本发明属于生物细胞技术领域，具体涉及一种 能用于从人表皮细胞分离得到 人表皮源性间充质干细胞样多能细胞的细胞培 养基和分离得到的人表皮源性间 充质干细胞样多能细胞及其制备方法。

背景技术：

干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎 干细胞由于材料来源困难、伦 理问题和异种（异体）免疫排斥反应等原因， 不容易被应用到临床。 成体干细胞 存在于成体各种组织中。 由于其材料来源广泛， 可实施自体细胞移植， 故在临床 疾病治疗中有着广泛的应用前景。目前国内外 分离成功的成体干细胞有间充质干 细胞、 表皮干细胞、 神经干细胞、 脂肪干细胞和胰岛干细胞等。 但目前报道的这 些成体干细胞要么生长速度缓慢， 要么扩增代数有限， 都不能在较短时间内 （三 个月）获得临床疾病治疗所需要的巨额细胞数 。这也是目前妨碍成体干细胞应用 到临床的瓶颈之一。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能用于从人表 皮细胞分离得到人表皮源性 间充质干细胞样多能细胞的细胞培养基，该细 胞培养基还可以用于人表皮源性间 充质干细胞样多能细胞的传代培养。

本发明的能用于从人表皮细胞分离得到人表皮 源性间充质干细胞样多能细 胞的细胞培养基为：在葡萄糖含量为 0.5〜5g/L的 DMEM培养基中添加胎牛血清、 hbFGF、 hSCF、 非必须氨基酸、 L-谷氨酰胺、 庆大霉素， 并使各种添加成分的终 浓度如下： 胎牛血清： 体积分数为 10〜25%、 l〜40ng hbFGF /mL、 0.1~20ng hSCF /mL、 0.1〜2 mL 100X非必须氨基酸 /100mL、 0.1〜2 mL含质量分数为 3% L-谷氨 酰胺的 PBS溶液 /lOOmL和 1000〜8000U庆大霉素 /100mL。

本发明的 DMEM培养基是公知的培养基， 葡萄糖、 胎牛血清、 hbFGF (人 碱性成纤细胞生长因子）、 hSCF (重组干细胞因子）、 100X的非必须氨基酸、 L- 谷氨酰胺、 PBS溶液以及庆大霉素都属于现有技术的产品， 要么能够根据现有技 术配置， 要么能够从试剂公司购买到。 本发明的能用于从人表皮细胞分离得到人表皮 源性间充质干细胞样多能细 胞的细胞培养基的配制方法是： 在 DMEM培养基中加入葡萄糖， 搅拌均匀， 使 其终浓度为 0.5〜5g/L， 形成一级基础培养基。然后在一级基础培养基 中添加胎牛 血清， hbFGF、 hSCF、 非必须氨基酸、 L-谷氨酰胺、 庆大霉素， 并使各种添加成 分的终浓度如下：胎牛血清： 体积分数为 10〜25%、 l〜40ng hbFGF /mL、 0.1〜20ng hSCF /mL、 0.1〜2 mL 100X非必须氨基酸 /100mL、 0.1〜2 mL含质量分数为 3% L- 谷氨酰胺的 PBS溶液 /lOOmL和 1000〜8000U庆大霉素 /lOOmL, 搅拌均匀后而制 得能用于从人表皮细胞分离得到人表皮源性间 充质干细胞样多能细胞的细胞培 养基。所述的含质量分数为 3% L-谷氨酰胺的 PBS溶液是在每 100 mL的 PBS溶 液中加入 3g的 L-谷氨酰胺。

本发明的第二个目的是提供一种利用本发明的 细胞培养基制备人表皮源性 间充质干细胞样多能细胞的方法及其制备出的 人表皮源性间充质干细胞样多能 细胞。

本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞 的制备方法，其特征在于， 包 括以下步骤：

a) 将人表皮细胞在上述细胞培养基中培养；

b) 然后用消化液消化， 祛除未消化下来的人表皮细胞， 收集消化下来的间 充质干细胞样细胞， 即为人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。

