KIM JIN-HYUCK (KR)
HONG SUNG-WON (KR)
NAM YONG-SUK (KR)
KIM JIN-HYUCK (KR)
HONG SUNG-WON (KR)
| US20050250092A1 | 2005-11-10 | |||
| US20070037137A1 | 2007-02-15 |
HUSNJAK, K. ET AL.: "Comparison of five different polymerase chain reaction methods for detection of human papillomavirus in cervical cell specimens", J. VIROL. METHODS., vol. 88, no. 2, August 2000 (2000-08-01), pages 125 - 134
HUANG, S. ET AL.: "Thermodynamically modulated partially double-stranded linear DNA probe design for homogeneous real-time PCR", NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 35, no. 16, 9 August 2007 (2007-08-09), pages 1 - 12
DATABASE NCBI GENBANK 12 August 2002 (2002-08-12), Database accession no. AF486347
DATABASE NCBI GENBANK 12 August 2002 (2002-08-12), Database accession no. AF486349
| 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 34의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58에 특이적인 프라이머 쌍; 및 서열번호 37의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 43의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 46의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 47의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 49의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 52의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 53의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42에 특이적인 프라이머 쌍; 서열번호 55의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 56의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 43에 특이적인 프라이머 쌍; 및 서열번호 58의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 59의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44에 특이적인 프라이머 쌍; 으로 이루어진 군으로부터 선택된 3종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 HPV 검출용 프라이머. |
| 제1항에 있어서, 상기 HPV 검출용 프라이머는 내부 양성 대조로 서열번호 61의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 62의 염기서열로 이루어진 인간 β-액틴 특이적인 프라이머 쌍을 더욱 포함하는 HPV 검출용 프라이머. |
| 제1항에 따른 HPV 검출용 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16 탐지용 프로브; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18 탐지용 프로브; 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26 탐지용 프로브; 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31 탐지용 프로브; 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33 탐지용 프로브; 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35 탐지용 프로브; 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39 탐지용 프로브; 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45 탐지용 프로브; 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51 탐지용 프로브; 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52 탐지용 프로브; 서열번호 33의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56 탐지용 프로브; 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58 탐지용 프로브; 서열번호 39의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59 탐지용 프로브; 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66 탐지용 프로브; 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68 탐지용 프로브; 서열번호 48의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6 탐지용 프로브; 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11 탐지용 프로브; 서열번호 54의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브; 서열번호 57의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브; 및 서열번호 60의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44 탐지용 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 HPV 탐지용 프로브 를 포함하는, HPV를 실시간 PCR로 검출하기 위한 HPV용 검출 세트. |
| 제3항에 있어서, 상기 검출 세트에 포함되는 프라이머 및 프로브는 동일한 HPV 유형을 표적으로 하며, 1종 이상의 HPV 유형을 검출하기 위한 것임을 특징으로 하는 검출 세트. |
| 제3항에 있어서, 상기 PCR은 2종 이상의 프라이머 쌍 및 상기 프라이머 쌍과 동일한 HPV 유형 탐지용 프로브 2종 이상을 이용하여 멀티플렉스(mutiplex) PCR로 실시되는 것을 특징으로 하는 검출 세트. |
| 제3항에 있어서, 상기 HPV 탐지용 프로브는 내부 양성 대조로 서열번호 62의 염기서열로 이루어진 인간 β-액틴 탐지용 프로브를 더욱 포함하는 검출 세트. |
| 제3항에 있어서, 상기 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된, 검출 세트. |
| 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 제6항의 HPV용 검출 세트 1종 이용하여 실시간 PCR을 실시하는 단계; 및 상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 HPV 감염 여부 및 HPV 유형을 판단하는 단계를 포함하며, 사용되는 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 것을 특징으로 하는, HPV의 검출 방법. |
| 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 제3항의 HPV용 검출 세트 2종 이상을 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계; 및 상기 실시간 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하여 HPV 감염 여부 및 HPV 유형을 판단하는 단계를 포함하며, 상기 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 것을 특징으로 하는, HPV의 검출 방법. |
| 제1항에 따른 HPV 검출용 프라이머; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16 탐지용 프로브; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18 탐지용 프로브; 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26 탐지용 프로브; 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31 탐지용 프로브; 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33 탐지용 프로브; 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35 탐지용 프로브; 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39 탐지용 프로브; 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45 탐지용 프로브; 서열번호 27의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51 탐지용 프로브; 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52 탐지용 프로브; 서열번호 33의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56 탐지용 프로브; 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58 탐지용 프로브; 서열번호 39의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59 탐지용 프로브; 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66 탐지용 프로브; 서열번호 45의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68 탐지용 프로브; 서열번호 48의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6 탐지용 프로브; 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11 탐지용 프로브; 서열번호 54의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브; 서열번호 57의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브; 및 서열번호 60의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44 탐지용 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 HPV 탐지용 프로브를 포함하고, 상기 프로브의 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 제3항에 따른 HPV 탐지용 프로브를 포함하는, HPV 검출용 키트. |
| 제10항에 있어서, 상기 프라이머 쌍 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립(strip) 또는 마이크로플레이트에 패키징 되는 것을 특징으로 하는 HPV 검출용 키트. |
본 발명은 인유두종 바이러스 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 멀티플렉스 PCR로 사용가능한 20종의 인유두종 바이러스 유전형 검출용 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용하여 인유두종 바이러스 감염 여부 및 감염된 인유두종 바이러스의 유전형을 확인하는 방법에 관한 것이다.
자궁경부암은 전세계 여성의 암 사망 원인 중 유방암과 폐암에 이어 세 번째를 차지하고 있고, 해마다 약 500,000명에게서 발병하고, 발생 빈도는 유방암에 이어 두 번째로 빈번히 발생한다.
자궁경부암의 발생원인은 다양하여 출산횟수, 첫 성교 연령, 성교 상대자수, 흡연 등이 있으며, 특히 성 접촉으로 감염되는 인유두종 바이러스(Human Papilloma Virus, 이하 'HPV')가 자궁경부 종양의 발생에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. HPV 감염은 생식기 피부접촉만으로도 전염이 가능하고, 모든 성생활을 하는 여성의 약 50~80%가 평생에 한번은 HPV에 감염되며, 그 중 절반 정도가 발암성 HPV인 것으로 추정된다.
