Dans la présente description, les termes acétylcholinestérase et AChE seront indifféremment employés pour désigner cette enzyme.

Depuis leur apparition il y a 20 ans, les techniques immunoenzymatiques occupent une place prépondérante dans le domaine du dosage in vitro de nombreuses substances biologiques. L'utilisation d'un support solide favorisant l'immobilisation de l'un des immunoréactifs a révolutionné la reconnaissance fine d'un élément parfois peu représenté dans un échantillon biologique (Engvall et al., 1971 ; VanWeeman et al., 1971 ; Avraméas et al., 1971). Ces techniques sont aujourd'hui très largement mises en oeuvre dans de nombreux secteurs industriels tels que notamment l'analyse des effluents industriels ou domestiques, l'analyse de la qualité de l'eau potable, de la qualité des produits agro-alimentaires et également en biologie clinique humaine ou vétérinaire dans des domaines aussi divers que l'hormonologie, les maladies auto- immunes, les marqueurs tumoraux ou les maladies infectieuses.

Le dosage d'analytes dans un échantillon à tester se fait principalement au moyen de traceurs enzymatiques constitués d'un antigène, un haptène ou tout ou partie d'un anticorps lié, de façon covalente, à une enzyme dont l'activité catalytique est détectable.

Afin de permettre un développement de tests fiables et reproductibles, une enzyme appropriée doit satisfaire les critères suivants : -son activité spécifique doit être élevée pour des faibles concentrations de substrat et sa constante catalytique doit être également élevée ; -les produits résultant de l'activité catalytique de l'enzyme doivent pouvoir être détectés par spectro-photométrie ; -cette enzyme doit avoir une bonne stabilité, quelle que soit la nature du milieu constituant l'échantillon à tester et doit ainsi rester biologiquement active dans une large gamme de conditions de pH, de force ionique et/ou de température ; -1'enzyme doit pouvoir être obtenue facilement, en grande quantité et à un coût réduit ; -le cas échéant, 1'enzyme doit contenir des groupes réactifs libres par lesquels elle pourra être liée de manière covalente à d'autres protéines (haptènes, protéines) ; -elle doit être stable durant une conservation de longue durée ; -1'enzyme ne doit pas interagir de façon non spécifique avec une phase solide ou avec d'autres protéines ; -les substrats utilisés pour la détection colorimétrique doivent être stables, peu coûteux et les produits de réaction doivent pouvoir être détectés dans une large gamme de concentration.

Aujourd'hui, quatre enzymes sont couramment utilisées comme constituants de traceurs enzymatiques : 1) La péroxydase de raifort est 1'enzyme la plus utilisée, du fait de ses caractéristiques avantageuses de cinétique enzymatique rapide et de ses limites de détection comprises entre 10''4 et 10'"M. Cependant, cette enzyme est peu stable et son activité enzymatique est rapidement inhibée par les produits de réaction, ce qui limite le temps d'incubation de 1'enzyme avec son substrat. Elle est aussi très sensible aux métaux et est facilement inactivée par certains milieux comme l'urine. Enfin, il peut y avoir une interférence avec des péroxydases présentes dans l'échantillon à doser.

2) La phosphatase alcaline possède une activité spécifique élevée et le substrat colorimétrique le plus souvent utilisé (le p-nitrophénylphosphate) est stable et la

réaction colorée se développe lentement. Cependant, la phosphatase alcaline est une enzyme codteuse. Par ailleurs, l'existence de phosphatases endogènes dans l'échantillon peut donner lieu à des réactions faussement positives.

3) La beta-galactosidase est une enzyme tétramérique stable mais de poids moléculaire élevé (465 kDa) et peu utilisée dans des tests immunoenzymatiques.

4) L'acétylcholinestérase (AChE) de gymnote (Electrophorus electricus) est une enzyme tétramérique soluble de haut poids moléculaire (240 kDa) possédant une constante catalytique plus élevée que les trois enzymes précédemment décrites et ayant un seuil de détection très faible de l'ordre de 10 l8 M. Parmi les substrats utilisés, contenant des groupes SH libres, on préfère généralement l'acétyl- thiocholine en présence d'acide 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoique). Ce substrat permet le développement d'une réaction colorée dont le signal augmente de façon linéaire pendant plusieurs heures, sans nécessiter un arrêt de la réaction.

L'acétylcholinestérase de gymnote a été utilisée dans le développement de tests de type ELISA pour la détection et la quantification de substances variées en phase homogène ou hétérogène (Grassi et al., 1989 ; Pradelles et al., 1989 ; Creminon et al. 1993 ; Volland et al., 1994 ; Grassi et al., 1996, Brevet européen n° 0 139 552 au nom du Commissariat à l'Energie Atomique, France).

Des tests mettant en oeuvre l'AChE peuvent ainsi être adaptés à la concentration de la substance à rechercher dans un échantillon, sans nécessiter la répétition du test, simplement en déterminant les temps de réaction pour lesquels une lecture colorimétrique sera effectuée. De fortes concentrations de la substance recherchée seront détectées rapidement après quelques minutes de réaction enzymatique, alors que de faibles concentrations de cette substance pourront être détectées pour des temps d'incubation plus longs pouvant aller jusqu'à 24 h ou 48 h.

Bien que représentant une enzyme réunissant de nombreuses caractéristiques de 1'enzyme idéale décrite ci-avant, l'AChE de gymnote présente des inconvénients qui n'ont jamais été surmontés jusqu'à présent.

Tout d'abord, 1'AChE de gymnote est obtenue par purification protéique à partir de l'organisme naturel, ce qui représente une méthode longue et coûteuse et qui, de surcroît, ne peut garantir la production d'une protéine qui serait purifiée à

homogénéité et qui serait, en outre, dépourvue de produits contaminants non apparentés susceptibles de gêner l'activité enzymatique ou d'interférer avec le test de détection dans lequel elle est mise en oeuvre. En particulier, les techniques de purification de l'AChE nécessitent l'utilisation de détergents, tels que le Triton X-100 ou le Brj-96, ou encore de protéases, ce qui conduit il des préparations contenant une partie de la protéine solubilisée ayant une conformation altérée ou étant partiellement protéolysée.

En second lieu, il est difficile d'obtenir une enzyme monomérique et enzymatiquement active à partir de l'AChE de gymnote, qui est naturellement tétramérique.

De plus, la structure de l'AChE de gymnote, ainsi que la plupart des autres AChE multimériques décrites jusqu'à présent, contient un segment « T » du coté C- terminal. La structure du peptide « T » est bien conservée parmi les AChE, sa longueur est de 40 acides aminés, avec une succession d'acides aminés aromatiques.

La nature de la séquence peptidique « T *, l'espacement des acides aminés aromatiques ainsi que le fait que les acides aminés aromatiques se superposent sur un côté de 1'hélice, indiquent une organisation structurale sous forme d'une hélice alpha amphiphile, pouvant être associée avec des protéines structurales dépourvues d'activité enzymatique, ce qui rend ces protéines, peu ou pas du tout solubles en solution.

De plus, l'AChE de gymnote, ainsi que la plupart des autres formes moléculaires de l'AChE, exceptée l'AChE de venin de serpent, est associée aux membranes biologiques et à d'autres structures cellulaires ou péri-cellulaires (par exemple, membranes basales) de sorte qu'un traitement à haute force ionique ou en présence de détergent est nécessaire pour solubiliser cette enzyme.

En outre, la présentation de l'AChE de gymnote sous forme tétramérique, et en conséquence le haut poids moléculaire de cette protéine (240 kDa), conduit à l'obtention de conjugués utilisables en diagnostic d'un poids moléculaire d'au moins 300 kDa, possédant un faible coefficient de diffusion dans l'échantillon à tester et donc une cinétique de réaction assez lente.

Afin de remédier aux inconvénients des enzymes constitutives des traceurs enzymatiques de l'art antérieur, les inventeurs ont cherché à réaliser des traceurs

enzymatiques incorporant une forme d'acétylcholinestérase, catalytiquement active, dont l'activité catalytique est du même ordre de grandeur que celle de l'acétylcholinestérase de gymnote précédemment decrite, qui est présentée sous une forme de monomère soluble en solution, de manière à favoriser l'obtention d'une cinétique de réaction élevée.

Plus particulièrement, les inventeurs se sont attachés à mettre au point un traceur enzymatique réunissant à la fois des caractéristiques d'activité spécifique et de constante catalytique élevées, qui soit stable longtemps, qui puisse être obtenu facilement, en grande quantité et A un coût réduit, qui soit capable de modifier des substrats stables, peu coûteux et dont les produits de la réaction enzymatique sont détectés dans une large gamme de concentration.

Pour atteindre ce but, les inventeurs ont construit un polypeptide de fusion entre une acétylcholinestérase monomérique, dépourvue de peptide « T », et un récepteur protéique ayant une affinité pour une molécule ligand à rechercher dans un échantillon, de faible poids moléculaire ayant une constante et une cinétique catalytique élevées, et qui peut être purifié en une seule étape sur une colonne de chromatographie d'affinité.

Par acétylcholinestérase monomérique aux fins de la présente invention, on entend un polypeptide purifié présentant l'activité catalytique d'hydrolyse de l'acétylcholine caractéristique de ces enzymes regroupées, selon la nomenclature internationale, dans le groupe EC 3.1. 1. 7, dont l'activité catalytique est observée lorsque 1'enzyme libre est sous la forme d'un monomère.

Répond notamment à la définition ci-dessus un polypeptide purifié, soluble en solution saline, représentant l'une des sous-unités catalytiques d'une acétyl- cholinestérase multimérique dépourvue du peptide « T ».

De préférence, une acétylcholinestérase répondant aux buts de la présente invention est une acétylcholinestérase qui, lorsqu'elle est produite naturellement, se présente sous une forme monomérique et soluble. Entre dans cette catégorie, les acétylcholinestérases retrouvées dans les venins de serpent.

Avantageusement, une acétylcholinestérase constitutive d'un polypeptide de fusion selon l'invention est codée par un polynucléotide hybridant, dans des conditions

d'hybridation stringentes, avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 3 selon l'invention.

De manière tout à fait préférée, une telle acétylcholinestcrase monomérique est définie de telle sorte que le polynucldotidc codant celle-ci hybride, dans des conditions d'hybridation fortement stringentes, avec au moins l'un quelconque des :oligonucléotidessuivants a) un oligonucléotide codant pour un peptide choisi parmi les peptides de séquences SEQ ID n° 8, SEQ ID N° 9 et SEQ ID N° 10 ; les peptides de séquences SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 9 et SEQ ID N° 10 étant compris dans le polypeptide de séquence SEQ ID N° 1 constitutif d'un polypeptide de fusion selon l'invention ; b) un oligonucléotide comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°lletSEQIDN°12 ; c) un oligonucléotide comprenant la séquence SEQ ID N°13 ; dans lesquelles séquences SEQ ID N° 11, SEQ N° 12 et SEQ ? 13, tes symboles utilisés D, H, N, R, S, W et Y sont ceux recommandés par la commission de la nomenclature Biochimique IUPAC-IUB ; et d) un oligonucléotide particulier, répondant à la définition selon a), b) ou c) ci- dessus, comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 et SEQ ID N° 7 ; les oligonucléotides de séquences SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6 et SEQ ID N° 7 étant compris dans le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 3 codant pour l'acétylcholinestérase monomérique retrouvée dans le venin du serpent Bungarus fasciatus.