该人表皮源性间充质干细胞样多能细胞在体外 条件下进行传代培养，因此本 发明的第三个目的是提供本发明的人表皮源性 间充质干细胞样多能细胞的传代 培养方法，该方法为： 以本发明的细胞培养基作为传代培养基，于 36±1 °C、 5±1% C0 ₂ 、 90〜100%湿度下进行传代培养， 而获得人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞株。本发明的人表皮源性间充质干细胞样多 能细胞生长速度快， 隔 1〜4天就可 以 1 : 3的比例传代一次， 可在 3个月内传 30代以上， 且至少可以从每个临床废 弃的皮肤标本从约 3x l0 ⁴ 个细胞开始三个月内获得 2x l0 ¹⁶ 个新的成体干细胞。

所述的人表皮细胞的优选获取方法是： 取包皮或其他皮肤组织， 用 II型组织 酶消化获得表皮， 将表皮剪碎， 再用胰蛋白酶进一步消化， 获得表皮细胞。

所述的人表皮细胞在上述细胞培养基中培养， 优选培养条件为： 36±1 °C、 5±1% C0 ₂ 、 90〜100%湿度， 每隔 2-3天更换细胞培养基。 所述的 b)步骤优选为当细胞生长至 60〜90%融合度时，用质量分数为 0.25% 的胰蛋白酶与质量分数为 0.02%的 EDTA溶液按照体积比 1 : 1混合而形成的消 化液消化，祛除未消化下来的人表皮细胞，收 集消化下来的间充质干细胞样细胞， 即为人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。

将本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞 （见图 1、 2) 用常规的方 法制备染色体涂片，进行核型检查：核型为正 常男性 46条染色体，带型正常（见 图 3、 4)。

使用流式细胞术和免疫组化技术检测本发明的 人表皮源性间充质干细胞样 多能细胞株的表面标志（检测方法是公知技术 ， 商业试剂公司可提供试剂盒， 按 照试剂公司提供的技术方案实施即可）， 其表达间充质干细胞和神经前体细胞的 特异性标志： CD73 (93.5〜99.8%)、 CD90 (63.4〜99.7%)、 CD 105 (20.3〜92.8%)、 Vimentin (51.3〜96.7%) 和 Nestin (74.2〜98.4%)， 如图 5所示， 阳性的细胞呈 棕色或棕黑色； 不表达或低表达终末神经细胞、表皮细胞、血 液细胞和血管内皮 细胞标志： β-IIItubulin (0〜18.7%)、 MAP-2 (0〜3.2%)、 GFAP (0〜7.2%)、 CK19 ( 0〜1.0%)、 CD34 ( 0〜1.3%)、 CD45 ( 0〜0.5%)、 CD3 ( 0〜1.1%)、 CD19 (0〜0.5%)、 CD16 (0〜0.7%)、 CD4 (0〜0.5%)、 CD8 (0〜0.7%)、 CD31 (0〜 5.8%)、 VEGF-R2 (0〜5.5%) 和 CD10 ( 0.2〜18.2%)。

用无血清神经干细胞培养基 （购自 GIBCO公司） 培养本发明的人表皮源性 间充质干细胞样多能细胞株 6天，再改用添加胎牛血清至终体积分数为 10%的神 经干细胞培养基 （购自 GIBCO公司） 培养 7天， 镜检发现， 细胞已形成神经细 胞样的细长突起 （见图 6)。 激光共聚焦显微镜观察技术检测细胞表面标志 （检 测方法是公知技术， 商业试剂公司可提供试剂盒， 按照试剂公司提供的技术方案 实施即可）， 发现其表达神经细胞特异性标志： ΜΑΡ-2、 β-ΙΙΙ tubulin, 阳性的细 胞呈红色荧光 （见图 7， 蓝色为细胞核 Hochest染色， 红色为标记红色荧光单抗 染色， 由于图 7是黑白图， 蓝色的细胞核呈椭圆状， 而红色荧光呈点状）。 由此 可见本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能 细胞株能分化为神经样细胞。

用免疫细胞培养基 （购自 GIBCO公司） 培养本发明的人表皮源性间充质干 细胞样多能细胞株， 7天后， 镜检形态观察发现， 细胞形成了分泌泡， 细胞内外 存在多量的折光性强的圆形小泡 （见图 8)。 用流式细胞术检测其表达免疫细胞 特异性标志的量增加， 如 CD19 ( 1.7〜11.3%)、 CD16 ( 1.3〜5.4%)、 CD4 (7.3〜 14.5%)、 CD8 (4.2〜8.1%)。 由此可见本发明的人表皮源性间充质干细胞样 多能 细胞株能分化成免疫细胞样细胞。