HPV는 45~55nm 크기의 이중쇄 환상 DNA 바이러스로 약 8kb의 염기쌍으로 갖으며, HPV 게놈에는 숙주 세포를 감염시킨 후 초기 과정에 관여하는 E1 내지 E7 유전자와 후기 과정에 관여하는 L1, L2 유전자가 존재한다. 현재까지 HPV는 E6, E7, L1 유전자의 ORF(Open Reading Frame) 서열 차이에 따라 100 여종이 넘은 아종(subtype)이 존재하는 것으로 알려져 있다. 이중 30 내지 40종의 HPV는 점막조직 감염을 유발한다. 이외의 대부분의 바이러스는 발바닥 사마귀와 같은 생식기 외의 신체부위에 감염된다.
점막조직 감염을 유발하는 HPV 유형 중에는 자궁경부 표면에 양성의 저등급병변이나 암으로의 진행 가능성이 매우 낮은 생식기 사마귀 등을 유발하는 저위험성(low-risk)의 HPV가 있다. 하지만 이보다 중요한 것은 자궁경부암과 직접 관련이 있는 15종 이상의 고위험성(high-risk)인 발암성 HPV이다. 이러한 발암성 HPV 중 특히 HPV-16, HPV-18 유형이 가장 중요한데 이는 전세계적으로 70% 이상의 자궁경부암에서 발견된다.
일반적으로 대부분의 HPV 감염은 6개월에서 2년 이내에 자연 치유되지만 위험성 HPV에 지속적으로 감염되면 자궁경부암으로 진행될 수 있다. HPV의 경우 한번 감염되었다고 해서 이후 감염에 대한 면역체계가 형성되는 것이 아니며, 또한 HPV 지속적 감염의 위험을 감소시키지도 못한다. 따라서 여성들은 성생활을 지속하는 동안 언제든지 HPV에 감염될 위험이 있다.
현재 HPV 감염 여부 검사는 항원/항체 반응, 염기서열 분석, PCR 그리고 DNA chip 등의 방법을 이용하고 있다. 하지만 항원/항체 반응의 경우 다른 방법들에 비해 정확성이 부족하고, 염기서열 분석의 경우 가장 정확한 결과를 얻을 수 있지만 복수 감염을 확인하기 힘들고 결과 확인에 많은 시간이 소요된다. 또한 PCR의 경우 다수의 시료를 스크리닝 하기에 최적의 방법이지만 다수의 HPV 유전형을 확인하기 위해서는 많은 양의 노동력과 시간을 필요로 한다. DNA chip은 현재 사용하는 방법 중 가장 발전된 방법으로 다수의 HPV 유전형을 한번에 확인할 수 있지만 민감도 및 허위신호(false signal)에 대한 문제가 아직 남아있다.
따라서, HPV의 감염여부와 감염된 HPV의 유전형을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 HPV 검출 방법 및 검출 키트 개발 필요성이 요구되고 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서는 복수의 시료를 적은 노동력으로 빠른 시간 내에 정확하게 분석할 수 있는 실험 방법이 필요한데, 현재 개발된 기술 중 이러한 조건에 가장 부합되는 것은 실시간 PCR(RT-PCR)이라고 할 수 있다.
실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 증가를 PCR의 매 주기마다 실시간으로 관찰하는 방법으로, PCR 증폭산물과 반응하는 형광물질의 검출과 정량으로 해석하는 기술이다. 이 방법은 기존의 PCR법이 최종 단계를 마치고 겔 상에서 염색하여 전기영동 후 PCR 증폭산물을 확인하는 것에 비해, 전기영동의 추가 작업이 필요 없고 정확도 및 민감도가 뛰어나며, 재현율이 높고, 자동화가 가능하고, 결과를 수치화할 수 있으며, 신속하고 간편하며, EtBr(Ethidium Bromide)과 같은 염색제에 의한 오염 및 자외선 조사 등의 유해문제에 따른 생물학적 안전성이 뛰어나고, 자동으로 특이 유전자의 증폭 유무를 확인할 수 있는 진단방법으로, 검출하고자 하는 DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다(Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. 2002. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 30(6):1292-1305).
따라서, 실시간 PCR 방법을 통해 PCR이나 항원/항체와 같은 정성적인 결과가 아닌 정량적인 결과를 확인할 수 있고, 염기서열 분석에 버금가는 높은 특이도를 얻을 수 있다. 또한 형광 표지인자로 표지된 프로브를 이용하기 때문에 DNA chip이나 항원/항체 반응에 사용되는 시료양 보다 적은양의 시료로도 결과를 확인할 수 있다.
이에 본 발명자들은 실시간 PCR을 이용하여 다수 종의 HPV 유형을 동시에 검출할 수 있는 방법 및 키트에 대하여 다각적 연구를 수행하던 중, 하나의 검사 반응물에서 각각의 HPV 유형을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍, 각 증폭된 산물을 탐지하는 프로브, 상기 2종 이상의 프라이머 쌍 및 프로브가 조합된 상태에서도 서로 다른 고유 타겟을 증폭 및 탐지할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브, 검출 조건, 및 검출 결과를 한번에 파악할 수 있는 방법을 확립하게 되었으며, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
상기 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 고위험성 HPV 유형 15종과 저위험성 HPV 유형 6종의 HPV를 정확하고 신속하게 동시에 검출할 수 있는 HPV에 특이적인 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 각각의 HPV 유형에 특이적인 프라이머 쌍과 이의 증폭 산물을 탐지하기 위한 프로브로 이루어진 HPV 검출용 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 2 내지 20종의 HPV 유형을 다양한 조합으로 동시에 검출할 수 있는 HPV 검출용 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 HPV 감염 여부 및 감염된 HPV 유전형을 정확하게 판단할 수 있는 HPV 특이적인 프라이머를 이용한 실시간 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 사용이 용이하며, 단시간에 신속 정확하게 HPV를 검출할 수 있는 검출 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 HPV 검출용 프라이머를 제공한다:
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 19의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 22의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 25의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 28의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 31의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 34의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58에 특이적인 프라이머 쌍; 및
서열번호 37의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 40의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 43의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 44의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 46의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 47의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 49의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 50의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 52의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 53의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42에 특이적인 프라이머 쌍;
서열번호 55의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 56의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 43에 특이적인 프라이머 쌍; 및
서열번호 58의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 59의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44에 특이적인 프라이머 쌍.