Les conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention sont définies à partir du calcul de la température Tm (ou température de fusion), qui représente la température à laquelle les deux brins d'un homoduplex ADN/ADN ou un hétéroduplex ADN/ARN se trouve à 50 % sous forme dissociée ou dénaturée.

Avantageusement, les pouruneacétylcholinestérasecodant monomérique constitutive d'un polypeptide de fusion selon l'invention hybrident avec

l'une quelconque des séquences SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12 et SEQ ID N° 13 dans un intervalle de température allant de (Tm-15°C) A (Tm-20°C).

A titre illustratif, les conditions de stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.

L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100, ug/ml d'ADN de sperme de saumon.

1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05 M citrate de Na et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine.

Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être les suivantes : -deux lavages de 5 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1 % SDS ; -un lavage de 30 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1 % SDS ; -un lavage de 10 min, préférentiellement à 65°C, dans un tampon de 1 x SSC et 0,1 % SDS.

L'AChE monomérique sélectionnée par les inventeurs en tant que mode de réalisation particulier du polypeptide de fusion selon l'invention est originaire du venin du serpent Bungarus fasciatus et a récemment été caractérisée (Cousin et al., 1996a ; Frobert et al., 1997). Il s'agit d'une protéine soluble monomère, à la différence des AChE précédemment décrites qui sont des homodimères liés aux membranes via des glycolipides, ou encore des structures oligomériques reliées par des ponts disulfures, et comprenant des homo-oligomères (dimères et tétramères) et des hétéro-oligomères liés au collagène ou à des sous-unités hydrophobes (Massoulié et al., 1993).

La constante catalytique de l'AChE de B. fasciatus est de 7 000/s (7 000 molécules de substrat hydrolysées par une molécule d'enzyme en une seconde). Cette constante catalytique est deux fois plus faible que celle de l'AChE tétramérique du

gymnote, mais supérieure à celle de la péroxydase de raifort (1 000/s) ou encore celle de la phosphatase alcaline (2 000/s) et de la beta-galactosidase (250-500/s) (Vigny et al., 1978 ; Grassi et al., 1987).

L'une des difficultds attendues de mise en oeuvre d'une AChE monomérique pour la réalisation d'un traceur enzymatique est inhérente au fait qu'il s'agit d'une protéine de petite taille, d'un poids moléculaire de 72 kDa. Le couplage d'une AChE monomérique de ce type avec un récepteur protéique spécifique de la molécule ligand à rechercher dans un échantillon est fortement susceptible d'affecter la conformation dans 1'espace de l'enzyme et ainsi de réduire significativement, voire abolir son activité catalytique.

De manière surprenante, les inventeurs ont découvert qu'un polypeptide de fusion entre une AChE monomérique et un récepteur protéique conserve l'activité catalytique de l'AChE à un niveau comparable à celui de 1'enzyme libre.

Cette découverte a permis aux inventeurs de réaliser un traceur enzymatique comprenant un premier polypeptide constitué d'une acétylcholinestérase monomérique, ou d'un variant biologiquement actif de cette dernière, et un second polypeptide constitué d'un récepteur protéique reconnaissant spécifiquement une molécule ligand à rechercher dans un échantillon.

Par variant biologiquement actif d'une acétylcholinestérase monomérique selon la présente invention, on entend un polypeptide présentant, par rapport au polypeptide initial, une ou plusieurs additions, substitutions et/ou dételions d'acides aminés, étant entendu que le variant biologiquement actif doit, d'une part, conserver qualitativement l'activité catalytique caractérisant les acétylcholinestérases et, d'autre part, posséder un niveau d'activité catalytique au moins du même ordre que 1'enzyme libre native, c'est-à-dire d'au moins la moitié du niveau d'activité catalytique de 1'enzyme native.

L'activité catalytique d'un variant biologiquement actif d'une acétylcholinestérase, tel que défini ci-dessus, peut être aisément quantifiée, par exemple en mettant en oeuvre la technique décrite à l'Exemple 3 de la présente description.

Une délétion de 15 acides aminés du côté C-terminal de la séquence peptidique de l'acétylcholinestérase du venin de Bungarus fasciatus peut par exemple être pratiquée sans affecter aucunement l'activité catalytique du polypeptide résultant. Un

tel peptide tronqué est, par exemple, représenté par le polypeptide de séquence SEQ ID N° 1, constitutif d'un polypeptide de fusion selon l'invention.

Ainsi, une délétion sera préférentieltement pratiquée du côté C-terminal de la région du polypeptide de fusion correspondant à l'acCtylcholinestérase, la taille de cette délétion étant avantageusement de 1 à 20 acides aminés. Cela n'exclut pas qu'une délétion puisse également être localisée dans un ou plusieurs autres segments de cette région du polypeptide de fusion.

Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés-consécutifs ou non consécutifs-sont remplacés par des acides aminés « équivalents ». L'expression acide aminé « équivalent » vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les propriétés catalytiques des peptides correspondants.

Ces aminoacides équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les aminoacides auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité acétylcholinestérase.

A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie de l'activité acétylcholinestérase des peptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de 1'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions.

Ainsi, un acide aminé appartenant à une classe particulière d'acides aminés pourra être remplacé par un acide aminé différent appartenant à la même classe, comme illustré dans le Tableau 1 ci-après.

Tableau 1 : Les différentes classes d'acides aminés Classe d'acide aminé Exemples d'acides aminés Non polaire A, V, L, I, P, G, F, W Polaire non chargé M, S, T, C, Y, N, Q Acide D, E Basique K, R, H Par « récepteur protéique » au sens de la présente invention, on entend un polypeptide d'origine naturelle, obtenu par synthèse chimique ou par recombinaison génétique et ayant une affinité pour un ligand, de telle manière que ce polypeptide se lie spécifiquement, au moins par des liaisons dites « faibles » (liaisons électrostatiques, liaisons hydrogènes, forces de Van der Waals, forces électrostatiques ou encore liaisons hydrophobes), à la molécule dite molécule ligand du récepteur considéré. Par affinité, on entend la valeur de la constante d'association intrinsèque, K, dont la formule de calcul est la suivante : [Récepteur-Ligand] K=, [Récepteur] x [Ligand] dans laquelle [Récepteur-Ligand] représente la concentration du complexe polypeptide de fusion avec sa molécule ligand, [Récepteur] représente la concentration du polypeptide de fusion selon l'invention sous forme libre et [Ligand] représente la concentration de la molécule ligand selon l'invention sous forme libre.

La valeur de l'affinité du récepteur protéique pour son ligand n'est pas une caractéristique technique déterminante des polypeptides de fusion selon l'invention.

Une forte affinité du récepteur protéique pour son ligand ne sera pas requise lorsque l'échantillon à tester n'est pas un milieu complexe au sein duquel peuvent se former des complexes non spécifiques de molécules contenues dans l'échantillon avec le traceur enzymatique constitué par le polypeptide de fusion.

La définition ci-dessus d'un récepteur protéique selon l'invention inclut des molécules protéiques qui sont considérées généralement par l'homme du métier comme des ligands d'un récepteur. Entrent dans cette catégorie les hormones, qui sont reconnues par leur (s) récepteur (s) respectifs), comme par exempte la LIIRII ou encore l'hormone de croissance.

Une molécule ligand selon l'invention est définie de telle sorte qu'elle possède une affinité pour le récepteur protéique précédemment décrit. Une telle molécule ligand peut représenter un analyte de nature quelconque, protéique (par exemple un récepteur de médiateur endogène ou encore une enzyme biologiquement active ou inactivée), ou non protéique, dont on recherche la présence dans un échantillon. La molécule ligand peut être elle-même une molécule de marquage, par exemple un anticorps couplé à la biotine ou à l'avidine.

Par polypeptide de fusion au sens de la présente invention, on entend une molécule protéique comprenant un premier polypeptide ayant une activité d'acétyl- cholinestérase monomérique et comprenant en outre au moins un second polypeptide représentant un récepteur protéique, le premier et le second polypeptide étant liés entre eux, directement ou indirectement, de manière covalente, soit que le polypeptide de fusion résulte d'un couplage chimique entre les deux polypeptides de départ, soit du fait que le polypeptide de fusion représente le produit d'expression d'un acide nucléique codant, dans une phase de lecture ouverte unique, les deux polypeptides de départ, étant entendu, en outre, que le premier et le second polypeptide peuvent être indifféremment orientés l'un par rapport à l'autre au sein du polypeptide de fusion.

Par échantillon au sens de l'invention, on entend un milieu liquide ou un matériau solide susceptible de contenir une molécule ligand telle que définie ci-dessus.

Un tel échantillon peut être d'origine biologique tel que notamment du sérum, du plasma, une coupe de tissu biologique (par exemple une biopsie) ou encore l'urine.

L'échantillon de l'invention peut être aussi le résultat d'un prélèvement sur des produits agro-alimentaires ou sur des effluents domestiques ou industriels ainsi que sur de l'eau à analyser. L'échantillon peut également être représenté par le contenu d'une plaque de microtitration dans lequel on recherche la présence d'un complexe récepteur-ligand, par exemple un complexe antigène-anticorps, l'une des molécules

parmi le récepteur ou le ligand étant marquée par une molécule non directement détectable ou visualisable, telle que la biotine ou l'avidine.

Comme exemple illustratif des polypeptides de fusion selon la présente invention, les inventeurs ont utilisé, en tant qu'acétylcholinestérase monomErique, 1'actétylcholinestérase retrouvée dans le venin du serpent Bungarusfasciatus.

Les inventeurs ont ainsi pu mettre au point la réalisation d'un polypeptide de fusion entre l'AChE de Bungarus fasciatus et un récepteur protéique, en l'occurrence un fragment peptidique constitué d'une chaîne unique contenant la partie variable Fv d'un anticorps monoclonal, le polypeptide de fusion pouvant être utilisé pour détecter spécifiquement, et avec une grande sensibilité, l'antigène correspondant.

Ainsi, 1'invention a pour objet un polypeptide de fusion caractérisé en ce qu'il comprend : a) un premier polypeptide constitué d'une acétylcholinestérase monomérique ou un variant biologiquement actif de ladite acétylcholinestérase monomérique ; b) un second polypeptide constitué d'un récepteur protéique spécifique d'une molécule ligand recherchée dans un échantillon.

Plus particulièrement, l'invention vise un polypeptide de fusion tel que défini ci-dessus, dans lequel l'acétylcholinestérase monomérique comprend la séquence en acides aminés SEQ ID N° 1 telle que décrite dans la liste de séquences ci-après.

Dans un mode particulier de réalisation du polypeptide de fusion selon l'invention, la partie polypeptidique constituée du récepteur protéique est dérivée d'un anticorps, ou d'une partie d'un anticorps, par exemple un anticorps monoclonal.

Par partie d'un anticorps selon l'invention, on entend notamment un fragment Fab, un fragment (Fab)'2 ou encore un ou plusieurs fragments scFv.