以每个胚胎 4〜8个本发明的人表皮源性间充质干细胞样多� ��细胞的量注射 入小鼠囊胚腔内制作嵌合体小鼠（常规制作方 法）， 经 PCR技术、人 Y染色体原 位杂交技术以及抗人单抗免疫荧光激光共聚焦 显微镜观察技术检测发现（检测方 法是公知技术， 商业试剂公司可提供试剂盒， 按照试剂公司提供的技术方案实施 即可），在嵌合体小鼠血液中存在人 Y染色体以及人 CD19等蛋白。如图 9 (PCR 电泳图）所示 PCR技术检测到在 10号和 11号嵌合体小鼠（约 5.5月龄）血液中 存在人 Y染色体标志性基因 SRY基因 （10和 11泳道）； 如图 10 (人 Y染色体 原位杂交技术以及抗人单抗免疫荧光激光共聚 焦显微镜观察技术检测图） 所示 10号嵌合体小鼠 （约 5.5月龄） 血液中存在的人 Y染色体 （图 10A和 D中的红 色点， 即图 10A中箭头所指的部分） 和人标志性蛋白 CD19 (图 10B和 D中的 绿色荧光点）。 由此可见本发明的人表皮源性间充质干细胞样 多能细胞在 5个月 内可以在嵌合体小鼠体内存活、迁移和分化。 流式细胞术和免疫缺陷小鼠体内移 植实验检测 （常规方法） 发现： HLA-DR (0〜1.3%) 低表达或不表达和 HLA-I (0.1〜61.1%) 低表达或中度表达； 以每只鼠约 lxlO ⁷ 个将细胞经腹腔注射和皮 下注射入 SCID小鼠体内 3个月后无发现肿瘤产生。 由此表明本发明的人表皮源 性间充质干细胞样多能细胞生物安全性良好。

综上所述，本发明的人表皮源性间充质干细胞 样多能细胞具有间充质干细胞 样的表形、核型正常， 能够表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异 性标志， 不 表达或低表达终末神经细胞、表皮细胞、血液 细胞和血管内皮细胞的特异性标志， 能够分化为神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞 ， 生物安全性良好。

利用本发明提供的细胞培养基， 按照本发明的分离方法， 可从人表皮细胞中 分离得到人表皮源性间充质干细胞样多能细胞 ，该人表皮源性间充质干细胞样多 能细胞生物安全性良好， 能够分化为神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞 ， 具有在 神经系统损伤修复、免疫系统疾病治疗和异种 器官构建的应用潜能。本发明的人 表皮源性间充质干细胞样多能细胞生长速度快 ， 在本发明的体外传代培养条件 下， 可在短时间内 （三个月内） 至少可以传代 30代， 每个临床废弃的皮肤标本 从约 3x l0 ⁴ 个细胞开始最终至少可以获得 2χ 10 ^1δ 个细胞，足以满足临床疾病治疗 和构建组织工程化器官所需。

附图说明：

图 1和图 2是人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株的� �通光学形态图，类似间 充质干细胞的表形；

图 3和图 4 是本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞株的染色体涂片的 带型图；

图 5 是应用流式细胞术和免疫组化技术检测本发明 的人表皮源性间充质干细胞 样多能细胞表达间充质干细胞和神经前体细胞 的特异性标志图； 图 6 是显微镜下观察本发明的人表皮源性间充质干 细胞样多能细胞分化为神经 细胞样细胞图；

图 Ί 是激光共聚焦显微镜观察技术检测细胞表达神 经细胞特异性标志 ΜΑΡ-2、 β-IIItubulin的图； 图 7Α是细胞核 Hochest染色 （蓝色）， 图 7B是细胞体 红色荧光标记单抗染色、 图 7C是图 7A和图 7B的重叠图。

图 8 是显微镜下观察本发明的人表皮源性间充质干 细胞样多能细胞分化为免疫 细胞样细胞的图；

图 9 是对嵌合体小鼠的血液经 PCR技术检测的电泳图， 其中 M: Marker, H20: 水、 N: 正常鼠外周血 （阴性对照）、 6： 6号嵌合体小鼠外周血、 7: 7号嵌 合体小鼠外周血、 8: 8号嵌合体小鼠外周血、 9: 9号嵌合体小鼠外周血、 10： 10号嵌合体小鼠外周血、 11 : 11号嵌合体小鼠外周血、 P: 人表皮源性 间充质干细胞样多能细胞 （阳性对照）；

