CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención pertenece al campo de la producción de proteínas recombinantes, más concretamente se refiere a un anticuerpo monoclonal humano que reconoce el dominio extracelular del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) y es producido en células de retina embriónica humana. Asimismo, la presente invención se refiere al uso de dicho anticuerpo, en particular para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos neoplásicos que cursan con la sobreexpresión de HER2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La mayoría de los anticuerpos terapéuticos desarrollados como agentes médicos son isotipos humanos lgG1 incluyendo lgG1 quimérica ratón/humano, humanizada y humana. La lgG1 humana es una glicoproteína que tiene en la mayoría de los casos dos glicosilaciones tipo complejo N-biantena unidos a la parte constante (Fe) del anticuerpo, en la cual la mayoría de los oligosacáridos están fucosilados. La lgG1 humana ejerce entre otras funciones, funciones efectoras en la Citotoxicidad Celular Dependiente de Anticuerpo (ADCC, Antibody Dependent Celular Citotoxicity) y en la Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC, Complement Dependent Citotoxicity) a través de la interacción de la región Fe con cada uno de los receptores de los leucocitos (FcyRs) o el complemento. La eficacia de los anticuerpos terapéuticos resulta de la especificidad del antígeno diana y de las funciones efectoras del anticuerpo, las cuales son activadas por la formación de los complejos inmunes. Recientemente se ha demostrado que la respuesta ADCC y CDC es uno de los mayores mecanismos anti-neoplásicos responsables de la eficacia clínica de los anticuerpos terapéuticos.

Una de las características comunes de los anticuerpos terapéuticos usados en el tratamiento del cáncer es que su eficacia anti-tumoral requiere altas concentraciones séricas y una terapia continua durante varios meses. Los ciclos de tratamiento requieren, por tanto, varios gramos de anticuerpo terapéutico, resultando en una cantidad de droga significante y unos costes muy altos. De hecho, se requiere una alta dosis (2-8 mg kg ^"1 ) de rituximab lgG1 anti-CD20 (Rituxan ®) o de trastuzumab lgG1 anti-Her2 (Herceptin ®) para conseguir una concentración sérica efectiva de más de 10 pg ml_ ^"1 . A diferencia de estas dosis in vivo, la actividad citotóxica máxima in vitro vía ADCC de los anticuerpos terapéuticos se consigue con concentraciones de menos de 10 ng kg ^~1 . Esta discrepancia entre la eficacia in vivo e in vitro se debe principalmente a que la IgG sérica, aunque no afecta la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo terapéutico, dificulta la unión del anticuerpo terapéutico con el receptor Fc Rllla de las células NK inhibiendo la respuesta ADCC inducida por dichos anticuerpos. Se ha visto que los anticuerpos terapéuticos afucosilados (no fucosilados) pueden evadir dicho efecto inhibidor de la IgG plasmática humana sobre la ADCC.

La mayoría de anticuerpos terapéuticos actualmente permitidos en el mercado son producidos en líneas celulares de roedores como células de Ovario de Hámster Chino (CHO), mieloma de ratón NS0 y SP2/0 e hibridoma de ratón, estando casi todas las moléculas producidas por estas líneas celulares fucosiladas en los oligosacáridos de la Fe, lo que significa que la respuesta ADCC no es la óptima. Además, en el sistema celular CHO los enzimas encargados de llevar a cabo los procesos de glicosilación difieren de los humanos, como es el caso del enzima que realiza la adición de galactosa (GnTI, GnTII), muy activo y abundante en humanos a diferencia de los roedores. A este respecto, diferentes estudios han descrito que un aumento en el porcentaje de galactosilación resulta en una mejor respuesta CDC en IgG recombinantes, mientras que dicho aumento no tiene un efecto negativo en la respuesta ADCC.