Dans un mode de réalisation tout à fait préféré, le récepteur protéique consiste en un fragment scFv unique, le polypeptide de fusion résultant étant alors monovalent, ce qui lui confère un poids moléculaire minimal et ainsi une excellente constante de diffusion lui permettant de lier la molécule ligand beaucoup plus rapidement qu'un immuno-conjugué divalent. D'autre part, la présence d'un site unique de fixation de l'antigène abolit la formation de réseaux de complexes antigène-anticorps observés

lorsque plusieurs sites antigéniques sont présents dans une même structure, et réduit en outre la présence d'interactions non spécifiques.

Plus généralement, une partie d'anticorps monoclonal aux fins de la présente invention sera représentée par un polypeptide portant les régions variables responsables de la reconnaissance spécifique de t'antigène contre lequcl celui-ci est dirigé et plus précisément au moins l'une des régions choisies parmi VL et VH et en particulier au moins l'une des régions hypervariables CDR1 et/ou CDR2 et/ou CDR3 (CDR signifiant « complementary determining région") se liant A l'antigène.

A titre illustratif, un polypeptide de fusion selon l'invention a été réalisé en fusionnant 1'acétylcholinestérase de Bungarus fasciatus avec le fragment scFv d'un anticorps monoclonal dirigé contre la sous-unité non catalytique CA de la crotoxine, ledit polypeptide de fusion possédant la séquence en acides aminés SEQ ID N° 2 telle que décrite dans la liste de séquences ci-après.

Des anticorps, ou les polynucléotides codant pour ces derniers, utilisés comme matériel de départ pour la construction, par voie chimique ou par recombinaison génétique, d'un polypeptide de fusion selon l'invention sont préférentiellement des anticorps monoclonaux dirigés contre certains médiateurs endogènes comme les cytokines, et parmi celles-ci les cytokines intervenant dans la régulation de la réponse immunitaire ainsi que certains facteurs de croissance, tels que l'EGF ou le NGF.

Parmi les cytokines d'intérêt reconnues par le récepteur protéique d'un polypeptide de fusion selon l'invention, on peut citer l'interféron alpha, l'interféron beta, l'interféron gamma, les interleukines (IL-1 à IL-16), le facteur stimulant les colonies de monocytes/macrophages (CSF-1 ou MCSF), le facteur stimulant la formation de colonies de granulocytes (G-CSF), le facteur stimulant la formation de colonies mixtes granulocytes/macrophages (GM-CSF), le facteur inhibiteur de leucémie (LIF), le facteur de nécrose tumorale (TNF alpha), la lymphotoxine (LT ou TNF beta), le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), les facteurs de croissance des fibroblastes (FGFs), le facteur de croissance des cellules endothéliales vasculaires (VEC-GF), l'érythropoïétine, le TGF beta (pour « Transforming growth factor beta »), le TGF alpha, le facteur de croissance des cellules B (BCGF), le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF) ou encore la protéine-1

chémoattractive pour les monocytes (« Monocyte Cllemoattractant Protein-l » ou MCP-1).

A titre illustratif des hybridomes utilisés comme matériel de départ pour la réalisation d'un polypeptide de fusion selon l'invention, on peut citer notamment les hybridomes produisant les anticorps suivants : a) Ac. anti-IL-1 beta : ATCC N° HB10219 ; N° 10220 ; N° 10221 ; N° 10222 ; b) Ac. anti-IL-2 (rat) : ATCC ? HB8091 ; N° HB8092 ; N° HB8093 ; c) Ac. anti-interféron alpha (humain) : ATCC N° HB8619 ; <BR> <BR> <BR> <BR> d) Ac. anti-interfron gamma (humain) : ATCC N° HB8700 ; N° HB8291 ; ;N°HB8699 e) Ac. anti-CSF-1 (humain) : ATCC N° HB8207 ; N° HB8208.

Parmi les interleukines, on recherchera tout particulièrement l'interleukine 4 (IL-4), l'interleukine 6 (IL-6) et l'interleukine 8 (IL-8) : a) L'IL-4 est une interleukine définie principalement comme étant un facteur de prolifération de lymphocytes B. Elle induit une activité de prolifération des cellules pro-B chez la souris, augmente le volume des cellules B au repos, induit ou modifie de façon importante la différenciation des lymphocytes B et affecte la nature des isotypes sécrétés.

L'IL-4 intervient dans des circonstances pathologiques et peut en conséquence avoir une application notamment dans le traitement de maladies inflammatoires acompagnant un choc endotoxinique ou dans le traitement d'affections allergiques.

La mise au point d'un test d'immunodétection de l'IL-4 dans un échantillon biologique revêt donc une importance diagnostique et médicale.

A titre illustratif, un polypeptide de fusion entre l'AChE et le fragment scFv de l'un des anticorps monoclonaux décrits par Cavaillon et al. (1996) et par Marty et al.

(1994), de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome 12-6-68 ou encore par l'hybridome 11B11 (ATCC N° HD188) font également partie de l'invention. b) L'IL-6 est un médiateur du système immunitaire qui possède un large spectre d'activités biologiques, et de nombreux types cellulaires sont capables de synthétiser cette cytokine, tels que les monocytes/macrophages, les fibroblastes,

les cellules endothéliales, les kératinocytes, les mastocytes, les cellules T et de nombreuses cellules tumorales.

Des taux élevés sériques ou plasmatiques peuvent intervenir dans différentes maladies telles que le choc septique, les maladies auto-immunes, après un rejet de greffe, les lymphomes, le SIDA ou encore les patients présentant différentes pathologies inflammatoires.

Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide de fusion selon l'invention dans lequel le récepteur protéique est constitué du fragment scFv de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H12.3 ou encore des anticorps monoclonaux décrits par Cavaillon et al. (1996) ou par Marty et al. (1994). c) L'IL-8 est une cytokine inflammatoire qui est présente chez des patients présentant différentes pathologies inflammatoires.

Un autre polypeptide de fusion selon l'invention comprendra un récepteur protéique constitué du fragment scFv de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome-clone 4-ou encore des anticorps monoclonaux décrits par Cavaillon et al. (1996) ou par Marty et al. (1994).

Dans un autre mode de réalisation du polypeptide de fusion selon l'invention, le récepteur protéique est un antigène, par exemple un antigène bactérien, viral ou fongique, si le ligand que l'on cherche à détecter est un anticorps, par exemple un anticorps généralement retrouvé chez des patients affectés d'une pathologie telle qu'une infection bactérienne ou virale ou encore un désordre immunitaire tel qu'une maladie auto-immune.

Plus particulièrement, un antigène constitutif du récepteur protéique contenu dans un polypeptide de fusion selon l'invention peut être choisi parmi les antigènes suivants : a) tout ou partie de l'une des glycoprotéines codées par le génome d'un virus de type HIV, notamment HIV-1 (brevets GB 83 24800, EP 84401834, ou EP 85905513) ou du virus HIV-2 (EP 87400151), et en particulier tout ou partie d'une protéine sélectionnée parmi gag, pol, nef ou env., préférentiellement de la glycoprotéine d'enveloppe d'un virus de type HIV, et de manière tout à fait préférée de tout ou partie de la boucle V3 de la glycoprotéine d'enveloppe ;

b) un antigène de surface de l'hépatite B (brevet FR 79 21811), sous l'une de ses formes S, S-préSl, S-preS2 ou S-préS2-préSl ; ou encore une protéine d'un virus de l'hépatite A, ou d'une hépatite non-A, non-B, telle que dérivée d'un virus de l'hépatite C, E ou delta ; c) un antigène mycobactérien, en particulier originaire de M. tuberculosis, comprenant tout ou partie d'une protéine choisie parmi les protéines suivantes : la protéine 45/47kD (PCT/FR 92/00508 ; PCT/FR 96/00166), la protéine LIP-DTH (PCT/FR 93/00268), la protéine P27 (FR 97 00100 du 08/01/1997), la protéine ESAT-6 (Harboe et al., 1996 ; Sorensen et al., 1995) ou encore le polypeptide LHP codé par un polynucléotide situé, sur le génome de M. tuberculosis, en aval des signaux de régulation de ESAT-6 et en amont de la séquence codant ESAT-6.

Sont également considérées comme des récepteurs protéiques au sens de la présente invention des protéines inhibitrices d'enzymes, telles que les inhibiteurs d'enzymes impliquées dans la coagulation sanguine (par exemple inhibiteur de l'activateur tissulaire du plasminogène ou tPA).

Entrent également dans la définition ci-dessus des enzymes inactivées, de préférence des enzymes inactivées conservant une affinité pour leur substrat, telles que les enzymes ayant pour substrat l'enképhaline.

Constituent également des récepteurs protéiques selon l'invention, des lectines ou parties de lectines, par exemple les lectines de type C animales telles que la Mannose-Binding-Protein (MBP) ou encore des molécules d'adhésion cellulaire, des récepteurs d'endocytose et des protéines de la matrice extracellulaire comme les sélectines (p. ex. selectine E), les récepteurs des asialoglycoprotéines, ou des récepteurs macrophagiques (Spiess, 1990). Parmi les lectines d'intérêt figurent aussi la « IX/X-binding protein » qui se lie aux facteurs IX (a) et X (a) (Atoda 1989,1991, 1994), la botrocétine (Fujimura 1991 ; Usami 1993) et la bitiscétine (Hamako 1996) qui induisent la liaison du facteur von Willebrand aux plaquettes, la « GPIb-binding protein * (Fujimura 1995, Kawasaki 1996), l'agkicétine (Chen 1995), l'alboaggrégine B (Yoshida 1993, Usami, 1996), la tokaracétine (Kawasaki 1995), la flavocétine A et B (Taniuchi 1995) et l'échicétine (Peng qui se lient à la

glycoprotéine Ib, la convulxine qui active les plaquettes (Polgar 1997) et la bothrojaracine qui inhibe la thrombine (Zingali 1993).

Dans encore un autre mode de réalisation du polypeptide de fusion selon l'invention, le récepteur protéique est du type avidine ou streptavidinc, par exemple dans le cas où le polypeptide de fusion est utilisé pour un marquage indirect d'une substance utilisée comme premier révélateur de la présence d'une molécule recherchée dans un échantillon, ce premier révélateur étant conjugué à une molécule de type biotine. La propriété de la biotine à lier simultanément plusieurs molécules d'avidine permet une amplification du signal visualisable et constitue ainsi un mode de réalisation avantageux d'un polypeptide de fusion selon l'invention.

Dans le cas où le premier révélateur est conjugué à une molécule de avidine ou streptavidine, c'est le polypeptide de fusion selon l'invention qui contiendra une région peptidique correspondant à une molécule de type biotine.

Dans un autre mode de réalisation du polypeptide de fusion selon l'invention, le récepteur protéique est représenté par un analogue non métabolisé d'un substrat enzymatique, si l'on recherche par exemple la présence d'une enzyme particulière dans un échantillon.

Le procédé selon l'invention permet, en outre, la construction de banques de ScFv en fusion avec l'AChE, en utilisant notamment les sites de clonage SfiI et NotI qui sont les sites les plus utilisés pour la construction de banques de cDNA. Ceci permet un criblage rapide des anticorps clones.

