Objet de l'invention.

La pr~sente invention concerne des d~riv~s chimioluminescents d'acridinium ainsi qu'un conjugu~ comprenant un de ces d~riv~s, li~ ~ un composant biologique sp~cifique.

Un autre aspect de l'invention concerne la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant ce conjugu~ ou un de ces d~riv~s, et l'utilisation du conjugu~ ou d'un de ces d~riv~s chimioluminescents pour le dosage et/ou la d~tection d'un compos~ biologique sp~cifique.

Arri~re-plan technologique ~ la base de l'invention.

La chimioluminescence est une formation de lumi~re obtenue par une r~ation chimique. Le m~canisme g~n~ral de cette r~action a ~t~ notamment d~crit par Schuster et al (Advances in Physical Organic Chemistry, 187-238 (1984)) par la r~action suivante A < B* g B + hM Le compos~ A, par une r~action chimique, physique ou biochimique (le plus souvent par une oxydation avec un peroxyde) donne un produit ~ un ~tat excit~ ("B*") qui revient ~ l'~tat fondamental par l'~mission de lumi~re (h3).

Ce proc~d~ de chimioluminescence est largement utilis~ en chimie analytique et en biologie clinique, notamment pour les immunodosages (chemoluminescence immuno

assay ou "CLIA").

Les demandes de brevet EP-A-273115, EP-A-257541 et EP-A-263657 d~crivent des compos~s chimioluminescents h~t~rocycliques d~riv~s d'acridinium, de ph~nantridiniumn de quinol~nium et dtisoquinol~nium et leurs isom~res, eventuellement conjugu~s ~ des antig~nes, des anticorps ou des acides nucl~iques pour ~tre utilis~s dans des tests de chimioluminescence.

Le pouvoir chimioluminescent de ces d~riv~s est calcul~ par l'~mission de lumi~re engendr~e au contact de l'eau oxyg~n~e en milieu alcalin. Des ~tudes r~alis~es par F. McCapra (Accounts of Chemical Research (1976), 9, 6, p.

201-209) ont permis d'~tablir un m~canisme de chimioluminescence des compos~s d'acridinium. Il postule la formation d'un interm~diaire r~actionnel excit~ (diox~tane) qui se d~compose en CO2 et en m~thylacridone.

Il implique ~galement le d~placement par H202 d'un groupement partant Y. Ce d~placement serait, selon la th~orie g~n~ralement admise, possible pour des d~riv~s pr~sentant un groupement Y poss~dant un pKa inf~rieur ~ celui de l'eau oxyg~n~e (pKa < 12).

La demande de brevet W095/19976 d~crit des d~riv~s h~t~rocycliques d'acridinium, de ph~nantridinium, de quinol~inium et dtisoquinol~nium ainsi que leurs isom~res et d~riv~s quelconques obtenus par substitution, am~lior~s, en particulier des d~riv~s stables et/ou pr~sentant une chimioluminescence ~lev~e, notamment lorsque la valeur du pKa du groupement partant est ~lev~e, de pr~f~rence lorsque le pKa est sup~rieur ~ 12.

Buts de l'invention.

La pr~sente invention a pour but d'obtenir des d~riv~s d'acridinium apparent~s chimiquement ~ ceux d~crits dans la demande de brevet W095/19976 pr~cit~e, de synth~se ais~e, qui offrent en outre de nombreuses possibilit~s d'adaptation comportant notamment une s~rie de modifications chimiques telles que le greffage d'un bras (spacer), le but ~tant entre autres d'orienter le couplage

vers des fonctions habituellement peu accessibles lors du marquage de prot~ines telles que les groupements ph~nols et thiols.

La pr~sente invention a ~galement pour but d'obtenir des d~riv~s chimioluminescents caract~ris~s par une courbe dose - r~ponse permettant leur utilisation dans le dosage et/ou le diagnostic sur une large plage de concentration Un dernier but de la pr~sente invention est d'obtenir une trousse de diagnostic comprenant ledit d~riv~ chimioluminescent actif et/ou stable.

Elenents caract~ristiques de l'invention.

La pr~sente invention concerne des d~riv~s d'acridinium chimioluminescents de formule dans laquelle R1 ~ R13 sont des substituants n'emp~chant pas l'expression de la chimioluminescence, ~tant entendu que l'un au moins des substituants R12 et R13 comporte, comme ~l~ment unique ou comme ~l~ment de liaison au d~riv~ d'acridinium, un atome autre que la carbone.