El uso de células no humanas para la producción de proteínas recombinantes puede causar además otros problemas, como un plegamiento incorrecto de las proteínas que sucede durante o después de la traducción, el cual puede ser dependiente de la presencia de las proteínas chaperonas apropiadas. Un plegamiento aberrante puede conducir a una disminución o ausencia de actividad biológica de la proteína recombinante, a una disminución del tiempo de vida media en sangre e inclusive a un aumento de la inmunogenicidad. Además, es de gran importancia la expresión simultánea y en cantidades relativas correctas de aquellos polipéptidos que forman las distintas subunidades de proteínas con estructura cuaternaria, como son los anticuerpos. Los anticuerpos están formados por una unidad básica compuesta de dos cadenas polipeptídicas globulares pesadas y dos cadenas polipeptídicas ligeras unidas entre sí por puentes disulfuro. Ambas cadenas presentan una zona constante y una zona variable. En esta última, se encuentra una zona hipervariable formada por 10 a 15 aminoácidos responsables de la unión específica con el antígeno. En cuanto a los anticuerpos terapéuticos para el tratamiento del cáncer, el Trastuzumab (comercializado por Roche como Herceptin®) es un anticuerpo monoclonal humanizado lgG1 que reconoce el dominio extracelular del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Este anticuerpo está diseñado para bloquear la ruta de proliferación activada por el receptor HER2, producido por un gen específico con potencial cancerígeno. La producción de dicho anticuerpo se lleva a cabo utilizando la línea celular CHO lo que puede conllevar los inconvenientes descritos anteriormente (disminución de la actividad biológica, aumento de la inmunogenicidad, etc.). Por lo tanto, sigue existiendo en el estado de la técnica la necesidad de conseguir un anticuerpo monoclonal humano anti- HER2 con un patrón de glicosilación que favorezca una mejor respuesta inmune.

OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en un aspecto a un polipéptido caracterizado porque comprende la secuencia polipeptídica SEQ ID NO 1. Asimismo se refiere a la secuencias nucleotídica que codifica dicha secuencia SEQ ID NO 1 y a un vector que comprende dicha secuencia nucleotídica. También se refiere, en otro aspecto, a una célula de retina embrionaria humana caracterizada porque ha sido transfectada con dicho vector.

Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humano que reconoce HER2 caracterizado porque es producido por dicha célula de retina embrionaria humana. Y se refiere también a una inmunotoxina que comprende un conjugado de dicho anticuerpo y al menos un agente citotóxico. Asimismo se refiere a un kit que comprende dicho anticuerpo o dicha inmunotoxina.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Asimismo, se refiere a una composición farmacéutica que comprende una inmunotoxina que comprende un conjugado de dicho anticuerpo con al menos un agente citotóxico, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se refiere, en otro aspecto, al uso de dicho anticuerpo para medir el nivel de expresión de HER2. Asimismo, se refiere al uso de dicho anticuerpo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neoplásico que cursa con la sobreexpresión de HER2. También, se refiere al uso de una inmunotoxina que comprende un conjugado de dicho anticuerpo y al menos un agente citotóxico, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neoplásico que cursa con la sobreexpresión de HER2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra un ensayo de unión del anticuerpo CRX01 (anticuerpo monoclonal humano anti-HER2 producidos en células PER.C6® cuyas cadenas pesadas comprenden la SEQ ID NO 1 , cuyas cadenas ligeras comprenden la SEQ ID NO 4 y cuyo perfil de glicosilación comprende un porcentaje de afucosilacion menor o igual al 4% y un porcentaje de galactosilación mayor o igual al 35%) y Herceptin® realizado mediante Western Blot en condiciones reductoras utilizando como anticuerpo primario CRX01 (A) o Herceptin® (B), ambos a una concentración de 5 μg/ml, y como anticuerpo secundario peroxidasa anti-lgG humana a una dilución 1 :20.000. Se cargaron 300 ng de un péptido correspondiente al dominio extracelular de la proteína HER2 conjugado a la proteína GST, que tiene un peso molecular total de 35 kDa. Como control negativo se cargo un extracto de células JKT. El Western Blot muestra que CRX01 es capaz de unirse en condiciones reductoras a HER2, pudiendo bloquear su actividad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Un aspecto de la presente invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 1. Asimismo, se refiere a una molécula de ADN, ADNc o ARN que comprende la secuencia que codifica el polipéptido de SEQ ID NO 1. En una realización particular, dicha molécula de ADN comprende la secuencia SEQ ID NO 2.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector que comprende una molécula de ADN que codifica un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 , en una realización particular dicho vector comprende la SEQ ID NO 2. En otra realización particular dicho vector comprende además una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de secuencia SEQ ID NO 4, comprendiendo dicho dicha secuencia nucleotídica, en una realización particular, la secuencia nucleotídica SEQ ID NO 5. En una realización particular, el vector comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO 3. En otra realización particular, dicho vector tiene la secuencia SEQ ID NO 3. Los anticuerpos están formados por una unidad básica compuesta de dos cadenas polipeptídicas globulares pesadas (referidas también como cadenas pesadas) y dos cadenas polipeptídicas ligeras (referidas también como cadenas ligeras) unidas entre sí por puentes disulfuro. Ambas cadenas (pesadas y ligeras) presentan una zona constante y una zona variable. La secuencia SEQ ID NO 1 codifica cada una de las cadenas polipeptídicas pesadas del anticuerpo monoclonal humano anti-HER2 objeto de la presente invención (ver más adelante) y la secuencia SEQ ID NO 4 codifica cada una de las cadenas polipeptídicas ligeras de dicho anticuerpo. Cabe destacar que en la secuencia polipeptídica de las cadenas pesadas la secuencia los residuos 359 y 361 del dominio constante son ácido aspártico (D) y leucina (L), respectivamente, correspondiendo al alotipo G1 m17.1 ;Km3.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una célula de retina embriónica humana (en adelante célula de la invención) caracterizada porque es transfectada con un vector que comprende una molécula de ADN que codifica un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO 1. En una realización particular, la célula de la invención es transfectada con un vector que codifica un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO 1 y un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO 4. En otra realización particular, la célula de la invención es transfectada con un vector que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO 3. En otra realización particular, la célula de la invención es la célula PER.C6® (Crucell, Percivia), depositada en la European Collection of Cell Cultures (ECACC) con el número 96022940 (patentes ES 2333425 T3 y EP 1445322 B1 del titular Crucell Holland B.V.). En una realización particular, la célula de la invención es la célula ECACC 96022940 transfectadada con el vector que comprende la SEQ ID NO 3. En una realización particular, dicho vector es transfectado tras ser linealizado, en particular mediante digestión enzimática con el enzima de restricción Seal. Dicha célula ECACC 96022940 transfectada con el vector de secuencia SEQ ID NO 3 linealizado con Seal está depositada según el Tratado de Budapest en la institución Health Protection Agency Culture Collections (HPACC) con el número de depósito 12030701 . Otro aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humano que reconoce a HER2 (en adelante anticuerpo de la invención) es producido por la célula de la invención. Dicho anticuerpo anti-HER2 reconoce HER2 tal y como se muestra en la Figura 1. En los términos de la presente invención se entiende por "anticuerpo monoclonal recombinante humano", también referido como "anticuerpo monoclonal humano", todo aquel anticuerpo monoclonal producido en células humanas a través de la tecnología del ADN recombinante. La producción en células humanas conlleva la importante ventaja de que los anticuerpos producidos presentan un perfil de glicosilación humano y pueden ser por tanto menos inmunogénicos que los producidos en células no humanas. En una realización particular, el anticuerpo de la invención se caracteriza porque tiene un perfil de glicosilación que comprende un porcentaje de afucosilacion menor o igual al 4%. En otra realización particular, el anticuerpo de la invención tiene un perfil de glicosilación que comprende un porcentaje de galactosilacion mayor o igual al 35%. En otra realización particular, el anticuerpo de la invención tiene un perfil de glicosilación que comprende un porcentaje de afucosilacion menor o igual al 4% y un porcentaje de galactosilacion mayor o igual al 35%, y de manera más particular, dicho porcentaje de afucosilacion es menor o igual al 3,5% y dicho porcentaje de galactosilacion es mayor o igual al 40%, y de manera aún más particular dicho porcentaje de afucosilacion es menor o igual al 3% y dicho porcentaje de galactosilacion es mayor o igual al 45%. Estos porcentajes de fucosilación y galactosilacion suponen una importante ventaja ya que menores niveles de fucosilación han sido vinculados con una mejor respuesta ADCC, mientras que mayores niveles de galactosilacion han sido vinculados con una mejor respuesta CDC, lo cual permite que dichos anticuerpos sean administrados en dosis menores.

Otro aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende el anticuerpo de la invención según se ha definido en el párrafo anterior. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una inmunotoxina que comprende un conjugado del anticuerpo de la invención según se ha definido anteriormente, y al menos un agente citotóxico. Refiriéndose la invención también, en otro aspecto, al kit que comprende dicha inmunotoxina. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención según se ha definido anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Asimismo, se refiere a una composición farmacéutica que comprende una inmunotoxina que comprende un conjugado del anticuerpo de la invención según se ha definido anteriormente y al menos un agente citotóxico, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención en otro aspecto se refiere al uso del anticuerpo de la invención para medir el nivel de expresión de la proteína HER2. Asimismo, se refiere al uso del anticuerpo de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neoplásico que cursa con la sobreexpresión de HER2. En una realización particular, dicho trastorno neoplásico que cursa con la sobreexpresión de HER2 es cáncer de mama HER2- positivo. Un último aspecto de la presente invención se refiere al uso de una inmunotoxina que comprende un conjugado del anticuerpo de la invención según se ha definido anteriormente y al menos un agente citotóxico, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neoplásico que cursa con la sobreexpresión de HER2. En una realización particular, dicho trastorno neoplásico que cursa con la sobreexpresión de HER2 es cáncer de mama HER2-positivo.