Le récepteur protéique du polypeptide de fusion selon l'invention peut aussi être constitué par un peptide dérivé d'une banque de peptides aléatoires, utiles notamment dans la recherche d'épitopes. Des techniques de réalisation de banques de peptides aléatoires utilisables dans le cadre de la présente invention sont par exemple la technique utilisant des phages recombinants décrite par Parmley et Smith en 1988.

De préférence, le polypeptide de fusion selon l'invention comprend l'acétyl- cholinestérase monomérique, ou le variant biologiquement actif de celle-ci, placé du côté N-terminal afin d'éviter tout encombrement stérique de nature à réduire l'accessibilité du site catalytique de l'enzyme pour son substrat et ainsi affecter la cinétique enzymatique.

Le polypeptide de fusion selon l'invention peut en outre contenir d'autres fragments polypeptidiques placés indifféremment à l'extrémité N-terminale, à l'extrémité C-terminale ou encore entre le premier polypeptide AChE et le polypeptide récepteur protéique tel que défini ci-dessus. De tels fragments polypeptidiques peuvent revêtir des natures fonctionnelles diverses. Il peut s'agir, par exempte, d'un fragment peptidique reconnu par un anticorps déterminé, ce fragment peptidique étant alors utile pour détecter et/ou s'assurer de la bonne structure du polypeptide de fusion lors de sa préparation. Il peut s'agir également d'un ou de plusieurs fragments peptidiques utilisés comme peptides de liaison entre les différents domaines fonctionnels du polypeptide de fusion selon l'invention et qui peuvent s'avérer nécessaires pour maintenir l'intégrité conformationnelle, et en conséquence l'intégrité fonctionnelle, de l'AChE monomérique et du récepteur protéique constitutifs dudit polypeptide de fusion.

Il peut aussi s'agir d'un fragment peptidique portant un ou plusieurs sites de reconnaissance par des enzymes protéolytiques, telles que la trypsine, la chymotrypsine etc. Dans ce cas, le site de reconnaissance pour l'enzyme protéolytique sera choisi préférentiellement de telle manière que ce site soit unique dans le polypeptide de fusion, de telle sorte que l'action de 1'enzyme protéolytique résulte dans tous les cas en l'obtention de deux fragments polypeptidiques de longueur et de structure définies. Dans ce mode de réalisation particulier du polypeptide de fusion selon l'invention, l'action de 1'enzyme protyéolytique conduit notamment à l'obtention de la partie peptidique contenant le récepteur protéique sous une forme libre et purifiable par les différentes techniques de purification de protéines bien connues de l'homme du métier.

Le polypeptide de fusion selon l'invention peut être le résultat d'un couplage chimique entre l'AChE monomérique et le récepteur protéique. De manière générale, pour lier par une liaison de covalence les différents polypeptides constitutifs du polypeptide de fusion selon l'invention, on fait réagir l'un des groupements réactifs libres de l'AChE monomérique, tel que l'un des groupements lysyle, tyrosyle, histydyle, tryptophanyle ou glutamyle avec un groupement réactif porté par le récepteur protéique, par exemple avec une fonction acide, une fonction amine, une

fonction phénol, une fonction hydroxyle ou une fonction cétone. Ceci peut être effectué en particulier par des réactions de couplage couramment utilisées, au moyen de réactifs tels que les carbodiimides, le glutaratdehyde, la benzidine, les anhydrides mixtes ou encore l'acide para-amino-phénylacdtique. On aura notamment recours à des techniques classiques de couplage entre deux protéines bien connues de !'homme du métier, telles que le couplage avec le réactif hétérobifonctionnel N-succinimidyl-4- (N-maleimido-méthyl)-cyclohexane-l-carboxylate (McLaughlin et al., 1987 ; Cruelle et al., 1988 ; Grassi et al., 1989).

Toutefois, l'obtention d'un polypeptide de fusion par couplage chimique présente de nombreux inconvénients, tant du point de vue du coût, de la durée, de la reproductibilité du procédé employé que de la pureté du produit de couplage résultant.

Dans la majorité des cas, un protocole spécifique de couplage doit être préalablement mis au point pour la réalisation de chaque conjugué. De plus, pour un conjugué donné, les opérations de couplage doivent être répétées lors de la préparation de chaque lot de réactif, ce qui introduit une hétérogénéité qualitative et/ou quantitative dans la composition de chacun des lots du conjugué considéré. Par ailleurs, la nécessité d'utiliser des réactifs chimiques susceptibles de porter des éléments réactionnels spécifiques aux deux polypeptides de départ, pour la plupart des cas l'antigène ou l'anticorps, d'une part, 1'enzyme d'autre part, impose l'utilisation de réactifs de base parfaitement purs afin d'éviter des réactions de couplages indésirables susceptibles de fausser la réaction.

C'est pourquoi, dans un mode de réalisation tout à fait préféré de la présente invention, le polypeptide de fusion est obtenu directement comme produit d'expression recombinant d'un polynucléotide comprenant, dans une phase de lecture unique, une séquence codant pour le polypeptide de fusion en tant que tel.

Un tel mode de réalisation du polypeptide de fusion selon l'invention par fusion de gènes permet la production d'un polypeptide recombinant, ce qui évite ainsi les difficultés évoquées plus haut, liées à la préparation purement chimique des traceurs enzymatiques et, parmi celles-ci, la détérioration des activités des capacités immunologiques ou enzymatiques pouvant survenir au cours du couplage chimique.

Certains traceurs immunoenzymatiques ont déjà été préparés selon une telle technique,

comme par exemple la réalisation d'un polypeptide de fusion entre un fragment Fab d'anticorps monoclonal et une phosphatase alcaline sous forme dimerique. A titre illustratif, Ducancel et al., en 1993, ont obtenu une protéine de fusion contenant deux fragments scFv, dérivés d'un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine-alpha du venin de Naja nigricolis, liEs de manière covalente \ la phosphatase alcaline de E. coli. La protéine de fusion recombinante résultante a une affinité pour l'antigène significativement réduite par rapport à l'anticorps monoclonal natif. En outre, l'immunoconjugué recombinant de Ducancel et al., contrairement au polypeptide de fusion selon l'invention qui est monovalent, possède une structure bi-fonctionnelle contenant à la fois deux sous-unités de la phosphatase alcaline et deux fragments scFv.

De plus, les protéines de fusion enzyme-fragment d'anticorps de l'art antérieur sont toutes des molécules de haut poids moléculaire, ce qui leur confère un coefficient de diffusion très faible et une cinétique enzymatique résultante peu compatible avec la sensibilité de détection recherchée pour la réalisation de réactifs d'immunodétection commercialisables. A titre d'exemple illustratif, la protéine de fusion recombinante décrite par Ducancel et al. a un poids moléculaire supérieur à 250 kDa.

Au contraire des protéines de fusion recombinantes décrites dans l'état de la technique, le faible poids moléculaire de l'AChE monomérique qui lui est constitutive (72 kDa pour l'AChE de B. fasciatus), permet de réaliser de manière reproductible un polypeptide de fusion recombinant monovalent d'un poids moléculaire d'environ 100 à 150 kDa et possédant une capacité de détection très élevée.

En conséquence, 1'invention a également pour objet un polypeptide de fusion recombinant ayant la structure précédemment décrite des polypeptides de fusion selon 1'invention.

De préférence, la séquence codant l'acétylcholinestérase, ou un variant biologiquement actif de celle-ci, est placée du côté 5'du polynucléotide codant le polypeptide de fusion.

Plus particulièrement, 1'invention vise un polypeptide de fusion recombinant caractérisé en ce que la partie polypeptidique constituée par l'acétylcholinestérase est codée par le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 3 telle que décrite dans la liste de séquences ci-après.

A titre illustratif d'un mode particulier de réalisation du polypeptide de fusion selon l'invention, les inventeurs ont réalisé une construction génétique comprenant successivement, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', une séquence codant pour l'AChE de Bungarus fasciatus, une séquence codant pour le peptide cMyc (polypeptide oncogène d'origine humaine) et une séquence codant pour la partic variable simple chaîne (scFv) d'un anticorps monoclonal dirigé contre ! a sous-unité non catalytique (CA) de la crotoxine, principale toxine retrouvée dans le venin du crotale originaire d'Amérique du Sud. La région d'acide nucléique codant pour la partie variable de la chaîne lourde (VH) du fragment scFv et ! a région d'acide nucléique codant pour la partie variable de la chaîne légère (VL) du fragment scFv sont reliées entre elles par un fragment polynucléotidique codant pour un peptide de liaison, ledit peptide de liaison étant souligné en trait pointillé sur la Figure 1B. Ce peptide de liaison est destiné à assurer un positionnement adéquat de la chaîne lourde par rapport à la chaîne légère dans le polypeptide de fusion final, afin que ce dernier ait une affinité pour la sous-unité CA de la crotoxine comparable à celle observée pour l'anticorps monoclonal natif.

L'invention a donc également pour objet un polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide de fusion selon l'invention.

En particulier, un polynucléotide tel que défini ci-dessus comprendra une séquence codant pour une acétylcholinestérase monomérique ou pour un variant biologiquement actif d'une acétylcholinestérase.

Plus particulièrement, un tel polynucléotide comprendra la séquence SEQ ID N° 3 telle que décrite dans la liste des séquences ci-après codant pour 1'acétal- cholinestérase retrouvée dans le venin du serpent Bungarusfasciatus.

Selon un aspect particulier du polynucléotide codant pour un polypeptide de fusion selon l'invention, ce polynucléotide comprend notamment, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', une séquence codant pour 1'acétylcholinestérase monomérique du venin du serpent Bungarus fasciatus, le peptide cMyc, et le fragment scFv d'un anticorps monoclonal dirigé contre la sous-unité CA non catalytique du venin de crotale. Une telle séquence est, par exemple, la séquence SEQ ID N° 4 telle que décrite dans la liste des séquences ci-après.

La construction génétique décrite ci-dessus a été insérée dans un vecteur permettant l'expression du polypeptide dans des cellules hôtes et ledit vecteur a été introduit par transfection dans des cellules eucaryotes.

Laséquence caractérisant tes po ! ynuc ! éotides selon l'invention peut être optimisée, selon le type d'organisme hôte dans lequel l'expression du polypeptide de fusion est désirée et donc l'usage des codons spécifique il l'organisme considéré (cellules de mammifère ou d'insecte, cellules de plante, bactérie, notamment). Pour les bactéries et les plantes, respectivement, l'usage général des codons peut être retrouvé dans la demande de brevet européen N° EP-0 359 472 (Mycogen).

En conséquence, constitue aussi un objet de l'invention un vecteur de clonage et/ou d'expression contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide de fusion tel que défini ci-dessus.

Avantageusement, un tel vecteur comprendra, en outre, les signaux d'expression et/ou de régulation de la transcription et de la traduction nécessaires à une expression optimale du polypeptide de fusion dans l'hôte cellulaire choisi, ces signaux d'expression et/ou de régulation devant être, au sein du vecteur recombinant, liés de manière fonctionnelle au polynucléotide codant pour le polypeptide de fusion selon l'invention.

Par signaux d'expression et/ou de régulation liés de manière fonctionnelle à un polynucléotide codant pour un polypeptide de fusion selon l'invention, on entend des séquences de régulation permettant 1'expression du polynucléotide codant dans l'hôte cellulaire recombinant choisi.