De pr~f~rence, dans les d~riv~s chimioluminescents selon l'invention, A est un ion compl~mentaire choisi parmi les ions halog~no, nitrate, <BR> <BR> <BR> sulfate, iodomercurate, trifluorom~thanesulfonate, tartrate et phtalate, Rl ~ R11 sont l'hydrog~ne ou des radicaux de

type R14 ou B-R14 ou B repr~sente un groupe ou un atome de liaison et R14 repr~sente un radical hydrocarbon~ pouvant contenir un ou plusieurs h~t~roatomes, R12 et R13 sont des substituants identiques ou diff~rents dont la fonction porte sur la chimioluminescence et sur le couplage, l'un des substituants R12 et R13 comportant comme ~l~ment unique un atome d'halog~ne ou comportant comme ~l~ment de liaison au d~riv~ d'acridinium un atome choisi parmi les azotides et les chalcog~nes, tandis que l'autre des substituants R12 et R13 est semblable aux substituants Rl ~ Roll, ~ l'exception de l'hydrog~ne.

De pr~f~rence, dans les d~riv~s chimioluminescents selon l'invention, B repr~sente dans la formule B-R14, un groupe - (CH2)n - o~ n repr~sente un nombre entier de 1 ~ 5, B repr~sente ~galement un groupe contenant un azotide ou repr~sente un chalcog~ne, de pr~f~rence un groupe azot~ ou l'oxyg~ne deux fois li~s, R14 ~tant tel que d~fini pr~c~demment. Et plus particuli~rement, R14 est un radical choisi parmi le groupe constitu~ par alkyle, alk~nyle, alkynyle, aryle, arylalkyle, h~t~roaryle et h~t~roarylkyle ~ventuellement substitu~s.

Plus particuli~rement encore, dans ces d~riv~s chimioluminescents, R1 et R11 sont l'hydrog~ne, l'un des substituants R12 et R13 est un substituant choisi parmi les halog~nes et les groupes B-Rl4, l'autre des substituants R13 et R13 ~tant semblable ~ B-R14 ou ~ R14, B et R14 ~tant tels que d~finis pr~c~demment.

Selon une forme d'ex~cution pr~f~r~e, de l'invention, les d~riv~s chimioluminescents sont les compos~s; [l-~thoxy-l- ( 4-carboxyph~nyl ) -1-iminom~thane i -10- m~thylacridinium-9-carboxylate ou l-~thoxy-l- [4- ( 2-bromo~thoxy) -ph~nyl ]-l- iminom~thane}-10-m~thylacridinium-9-carboxylate ou

(1-chloro-1-ph~nyl-1-iminom~thane)-10- m~thylacridinium-9-carboxylate ou [l-benzyloxy-l- ( 4-carboxyph~nyl ) -1-iminom~thane] - 10 -m~thyl acr idinium- 9-carboxyl ate ou [l-chloro-l- ( 3-cyanoph~nyl ) -1-iminom~thane 1-10- m~thylacridinium-9-carboxylate ou [1-chloro-1-(2,4,5,-trifluoroph~nyl)-1- iminom~thane i -l0-m~thylacridinium-9-carboxylate ou (l-chloro-l-perfluoroph~nyl-l-iminom~thane ) -10- m~thylacridinium-9-carboxylate.

Ces d~riv~s sont d~sign~s par les r~f~rences OX1 ~ OX7 respectivement et leurs formules de structure sont reprises au tableau 1 qui suit. Tableau 1: d~riv~s de type OX synth~tis~s D~riv~ Rit gwl3 CtH3 OXI oxo o OH 0 1 o 0II o N M Il Ox2 13 O CH 0 CH Ox3 C'I o CH, OX oiASoH ~l 0xs M OH Ci 0X6 F~IF Ci F OX7

Un autre aspect de l'invention concerne le conjugu~ comprenant un d~riv~ chimioluminescent selon l'invention li~ ~ un composant biologique sp~cifique.

On entend par "compos~ biologique sp~cifique", toute mol~cule biologique (lipide, saccharide, prot~ine, peptide, acide nucl~ique,...) ou ensemble de mol~cules biologiques, sp~cifiques d'une esp~ce (virale, bact~rienne, v~g~tale, animale ou autre), d'un individu, d'une pathologie (telle que le cancer ou caus~e par un agent viral, bact~rien ou autre), d'une activit~ ou d'un syst~me biochimique (telle qu'une r~action enzymatique,...).