图 10 是应用 Y染色体原位杂交技术以及抗人单抗免疫荧光� �聚焦显微镜观察技 术检测嵌合体小鼠血液的图； 图 10 A是人 Y染色体原位杂交图 （红色点 代表人 Y染色体）、 图 10B是绿色荧光标记的人 CD19单抗共聚焦显微镜 观察图（绿色代表人 CD19蛋白）、 图 10C是细胞核 Hochest染色（蓝色）、 图 10D是图 10 A、 图 10B和图 10C的重叠图。 经重叠后可见人 Y染色体 位于细胞核内， 人 CD19蛋白位于细胞体上。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 实施例 1

1. 配制细胞培养基：

在葡萄糖含量为 0.5g/L的 DMEM培养基中添加胎牛血清、 hbFGF、 hSCF、 非必须氨基酸、 L-谷氨酰胺、 庆大霉素， 并使上述各种添加成分的终浓度如下： 胎牛血清： 体积分数为 10%、 40ng hbFGF /mL O. lng hSCF /mL、 l mL lOOX非 必须氨基酸 /100mL、 2 mL含质量分数为 3% L-谷氨酰胺的 PBS溶液 /lOOmL和 1000U庆大霉素 /100mL。由此而形成本实施例的细胞培养基。所 述的 100 X的非 必须氨基酸购自购自 GIBCO公司， 其货号为 11140。

2. 获取表皮组织和表皮细胞：

取临床废弃的包皮组织， 浸泡在含 1000U庆大霉素 /mL的 PBS溶液中， 4°C 保存； 4小时内进行如下处理： 用 PBS充分洗涤， 祛除血细胞， 剪去皮下疏松结 缔组织， 用 Π型组织酶 （2U/mL) 浸泡消化过夜， 获得表皮， 然后将表皮剪碎， 用质量分数为 0.25%的胰蛋白酶进一步消化 30分钟， 获得表皮细胞， 用 PBS洗 涤， 然后离心祛除消化酶， 用本实施例的细胞培养基重新悬浮细胞。

3. 培养表皮细胞：

将每个标本获得的表皮细胞接种于含有本实施 例的细胞培养基的 T25 培养 瓶 3〜4个中， 于 36±1 °C、 5±1%C0 ₂ 、 90〜100%湿度培养箱内进行培养， 隔 2〜 3天更换细胞培养基。

4. 筛选和富集人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞：

当细胞生长至 60〜90 %的融合度时，用质量分数为 0.25%的胰蛋白酶加质量 分数为 0.02%的 EDTA (按体积比 1 : 1混合） 组成的消化液进行分段消化； 收集 消化下来的间充质干细胞样细胞， 祛除未消化下来的表皮细胞； 将收集到的间充 质干细胞样细胞置于离心管内， 1000〜1500rpm、 5min离心祛除消化液； 然后用 本实施例的细胞培养基重新悬浮细胞，该细胞 即为本发明的人表皮源性间充质干 细胞样多能细胞， 将该细胞进行计数。

5. 体外培养人表皮源性间充质干细胞样多能细胞 株：

将计数好的人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞以约 l x lO ⁵ 个 /mL的密度接 种于含有本实施例的细胞培养基的 T25培养瓶中， 于 36±1 °C、 5±1%C0 ₂ 、 90〜 100%湿度培养箱内进行培养， 隔 1〜4天， 以 1 : 3比例传代一次， 直至 30代以 上， 而获得人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株 。每个临床废弃的皮肤标本获 得的细胞三个月内至少传代 30代以上， 从约 3x l0 ⁴ 个细胞最终至少获得 2χ 10 ^1δ 个新的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。