La nature précise des régions de régulation nécessaires à 1'expression du gène varie d'un hôte cellulaire à l'autre. Celles-ci comprennent en général une région promotrice, laquelle contient chez les procaryotes à la fois le promoteur (qui dirige l'initiation de la transcription) ainsi qu'une ou plusieurs régions, lesquelles, une fois 1'ADN transcrit en ARN, contiennent un signal de début de traduction et un site de liaison aux ribosomes (séquence Shine-Dalgarno).

En outre, un site de terminaison de la transcription fonctionnel chez l'hôte cellulaire recombinant choisi peut être, si nécessaire, inséré en aval du codon d'arrêt de la traduction de la séquence codante, afin d'obtenir des transcrits de la taille la plus

réduite possible et ainsi favoriser 1'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide de fusion selon l'invention.

Les régions promotrices placdes A proximité de la séquence A exprimer sont choisies de telle manière qu'elles soient fonctionnelles dans l'hôte cellulaire désiré.

Parmi les promoteurs bactériens, on pourra notamment utiliser les promoteurs Lard, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, le promoteur de la polyhédrine ou le promoteur de la protéine plO du baculovirus (kit Novagen ; Smith et al., 1983 ; O'Reilly et al., 1992) ou encore le promoteur lambda PR ou le promoteur trc.

De préférence, la région promotrice sera placée à proximité du site d'initiation de la traduction de la séquence codant le polypeptide de fusion, par exemple à une distance comprise entre 10 et 400 paires de base en amont du codon ATG.

Pour une expression dans des cellules eucaryotes, on pourra avantageusement utiliser le promoteur précoce du CMV, le promoteur de la thymidine kinase du virus de l'Herpès simplex, le promoteur précoce ou le promoteur tardif de SV40, les régions LTR (« Long Terminal Repeat ») de certains rétrovirus ou encore le promoteur de la métallothionéine I de souris.

Plus généralement, le choix d'un promoteur adéquat par l'homme du métier pourra aussi être guidé par l'ouvrage de Sambrook de 1989 ou encore l'ouvrage de Fuller de 1996.

En particulier, si l'hôte cellulaire choisi est une bactérie, le vecteur de clonage et/ou d'expression selon l'invention comporte soit une origine de réplication fonctionnelle dans une bactérie, soit des séquences lui permettant de s'intégrer dans le génome d'une bactérie. Il peut s'agir plus particulièrement d'un plasmide, d'un phage, etc. En outre, certains vecteurs peuvent comporter avantageusement plusieurs origines de réplication, notamment deux origines de réplication, l'une fonctionnelle dans des bactéries du genre E. coli, utile pour une duplication aisée du vecteur, l'autre fonctionnelle dans la bactérie choisie pour 1'expression du polypeptide de fusion selon l'invention. De tels vecteurs sont notamment décrits dans l'ouvrage de Sambrook et al. publié en 1989.

On peut également utiliser un vecteur d'expression du type baculovirus contenant au moins un site de clonage multiple dans lequel sont insérés les éléments spécifiques de l'expression du gène pol dans un squelette de plasmide de type pUC8.

De tels plasmides peuvent être classés en deux sous-groupes, respectivement, d'une part, les vecteurs pVLMelMyc-qui permettent la fusion du polynucléotide à exprimer avec la séquence signal du gène de la mcllitine (Chai et al., 1993 ; Vlasak et al., 1983) et, d'autre part, les vecteurs pVLPolMyc-permettant la fusion du poly- nucléotide à exprimer avec la séquence codant pour les 12 premiers acides aminés de la protéine Pol et de la protéine cMyc. Le polynucléotide codant pour le polypeptide de fusion selon l'invention est inséré au niveau du site de clonage multiple, résultant en une fusion du peptide Mel-Myc ou Pol-Myc avec l'extrémité N-terminale du polypeptide de fusion selon l'invention. La mise en oeuvre de tels vecteurs est notamment décrite par Lenhard et al. enl996.

Parmi les vecteurs utilisables dans un système d'expression baculovirus, on peut encore citer les vecteurs de la famille BacTen, commercialisés par la société Quantum-Bioprobe. Il s'agit d'un système d'expression basé sur un promoteur fort et unique, le promoteur plO. Dans ces vecteurs particuliers, la totalité du locus polyhédrine ainsi que la séquence codant le polypeptide plO sont délétés, ce qui réduit le bruit de fond dû aux protéines natives. Par ailleurs, l'absence de séquence codant le polypeptide plO contribue à retarder la lyse des cellules infectées, ce qui prolonge la période de production des protéines recombinantes d'intérêt. Il s'agit en particulier des vecteurs QBI-pTenl2, QBI-pTen21, QBI-pTenTwin et QBI-pTenACE. Le plasmide QBI-pTenTwin permet 1'expression simultanée de deux transgènes ; le plasmide QBI- pTenACE contient la séquence codant le peptide signal de l'acétylcholinestérase de drosophile, ce qui permet la sécrétion dans le milieu de culture de la protéine recombinante d'intérêt.

Les vecteurs d'expression suivants peuvent également être utilisés : a) vecteurs bactériens : pBs, phagescript, Psi174, pBluescript SK, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH64a (commercialisés par Stratagene) ; pTrc99A, pKK223-3, pDR540, pRIT5 (commercialisés par Pharmacia) ; pQE-30 (commercialisé par QIAexpress) ;

b) système baculovirus : pVL1392/1393 (commercialisé par Pharmingen) ; c) vecteurs pour cellules eucaryotes : pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (commercialisés par Stratagene) ; pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (commercialisés par Pharmacia), pCDNA3 (commercialisé par Invitrogen).

De manière particulièrement préférée, le vecteur de l'invention est un vecteur réplicable dans E. coli et fonctionnel dans les cellules de mammifères, en particulier les cellules COS. Il s'agit du vecteur pCDNA3. A ce titre, fait également partie de l'invention le plasmide pC-AChE-scFv contenu dans la souche de E. coli I12-AChE B. f. 1 déposée à la CNCM le 30 octobre 1997 sous le numéro d'accès I-1938.

L'invention concerne en outre tout hôte cellulaire recombinant, procaryote ou eucaryote, comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide de fusion selon l'invention ou un vecteur de clonage et/ou d'expression tel que défini précédemment.

Les cellules recombinantes de l'invention peuvent être préparées en utilisant toutes les techniques connues de l'homme du métier permettant l'introduction d'un acide nucléique dans une cellule. Il peut s'agir par exemple de techniques physiques (électroporation, biolistique, etc.), de techniques chimiques (précipitation au phosphate de calcium, utilisation d'agents de transfert chimiques : lipides cationiques, polymères, etc.) ou d'autres méthodes telles que la fusion de cellules, la conjugaison, etc.

Des hôtes cellulaires recombinants préférés selon l'invention sont notamment : a) E. coli : K12 (ATCC N° 23820), DH5-alpha ; b) cellules eucaryotes : cellules HeLa (ATCC N° CCL2 ; N° CCL2.1 ; N° CCL2.2), cellules Cvl (ATCC N° CCL70), cellules COS (ATCC N° CRL1650 ; N° CRL1651), cellules CHO (ATCC N° CRL9096, N° CRL9618), cellules Sf-9 (ATCC N° CRL1711) ; S. cerevisiae (ATCC N° 2364 ; N° 2365 ; N° 2366).

De manière tout à fait préférée, un hôte cellulaire recombinant utile pour 1'expression du polypeptide de fusion recombinant selon l'invention est une lignée de cellules COS. Selon un autre aspect, un hôte cellulaire recombinant préféré pour le maintien et l'amplification d'un vecteur recombinant selon l'invention est la souche de

E. coli 112-AChE B. f. l recombinante déposée le 30 octobre 1997 sous le numéro d'accès N° I-1938.

Dans le cas où le récepteur protéique possède un ou plusieurs sites de glycosylation et où ce (ces) sites (s) de glycosylation est (sont) important (s) du point de vue de la capacité dudit récepteur protéique A se lier A la moldculc ligand qui est recherchée, on préférera une expression du polypeptide de fusion recombinant dans une cellule possédant un système enzymatique apte à réaliser convenablement l'étape de maturation protéique par glycosylation, c'est-à-dire une cellule eucaryote, par exemple une cellule de levure (comme Saccharomyces cerevisiae) et de manière particulièrement avantageuse dans une cellule de mammifère (cellules COS, cellules CHO, cellules HeLa).

L'invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide de fusion tel que défini dans l'invention. Un procédé particulier de production d'un polypeptide de fusion selon l'invention comprend la culture d'un hôte cellulaire recombinant tel que précédemment décrit, la récupération, et, le cas échéant, la purification dudit polypeptide de fusion à partir du surnageant de culture ou du lysat cellulaire de l'hôte recombinant.

Lorsque l'hôte recombinant est une cellule COS transfectée par le plasmide pC-AChE-scFv selon l'invention, le polypeptide de fusion sera de préférence purifié à partir du surnageant de culture où la plus grande partie du polypeptide de fusion est retrouvée, comme l'indiquent les résultats d'activité acétylcholinestérase présentés sur le Tableau 2.

Il a été observé que la protéine de fusion AChE-scFv est produite en grande quantité dans les cellules COS, sa concentration dans le milieu de culture des cellules COS transfectées étant supérieures à 1 yg/ml. La protéine AChE-scFv a été produite et sécrétée par les cellules COS recombinantes sous une forme active, tant du point de vue de l'activité catalytique de l'AChE que du point de vue de l'affinité du scFv pour la sous-unité CA de la crotoxine.

Les polypeptides de fusion recombinants selon l'invention peuvent être purifiés par chromatographie d'affinité selon diverses modalités. Par exemple, lesdits polypeptides sont purifiés par passage sur un support de chromatographie sur lequel a

été préalablement immobilisée une molécule choisie parmi un substrat ou un pseudo- substrat de l'acétylcholinestérase ou encore un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre tout ou partie du polypeptide de fusion à purifier, notamment contre l'acétylcholinestérase, contre le récepteur protéique ou encore contre un peptide interne de liaison ou servant de site de reconnaissance pour la purification, tcl que le peptide cMyc.

Les polypeptides de fusion recombinants selon l'invention, dans le mode de réalisation particulier dans lequel ils portent à l'une de leurs extrémités un segment de polyhistidine, par exemple une queue de six résidus histidine, peuvent en outre être purifiés sur une colonne de chromatographie contenant une résine à base de nickel, comme par exemple la résine NiNTA (Porath et al., 1975 ; demande internationale N° PCT/FR 96/01801, publiée sous le N° WO 97/18311 [Deubel et al.]).

Le polypeptide de fusion AChE-scFv a été purifié en une seule étape sur une colonne de chromatographie d'affinité de faible coût et réutilisable. Il s'agit d'un procédé beaucoup plus satisfaisant que les procédés de purification d'immuno- conjugués recombinants de l'art antérieur.

