 ) ； BAJ94385 : 大麦 Hord画 vWgare 的细胞色素 P450基因的基因库编号 （氨基酸序列为 SEQ ID NO: 8 ) ； ABC69856.1 : 水稻的细胞色素 P450基因的基因库编号 （氨基酸序列为 SEQ ID NO: 13 ) ， 这个基因被发现是抗苯达松和磺酰脲类除草剂 ； ACG27785 ： 玉米的细胞色素 P450 基因的基因库编号 （氨基酸序列为 SEQ ID NO: 12 ) ； ACG28028 : 玉米的细胞色素 P450 基因的基因库编号 （氨基酸序列为 SEQ ID NO: 6 ) ， 基因名称是 CYP81A9, 具有抗除草 剂的功能； ACG29853 : 玉米的细胞色素 P450基因的基因库编号， 基因名称是 CYP81 A3v2

(氨基酸序列为 SEQ ID NO: 10 ) ； P_001 142304： 一种玉米的细胞色素 P450基因的基因 库编号； XP_002466416 (氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1 1 ) ： 一种高粱的细胞色素 P450基因 的基因库编号 （氨基酸序列为 SEQ ID NO: 7) ； Zm-513 : 一种玉米的细胞色素 P450基因

(氨基酸序列为 SEQ ID NO: 14 ) ， 没有发现抗除草剂的能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述 ， 但本发明的保护范围并不仅限于此。 本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生 物化学方法均为已知的技术。在 Ausubel 编写的 John Wiley and Sons 公司出版的 Current Protocols in Molecular Biology, 禾口 J. Sambrook等编写 Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 出版的 Molecular Cloning: A Labortory Manual, 3rd ED.等文献均有详细的说明。

实施例 1、 抗烟嘧磺隆狗牙根的抗性测定：

狗牙根 Cynodon dactylon) 是一种常见杂草也是一种草坪草。 为了测定它是否具有 抗烟嘧磺隆能力， 喷施烟嘧磺隆 （400mg/L) ， 10天以后观察， 发现狗牙根没有死亡， 而 对照的其他杂草， 包括狗尾草、 野燕麦、 反枝苋、 律草、 马齿苋、 鸭舌草、 苘麻和莎草等， 都被杀灭。 同样喷施硝磺草酮（1000mg/L) ， 10天以后观察， 发现狗牙根没有死亡， 而其 他杂草发生白化而死亡。 说明狗牙根中可能具有抗除草剂的基因。

实施例 2、 抗性基因的克隆

植物通常具有比较大的 P450基因家族， 例如在 t/ra&wa基因组中， 发现 有超过 300个细胞色素 P450基因 （Werck-Reichhart et al. (2000) Trends in Plant Science 5(3): 116-123).。 尽管水稻并不抗烟嘧磺隆， 但是水稻的基因组序列已经知道。通过分子信 息学 在水稻中找到了 3个细胞色素 P450基因的同源基因 （多核苷酸序列分别是匪_0()1057876， 匪― 001057880和 — 001057877 ) ， 其中一个是参于一种除草剂苯达松分解的 P450基因

(Pan et al, Plant Molecular Biology, 2006, 61： 933-943 ) 。 对比这些多核苷酸的序列发现， 其中一些区域的序列比较保守。

根据水稻中这些细胞色素 P450基因的保守区域的核苷酸序列， 设计了如下的 PCR引 物： 450F: 5'ACG GCC CGC ACT GGC GCA ACC TCC GCC G 禾卩 450R: 5'GTT CCT CAC GCC GAA CAC GTC GAA CCA CCG。

从狗牙根中提取获得了总 rnRNA, 并且合成了 cDNA。 以此 cDNA作为模板， 利用 引物 450F和 450R进行 PCR。该 PCR体系和 PCR反应条件为： 95°C 1分钟， 58°C 1分钟， 72°C 1分钟， 重复 30个循环。 然后 72°C 5分钟。

从而获得了 PCR产物。 PCR产物被克隆到了 pMD18-T中， 并且进一步进行 D N A 序列测定。 发现 P C R产物中至少有 2种序列不同的片段。 利用 R A C E方法克隆获得了 包含完整读码框的 2个 cDNA. —个命名为 N-Z ( SEQ ID NO: 2) ,另外一个为 N-Z2 ( SEQ ID NO: 4) 。 N-Z 读码框编码的蛋白质多肽为 SEQ ID NO: 1， N-Z2读码框编码的蛋白 质多肽为 SEQ ID NO: 3。

实施例 3、 在水稻中表达的 N-Z1和 N-Z2表达框的构建

编码 N-Z1的 DNA片段通过一般的分子生物学方法在 5'端与玉米的 ubiquitin-Ι启动 子 （ZmUbi-1 ) 连接， 同时在 3 ' 端与一个 CaMV的 35S终止子连接， 形成可以在植物中表 达的开放阅读框 （其 5'端有 Hindlll位点， 3'端有 Kpnl位点）。 玉米的 ubiquitin-1启动子是通 过从玉米基因组中 PCR获得。 PCR引物分别是 ZmUbiF (5，

GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGC AGCGTGACCCGGTCGTGC, 下戈 ij线表示 Hindlll位 点）， 禾 P ZmUbiR (5'

BamHI位点）。 这个表达框然后被克隆到 pCambial300的 Hindlll和 Kpnl位点之间， 获得了 T-DNA载体 pCaml300-N-Zl。

编码 N-Z2的 DNA片段通过一般的分子生物学方法在 5'端与玉米的 ubiquitin-Ι启动子 (ZmUbi-1 )连接，形成可以在植物中表达的开放阅读框� � 同时在 3 '端与一个 CaMV的 35S 终止子连接。 获得了一个能够在植物细胞中表达的人工基因 （其 5 ' 端有 Hindlll位点， 3 ' 端有 M位点）。 玉米的 ubiquitin-1启动子是通过从玉米基因组中 PCR获得。 这个表达框然 后被克隆到 pCambia 1300的 Hindlll和 Kpnl位点之间， 获得了 T-DNA载体 pCam 1300-N-Z2。

实施例 4、 水稻的转化

转基因水稻的获得方法是采用现有技术 （卢雄斌 龚祖埙 1998 生命科学 10 : 125-131； 刘凡等， 2003 分子植物育种 1: 108-115 )。选取成熟饱满的"秀水 134"种子去壳， 诱导产生愈伤组织作为转化材料。 分别取含目的基因载体 pCaml300-N-Zl 和 pCaml300-N-Z2 的农杆菌划板， 挑单菌落接种准备转化用农杆菌。 将待转化的愈伤组织放 入适当浓度的农杆菌液中 （含乙酰丁香酮）， 让农杆菌结合到愈伤组织表面， 然后把愈伤组 织转移到共培养基中， 共培养 2〜3天。 用无菌水冲洗转化后的愈伤， 转移到含适当潮霉素 的筛选培养基上， 筛选培养两个月 （中间继代一次）。 把筛选后， 生长活力良好的愈伤转移 到预分化培养基上培养 20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分� ��培养基， 14小时光 照分化发芽。 2— 3周后， 把抗性再生植株转移到含有烟嘧磺隆（0.1mg/L) 的生根培养基上 壮苗生根， 最后将再生植株洗去琼脂移植于温室， 作为鉴定材料。

实施例 5: 转基因水稻的抗除草剂能力测定

选择 pCaml300-N-Zl载体转化获得的 10个不同的转基因水稻株和同品种"秀水 134" 的非转基因株种植在温室中 （温度 15-25°C)， 在苗高大约 10 cm时， 喷浓度 6mg /平方米 的烟嘧磺隆 （玉农乐， 浙江金牛农药有限公司）。 10天后检查， 发现非转基因株全部死亡， 而转基因水稻株死亡率为 0%， 其中 8个转基因株系没有任何可见生长抑制， 2个株系生长 减缓。

选择 pCaml300-N-Zl载体转化获得的 10个不同的转基因水稻株和同品种"秀水 134" 的非转基因株种植在温室中（温度 15-25°C)， 在苗高大约 10 cm时， 喷浓度 15mg /平方米 的硝磺草酮 （硝磺草酮 10%悬浮剂， 先正达）。 10天后检查， 发现非转基因株全部死亡， 而转基因水稻株死亡率为 0%， 其中 3个转基因株系没有任何可见生长抑制， 7个株系生长 减缓。

选择 pCaml300-N-Z2载体转化获得的 10个不同的转基因水稻株和同品种"秀水 134" 的非转基因株种植在温室中 （温度 15-25°C)， 在苗高大约 10 cm时， 喷浓度 6mg /平方米 的烟嘧磺隆。 10天后检查， 发现非转基因株和转基因株都全部死亡， 说明 N-Z2并没有抗 烟嘧磺隆的能力。

选择 pCaml300-N-Z2载体转化获得的 10个不同的转基因水稻株和同品种"秀水 134" 的非转基因株种植在温室中 （温度 15-25°C)， 在苗高大约 10 cm时， 喷浓度 15mg /平方米 的硝磺草酮。 10天后检查， 发现非转基因和转基因株全部死亡， 说明 N-Z2并没有抗硝磺 草酮的能力。

实施例 6: 双子叶转化载体的构建和拟南芥 (Arabidoposis thaliancd 的转化 载体构建：

将 pCambial300载体进行如下改造： 用 Xhol酶去除抗潮霉素基因， 然后用抗草甘膦 的 EPSPS基因取代（核苷酸序列是 SEQ ID NO: 15 ) , 获得的载体 pCambial300-35S: G10。 N-Z1的表达框由 CaMV的 35S启动子、 N-Z1基因和 CaMV的 35S终止子组成， 并且在 这个表达框的 5'端设置了一个 Hindlll位点， 3'端设置了 Kpnl位点。 这个表达框然后被克 隆到中间载体 pCambial300-35S _: G10 中的 Hindlll禾 P Kpnl位点之间， 得到转化载体 pCambia 1300-35 S/G10-35 S/N-Z 1。