또한, 본 발명은 하기 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 HPV 탐지용 프로브를 제공한다:
서열번호 3의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 16 탐지용 프로브;
서열번호 6의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 18 탐지용 프로브;
서열번호 9의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 26 탐지용 프로브;
서열번호 12의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 31 탐지용 프로브;
서열번호 15의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 33 탐지용 프로브;
서열번호 18의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 35 탐지용 프로브;
서열번호 21의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 39 탐지용 프로브;
서열번호 24의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 45 탐지용 프로브;
서열번호 27의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 51 탐지용 프로브;
서열번호 30의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 52 탐지용 프로브;
서열번호 33의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 56 탐지용 프로브;
서열번호 36의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 58 탐지용 프로브;
서열번호 39의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 59 탐지용 프로브;
서열번호 42의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 66 탐지용 프로브;
서열번호 45의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 68 탐지용 프로브;
서열번호 48의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 6 탐지용 프로브;
서열번호 51의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 11 탐지용 프로브;
서열번호 54의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브;
서열번호 57의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 42 탐지용 프로브; 및
서열번호 60의 염기서열로 이루어진 HPV 유형 44 탐지용 프로브.
또한, 본 발명은 상기 HPV 검출용 프라이머 및 상기 HPV 탐지용 프로브를 포함하는, HPV를 실시간 PCR로 검출하기 위한 HPV 검출 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 상기 HPV 검출 세트 1종을 이용하여 실시간 PCR을 실시하는 단계; 및 실시간 PCR 결과를 확인하여 HPV 감염 여부 및 HPV 유형을 판단하는 단계를 포함하며, 사용되는 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된, HPV의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 상기 HPV 검출 세트 2종 이상을 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계; 및 상기 실시간 멀티플렉스 PCR 결과를 확인하여 HPV 감염 여부 및 HPV 유형을 판단하는 단계를 포함하며, 사용되는 프로브의 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된, HPV의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 HPV 검출용 프라이머; 및 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 상기 HPV 탐지용 프로브를 포함하는, HPV 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 HPV 검출 세트 및 검출 방법은 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에 의해 15종의 고위험성 HPV 유형, 6종의 저위험성 HPV 유형을 동시에 검출함으로써, HPV 감염 여부와 감염된 HPV 유전형을 신속 정확하게 판단할 수 있다.
도 1은 실험예 1에서 제작한 서열번호 1 및 서열번호 2의 HPV 유형 16 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 HPV 유형 16 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 1에서 제작한 서열번호 4 및 서열번호 5의 HPV 유형 18 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 HPV 유형 18 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에서 제작한 서열번호 7 및 서열번호 8의 HPV 유형 26 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 HPV 유형 26 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 1에서 제작한 서열번호 10 및 서열번호 11의 HPV 유형 31 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 HPV 유형 31 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1에서 제작한 서열번호 13 및 서열번호 14의 HPV 유형 33 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 HPV 유형 33 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 실험예 1에서 제작한 서열번호 16 및 서열번호 17의 HPV 유형 35 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 HPV 유형 35 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실험예 1에서 제작한 서열번호 19 및 서열번호 20의 HPV 유형 39 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 HPV 유형 39 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실험예 1에서 제작한 서열번호 22 및 서열번호 23의 HPV 유형 45 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 HPV 유형 45 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실험예 1에서 제작한 서열번호 25 및 서열번호 26의 HPV 유형 51 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 HPV 유형 51 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실험예 1에서 제작한 서열번호 28 및 서열번호 29의 HPV 유형 52 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 HPV 유형 52 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 1에서 제작한 서열번호 31 및 서열번호 32의 HPV 유형 56 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 HPV 유형 56 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 1에서 제작한 서열번호 34 및 서열번호 35의 HPV 유형 58 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 HPV 유형 58 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 1에서 제작한 서열번호 37 및 서열번호 38의 HPV 유형 59 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 39의 HPV 유형 59 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 1에서 제작한 서열번호 40 및 서열번호 41의 HPV 유형 66 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 42의 HPV 유형 66 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 1에서 제작한 서열번호 43 및 서열번호 44의 HPV 유형 68 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 45의 HPV 유형 68 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 1에서 제작한 서열번호 46 및 서열번호 47의 HPV 유형 6 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 48의 HPV 유형 6 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실험예 1에서 제작한 서열번호 49 및 서열번호 50의 HPV 유형 11 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 51의 HPV 유형 11 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실험예 1에서 제작한 서열번호 52 및 서열번호 53의 HPV 유형 42 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 54의 HPV 유형 42 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 실험예 1에서 제작한 서열번호 55 및 서열번호 56의 HPV 유형 43 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 57의 HPV 유형 43 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 실험예 1에서 제작한 서열번호 58 및 서열번호 59의 HPV 유형 44 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 60의 HPV 유형 44 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 실험예 1에서 제작한 서열번호 61 및 서열번호 62의 인간 β-액틴 특이적 프라이머 쌍 및 서열번호 60의 인간 β-액틴 탐지용 프로브를 사용하여 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 실시예 1의 3종의 고위험성 HPV 유형 16, 56 및 58에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 58 및 58 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 실시예 2의 3종의 고위험성 HPV 유형 18, 52 및 33에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 18, 52 및 33 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 실시예 3의 3종의 고위험성 HPV 유형 39, 35 및 45에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 39, 35 및 45 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 실시예 4의 3종의 고위험성 HPV 유형 51, 31 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 51, 31 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 실시예 5의 3종의 고위험성 HPV 유형 39, 35 및 45에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 58 및 58 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 27은 실시예 6의 3종의 저위험성 HPV 유형 6, 11 및 42에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 6, 11 및 42 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 실시예 5의 3종의 고위험성 HPV 유형 43 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 43 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 KoRAS HPV version에서 실시간 PCR 결과 파일을 입력하는 화면의 일예를 보여주는 모식도이다.