Ledit composant biologique est susceptible d'~tre d~tect~ et/ou dos~, ou susceptible de servir au dosage et/ou ~ la d~tection d'un composant biologique sp~cifique.

De pr~f~rence, ce compos~ biologique sp~cifique est choisi parmi le groupe constitu~ par les anticorps, les hapt~nes, les antig~nes, les acides nucl~iques, les agonistes, les transporteurs cellulaires, les acides gras, les lipides et/ou un m~lange d'entre eux.

La pr~sente invention concerne ~galement la trousse de diagnostic et/ou de dosage comprenant le conjugu~ ou un des d~riv~s chimioluminescents selon l'invention et l'utilisation du conjugu~ et/ou d'un d~riv~ chimioluminescent selon l'invention pour le dosage et/ou la d~tection d'un compos~ biologique sp~cifique.

Br~ve description des Figures.

La figure 1 repr~sente un sch~ma g~n~ral de pr~paration des d~riv~s OX.

La figure 2 repr~sente le sch~ma de synth~se du d~riv~ OX7.

La figure 3 illustre la cin~tique des Ac (anticorps) marqu~s par OX3, OX5, OX6 et OX7.

Les figures 4 ~ 6 illustrent la stabilit~ des Ac marqu~s par OX6, OX7 et OX5 respectivement.

Dans les figures 3 ~ 6, le signal est exprim~ par le rapport entre l'intensit~ (en RLU) mesur~e au temps t et l'intensit~ (en RLU) mesur~e au temps t=0.

La figure 7 repr~sente l'~volution de la concentration en produit OX7 en fonction du temps dans un tampon ~ pH 8.

La figure 8 repr~sente un exemple de dosage de TSH avec Ac marqu~ par OX7.

La figure 9 repr~sente le spectre infrarouge du pentafluorobenzald~hyde.

La figure 10 repr~sente le spectre infrarouge de la pentafluorobenzaldoxime.

La figure 11 repr~sente le spectre infrarouge de la pentafluorobenzaldoxime chlor~e.

La figure 12 repr~sente le spectre infrarouge du produit de couplage de la pentafluorobenzaldoxime chlor~e avec le chlorure de l'acide 9-acridine carboxylique, ~tant le 9-acridine carboxylate de l-chloro-l-perfluoroph~nyl-l- iminom~thane.

Les figures 13 ~ 15 repr~sentent les spectres infrarouge des marqueurs OX7, OX5 et OX6.

Les figures 16 ~ 18 repr~sentent les spectres de masse des marqueurs OX5, OX6 et OX7.

Les compos~s OX dont les formules sont reprise au tableau 1, ont -tous ~t~ pr~par~s en suivant le sch~ma g~n~ral de pr~paration d~crit dans la figure 1. Leurs synth~ses ont n~cessit~ la synth~se de l'ald~hyde de d~part (II) lorsque celui-ci n'~tait pas directement disponible.

La premi~re ~tape consiste ~ former l'oxime (III) par r~action entre l'ald~hyde (II) et de l'hydroxylamine.

La r~action est r~alis~e dans un tampon ~ pH 4,5-5.

La chloroxime (IV) est pr~par~e par barbotage de chlore dans une solution d'oxime.

Les chloro-d~riv~s ont ~t~ obtenus directement par couplage de la chloroxime au noyau acridine. Les 3 autres d~riv~s ont ~t~ pr~alablement trait~s par un ~quivalent d'alcoolate sodique avant l'~tape de couplage au noyau acridine. L'alcoolate est pr~par~ ~ partir de sodium et de l'alcool correspondant.

Les compos~s IV ou IVb sont coupl~s au chlorure d'acide carboxylique dans un solvant organique additionn~ de NET3.

Les produits V ou Vb sont m~thyl~s par le couple de r~actifs CH3I/HgCl2 ou le triflate de m~thyle.

EXEMPLES EXEMPLE 1: MODES OPERATOIRES COMMUNS A CERTAINS DERIVES (FIG. 1).