对本实施例的人表皮源性间充质干细胞样多能 细胞株进行检测发现，该细胞 株具有间充质干细胞样的表形，核型正常， 表达间充质干细胞和神经前体细胞的 特异性标志： CD73、 CD90、 CD105、 Vimentin和 Nestin; 不表达或低表达终末 神经细胞、 表皮细胞、 血液细胞和血管内皮细胞标志： β-ΠΙ tubulin MAP-2、 GFAP、 CK19、 CD34、 CD45、 CD3、 CD19、 CD16、 CD4、 CD8、 CD31、 VEGF-R2 和 CD10; 能分化为神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞； HLA-DR低表达或不表 达和 HLA-I低表达或中度表达。以每只鼠约 l x lO ⁷ 个将细胞经腹腔注射和皮下注 射入 SCID小鼠体内 3个月后没有发现肿瘤产生。 由此表明本发明人表皮源性间 充质干细胞样多能细胞株生物安全性良好。 实施例 2

1. 配制细胞培养基：

在葡萄糖含量为 5g/L的 DMEM培养基中添加胎牛血清、 hbFGF、 hSCF、非 必须氨基酸、 L-谷氨酰胺、 庆大霉素， 并使上述各种添加成分的终浓度如下： 胎 牛血清： 体积分数为 25%、 lng hbFGF /mL 20ng hSCF /mL、 2 mL 100X非必须 氨基酸 /100mL、 0.1 mL含质量分数为 3% L-谷氨酰胺的 PBS 溶液 /lOOmL 和 8000U庆大霉素 /100mL。由此而形成本实施例的细胞培养基。所 述的 100 X的非 必须氨基酸购自购自 GIBCO公司， 其货号为 11140。

2. 获取表皮组织和表皮细胞：

取临床废弃的包皮组织， 浸泡在含 1000U庆大霉素 /mL的 PBS溶液中， 4°C 保存； 4小时内进行如下处理： 用 PBS充分洗涤， 祛除血细胞， 剪去皮下疏松结 缔组织， 用 II型组织酶 （2U/mL) 浸泡消化过夜， 获得表皮， 然后将表皮剪碎， 用质量分数为 0.25%的胰蛋白酶进一步消化 30分钟， 获得表皮细胞， 用 PBS洗 涤， 然后离心祛除消化酶， 用本实施例的细胞培养基重新悬浮细胞。

3. 培养表皮细胞：

将每个标本获得的表皮细胞接种于含有本实施 例的细胞培养基的 T25 培养 瓶 3〜4个中， 于 36±1 °C、 5±1% C0 ₂ 、 90〜100%湿度培养箱内进行培养， 隔 2〜

3天更换细胞培养基。

4. 筛选和富集人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞：

当细胞生长至 60〜90%的融合度时，用质量分数为 0.25%的胰蛋白酶加质量 分数为 0.02%的 EDTA (按体积比 1 :1混合） 组成的消化液进行分段消化； 收集 消化下来的间充质干细胞样细胞， 祛除未消化下来的人表皮细胞； 将收集到的间 充质干细胞样细胞置于离心管内， 1000〜1500rpm、 5min离心祛除消化液； 然后 用本实施例的细胞培养基重新悬浮细胞，该细 胞即为本发明的人表皮源性间充质 干细胞样多能细胞， 将该细胞进行计数。

5. 体外培养人表皮源性间充质干细胞样多能细胞 株：

将计数好的人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞以约 lxlO ⁵ 个 /mL的密度接 种于含有本实施例的细胞培养基的 T25培养瓶中， 于 36±1 °C、 5±1%C0 ₂ 、 90〜 100%湿度培养箱内进行培养， 隔 1〜4天， 以 1 : 3比例传代一次， 直至 30代以 上， 而获得人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株 。每个临床废弃的皮肤标本获 得的细胞三个月内至少传代 30代以上， 从约 3xl0 ⁴ 个细胞最终至少获得 2xl0 ¹⁶ 个新的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。

对本实施例的人表皮源性间充质干细胞样多能 细胞株进行检测发现，该细胞 株具有间充质干细胞样的表形，核型正常， 表达间充质干细胞和神经前体细胞的 特异性标志： CD73、 CD90、 CD105、 Vimentin和 Nestin; 不表达或低表达终末 神经细胞、 表皮细胞、 血液细胞和血管内皮细胞标志： β-ΠΙ tubulin MAP-2、 GFAP、 CK19、 CD34、 CD45、 CD3、 CD19、 CD16、 CD4、 CD8、 CD31、 VEGF-R2 和 CD10， 能分化神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞。 HLA-DR低表达或不表达 和 HLA-I低表达或中度表达，以每只鼠约 lxlO ⁷ 个将细胞经腹腔注射和皮下注射 入 SCID小鼠体内 3个月后没有发现肿瘤产生， 由此表明本发明人表皮源性间充 质干细胞样多能细胞生物安全性良好。 实施例 3