도 30은 실시예 8의 12종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 31은 실시예 8의 12종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 32는 실시예 9의 15종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 33은 실시예 9의 15종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 34는 실시예 10의 5종의 저위험성 HPV 유형 6, 11, 42, 43, 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 11, 42, 43, 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 35는 실시예 10의 5종의 저위험성 HPV 유형 6, 11, 42, 43, 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 11, 42, 43, 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 고위험성 HPV 유형 15종, 저위험성 HPV 유형 6종에 특이적인 표적 유전자를 PCR을 통해 증폭시키고, 동시에 증폭 산물에 혼성가능하며 검출가능한 수단으로 표지된 프로브를 반응시킴으로써, 실시간 PCR 방법을 통해 HPV를 검출하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 각 HPV 유형에 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 한 세트로 하여, 1 세트 또는 2세트 이상의 HPV 검출용 세트를 동시에 이용하는 방법으로, HPV 감염 여부 및 감염된 HPV 유전형 확인에 필요한 과정을 현저하게 단축시킨 신속 정확한 방법이다.
본 발명에서 언급한 실시간 PCR 방법은 thermal cycler와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 얻고자하는 DNA의 양을 분석하는 방법을 의미한다. 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 확인을 위한 전기영동이 필요 없으며, 증폭이 지수 함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물량을 비교하여 더욱 정확한 정량이 가능한, 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.
본 발명의 HPV 유형은, 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 고위험성(high-risk group) HPV 15종인 HPV-16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68과 저등급 병변이나 생식기 사마귀 등과 관련이 있는 저위험성(low-risk group) HPV 6종인 HPV-6, 11, 42, 43, 및 44로 이루어진 군으로부터 1종 이상, 바람직하기로는 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종 이상 선택될 수 있다. 가장 바람직하기로는 고위험성(high-risk group) HPV 15종인 HPV-16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68로 이루어진 군으로부터 선택된 3종, 또는 저위험성(low-risk group) HPV 6종인 HPV-6, 11, 42, 43, 및 44로 이루어진 군으로부터 선택된 3종이다.
본 발명의 바람직한 실험예 1을 참조하면, 각각의 HPV 유형에 특이적인 프라이머를 제작하였고, 이때 실시간 PCR시 적합하도록 60 내지 80 bp 로 증폭산물 크기를 조정하여 제작하였다.
아울러, 각 HPV 유형에 특이적인 20종의 프라이머를 여러 세트로 제작한 다음, 비특이적 반응이 일어나지 않는 단일 및 멀티플렉스 PCR 최적조건을 확립하였다. 프라이머와 프로브는 30 - 70% 의 GC를 나타내는 부위에서 약 18 내지 30 nt의 길이로 제작하였고, 이때 모든 프라이머의 Tm 값은 58 내지 60 ℃로 하였다. 프로브는 동일한 HPV 유형에 특이적인 프라이머쌍 내부의 염기서열 중 30 내지 70%의 GC를 나타내는 부위에서 약 13 내지 25 nt의 길이로 제작하였고, 이때 모든 프로브의 Tm 값은 68 내지 70 ℃로 하였다. 각각의 프라이머 쌍과 프로브는 염기서열 분석을 통해 멀티플렉스 PCR 반응시 함께 사용되는 다른 프라이머쌍과 프로브의 반응에 간성을 주지 않는 것을 확인하였다.
이러한 과정으로 제작한, 본 발명의 HPV 검출 세트의 상세한 사항은 하기와 같다.
1) HPV 유형 16
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-TTC GGT TGT GCG TAC AAA GC-3' (서열번호 1)
역방향: 5'-GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA A-3' (서열번호 2)
- 프로브: 5'-FAM-CAC ACG TAG ACA TTC G-MGB-3' (서열번호 3)
- 증폭산물의 크기 : 62bp
2) HPV 유형 18
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-AAG GCA ACA TTG CAA GAC ATT G-3' (서열번호 4)
역방향: 5'-AGA AGG TCA ACC GGA ATT TCA TT-3' (서열번호 5)
- 프로브: 5'-FAM-ATT GCA TTT AGA GCC CC-MGB-3' (서열번호 6)
- 증폭산물의 크기 : 65bp
3) HPV 유형 26
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향: 5'-CTG TGC AGA GCA GTC GAC AGA-3' (서열번호 7)
역방향: 5'-AAG GAC ACG TCT TCC ATT AAC ATC T-3' (서열번호 8)
- 프로브 : 5'-FAM-CGT TCG AGT GCT GGA G-MGB-3' (서열번호 9)
- 증폭산물의 크기 : 64bp
4) HPV 유형 31
- 표적 유전자: E1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ATG GCT GAT CCA GCA GGT ACA-3' (서열번호 10)
역방향 : 5'-CTT CTA CAT AAA ACC AAC CAT TGC AT-3' (서열번호 11)
- 프로브: 5'-VIC- ATG GGG AGG GGA CGG -MGB-3' (서열번호 12)
- 증폭산물의 크기: 64bp
5) HPV 유형 33
- 표적 유전자: E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-TGA TTT GTG CCA AGC ATT GG-3' (서열번호 13)
역방향 : 5'-TTT GCA TTC CAC GCA CTG TAG-3' (서열번호 14)
- 프로브: 5'-NED- ACA ACT ATA CAC AAC ATT G -MGB-3' (서열번호 15)
- 증폭산물의 크기: 64bp
6) HPV 유형 35
- 표적 유전자: E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CAA GAA TTA CAG CGG AGT GAG GTA-3' (서열번호 16)
역방향 : 5'-ATA TGG CTG GCC TTC TCT ATA TAC TAT ACA-3' (서열번호 17)
- 프로브: 5'-VIC-ATG ACT TTG CAT GCT ATG-MGB-3' (서열번호 18)