DEPÓSITO DE MATERIA BIOLÓGICA

La línea celular ECACC con el número 96022940 (PER.C6®) transfectada con el vector v074 (SEQ ID NO 3) linealizado mediante digestión enzimática con Seal ha sido depositada en la institución Health Protection Agency Culture Collections (HPACC, Portón Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido) el 7 de marzo de 2012, con el número de depósito 12030701.

Ejemplos A continuación se detallan unos ejemplos concretos de realización de la invención que sirven para ilustrar la invención.

En los presentes ejemplos, como se ha mencionado anteriormente, CRX01 hace referencia a un anticuerpo monoclonal humano anti-HER2 cuyas cadenas pesadas comprenden la SEQ ID NO 1 , cuyas cadenas ligeras comprenden la SEQ ID NO 4, y cuyo perfil de glicosilación comprende un porcentaje de afucosilaclón menor o igual al 4% y un porcentaje de galactosilación mayor o igual al 35%.

Ejemplo 1. Generación de clones productores del anticuerpo CRX01 Cultivo de las células PER.C6®

En todo el proceso de cultivo, las células PER.C6® fueron crecidas en medio PerMab (Thermo Fisher Scientific / HyClone, número de catálogo SH3087 .0 ), que está especialmente diseñado para permitir el crecimiento de células en alta densidad. El medio PerMab se completó con la adición del aminoácido glutamina (Ajinomoto) 3mM y del detergente ácido plurónico F-68 (Sigma, número de catálogo P1300) al 1 % y en ningún caso se añadió ningún tipo de suero al medio. Dicho medio PerMab complementado con glutamina y ácido plurónico también se denomina "medio completo" de aquí en adelante. El proceso de cultivo comenzó con la descongelación de un vial de células PER.C6® (Cruceil) y su cultivo en medio completo durante una semana en T-Flask 75 cm ² (Corning) en condiciones estáticas. A continuación las células fueron adaptadas a agitación para lo cual se cultivaron en Shake Flask 250 mi (Corning) a 75 rpm en un agitador orbital.

El cultivo fue sub-cultivado de forma general cada 3 ó 4 días sembrándose 0,5 x 10 ⁶ células viables/ml, excepto en los ensayos de producción en Batch en los que se sembraron inicialmente 1 x 10 ⁶ células viables/ml.

Transfección de la línea celular PER.C6® con el vector de secuencia SEQ ID NO 3 (vector v074).

Dos días antes de la transfección las células fueron pasadas mediante centrifugación para cambiar completamente el medio y se sembraron 0,7x10 ⁶ células viables/ml. Se transfectaron 5x10 ⁶ células viables PER.C6® procedentes de cultivo en Shake Flask, con 5 pg del vector de expresión v074, que codifica la cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal CRX01. El vector v074 fue transfectado en forma circular y lineal (digerido con el enzima de restricción Seal y purificado con QIAquick columns (QIAGEN)) obteniéndose dos pool estables de células expresando CRX01 que fueron denominadas pool estable PER.C6-CRX01 -circular y pool estable PER.C6-CRX01 -lineal, respectivamente. La transfección se realizó mediante electroporación utilizando el kit V nucleofector y el aparato de transfección AMAXA con el programa X001.

Una vez realizada la transfección, se determinó la densidad celular y se sembraron en T- Flask 0,5x10 ⁶ células/ml en medio PerMab libre de suero suplementado con 3mM glutamina y 1 % ácido plurónico F-68 (medio completo) sin geneticina. Además se realizó un control negativo de la transfección.

A las 48 horas desde la transfección el cultivo fue resembrado a una concentración de 0,5x10 ⁶ células viables/ml en T-Flask cambiando el medio completamente y suplementándolo con 3mM glutamina, 1 % ácido plurónico F-68 y 125 pg geneticina (G418, Invitrogen).

Desde este punto y durante dos semanas se sub-cultivó, sembrándose 0,3x10 ⁶ células viable/ml y renovando el medio PerMab suplementado con 3mM glutamina, 1 % ácido plurónico F-68 y 125 pg G418.