拟南芥 CArabidoposis thaliana) 的转化：

将导入了 pCambial300-35S/G10-35S/N-Zl载体的农杆菌接于有 YEP (包含： 酵母提 取物 10g /L， 蛋白胨 10g/L， NaCl 5g/L) 培养液的试管中， 28°C， 3000rpm摇过夜， 约 30 小时， 将已摇活的菌转至 300毫升 YEP中培养， 28 °C , 300rpm约 14小时， 测 OD值， 当 菌液达到 OD600为 1.53.0之内时， 可收集菌体于 250ml离心瓶（灭菌），4°C， 4000g 离心 lOmin 。 用 10%蔗糖 (含 0.02%silwet) 稀释至 OD600 约为 0.8— 1.0左右。 转化时将花在 溶液中浸泡 1分钟左右， 于弱光下生长。

经过农杆菌侵染的拟南芥获得的种子， 在含 0.5mM草甘膦的拟南芥生长培养基上发 芽和生长。 没有转化的种子发芽以后由于草甘膦的作用不 能生长， 黄化而死亡。 而导入 了 T-DNA的种子则能够生长发育， 开花并获得种子。 总共获得了 35个独立的抗草甘膦苗 ( TO代） ， 并获得种子。 实施例 7: 转基因拟南芥 (Arabidoposis thaliana 的抗除草剂能力测定 利用载体 pCambial300-35S/G10-35S/N-Zl共获得 35个独立转化系。 T1代苗（TO 代种子发芽以后获得）， 喷施 1 :200稀释的草甘膦 （41%草甘膦异丙胺盐水剂， 新安化工） 清除分离的不带导入抗草甘膦基因的植株。成 活的植株生长到 4-6 叶期进行抗除草剂试验。

抗烟嘧磺隆试验： 每个系 10株喷施了烟磺隆 （剂量相当于 6mg /平方米， 喷施 有效浓度是 80mg/L， 产品为： 玉农乐， 浙江金牛农药有限公司）。 非转基因的受体亲本拟 南芥作为阴性对照。 喷施烟磺隆 10 天以后评价它们的抗烟嘧磺隆水平。 结果发现， 21个 转化系没有观察到明显的药害， 8个表现出生长受到不同程度的抑制， 6个被杀死。 非转基 因的受体亲本拟南芥全部死亡。

抗硝磺草酮试验： 每个系 10株喷施了硝磺草酮 （剂量相当于 15mg /平方米， 喷 施有效浓度是 200mg/L， 产品为： 硝磺草酮 10%悬浮剂， 先正达）。 非转基因的受体亲本 拟南芥作为阴性对照。 喷施硝磺草酮 10天以后评价它们的抗硝磺草酮水平。 结果发现， 6 个转化系没有观察到明显的药害， 18个早期表现出一定程度的白化， 但是后来大部分得到 恢复， 11个被杀死。 非转基因的受体亲本拟南芥全部死亡。

抗 2,4-D试验： 每个系 10株喷施了 2,4-D (剂量相当于 150mg /平方米， 喷施 浓度是 1 .4g/L， 产品为： 2甲 4氯钠可溶性粉剂， 海盐博大精细化工有限公司）。 非转基 因的受体亲本拟南芥作为阴性对照。 喷施 2,4-D以后 10 天评价它们的抗性水平。 结果发 现， 27个转化系没有观察到明显的药害， 8个表现出生长受到不同程度的抑制。 非转基因 的受体亲本拟南芥全部死亡。

其中， 转化系 N-Zl-At6 对上述 3种除草剂的抗性良好。 进一步试验了 N-Zl-At6 对其他除草剂的抗性能力。 在 4-6叶期分别喷施： 莠去津 （90% 水分散粒剂， 先正达）、 Dicamba (48%水剂， 先正达）、 氟烯草酸（10%乳油， 日本住友化学株式会社 ）、 苯达松、 五氟磺草胺， 苄嘧磺隆， 苯磺隆 。 结果发现， N-Zl-At6对这些除草剂的抗性水平比非转 基因的亲本植株明显提高。

转化系 N-Zl-At6进一步试验对除草剂混合物的抗性能力� �� 结果发现 N-Zl-At6对 硝磺草酮和烟嘧磺隆混合物、 硝磺草酮和 2， 4D混合物、 氟烯草酸和 2,4D混合物、 苯达松 和五氟磺草胺混合物等的抗性明显比非转基因 对照高。 N-Zl-At6对硝磺草酮、 烟嘧磺隆和 2,4D等三种除草剂的混合物同样抗性显著。