- 증폭산물의 크기 : 78bp
7) HPV 유형 39
- 표적 유전자: L1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-AGT CTG CAG CCA TTA CAT GTC AA-3' (서열번호 19)
역방향 : 5'-GAC CGT CAT ATG GAT CTT TCT TTT C-3' (서열번호 20)
- 프로브: 5'-FAM- AGG ATG CTC CAG CAC C -MGB-3' (서열번호 21)
- 증폭산물의 크기 : 66bp
8) HPV 유형 45
- 표적 유전자: L1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ATG GCA CAC AAT ATT ATT TAT GGC C-3' (서열번호 22)
역방향 : 5'-CCA TCT GCA AAA AAA TAG GGA ATA C-3' (서열번호 23)
- 프로브: 5'-NED-TGG TAT TAT TAT TTT CCT AAA AAA CGT AAA-MGB-3' (서열번호 24)
- 증폭산물의 크기 : 82bp
9) HPV 유형 51
- 표적 유전자: L1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-TGC CAC TGC TGC GGT TT-3' (서열번호 25)
역방향 : 5'-CCC CAT GCC TAA TAT ATT GCT TAA A-3' (서열번호 26)
- 프로브: 5'-FAM-CCC AAC ATT TAC TCC AAG-MGB-3' (서열번호 27)
- 증폭산물의 크기 : 65bp
10) HPV 유형 52
- 표적 유전자: L1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GGA TTT GGT TGC ATG GAT TTT AA-3' (서열번호 28)
역방향 : 5'-GCT ACA TAT ATC AAT GGG CAC ATC A-3' (서열번호 29)
- 프로브: 5'-VIC-ACC TTG CAA GCT AGT AAA-MGB-3' (서열번호 30)
- 증폭산물의 크기 : 69bp
11) HPV 유형 56
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ATG CAT GGT AAA GTA CCA ACG CT-3' (서열번호 31)
역방향 : 5'-TGT AGG TCA ATT TCT GTT TGA GGT G-3' (서열번호 32)
- 프로브: 5'-VIC- CAA GAC GTT GTA TTA GAA CTA -MGB-3' (서열번호 33)
- 증폭산물의 크기 : 71bp
12) HPV 유형 58
- 표적 유전자 : E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-TCC AGG ACG CAG AGG AGA A-3' (서열번호 34)
역방향 : 5'-TCC AAC GCC TGA CAC AAA TC-3' (서열번호 35)
- 프로브 : 5'-NED-CCA CGG ACA TTG CA-MGB-3'(서열번호 36)
- 증폭산물의 크기 : 55bp
13) HPV 유형 59
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-AGC GAC CAA GAC AGT GTG GAT-3' (서열번호 37)
역방향 : 5'-GTC CAC TGA CAC GCT GGT AGA C-3' (서열번호 38)
- 프로브: 5'-NED-CAC ACA GCA CCC TC-MGB-3'(서열번호 39)
- 증폭산물의 크기 : 59bp
14) HPV 유형 66
- 표적 유전자: E1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GAC AGG GAG ACA GCT CAA CAA TTA-3' (서열번호 40)
역방향 : 5'-TTG CAA CGT CTG TGC ATC TG-3' (서열번호 41)
- 프로브: 5'-VIC-TGC AAG TAC AAA CAG C-MGB-3'(서열번호 42)
- 증폭산물의 크기 : 66bp
15) HPV 유형 68
- 표적 유전자: E1
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GGC CAA TTG TGA AGG TAC CG-3' (서열번호 43)
역방향 : 5'-CTT CTA CAA AAA ACC ATC CGT TAC AC-3' (서열번호 44)
- 프로브 : 5'-NED- TGG GGA CGG GAC GG -MGB-3'(서열번호 45)
- 증폭산물의 크기: 62bp
16) HPV 유형 6
- 표적 유전자: E7
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GAC AGC AAC GTT CGA CTG GTT-3' (서열번호 46)
역방향 : 5'-GAA GCT GTT GCA CTT CTC TGA TGT-3' (서열번호 47)
- 프로브 : 5'-FAM-TGC AGT GTA CAG AAA CA-MGB-3' (서열번호 48)
- 증폭산물의 크기 : 64bp
17) HPV 유형 11
- 표적 유전자: E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GCG AGA CAA CTT TCC CTT TGC-3' (서열번호 49)
역방향 : 5'-TGG TTA ATT TTC CCT TGC AGT TC-3' (서열번호 50)
- 프로브 : 5'-VIC-CGT GTG CCT GTT GCT-MGB-3' (서열번호 51)
- 증폭산물의 크기 : 63bp
18) HPV 유형 42
- 표적 유전자: E6
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GGC AGA ATG TCA GGT ACA TCT GC-3' (서열번호 52)
역방향 : 5'-CCC AAA TTC CTT ACA CAA TTG GTA TAA-3' (서열번호 53)
- 프로브 : 5'-NED-TCA TCA CAG CCA CGC AC-MGB-3' (서열번호 54)
- 증폭산물의 크기 : 69bp
19) HPV 유형 43
- 표적 유전자: E2
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-GTG AAC AAC AGA GGG CTG ACT TT-3' (서열번호 55)
역방향 : 5'-GCT CCC AGG CAC TGT TTA ATA GTT A-3' (서열번호 56)
- 프로브 : 5'-FAM-TGT CTC GTG TTA AAA TAC CT-MGB-3' (서열번호 57)
- 증폭산물의 크기 : 70bp
20) HPV 유형 44
- 표적 유전자: E2
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-ATG GAG ACA ATA GCC AAG CAT TTA G-3' (서열번호 58)
역방향 : 5'-TTG TAA GTT TAT TAC TAT TTT CTT CAT ACA GTT CTA
AC-3' (서열번호 59)
- 프로브 : 5'-VIC-TGT GTG CCA GGA ACA-MGB-3' (서열번호 60)
- 증폭산물의 크기 : 82bp
상기 HPV 검출 세트는 검사의 신뢰도를 높이고, 실험 과정에 사용되는 전체 PCR 튜브에 포함되어 template 및 PCR 조건의 상태 확인을 위해 내부 양성 대조(Internal Positive Control, 이하'IPC')를 추가로 포함할 수 있다. 상기 IPC로β-글로빈, 인간 β-액틴, GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는 인간 β-액틴 유전자를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 제작된 IPC의 상세한 사항은 하기와 같다.