1. 配制细胞培养基：

在葡萄糖含量为 2.5g/L的 DMEM培养基中添加胎牛血清、 hbFGF、 hSCF、 非必须氨基酸、 L-谷氨酰胺、 庆大霉素， 并使上述各种添加成分的终浓度如下： 胎牛血清： 体积分数为 18%、 20ng hbFGF /mL、 10ng hSCF /mL O. l mL lOOX非 必须氨基酸 /100mL、 1 mL含质量分数为 3% L-谷氨酰胺的 PBS溶液 /lOOmL和 4000U庆大霉素 /100mL。由此而形成本实施例的细胞培养基。所 述的 100 X的非 必须氨基酸购自购自 GIBCO公司， 其货号为 11140。

2. 获取表皮组织和表皮细胞：

取临床废弃的人包皮组织，浸泡在含 1000U庆大霉素 /mL的 PBS溶液中， 4°C 保存； 4小时内进行如下处理： 用 PBS充分洗涤， 祛除血细胞， 剪去皮下疏松结 缔组织， 用 Π型组织酶 （2U/mL) 浸泡消化过夜， 获得表皮， 然后将表皮剪碎， 用为质量分数为 0.25%胰蛋白酶进一步消化 30分钟， 获得表皮细胞， 用 PBS洗 涤， 然后离心祛除消化酶， 用本实施例的细胞培养基重新悬浮细胞。

3. 培养表皮细胞：

将每个标本获得的表皮细胞接种于含有本实施 例的细胞培养基的 T25 培养 瓶 3〜4个中， 于 36±1 °C、 5±1% C0 ₂ 、 90〜100%湿度培养箱内进行培养， 隔 2〜 3天更换细胞培养基。

4. 筛选和富集人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞：

当细胞生长至 60〜90 %的融合度时，用质量分数为 0.25%的胰蛋白酶加质量 分数为 0.02%的 EDTA (按体积比 1 : 1混合） 组成的消化液进行分段消化； 收集 消化下来的间充质干细胞样细胞， 祛除未消化下来的表皮细胞； 将收集到的间充 质干细胞样细胞置于离心管内， 1000〜1500rpm、 5min离心祛除消化液； 然后用 本实施例的细胞培养基重新悬浮细胞，该细胞 即为本发明的人表皮源性间充质干 细胞样多能细胞， 将该细胞进行计数。

5. 体外培养人表皮源性间充质干细胞样多能细胞 株：

将计数好的人表皮源性间充质干细胞样多能细 胞以约 l x lO ⁵ 个 /mL的密度接 种于含有本实施例的细胞培养基的 T25培养瓶中， 于 36±1 °C、 5±1%C0 ₂ 、 90〜 100%湿度培养箱内进行培养， 隔 1〜4天， 以 1 : 3的比例传代一次， 直至 30代 以上， 而获得人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株 。每个临床废弃的皮肤标本 获得的细胞三个月内至少传代 30代以上，从约 3x l0 ⁴ 个细胞最终至少获得 2χ 10 ^1δ 个新的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。 对本实施例的人表皮源性间充质干细胞样多能 细胞株进行检测发现，该细胞株具 有间充质干细胞样的表形，核型正常， 表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异 性标志： CD73、 CD90、 CD105、 Vimentin和 Nestin; 不表达或低表达终末神经 细胞、 表皮细胞、 血液细胞和血管内皮细胞标志： P-mtubulin、 MAP-2、 GFAP、 CK19、 CD34、 CD45、 CD3、 CD19、 CD16、 CD4、 CD8、 CD31、 VEGF-R2 和 CD10, 能分化为神经细胞样细胞和免疫细胞样细胞。 HLA-DR低表达或不表达 和 HLA-I低表达或中度表达，以每只鼠约 lxlO ⁷ 个将细胞经腹腔注射和皮下注射 入 SCID小鼠体内 3个月后没有发现肿瘤产生， 由此表明本发明人表皮源性间充 质干细胞样多能细胞生物安全性良好。