En particulier, l'immunoconjugué recombinant décrit par Ducancel et al. précipite au niveau du cytoplasme bactérien et doit, après extraction à partir des sphéroplastes, être renaturé et purifié selon des méthodes conventionnelles beaucoup moins performantes, à savoir des traitements répétés de congélation-décongélation en présence de Dnase I, ultracentrifugation des lysats ainsi obtenus, filtration puis enfin passage sur une colonne de chromatographie d'affinité. Le procédé de purification de l'état de la technique décrit ci-dessus est donc long, coûteux du fait de l'infrastructure nécessaire à sa réalisation, à rendement faible du fait du nombre d'étapes important, et peu efficace du fait de la perte d'activité enzymatique due aux environnements de milieu défavorables utilisés.

Les polypeptides de fusion selon l'invention permettent la réalisation de tests de détection de grande sensibilité et spécifiques de la molécule ligand recherchée.

Notamment, le récepteur protéique constitutif du polypeptide de fusion conserve une affinité pour son ligand du même ordre de grandeur que lorsque ce récepteur protéique est sous une forme libre, non-fusionnée.

Ainsi, le polypeptide de fusion AChE-scFv constitutif du traceur enzymatique décrit ici par les inventeurs a permis de réaliser un test immunoenzymatique de grande spécificité pour la sous-unité CA de la crotoxine. Ainsi, pour une dilution au 1/2000 du peptide de fusion, ce qui correspond approximativemcnt à une concentration du peptide de fusion en solution de 0,7 ng/ml (Figure 2 B et Tableau 2), le ligand, en l'occurrence la sous-unité CA de la crotoxine, a été détecté. Dans un test de type ELISA par compétition, la fixation du polypeptide de fusion à la sous-unité CA de la crotoxine immobilisée sur la surface d'une plaque de microtitration est inhibée à 50 % par une concentration de sous-unité CA libre de 5 x 10 9 M (Indice In50). La valeur de l'indice IC50 de la sous-unité CA avec le polypeptide de fusion AChE-scFv est identique à l'affinité de l'anticorps natif A-56.36 (Choumet et al. 1992). Ce dernier résultat démontre que le repliement protéique de la partie variable simple chaine (scFv) produite par recombinaison génétique n'a pas été modifié au sein du polypeptide de fusion AChE-scFv.

Les polypeptides de fusion selon l'invention seront donc avantageusement mis en oeuvre en tant que réactifs pour la détection de ligands possédant une affinité pour le récepteur protéique inclus dans ces polypeptides, tel que par exemple le récepteur protéique constitué du fragment scFv de l'anticorps monoclonal A-56.36 dirigé contre la sous-unité CA de la crotoxine.

En conséquence, un autre objet de l'invention consiste en un réactif de diagnostic caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide de fusion selon l'invention, le cas échéant en association avec un ou plusieurs excipients biocompatibles.

L'invention vise aussi un procédé de détection d'une molécule ligand dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un polypeptide de fusion ou d'un réactif de diagnostic selon l'invention avec un échantillon susceptible de contenir la molécule ligand recherchée ; b) mise en évidence du complexe formé entre, d'une part, le polypeptide ou le réactif de diagnostic et, d'autre part, la molécule ligand éventuellement présente dans l'échantillon à analyser.

Dans le mode particulier de réalisation d'un polypeptide de fusion dans lequel le récepteur protéique possède une structure dérivée d'un anticorps, en particulier d'un anticorps monoclonal, et donc dans le cas où le procédé de détection précédemment décrit revêt toutes les caractéristiques d'un test de détection immunoenzymatique, l'homme du métier pourra avantageusement se référer, pour sa mise en oeuvre, à l'ouvrage de D. Wild (1994), à l'ouvrage de S. S. Desphande (1996) ou encore à l'ouvrage de M. Terpstra (1992), l'enseignement contenu dans ces ouvrages, en tant qu'il se rapporte à des techniques immunoenzymatiques, étant ici incorporé par référence.

Fait aussi partie de l'invention un procédé de détection immunoenzymatique (ELISA) d'une molécule ligand susceptible d'être présente au sein d'un échantillon à tester.

Un tel procédé comprendra, par exemple, les étapes suivantes : a) dépôt d'une fraction aliquote d'un échantillon à tester, ou d'une dilution d'un échantillon à tester, dans les puits d'une plaque de microtitration ; b) lavage des puits de la microplaque afin d'éliminer la partie de l'échantillon non adsorbée sur les puits ; d) incubation des puits de la microplaque avec un polypeptide de fusion selon l'invention, dirigé contre l'antigène recherché ; e) détection, le cas échéant en comparaison avec un témoin de contrôle positif et/ou un témoin de contrôle négatif, de la quantité de substrat hydolysé par l'acétyl- cholinestérase du polypeptide de fusion complexé à l'antigène recherché.

Fait également partie de l'invention un procédé de détection de type « sandwich », dans lequel un anticorps de spécificité donnée-dit molécule de capture- est préalablement immobilisé sur un support avant incubation avec l'échantillon à analyser, la détection des complexes récepteur protéique-molécule ligand étant alors réalisée par une seconde incubation avec un polypeptide de fusion selon l'invention.

Dans ce mode de réalisation particulier de l'invention, l'anticorps immobilisé et la partie récepteur protéique constitutif du polypeptide de fusion doivent reconnaître des épitopes différents de la molécule analyte dont la présence est recherchée dans l'échantillon.

Une telle technique de type « sandwich », appliquée à un test immunologique, a été notamment décrite par Addison en 1970, le contenu de cet article étant ici incorporé par référence.

Dans un autre mode de réalisation du procédé de détection selon l'invention, la moldcule ligand à rechercher est un traceur « primaire », comme par exemple un conjugué de type biotine ou encore de type avidine ou streptavidine, le polypeptide de fusion selon l'invention étant alors employé comme traceur « secondaire » permettant de visualiser la formation d'un complexe avec le conjugué traceur « primaire » dans un échantillon.

Un ensemble de deux molécules traceur « primaire » et traceur « secondaire » tels que définis ci-dessus fait également partie de l'invention et peut avantageusement être inclus dans une trousse de détection telle que décrite ultérieurement dans la description.

L'invention concerne donc également un ensemble de réactifs de diagnostic, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un réactif comprenant une molécule reconnaissant spécifiquement un analyte à rechercher dans un échantillon, ladite molécule étant couplée à une molécule de type biotine ; b) un polypeptide de fusion selon l'invention, dans lequel le récepteur protéique est une molécule de type avidine ou streptavidine.

Dans encore un autre mode de réalisation avantageux du procédé de détection selon l'invention, au moins deux polypeptides de fusion sont mis en oeuvre : a) un premier polypeptide de fusion comprenant un récepteur protéique ayant une affinité pour l'analyte d'intérêt recherché dans l'échantillon et représentant la molécule ligand dudit récepteur protéique ; b) au moins un second polypeptide de fusion comprenant un récepteur protéique ayant une affinité pour une région du premier polypeptide de fusion différente de l'acétylcholinestérase, la fixation du second polypeptide de fusion n'affectant pas significativement l'activité catalytique de la partie acétylcholinestérase du premier polypeptide de fusion.

La mise en oeuvre, comme décrit ci-dessus, d'au moins deux polypeptides de fusion catalytiquement actifs pour reconnaitre un même analyte constitue un moyen avantageux d'amplifier le signal de détection et, en conséquence, d'améliorer encore la sensibilité du test de ddtcction selon l'invention.

La présente invention concerne donc également, de manière générale, l'application dans le domaine de la détection d'analytes dans un dchantillon, d'une acétylchoiinestérase monomérique, en particulier lorsque t'acétytchotinestérase est présentée comme élément constitutif d'un polypeptide de fusion selon l'invention.

Les trousses de détection actuellement commercialisées, par exemple les trousses de type ELISA pour différentes cytokines sont onéreuses et la valeur de la limite inférieure de détection est parfois trop élevée pour permettre une évaluation rigoureuse de faibles concentrations de cytokines, notamment telles que l'IL-4, l'IL-6 ou l'IL8, ce seuil de détection étant en générât de 5 à 10 pg/ml. Les inventeurs se proposent en conséquence de remédier aux inconvénients des trousses de détection de l'art antérieur grâce aux polypeptides de fusion selon l'invention.

L'invention a également pour objet une trousse ou kit de détection d'une molécule ligand dans un échantillon, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un polypeptide de fusion ou un réactif de diagnostic selon l'invention ; b) le cas échéant, un substrat de 1'acétylcholinestérase ; c) le cas échéant, un témoin de contrôle positif comprenant une quantité ou une concentration déterminée de la molécule ligand recherchée.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants : Légendes des Figures Figures 1A et 1B : Séquence nucléotidique du gène chimère AChE-ScFv et séquence en acides aminés de la protéine de fusion codée par le gène chimère.

Figure 1A : Séquence nucléotidique codant pour le polypeptide de fusion AChE-scFv.

La séquence nucléotidique du gène synthétique est représentée avec l'indication de la position des sites de restriction BamH1, BgIII et SfiI.

La séquence codant pour l'AChE tronquée s'étend du nucléotide en position 1 au nucléotide en position 1698 de la Figure.

La séquence codant pour le peptide cMyc s'étend du nucléotide en position 1699 au nucléotide en position 1731 de la Figure.

La sdquence codant pour le fragment scFv s'étend du nucléotide en position 1732 au nucléotide en position 2478 de la Figure.

Les séquences codant pour les régions hypervariables de la chaîne lourde (VH1, VH2, VH3) et de la chaîne légère (VL1, VL2, VL3) du fragment scFv sont soulignées en gras.

La séquence codant pour le peptide de laison entre la chaîne lourde et la chaîne légère du fragment scFv s'étend du nucléotide en position 2107 au nucléotide en position 2151 de la Figure.

Figure 1B : Séquence en acides aminés du polypeptide de fusion AChE scF v.

La séquence peptidique représentant I'AChE tronquée s'étend de 1'acide aminé en position 1 à l'acide aminé en position 566 de la Figure.

La séquence peptidique du peptide cMyc s'étende de l'acide aminé en position 567 à 1'acide aminé en position 577 de la Figure.

La séquence peptidique du fragment scFv s'étend de l'acide aminé en position 578 à l'acide aminé en position 826 de la Figure.

La séquence peptidique du peptide de liaison entre la chaîne lourde et la chaîne légère du fragment scFv s'étend de l'acide aminé en position 703 à l'acide aminé en position 717 de la Figure ; cette séquence est soulignée en pointillés.

Les régions correspondant aux régions hypervariables de la chaîne lourde (VH1, VH2, VH3) et de la chaîne légère (VL1, VL2, VL3) du domaine peptidique scFv sont soulignées en gras.

Figures 2A et 2B : Fonction du traceur immunoenzymatique AChE-scFv.

Figure 2A : Le milieu de culture des cellules COS transfectées a été incubé pendant 1 heure à 37°C dans une plaque de microtitration sur laquelle a été préalablement immobilisée la sous-unité CA de la crotoxine. La plaque a ensuite été

lavée puis incubée pendant 1 heure à 37°C avec l'anticorps monoclonal 9E10, spécifique du peptide cMyc.

Le test ELISA a été réalisé comme décrit dans la section Matériel et Méthodes.

(O) pcBl ; (D) pC-AChE-scFv.