Los niveles de viabilidad cayeron hasta un 20% en ambas transfecciones. Cuando los parámetros de crecimiento y viabilidad comenzaron a mejorar, aproximadamente a partir del día 15, el cultivo ya se consideró como estable. Desde ese momento, el pool estable de células expresando el vector v074 fue sub-cultivado cada 3 ó 4 días mediante dilución en T- Flask sembrando 0,5x10 ⁶ células viables/ml y renovando el medio PerMab suplementado con 3mM glutamina, 1 % ácido plurónico F-68 y 125 pg G418. Generación de un Master Cell Bank (MCB) y un Working Cell Bank (WCB) del pool estable Per.C6-CRX01 -lineal y del pool estable Per.C6-CRX01 -circular

Cuando la viabilidad superó el 85% se generó un MCB de ambos pools estables en medio PerMab suplementado con 3 mM glutamina y 1 % ácido plurónico F-68. Este MCB fue generado en condiciones estáticas.

A continuación se descongeló una alícuota del MCB de ambos pools y se cultivó en condiciones estáticas durante la primera semana en medio PerMab suplementado con 3mM glutamina y 1 % de ácido plurónico, a partir de la cual las células fueron adaptadas a agitación a 75 rpm utilizando el mismo medio de cultivo suplementado con G418. Cuando los parámetros de viabilidad estuvieron por encima del 90% y los tiempos de duplicación estuvieron entre 30 y 40 horas se generó el WCB de ambos pools estables.

Selección de clones productores del anticuerpo CRX01

Para seleccionar clones súper-productores del anticuerpo CRX01 se realizó un proceso de dilución límite, que consistió en sembrar entre 0,5 y 1 células por pocilio en placas de 96 pocilios, a partir de aquí se llevaron a cabo dos screenings de cada uno de los pools estables, circular y lineal. Un primer screening en placas de 96 pocilios de donde se eligieron los 24 clones más productivos. Dichos clones fueron sometidos a un segundo screening en T-Flask de 25 cm ² , del cual se eligieron los 4 clones que más CRX01 produjeron, llamados PER.C6-CRX01 -Lin45, PER.C6-CRX01-Lin90, PER.C6-CRX01- Circ49, PER.C6-CRX01-Circ103.

Ejemplo 2.- Afucosilación y galactosilación del anticuerpo CRX01.

Se ha llevado a cabo un estudio comparativo del porcentaje de afucosilación y galactosilación de Herceptin y de CRX01 producidos en células PER.C6® siguiendo las instrucciones de la compañía distribuidora de las células PER.C6® (Percivia) y descritas en el ejemplo anterior. Para ello, se ha llevado a cabo un ensayo de liberación enzimática de los glicanos, seguido de mareaje fluorescente y análisis mediante UPLC (cromatografía líquida de alta eficacia). Los N-glicanos fueron liberados de las muestras de IgG mediante incubación overnight con N-glicosidasa F (Prozyme, Hayward, CA). Los glicanos liberados fueron recuperados en el sobrenadante seco tras la precipitación de la proteína con etanol al 75%. Los oligosacáridos fueron marcados con el fluoróforo 2-aminobenzamida (2AB, Prozyme) y analizados utilizando "Acquity UPLC® BEH glycan column" (Waters) siguiendo las instrucciones del fabricante. Con los datos obtenidos, se calcularon los porcentajes de afucosilación y galactosilación según las siguientes fórmulas: G0+G1+G2

% afucosilación : X 100

G0+G0F+G1+G1F+G2+G2F

GlF+(2 x G2F)

% galactosilación= _Λ „„ x 100

2 x(G0F+GlF+G2F)

GO, G1 y G2 se refieren a estructuras compleja, neutral, biantena con 0, 1 y 2 residuos terminales de galactosa, mientras que GOF, G1 F y G2F son las correspondientes estructuras fucosiladas. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1 , donde se observa que el porcentaje de afucosilación en CRX01 (obtenido de distintos clones PER.C6- CRX01 tanto lineales como circulares) es menor que el porcentaje de afucosilación en Herceptin. En concreto, el porcentaje de afucosilación en CRX01 es menor al 4%, mientras que el de Herceptin es del 5%. En cuanto al porcentaje de galactosilación, el mismo es superior en CRX01 que en Herceptin, siendo dicho porcentaje superior al 40% en CRX01 , mientras que en Herceptin no supera el 25%.

Tabla 1.- Porcentaje afucosilación y galactosilación de CRX01 y Herceptin.