1. Synth~se de l'ald~hyde II (pour les d~riv~s OX6 et OX7).

Les ald~hydes employ~s dans la synth~se des d~riv~s OX6 et OX7 ont ~t~ r~alis~s par r~duction des chlorures d'acides correspondants (chlorure d'acide 2,4,5- trifluorobenzo~que ou 2,3,4,5,6-pentafluorobenzo~que). Le protocole utilis~ est le suivant: un ~quivalent de chlorure d'acide est mis en pr~sence d'l,l ~quivalents de Bu3SnH dans du THF. Apr~s r~action, le THF est ~vapor~ sous vide et le r~sidu trait~ par de l'eau. Ce dernier est ensuite extrait par de l'~ther de p~trole (Eb 40~ C) puis pass~ sur charbon. L'ald~hyde est obtenu par ~vaporation sous vide.

2. Formation de ltoxime III (pour tous les d~riv~s).

Un ~quivalent d'ald~hyde dissous dans le lt~thanol est additionn~ d'eau et de cinq ~quivalents de chlorhydrate d'hydroxylamine. Le pH est ajust~ ~ une valeur de 5 par ajout de NaOH ~ 5 %. Le solvant organique est ~vapor~ et l'oxime form~e est extraite au tolu~ne. La solution organique est s~ch~e sur Na2SO4 et pass~e sur charbon. ELle est ensuite concentr~e sous vide et additionn~e de p~trol~ine 40 C. Le refroidissement de la solution ~ -20 C provoque la cristallisation de l'oxime.

3. Transformation en chloroxime IV (pour tous les d~riv~s).

La chloroxime est pr~par~e par barbotage de chlore dans une solution d'oxime dans un m~lange CHCI3/dioxane pr~alablement refroidi ~ 0 C. La r~action est compl~te et la chloroxime (III) est directement obtenue par ~vaporation des solvants suivie, lorsque la chloroxime

est solide ~ temp~rature ambiante, d'une recristallisation par ajout de p~trol~ine 40 C. (la chloroxime des d~riv~s OX6 et OX7 est liquide).

4. Etape de r~action avec un alcoolate (pour d~riv~s OX1, OX2 et Ou4).

Obtention du produit IVb.

L'alcoolate est pr~par~ par r~action entre un ~quivalent de sodium et d'un ~quivalent d'alcool (~thanol ou ph~nol). La r~action est effectu~e dans l'alcool lorsque c'est possible (~thanol) ou dans l'ac~tone (ph~nol).

Un ~quivalent de chloroxime dissous dans l'ac~tone est directement mis en r~action avec un ~quivalent d'alcoolate. Le pH du milieu est ajust~ ~ 4,5 par ajout de HCI concentr~ et le pr~cipit~ form~ (NaCI) est ~limin~ par filtration ou par centrifugation. La solution est additionn~e d'eau. L'~vaporation des solvants organiques provoque la cristallisation du produit.

5. Couplage ~ l'acridine (pour tous les d~riv~s).

Obtention du produit VIb.

L'acide acridine carboxylique est transform~ en chlorure d'acide dans du chlorure de thionyle port~ ~ reflux. Apr~s transformation compl~te de l'acide, le chlorure de thionyle est ~vapor~ sous vide.

Un ~quivalent des compos~s pr~par~s aux ~tapes 3 (OX3, OX5, OX6 et OX7) ou 4 (OX1, OX2 et OX4) sont coupl~s avec un ~quivalent de chlorure d'acide acridine carboxylique dans du THF additionn~ d'un exc~s de pyridine.

Le THF est ~vapor~ sous vide et le r~sidu repris dans du tolu~ne. On lave la phase tolu~nique ~ l'eau puis on la s~che sur du sulfate sodique anhydre. Le produit form~ est soit cristallis~ par ajout d'~ther de p~trole (Eb 40 C) ~ la solution (OX1, OX2, OX3, OX4 et OX5) ou chromatographi~ sur une colonne de silice en utilisant une phase tolu~ne /ac~tate d'~thyle/ acide ac~tique en propotions 2/1/0,01 (OX6 et OX7). Les fractions correspondant au premier produit qui sort de la colonne sont r~cup~r~es et

concentr~es sous vide. L'addition d'~ther de p~trole (Eb 40~ C) provoque la cristallisation du produit.