Figure 2B : L'extrait cellulaire des cellules COS transfectées a été incubd pendant 1 heure à 37°C dans une plaque de microtitration sur laquelle a été préalablement immobilisée la sous-unité CA de la crotoxine. La plaque a ensuite été lavée, le milieu de test AChE a été ajouté et la réaction a été poursuivie pendant 4 heures à 37°C. (O) pcBl ; (O) pC-AChE-scFv.

Figure 3 : Affinité de la protéine de fusion AChE-scFv pour la sous-unité CA de la crotoxine.

Le milieu de culture des cellules COS transfectées avec le gène chimère a été préparé à la dilution 1/800 et incubé pendant une nuit à 4°C avec différentes concentrations de la sous-unité CA. Des fractions aliquotes de 100 1 ont ensuite été transférées dans les puits d'une plaque de microtitration sur laquelle aété préalablement immobilisée la sous-unité CA de la crotoxine. La plaque est ensuite incubée pendant 30 minutes à la température du laboratoire, lavée, puis l'activité AChE est mesurée par la méthode d'Ellman.

Figure 4 : Electrophorèse de la protéine de fusion purifiée par chromatographie d'affinité.

Des protéines, dénaturées en présence de SDS à 1 %, de mercaptoéthanol à 0,1 M, ont été déposées sur un gel de polyacrylamide à 12 % et soumises à une électrophorèse.

Après migration, le gel d'électrophorèse a été coloré au bleu de Coomassie.

Les protéines marqueurs de poids moléculaire suivants sont symbolisés sur le côté droit de la photographie du gel : phosphorylase B, 94 kDa ; sérumalbumine bovine, 67 kDa ; ovalbumine, 43 kDa ; anhydrase carbonique, 30 kDa.

Piste de gauche : protéine de fusion AChE-scFv purifiée par chromatographie d'affinité.

Piste de droite : AChE du venin de Bungarus fasciatus, purifiée par chromatographie d'affinité.

Figure 5 : Carte du plasmide pCDNA3 contenant l'insert de séquence SEQ ID N° 4 et déposé la CNCM le 30 octobre 1997 sous le numéro I-1938.

P CMV : promoteur du cytomegalvirus ; P T7 : promoteur du bactériophage T7 ; P SP6 : promoteur pSP6 ; ColEl : origine de réplication fonctionnelle dans Fscitericliia coli provenant du plasmide pUCl9 ; SV40 polyA : site de polyadénylation ; Amp R : gène de la beta lactamase conférant un phénotype de résistance à l'ampiciline ; P SV40 ori : origine de réplication de SV40 pour une expression épisomale transitoire dans des cellules exprimant l'antigène T de SV40.

Les promoteurs P T7 et P SP6 sont localisés de part et d'autre du site de clonage multiple détaillé sur la figure et orientés en sens opposés.

Le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 4, sous une forme double brin est inséré, dans le sens 5'vers 3', entre le site EcoRI et le site Notl du site de clonage multiple représenté sur cette Figure. En conséquence, les sites EcoRV et BstXI situés entre les sites EcoRI et NotI sont supprimés au moment de l'introduction de l'insert de séquence SEQ ID N° 4.

Figure 6 : Dosage de l'IL-6 par un anticorps biotynilé (Pharmingen) ou par le conjugué AChE-scFv H12-6 (les mesures ont été réalisées en triplicate) <BR> <BR> <BR> <BR> AChE-scFv H12-6<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> -*-P2-biotinylé Linéaire (AChE-scFv H12-6) Linéaire (P2-biotinylé).

Matériel et Méthodes I. Matériel L'acétylthiocholine et l'acide 5-5'-dithio-bis (2-nitrobenzoïque) sont commercialisés par Sigma (St Louis, Missouri, USA).

Les enzymes utilisées pour la construction des plasmides sont commercialisées par Boehringer-Mannheim (Allemagne) et par Promega Biotech (Madison, USA).

L'anticorps monoclonal 9E10 anti-cmyc est commercialisé par Pharmingen (San Diego, USA).

La crotoxine ainsi que la sous-unité CA de la crotoxine ont été purifiées à partir du venin de Crotalus durissus terrificus comme décrit précédemment (Hendon et al., 1971 ; Faure et al., 1991).

Les autres réactifs et les solvants de haute pureté sont respectivement commercialisés par Merck (Darmstadt, Allemagne), Sigma (St Louis, Missouri, USA) et par Prolabo (Paris, France). Les plaques de microtitration ont été obtenues auprès de Nunc (Roskilde, Danemark).

II. Méthodes A) Production du gène chimérique codant l'AChE et le scFv.

Un ADNc codant l'AChE du venin de B. fasciatus a été isolé à partir d'une banque d'ADNc clonée dans le plasmide pT3T7 (Pharmacia), cette banque d'ADNc ayant été construite après digestion par les enzymes EcoRI et NotI (Cousin et al., 1996a). Un fragment codant le domaine catalytique (allant du nucléotide en position 204 au nucléotide en position 1946 de la séquence décrite par Cousin et al., 1996a) a été introduit entre les sites EcoRI et NotI du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) résultant en le plasmide pCBl, plasmide qui a été utilisé comme témoin négatif (Cousin et al., 1996a). Le gène chimère a été obtenu par réaction PCR, en utilisant une amorce aller de séquence SEQ ID N° 14 identique à la séquence allant du nucléotide en position ntl641 au nucléotide ntl664 inclus de la séquence décrite par Cousin et al. (1996a) (5'-GGATTGCCGCTCAACGACAGCCTG-3') et une amorce retour de séquence SEQ ID N° 15 hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence allant du nucléotide en position nt 1946 au nucléotide en position nt 1884 de la séquence décrite par Cousin et al. (1996a) (3'-TTTGACGACTTGCGGTGTCTTGTTTTTGAGTAGA GTCTTCTCCTAGACTTACGCCGGGTCGGCCGGTAC-5') du gène de l'AChE de B. fasciatus. Cette dernière amorce comprend, du côté 5', et dans le sens 3'vers 5', une séquence complémentaire de la séquence codant pour le peptide cMyc ainsi

qu'une séquence complémentaire de la séquence reconnue par 1'enzyme de restriction SfiI sur le brin codant. La région codant pour le peptide cMyc ainsi que le site de restriction SHII sont ainsi ajoutés à cette étape. L'amplicon résultant contient donc la séquence codante du polypeptide cMyc et le site de restriction Sfil.

Le fragment amplifié est clou6 dans pGEM-T. Ce fragment contient l'extrémité 3'de I'AChE fusionné avec la séquence codante de cmyc et le site sElI. Ce plasmide est digéré par BG1II et Notl (le site NotI est dans le vecteur pGEM-T) et le fragment est transféré dans pT3T7 à la place du fragment BgUI-notI d'AChE. On obtient alors le vecteur pT3T7-AChE-cmyc.

Le plasmide résultant est ensuite digéré par BamHI et NotI, et le fragment obtenu est introduit dans le vecteur pCB1 (à la place du fragment AChE correspondant).

Le gène codant scFv I12, le fragment de l'anticorps spécifique de la sous-unité CA de la crotoxine, est ensuite introduit entre les sites SfiI et Notl du fragment pC- AChE-cMyc afin d'obtenir la construction pC-AChE-scFv, un plasmide qui contient le gène chimère (figures 1A et 1B).

B) Transfection dans les cellules COS.

Les cellules COS ont été transfectées avec 5 yg du vecteur pCDNA3 contenant le gène chimère AChE-scFv, en utilisant la méthode au DEAE-dextran, comme décrit par Bon et Massoulié (1997).

Les cellules sont ensuite mises en culture pendant 5 jours à 37°C puis récupérées par centrifugation (4 000 t/min pendant 10 min). Le surnageant de culture est séparé et conservé. Les cellules sont remises en suspension dans 500 lit de tampon phosphate (PBS) contenant des inhibiteurs de protéases, puis soumis à une sonication pendant 90 sec. Les cellules intactes ont été récupérées par centrifugation et le surnageant de centrifugation (contenant l'extrait cellulaire soniqué) est séparé et conservé à 4°C.

C) Purification de la protéine de fusion.

La protéine de fusion AChE-scFv a été purifiée par chromatographie d'affinité, comme décrit par Cousin et al. (1996b) ou Frobert et al. (1997). Un gel de chromatographie d'affinité pour l'AChE a été préparé en couplant le ligand m-

carboxyphényldiméthyléthyle au support de chromatographie EAH Sepharose 4B (Massoulié et al., 1976). Le surnageant de culture des cellules COS (3 ml) a été dialysé contre une solution de phosphate de potassium à 0,1 M à pH 7,4, puis charge sur une colonne contenant 1 ml de gel d'affinité et équiïibré avec un tampon identique au tampon de dialyse. La colonne est lavée avec 2 ml du tampon d'équilibrage, puis avec 2 ml de solution de NaCl à 0,25 M dans le tampon d'équilibrage.

L'échantillon est élue avec 2 ml de solution NaCl A 0,25 M, décaméthonium A 20 mM, phosphate de potassium A 0,1 M à pH 7,4. Les fractions d'élution contenant une activité AChE ont été réunies puis dialysées contre une solution tampon de phosphate de potassium à 0,05 M à pH 7,4 pendant 72 heures à une température de 4°C.

D) Mesure de l'activité AChE.

L'activité acétylcholinestérase a été déterminée par colorimétrie, selon la technique décrite par Ellman et al. en 1961.

E) Détection de la protéine de fusion par ELISA.

Les puits de plaques de microtitration ont été incubés avec la sous-unité CA de la crotoxine (100 141 par puits dans une solution de PBS contenant une concentration de 1 jig/ml de CA) pendant 2 heures A 37°C. Les sites libres de la surface des puits de microplaques sont ensuite saturés en incubant chacun d'entre eux avec 100 fil d'une solution de PBS (tampon PBS-Tween-SAB) contenant 3 % de sérum albumine bovine (SAB) et 0,1 % de Tween-20.

Les surnageants de cultures des cellules COS et les extraits cellulaires ont fait l'objet de dilutions en série dans du tampon PBS-Tween-SAB. Une fraction aliquote de 100 ; nl de chaque dilution est ajoutée dans chacun des puits et les plaques de microtitration ont été incubées pendant 1 heure à 37°C.

Deux méthodes de détection ont été utilisées : -l'activité acétylcholinestérase (AChE) a été mesurée en ajoutant 100 1 de réactif d'Ellman par puits de microplaque et en déterminant la densité optique à 415 nm après des temps d'incubation variables ; -la protéine de fusion a été détectée en ajoutant, dans chacun des puits, 100 y1 d'une solution au 1/SOOème de l'anticorps monoclonal 9E10, spécifique du

polypeptide cmyc, dans du tampon PBS-Tween-SAB et en incubant durant 1 heure à 37°C. Les puits de microplaques sont ensuite lavés avec une solution de PBS contenant 20 % de Tween-20 (tampon PBS-Tween), puis incubes avec un anticorps anti igG de souris conjugue à ! a péroxydase. La microplaque est ensuite à nouveau lavée, incubée avec le substrat o-phénylènediamine (OPD) et l'activité enzymatique est calculée à partir des mesures de densité optique à 490 nm.

F) ;) Affinité de la protéine de fusion.