1) IPC
- 표적 유전자 : 인간 β-액틴
- 프라이머쌍
정방향 : 5'-CTG GCA CCC AGC ACA ATG-3' (서열번호 61)
역방향 : 5'-GCC GAT CCA CAC GGA GTA CG-3' (서열번호 62)
- 프로브 : 5'-Cy5-ATC AAG ATC ATT GCT CCT CCT GAG CGC-BHQ2-3'(서열번호 63)
- 증폭산물의 크기 : 69bp
본 발명의 HPV 검출용 세트 총 20종 중 이들의 2종 이상의 조합, 바람직하기로는 3종 이상의 조합을 동시에 사용하여 실시간 PCR을 수행할 수 있다. 이들 총 20종의 HPV 검출용 세트의 조합은 프로브의 3' 및 5' 말단에 검출가능한 수단을 포함하거나, 예컨대 표지되어 있을 수 있다.
이때, 하나의 PCR 반응물에 동시에 사용하는 HPV 검출용 세트의 종류에 따라, 각각의 프로브는 서로 상이한 검출가능한 수단으로 표지된다. 상기 검출가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 모방체 등을 의미한다. 그 예로, 통상적으로 사용되는 형광 표지인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 예로, 형광 표지 인자가 가장 바람직하다. 형광 표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 용이하게 입수가능하다. 형광 표지 인자의 예로는, FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, NED, HEX, TET, SYBR Green, Cy3, Texas Red, RED610, RED670, Cy5™ 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르면 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 인자는 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
일 예로, 형광 표지 인자는 통상의 방법으로 본 발명에 따른 HPV 검출용 세트에 포함된 프라이머, 또는 프로브에 표지된다. 표지 방법은 인터컬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 인터컬레이팅 방법은 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(inter-chelator: SYBR Green I, EtBr 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법으로, 인터컬레이터가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광을 발하며 이 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqMan TM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다. 분자 비콘 방법은 양 말단을 형광 표지인자(FAM, TAMRA 등)과 quencher 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 만드는 올리고뉴클레오티드 프로브(Molecular Beacon probe)를 PCR 반응계에 첨가하는 방법이다. 분자 비콘 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하며 형광 표지인자와 quencher 물질에 근접해 있어 형광발생이 억제되지만, 어닐링 단계에서 주형 DNA와 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화할때 형광 표지인자와 quencher 물질과의 거리가 멀어져 quencher 물질에 의한 억제가 해소됨으로써 프로브상의 형광색소가 형광을 나타내게 된다. 그러나, 혼성화되지 않은 분자 비콘 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않게 된다.
이러한 방법을 본 발명의 HPV를 검출하기 위한 실시간 멀티플렉스 PCR 방법에 적용할 수 있다. 상기한 방법들은 당업계에 공지된 것이므로, 반응 효율, 시간, 형광 표지인자 타입 등을 적절히 고려하여, 특정 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본 발명에서는 일 예로, TaqMan™ 프로브 방법을 사용할 수 있다. 이때 상기 프로브는 5' 말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된다.
본 발명의 HPV를 검출하는 방법에 있어, 멀티플렉스 실시간 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있다. 단일 실시간 PCR과 멀티플렉스 실시간 PCR 반응은 동일한 조건으로 수행될 수 있으며, 일예로 UDG 활성을 위하여 50℃에서 2분간 처리하고, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 15초), 결합 및 연장(annealing & extension, 60℃에서 1분)을 총 40회 실시하는 조건을 취할 수 있다. 실시간 PCR 중 결합 및 연장단계에서 프로브에 의해 생성된 형광을 측정한다.
또한, 본 발명의 HPV 검출용 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여, 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명에 사용가능한 실시간 PCR 기기로는 AB 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Roche 사의 LightCycler ® 480, Stratagene 사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 종료시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 도 22 내지 28과 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동과정없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.
본 발명에서는 일 예로, 자동화 프로그램으로 KoRAS TM (코젠바이오텍)을 사용할 수 있다. 상기 자동화 프로그램을 사용하는 경우 분석된 결과를 O/X 타입 또는 Ct 타입으로 나타낼 수 있어 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
본 발명의 HPV 검출용 세트 및 이를 이용한 HPV 검출 방법에 의해, 기존의 HPV를 식별하기 위한 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다. 이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
또한, 본 발명은 HPV 검출용 프라이머; 및 5' 말단이 서로 다른 색상의 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 HPV 탐지용 프로브를 포함하는, HPV 검출용 키트를 제공한다. 상기 프라이머 쌍 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징된다. 또한, 본 발명의 키트는 텍 중합효소(Taq polymerase), MgCl 2 를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약, 예컨대 실시간 PCR용 마스터 믹스를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 인유두종 바이러스 특이적 프라이머 제조
1-1. 고위험성 HPV 유형 특이적 프라이머 제작
자궁경부암의 원인으로 알려진 15종의 고위험성 인유두종 바이러스, HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66 및 HPV-68 각각에 특이적인 프라이머를 개발하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~80bp 이내로 하였다.
각각의 프라이머는 최초 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 통해 얻은 다수의 동종 DNA를 유사성 분석하여 동종간 염기서열이 모두 일치하는 유전자에서 제작하였다. 제작된 프라이머 염기서열은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 목표가 되는 HPV 유형과의 특이성 부합 여부를 재확인하였다.
제작된 고위험성 HPV 유형별 프라이머의 상세한 사항은 아래 표 1에 나타내었다.