6. M~thylation des compos~s (pour tous les d~riv~s).

Les produits obtenus ~ l'~tape 5 sont m~thyl~s par le couple de r~actifs CH3l/HgCl2. La r~action est r~alis~e sur un m~lange intime de 50 mg de produit avec 50 mg de HgCl2 additionn~ de 1 ml de CH3I. Elle se d~roule dans une bombe port~e ~ 110 C durant 2h30. Apr~s r~action, la bombe est r~frig~r~e ~ -20 C. Apr~s refroidissement et d~cantation du contenu de la bombe, le surnageant est ~limin~ et les cristaux de produit m~thyl~ sont lav~s successivement par du CH3l puis par de l'~ther di~thylique. Le produit m~thyl~ peut ~ventuellement ~tre recristallis~ dans un m~lange ac~tone/~ther di~thylique.

EXEMPLE 2: SYNTHESE DE LA SONDE OX7 (FIG. 2) OU <BR> <BR> <BR> (1-CHLORO-1-PERFLUOROPHENYL-1-IMINOMETHANE)-10- <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> METHn;ACRIDINIUM-9-CARBOXYLATE , 1. Pr~paration de la pentafluorobenzaldoxime (I).

20 g de pentafluorobenzald~hyde sont mis en solution dans 400 ml d'~thanol. D'autre part, 25 g de chlorhydrate d'hydroxylamine sont solubilis~s dans 200 ml d'eau. La solution aqueuse est ajout~e ~ la solution alcoolique et le pH de la solution r~sultante est amen~ ~ 5 par addition de NaOH 2N. Apr~s transformation compl~te (CCM), on cristallise l'oxime par ~vaporation de l'~thanol de la solution. Le produit est isol~ par filtration et lav~ abondamment ~ l'eau. 17,8 g de pentafluorobenzaldoxime sont r~cup~r~s apr~s s~chage du pr~cipit~ (rendement 82 %).

2. Pr~paration de la chloropentafluorobenzaldoxime (11).

1 g de pentafluorobenzaldoxime est mis en solution dans 15 ml d'un m~lange dioxanne-chloroforme (1:1). Cette solution est refroidie ~ 0 C et satur~e par du chlore. Apr~s 90 minutes de r~action, la transformation est compl~te (CCM). Les solvants et l'exc~s de chlore sont ~limin~s sous pression r~duite et le r~sidu est utilis~ tel quel dans l'~tape suivante.

3. Couplage de la chloropentafluorobenzaldoxime (II) au chlorure de l'acide 9-acridine carboxylique (III).

1,05 g d'acide 9-acridine carboxylique est transform~ en chlorure d'acide par traitement au chlorure de thionyle (10 ml) contenant une trace de N, N- dim~thylformamide pendant 90 minutes ~ 85~ C. L'exc~s de chlorure de thionyle est ~limin~ sous d~pression. Le chlorure d'acide (III) obtenu sous forme de chlorhydrate est mis en suspension dans 20 ml de tetrahydrofurane et neutralis~ par 5 ~quivalents (2400 1) de tri~thylamine.

Le produit obtenu ~ l'~tape pr~c~dente est dilu~ dans 10 ml de t~trahydrofurane et additionn~ ~ la solution de chlorure d'acide. Apr~s 30 minutes de r~action, le solvant est ~limin~ sous d~pression et le r~sidu est solubilis~ dans un minimum de chloroforme. La phase organique est lav~e trois fois par 40 ml d'eau, d~cant~e et s~ch~e sur sulfate sodique anydre. Le solvant est ~limin~ au rotavapor et le r~sidu est dilu~ par un minimum de tolu~ne et abandonn~ ~ la cristallisation ~ 0 C pendant une nuit. Le produit est filtr~, lav~ par du tolu~ne froid puis par de l'~ther de p~trole. Il est ensuite s~ch~ sous vide en pr~sence d'un dess~chant. 1,8 g de produit (IV) sont r~cup~r~s apr~s s~chage (rendement 85 %).

4. N-m~thylation du produit (IV) et obtention du traceur chimioluminescent OX7 (V).

50 mg du produit (IV) sont mis en solution dans 2 ml de dichlorom~thane anhydre et trait~s par 800 p1 d'une solution ~ 10% de trifluorom~thanesulfonate de m~thyle dans le dichlorom~thane. Apr~s 4h de r~action, le produit d~sir~ est pr~cipit~ par addition mod~r~e d'~ther dans le milieu r~actionnel. Le traceur est isol~ par filtration et lav~ successivement par de l'~ther di~thylique puis par de l'~ther de p~trole. 50 mg de produit (V) sont r~cup~r~s (rendement 73%).