La protéine de fusion AChE-scFv a été incubée pendant une nuit à 4°C, à la dilution appropriée (comme déterminée par les expériences d'ELISA direct) avec plusieurs concentrations de sous-unité CA de la crotoxine. Des fractions aliquotes de 100 jil ont été transférées dans les puits d'une plaque de microtitration préalablement incubée avec ! a sous-unité ÇA, et la plaque a été soumise à une incubation de 30 min à 37°C. La plaque a ensuite été lavée avec du tampon PBS-Tween et l'activité AChE résiduelle a été déterminée comme décrit précédemment, après incubation de la plaque pendant 4 heures à 37°C.

G) Analyse de la protéine de fusion par électrophorèse.

La solution contenant la protéine purifiée par chromatographie d'affinité a été concentrée par centrifugation sur une membrane Centricon (Amicon, Grasse, France) puis soumise à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide-SDS à 12,5 % à 1'aide d'un appareil Phastsystem (Pharmacia, Uppsala, Suède). Le gel a été coloré à l'aide du kit « colloidal Coomassie » (Novex, San Diego, CA, USA).

Exemples Exemple 1 : Séquence du gène codant pour la protéine de fusion.

La séquence du gène de fusion synthétique AChE-scFv, codant le domaine cmyc de l'AChE et le fragment scFvI12, est représentée sur les figures 1A et 1B. On s'attend à ce que seul le domaine catalytique soit présent dans le produit d'expression de l'AChE mature, du fait que 1'enzyme subit une maturation postraductionnelle aboutissant à la sécrétion dans le venin d'une enzyme dont une partie de l'extrémité C- terminale a été clivée. Des études sur 1'expression de ce gène ont montré que ce clivage a lieu dans les cellules COS (Cousin et al., 1996a). Le domaine cmyc est

reconnu par l'anticorps 9E10, facilitant ainsi la détection de la protéine de fusion. Le domaine scFvI12 code un anticorps reconnaissant la sous-unité ÇA de la crotoxine (Choumet et al., 1997).

Exemple 2 : Expression de la a protéine de fusion AChE-scFv dans les cellules COS.

La production de la protéine de fusion AChE-scFv par les cellules COS transfectées avec le vecteur pC-AChE-scFv a été testée en mesurant l'activité AChE dans le milieu de culture et dans les extraits cellulaires obtenus par sonication des cellules (Tableau 2). Le vecteur pCB1 a été utilisé comme témoin positif et le vecteur pCDNA3 dépourvu d'insert a été utilisé comme témoin négatif pour la transfection des cellules COS.

Tableau 2 : Mesure de l'activité AChE dans les extraits cellulaires Vecteur Activité enzymatique Concentration déduite (*) (U/ml) (, ug/ml) Extraits cellulaires Pcdna3 8,5 1,14 0,112 t 0,15 Pcbl 30,3 4,36 0,401 0,057 pC-AChE-scFv 74,56 zi : 7,14 0,985 ~ 0, 09 Surnageants culture Pcdna3 34,82 0,461 pcBl 52,2 0,691 pC-AChE-scFv 102,7 1,36 (*) La concentration a été calculée en postulant que la constante catalytique de la protéine de fusion est identique à celle de l'AChE du venin de Bungarus fasciatus.

L'activité AChE a été détectée dans les surnageants de cellules transfectées avec le vecteur dépourvu d'insert, vraisemblablement du fait de la sécrétion de AChE

native dans les cellules COS. Des niveaux d'activité beaucoup plus grands ont été détectés dans les cellules transfectées avec les vecteurs AChE-scFv ou pCB1.

Exemple 3 : Propriétés fonctionnelles de la protéine de fusion AChE-scFv.

La protéine de fusion AChE-scFv a été détectée dans des extraits cellulaires par ELISA. La plaque de microtitration a été incubde avec la sous-unité CA de la crotoxine et l'anticorps 9E10, spécifique du polypeptide cMyc, a été utilisé lors de l'étape de détection (figure 2A). Le témoin négatif est constitué du surnageant de lysat des cellules transfectées avec le vecteur pCBl puis détruites par sonication.

Une protéine contenant à la fois le fragment scFv et le polypeptide cMyc est présent dans le milieu de culture des cellules COS transfectées avec le vecteur pC- AChE-scFv.

Une telle protéine n'a pas été détectée dans le surnageant des cellules COS transfectées avec le vecteur pCBI. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant les surnageants de culture des cellules COS transfectées (résultats non représentés).

La protéine de fusion a été également détectée en utilisant un test ELISA dans lequel les puits d'une plaque de microtitration sont incubés avec la sous-unité CA de la crotoxine et la protéine est détectée par mesure directe de l'activité AChE. La protéine de fusion a été détectée spécifiquement dans les cellules COS transfectées avec le vecteur pC-AChE-scFv. Cette méthode de détection est extrêmement sensible, du fait qu'un niveau d'activité significativement positif par rapport à un témoin négatif a été obtenu pour des dilutions du conjugué aussi importantes que 1/2000 (figure 2B).

L'anticorps 9E10 anti-cmyc n'est capable de détecter le conjugué qu'au plus à la dilution 1/180 (figure 2A).

Comme déterminé par les tests ELISA, la liaison de la construction AChE- scFv avec la sous-unité CA de la crotoxine immobilisée est déplacée de manière dose- dépendante par la sous-unité CA de la crotoxine libre, à des concentrations entre 4 x 10'6 et 6 x 10 10 M. On observe 50 % d'inhibition pour une concentration de la sous- unité de CA de 5 x 10'9 M (figure 3). Ainsi, l'activité AChE mesurée est associée au fragment scFv, qui reconnaît la sous-unité CA de la crotoxine fixée sur la plaque de microtitration. La CI50 de la sous-unité CA sur le complexe AChE-scFv est identique à

l'affinité de l'anticorps A-56.36 initial pour la sous-unité ÇA et est identique à l'affinité du fragment scFv libre (Travaux non publiés de Choumet et al.).

Exempte 4 : Purification de la protéine de fusion AChE-scFv et analyse en électrophorèsc.

La protéine de fusion AChE-scFv a été purifiée en une seule étape A partir des surnageants de culture des cellules COS transfectées par le vecteur pCDNA3 contenant le gène chimère AChE-scFvI12, par chromatographie d'affinité retenant l'AChE. Le rendement de purification est de 40 %. La fraction protéique purifiée migre en une seule bande protéique dans un gel de type SDS-PAGE, montrant clairement que la protéine de fusion peut être purifiée simplement et efficacement à partir du milieu de culture cellulaire (figure 4). Le poids moléculaire observé de la protéine de fusion est légèrement supérieur à 94 kDa, ce qui est en accord avec le poids moléculaire de la protéine de fusion (97 kDa), calculé à partir des poids moléculaires de ses composants, scFvI12 (25 kDa) et AChE (72 kDa).

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux des modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Exemple 5 : Obtention de protéines de fusion scFv-AChE avec des scFv anti- interleukine A) Obtention et clonage des scFv anti-interleukine 3 conjugués différents couplant l'acétylcholinestérase (AChE) avec 3 anticorps anti-interleukine ont été obtenus. Les caractéristiques de ces anticorps sont données dans le Tableau 3. La première étape a été l'obtention des scFv correspondants à partir d'hybridomes. Les 3 scFv obtenus correspondent à un anticorps anti-IL-4 (hybridome 12-6-68) et à deux scFv anticorps anti-IL-6 (hybridome H4-10 et H 12-6).

Ces 3 scFv ont été d'abord clones dans un vecteur phagemidique afin d'isoler le ou les clones actifs, puis ont été clones dans le vecteur pC-AChE qui contient déjà le gène

codant pour I'AChE. Les affinités des scFv obtenus à partir des hybridomes H4-10 et H 12-6 ont été comparées à celles obtenues pour les anticorps correspondants (cf.

Tableau 4 ci-après).

Tableau 3 : caractéristiques immunochimiques des anticorps monoclonaux utilisés IL-6AntigèneIL-4 Anticorps 12-6-68 H4-10 H12-6 Isotype yl yl y2a Affinité (109M) 27 0, N3 0,048

Tableau 4 : Comparaison de l'affinité (en Molaire) des anticorps anti-IL-6 et des scFv correspondants H 4-10 H 12-6 ANTICORPS 10-114,8X10-11X scFv 3x10- 5x10-

B) Obtention de la protéine fusion scFv-AChE, expression dans les cellules COS et purification La production de la protéine fusion AChE-scFv dans les cellules COS a été mesurée en dosant l'activité enzymatique. Après culture des cellules, les protéines de fusion ont été purifiées sur colonne de carboxyphényldiméthyl-éthylammonium. Les résultats de purification sont indiqués dans le Tableau 5 ci-après. Tableau 5 : Mesure de l'activité enzymatique après transfection dans les cellules COS (entre parenthèse, concentration calculée). N. E. : Non effectue Avant purification Après purification pC-AChE-0,45 U/ml (0, 006, ug/ml) N. E. scFv 12-6-68 pC-AChE-54,3 U/ml (0,7 yg/ml) 1200 U/ml (16 pg/ml) scFv H4-10 pC-AChE-95,7 U/ml (1, 26 yg/ml) 1900 U/ml (25 Hg/ml) scFv H12-6 pC-AchE 48 U/ml (0,6 yg/ml) N. E.

Exemple 6 : Dosage de l'interleukine 6 par ELISA Le dosage de l'IL-6 a été réalisé en comparant les résultats obtenus avec ceux d'un kit commercial (Pharmingen). Le dosage de l'interleukine a été réalisé par immunoessai selon la technique classique de l'ELISA comprenant : -la fixation d'anticorps anti-interleukine (hybridum H4-10) sur des cupules de microplaque de titration en polystyrène ; -l'incubation d'une solution d'interleukine 6 à différentes dilutions suivie de lavages ; -addition d'anticorps anti-interleukine biotynilé (Kit Pharmingen) ou du conjugué AChe-scFv (hybridome H12-6) suivie de lavages ; -révélation par addition d'un conjugué streptavidine-péroxydase suivie de son substrat P1E pour le Kit Pharmingen, ou par addition directe du substrat acétylthiocholine et DTNB pour le dosage de l'IL-6 par le conjugué AChE-scFv ; et -lecture de l'absorbance à 405-410 nm.

La limite de détection de l'IL-6 est de 10 pg/ml pour le conjugué AChE-scFv H12-6, alors que les performances du kit commercial sont classiques avec une limite de détection de 30 pg/ml (figure 6).

Ces résultats montrent que les conjugués AChE-scFv anti-interleukine selon l'invention permettent de détecter des interleukines avec une sensibilité plus grande

que celle obtenue avec les kits commerciaux tels que celui de Pharmingen. La limite de détection de l'IL-6 en utilisant le couple H4-10/AChE-scFv H12-6 est actuellement de 10 pg/ml d'IL-6. Ceci est inférieur à la limite de détection par les kits commerciaux et correspond aux besoins exprimés en clinique.

D'autre part, la sensibilité d'un tel dosage selon l'invention pourrait être certainement amélioré par l'utilisation de substrats fluorogéniques au lieu de substrats chromogéniques qui sont de 100 à 10 000 fois plus sensibles.

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