표 1
1-2. 저위험성 HPV 유형 특이적 프라이머 제작
암 발생의 원인은 아니지만 저등급 병변이나 생식기 사마귀 등을 생성하는 인유두종바이러스 중 대표적인 5종 인유두종 바이러스, HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43 및 HPV-44 각각에 특이적인 프라이머를 개발하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~80bp 이내로 하였다.
각각의 프라이머는 최초 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 통해 얻은 다수의 동종 DNA를 유사성 분석하여 동종간 염기서열이 모두 일치하는 유전자에서 제작하였다. 제작된 프라이머 염기서열은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 목표가 되는 HPV 유형과의 특이성 부합 여부를 재확인하였다.
제작된 저위험성 HPV 유형별 프라이머의 상세한 사항은 아래 표 2에 나타내었다.
표 2
1-3. HPV 검출 확인을 위한 Internal Positive Control 프라이머 제작
검사의 신뢰도를 높이고, 실험 과정에 사용되는 전체 PCR tube에 포함되어 template 및 PCR condition의 상태 확인을 위해 사용하기 위해 내부 양성 대조(Internal Positive Control, 이하'IPC')로 인간 β-액틴 특이적인 프라이머를 개발하였다.
이때 RT-PCR 효율의 극대화를 위해 생성되는 PCR 산물의 크기는 60~80bp 이내로 하였다.
각각의 프라이머는 최초 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 통해 얻은 다수의 동종 DNA를 유사성 분석하여 동종간 염기서열이 모두 일치하는 유전자에서 제작하였다. 제작된 프라이머 염기서열은 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)을 이용하여 목표가 되는 인간 β-액틴 유전자와의 특이성 부합 여부를 재확인하였다.
제작된 HPV 검출용 IPC 프라이머의 상세한 사항은 아래 표 3에 나타내었다.
표 3
1-4. 고위험성 HPV 유형 특이적 프로브 제작
프라이머 쌍으로 생성된 PCR 산물 내부에 결합되는 택맨-프로브(TaqMan-probe)를 제작하여 RT-PCR에서 실시간으로 증가하는 PCR 산물의 양을 감지할 수 있도록 하였다.
이렇게 제작된 프로브는 프로브에서 발생되는 형광에 의해 PCR 산물의 양이 확인되므로 기존의 젤 전기 영동 방식에 비해 높은 민감도를 나타낸다.
TaqMan-MGB (Minor Groove binder) 방식의 RT-PCR 용 프로브를 사용하였고, 다중분석을 위해 4가지 종류의 형광 표지인자(FAM, VIC, NED 및 Cy5)를 조합하여 사용하였다.
제작된 고위험성 HPV 유형별 프로브의 상세한 사항은 아래 표 4에 나타내었다.
표 4
1-5. 저위험성 HPV 유형 특이적 프로브 제작
상기 1-4와 동일한 방법으로 저위험성 HPV 유형 특이적 프로브를 제작하였다.
제작된 저위험성 HPV 유형별 프로브의 상세한 사항은 아래 표 5에 나타내었다.
표 5
1-6. HPV 검출 확인을 위한 IPC 프로브 제작
프라이머쌍으로 생성된 PCR 산물 내부에 결합되는 이중 표지 프로브(Dual labeled probe)를 제작하였다.
전체 반응에서 IPC를 확인해야 하므로 다른 프로브에서 사용되지 않는 Cy5 형광 표지 인자를 이용하여 프로브를 제작하였다.
제작된 HPV 검출용 IPC 프로브의 상세한 사항은 아래 표 6에 나타내었다.
표 6
실험예 2: HPV 유형 특이 프라이머 및 프로브의 특이도 검증
2-1. 프라이머 및 프로브의 특이도
실시예 1에서 제작한 각각의 프라이머 쌍 및 프로브의 특이도 확인을 위해, 실험적인 방법으로 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR 기종은 AB-7500-Real time PCR system을 사용하였다. 실시간 PCR 반응 조성 및 온도 조건은 표 7 및 8과 같다.
반응에 사용된 시료는 사용하기 전에 MY09/MY11 프라이머 세트(5'-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3'/5'-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3' )를 이용하여 염기서열을 분석한 후 사용하였다.
PCR 증폭 유무는 KoRAS TM (코젠바이오텍) 프로그램을 이용하여 실시간 관찰하였다.
실시간 PCR의 반응 조성
표 7
실시간 PCR의 온도 조건
표 8
2-1-1. HPV 유형 16 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 16의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, HPV 유형 16 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-2. HPV 유형 18 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 18의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, HPV 유형 18 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-3. HPV 유형 26 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 26의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참조하면, HPV 유형 26 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-4. HPV 유형 31 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 31의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머 쌍 및 서열번호 12의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, HPV 유형 31 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-5. HPV 유형 33 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 33의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, HPV 유형 33 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-6. HPV 유형 35 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 35의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 쌍 및 서열번호 18의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 참조하면, HPV 유형 35 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-7. HPV 유형 39 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 39의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, HPV 유형 39 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-8. HPV 유형 45 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 45의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 22 및 서열번호 23의 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8을 참조하면, HPV 유형 45 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-9. HPV 유형 51 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 51의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참조하면, HPV 유형 51 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-10. HPV 유형 52 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 52의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 28 및 서열번호 29의 프라이머 쌍 및 서열번호 30의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10을 참조하면, HPV 유형 52 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-11. HPV 유형 56 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 56의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 31 및 서열번호 32의 프라이머 쌍 및 서열번호 33의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11을 참조하면, HPV 유형 56 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-12. HPV 유형 58 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 58의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 34 및 서열번호 35의 프라이머 쌍 및 서열번호 36의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 참조하면, HPV 유형 58 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-13. HPV 유형 59 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 59의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 37 및 서열번호 38의 프라이머 쌍 및 서열번호 39의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13을 참조하면, HPV 유형 59 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-14. HPV 유형 66 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 66의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 40 및 서열번호 41의 프라이머 쌍 및 서열번호 42의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14를 참조하면, HPV 유형 66 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-15. HPV 유형 68 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 68의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 43 및 서열번호 44의 프라이머 쌍 및 서열번호 45의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15를 참조하면, HPV 유형 68 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-16. HPV 유형 6 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 6의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 46 및 서열번호 47의 프라이머 쌍 및 서열번호 48의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16을 참조하면, HPV 유형 6 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-17. HPV 유형 11 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 11의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 49 및 서열번호 50의 프라이머 쌍 및 서열번호 51의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17을 참조하면, HPV 유형 11 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-18. HPV 유형 42 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 42의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 52 및 서열번호 53의 프라이머 쌍 및 서열번호 54의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18을 참조하면, HPV 유형 42 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-19. HPV 유형 43 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 43의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 55 및 서열번호 56의 프라이머 쌍 및 서열번호 57의 프로브를 사용하여 상기 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19를 참조하면, HPV 유형 43 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-20. HPV 유형 44 프라이머 및 프로브의 특이도
전기 정제된 HPV 유형 44의 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 58 및 서열번호 59의 프라이머 쌍 및 서열번호 60의 프로브를 사용하여 상기와 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20을 참조하면, HPV 유형 44 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
2-1-21. HPV 검출용 IPC의 특이도
인유두종 바이러스 검출 확인을 위해 제작된 IPC에 대해 전기 정제된 HPV-16, HPV-18, HPV-26, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68 HPV-6, HPV-11, HPV-42, HPV-43 및 HPV-44 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 61 및 서열번호 62의 프라이머 쌍 및 서열번호 63의 프로브를 사용하여 상기와 기재된 방법으로 실시간 PCR을 수행하고, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21을 참조하면, 실험에 사용된 모든 HPV 유형 시료에 대하여 실시간으로 증폭 산물의 검출이 확인되었다.