Points de Fusion et donn~es chromatographiques. Compos~ NO Point de fusion (OC) Rf CCM Rr C C M SIL SIL G/UV2s4 RP18W/UV25 I 131 0,87 0,70 IV 206-207 0,77 0,31 v 210-213 0,00 0,97 Phases Mobiles CCM SIL G/UV254: tolu~ne/ac~tate d'~thyle/acide ac~tique (2: 1: 0,04).

CCM DIL RP18W/UV2s4 ac~tonitrile/tampon phosphate 0,1 M pH=3 (60: 40 heptanesulfonate sodique: 0,1 %).

EXEMPLE 3: ESSAIS EXPERIMENTTAUX SUR LES SONDES OX.

1. Rendement de chimioluminescence Le rendement de chimioluminescence des d~riv~s OX ne peut pas ~tre d~termin~ lorsque les mol~cules sont ~ l'~tat libre. il est mesur~ apr~s couplage de ces produits ~ une prot~ine. A titre d'exemple, pour les d~riv~s OX5, OX6 et OX7, le taux d'incorporation sur la prot~ine est mesur~ par une m~thode fluorescente.

Pour OX7, on peut aussi quantifier la fluorescence ~mise par un d~riv~ de d~gradation: l'acridone. Le rendement quantique de la mol~cule de OX7 conjugu~e ~ un anticorps anti-hCG a ~t~ ~valu~ ~ 1,1019 RLU/mole.

2. Cin~tique d'~mission Toutes les cin~tiques d'~mission enregistr~es avec des d~riv~s OX sont tr~s rapides. Plus de 95 % du signal est ~mis dans la seconde suivant l'injection du r~actif d~clenchant la r~action chimioluminescente. M~me coupl~s, les d~riv~s de chloroximes conservent cette cin~tique particuli~rement rapide. A titre d'exemple, la figure 3 reprend les cin~tiques observ~es sur des anticorps (Ac) marqu~s par les chloro-d~riv~s.

3. Etude de stabilit~ De tous les oximes synth~tis~s, les chloroximes apparaissent de loin les plus stables en pr~sence de

prot~ines. Des mesures r~alis~es par spectrom~trie de masse sur OX7 ne montrent aucune variation significative du spectre de la mol~cule apr~s une incubation de 45 minutes dans un m~lange ac~tonitrile/eau (proportions 50/50).

Cette stabilit~ chimique permet d'envisager le couplage de la sonde aux prot~ines via la fonction halog~n~e de la mol~cule. Toutes les mesures de stabilit~ effectu~es montrent que les oximes OX5, OX6 et OX7 augmentent fortement leur stabilit~ en milieu aqueux apr~s couplage aux prot~ines. Les premiers r~sultats d'une ~tude de stabilit~ sur des anticorps marqu~s par ces sondes sont donn~s dans les figures 4, 5 et 6. Cette ~tude est r~alis~e ~ 25 C dans des tampons (0,1 M phosphate, 0,15 M NaCl, 0,1 % NaN3, 0,1 % BSA) ~ pH 5, 6 et 7.

Dans les conditions exp~rimentales d~crit~s ci- apr~s, les premiers r~sultats montrent que la stabilit~ des traceurs diminue avec la basicit~ du milieu, ce qui est li~ ~ la nature des sondes. Ils montrent ~galement que le traceur OX5 est nettement moins stable que les traceurs OX6 et OX7. Les cassures observ~es entre t=470 et t=560 heures sur les courbes des figures 4 et 5 ~ pH 5 et 6 permettent difficilement de conclure sur la stabilit~ exacte des traceurs OX6 et OX7 ~ pH 5 et 6. Toutefois, le traceur OX7 appara~t comme ~tant le plus stable des trois, et ce plus particuli~rement ~ pH 5. Cette importante stabilit~ ~ pH 5 permet d'envisager une longue conservation du traceur ~ 4 C D'un autre c~t~, la stabilit~ de celui-ci ~ pH 7 permet d'envisager tous les immunodosages possible ~ ce pH.

La stabilit~ de la sonde OX7 est tr~s sensible au pH. En milieu acide (pH 5) la stabilit~ du compos~ est nettement plus ~lev~e qu'en milieu basique (pH 8). Lorsque la sonde est fix~e ~ une prot~ine, sa stabilit~ augmente fortement et ce quelque soit le pH test~.

3.1 STABILITE DE LA SONDE OX7 NON COUPLEE A PH 8 La stabilit~ de la sonde libre a ~t~ test~e ~ 25 C dans un milieu identique ~ celui employ~ dans les

r~actions de marquage (pH du milieu: 8). La d~gradation du produit a ~t~ suivie par analyse HPLC en utilisant comme support chromatographique une colonne (4x125 mm) des Lichrosph~res RP-18 (5 t~m) et comme phase mobile un m~lange ac~tonitrile/eau additionn~ d'acide d~cane sulfonique, d'hydroxyde de t~tram~thyle ammonium et d'acide trifluoroac~tique (pH final: 2,5).

La figure 7 pr~sente l'~volution de la concentration en produit OX7 en fonction du temps dans un tampon ~ pH 8.

L'ajustement param~trique des donn~es pr~sent~es par une fonction de type: Y = A* exp (-B*X) + C a conduit aux r~sultats suivants: Pararn~tre Valeur Approx. SE 95% intervalle de confiance A 633 constant B q, 0415 1,96 E-03 0,036 a 0,046 C 0 constant R-= 0,992, Sy.x=18,42 Le temps de demi-vie de la sonde libre obtenu en utilisant l'ajustement param~trique est de 17 minutes.

3.2 STABILITE DE LA SONDE OX7 COUPLEE A UN ANTICORPS.

La stabilit~ de la sonde OX7 coupl~e ~ un anticorps a ~t~ test~e ~ pH 5, 6 et 7. Elle a ~t~ ~valu~e par mesure de l'activit~ chimioluminescente d'~chantillons de prot~ine marqu~e vieillis dans des tampons phosphate/NaCl additionn~s de prot~ines. L'ajustement param~trique des donn~es recueillies ~ pH 6 et 7 conduit ~ des temps de demi-vie de l'ordre de 600 et 375 heures. Par contre ~ pH 5, le temps de demi-vie est nettement plus important (les faibles variations de signal enregistr~es sur une p~riode d' environ 2 mois ne permettent pas un ajustement param~trique valable).

4.1 MARQUAGE D'ANTICORPS ANTI-TSH PAR LA SONDE OX7 25 pg d'anticorps en solution dans 100 pl de tampon de marquage (solution 0,1 M phosphate de sodium, 0,15 M NaCl ajust~e ~ pH 8,0) sont additionn~s de 10 pl

d'une solution de OX7-m~thyltriflate dans l'ac~tonitrile (solution 0,5 mg/ml). Apr~s homog~n~isation, le m~lange r~actionnel est incub~ durant 15 minutes ~ temp~rature ambiante. L'exc~s de sonde OX7 est neutralis~ par ajout de 100 pl d'une solution de lysine dans le tampon de marquage (solution 1,5 mg/ml). Apr~s une nouvelle incubation de 5 minutes ~ temp~rature ambiante, le milieu est chromatographi~ sur une colonne (50x1 cm) de s~phadex G25.

La colonne chromatographique est ~quilibr~e et ~lu~e avec un tampon 0,1 M phosphate, 0,15 M NaCl. 0,1 % NaN3 contenant de la BSA (lg/l) et ajust~ ~ p 5,0. Les fractions chromatographiques sont lues par mesure de chimioluminescence. Les fractions correspondant au pic d'anticorps sont rassembl~es et conserv~s dans le tampon de purification ~ une temp~rature de 4 C.

4.2 DOSAGE DE TSH AVEC LES ANTICORPS MARQUES PAR OX7.

Un dosage non optimis~ de la TSH a ~t~ r~alis~ en suivant un protocole identique ~ un dosage IRMA commercial avec des anticorps anti-TSH marqu~s par la sonde OX7. Le protocole utilis~ comporte les ~tapes suivantes: pr~paration du traceur par dilution du pic d'anticorps marqu~s dans un tampon traceur ~ pH 7,0 (dilution 50x); remplissage des diff~rents tubes coat~s avec 200 pl de standards (0, 0,15, 0,5, 1.5, 4, 15, 50 et 85 pl/ml); agitation durant 2h ~ temp~rature ambiante; aspiration du contenu de chaque tube; rin~age des tubes avec un tampon de lavage (op~ration r~alis~e 2 fois) et ~limination de la phase liquide par aspiration; lecture de la chimioluminescence des diff~rents tubes.

La courbe de calibration obtenue (Fig. 8) montre que des anticorps marqu~s par la sonde OX7 peuvent parfaitement convenir comme traceur chimioluminescent dans le cadre d'un dosage n~cessitant une grande sensibilit~.