실험예 3: 프라이머 쌍 및 프로브를 이용한 실시간 멀티플렉스 PCR 방법
3-1. HPV 검출을 위한 다중 검출용 세트
실험예 1에서 제작한 프라이머 쌍 및 프로브를 실시간 PCR 방법으로 단일 용기에서 동시에 수행하였다. 이때 한 튜브에 3종류의 HPV 유형을 확인할 수 있도록 프라이머 쌍 및 프로브 세트를 구성하고, 모든 세트에는 IPC가 포함되었다. 제작된 다중 검출용 세트의 상세한 사항은 아래 표 9에 나타내었다. 실시간 PCR 반응 조성 및 반응 조건은 표 7 및 8과 동일하게 사용하였다.
표 9
상기 표 9에 기재된 실시예 1 내지 7의 HPV 검출 세트로 전기 정제된 HPV DNA 시료로 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응을 실시하고, 그 결과를 도 22 내지 28에 나타낸다.
도 22는 실시예 1의 3종의 고위험성 HPV 유형 16, 56 및 58에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 58 및 58 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 23은 실시예 2의 3종의 고위험성 HPV 유형 18, 52 및 33에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 18, 52 및 33 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 24는 실시예 3의 3종의 고위험성 HPV 유형 39, 35 및 45에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 39, 35 및 45 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 25는 실시예 4의 3종의 고위험성 HPV 유형 51, 31 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 51, 31 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 26은 실시예 5의 3종의 고위험성 HPV 유형 39, 35 및 45에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 58 및 58 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 27은 실시예 6의 3종의 저위험성 HPV 유형 6, 11 및 42에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 6, 11 및 42 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 28은 실시예 5의 3종의 고위험성 HPV 유형 43 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 43 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과이다.
도 22 내지 38을 참조하면, 모든 HPV 시료에 대하여 각각에 해당하는 정확한 PCR 산물이 생성되었음을 알 수 있다.
상기 결과로, 본 발명의 HPV 유형 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하여 HPV 유형을 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
3-2. 자동화 프로그램을 이용한 HPV 검출을 위한 다중 검출용 세트
실험예 1에서 제작한 프라이머 쌍 및 프로브를 실시간 PCR 방법으로 단일 용기에서 동시에 수행하였다. 이때 한 튜브에 12종, 15종, 5종의 HPV 유형을 확인할 수 있도록 프라이머 쌍 및 프로브 세트를 구성하고, 모든 세트에는 IPC가 포함되었다. 제작된 다중 검출용 세트의 상세한 사항은 아래 표 10에 나타내었다. 실시간 PCR 반응 조성 및 반응 조건은 표 7 및 8과 동일하게 사용하였다.
이때 실시간 PCR 을 통해 실험된 결과를 분석하기 위한 자동화 프로그램인 KoRAS(Kogene Real-time Analysis System) HPV version을 이용하였다. 도 29는 상기 KoRAS HPV version에 실시간 PCR 결과 파일을 입력하는 화면의 일예를 보여주는 모식도이다. 상기 프로그램을 통해 실시간 PCR 결과를 CSV 확장자 파일로 추출하고, 이렇게 추출된 파일에는 실험에 사용된 모든 시료의 Ct 밸류가 기록된다. 또한 결과를 Ct 타입 또는 O/X 타입으로 표시하는 것이 가능하다.
표 10
도 30은 실시예 8의 12종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 31은 실시예 8의 12종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 및 59 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 32는 실시예 9의 15종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 33은 실시예 9의 15종의 고위험성 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 및 68 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 34는 실시예 10의 5종의 저위험성 HPV 유형 6, 11, 42, 43, 및 44에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 11, 42, 43, 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 Ct 타입 결과를 나타낸 화면이다.
도 35는 실시예 10의 5종의 저위험성 HPV 유형 6, 11, 42, 43, 및 44/에 특이적인 프라이머 및 프로브 검출 세트로 전기 정제된 HPV 유형 16, 11, 42, 43, 및 44 DNA 주형에 대해 동시에 단일 용기에서 멀티플렉스 PCR 반응시킨 결과를 KoRAS 자동화 분석화 프로그램으로 분석한 O/X 타입 결과를 나타낸 화면이다.
상기 결과로, 본 발명의 HPV 유형 특이적인 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 멀티플렉스 PCR을 실시하여 HPV 유형을 간단하고 신속하게 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.