NANOPARTICULES HYBRIDES

Domaine de l’invention

La présente invention concerne une nanoparticule et son utilisation à titre de médicament ou d’agent de diagnostic. La présente invention concerne également un procédé de préparation d’une nanoparticule.

Arrière-plan technique

Les nanoparticules hybrides combinant une partie métallique associée à un polymère biocompatible et à une molécule thérapeutique sont des nanomédicaments et des agents théranostiques prometteurs, notamment dans le cadre du traitement des cancers. Ces nanoparticules permettent à la fois de transporter les molécules thérapeutiques jusqu’aux cellules cibles et peuvent servir, grâce à leur partie métallique, d’agents photothermothérapeutiques et/ou de marqueurs d’imagerie in vivo.

Ainsi, Emami étal. (2019) Mol. Pharmaceutics 16: 1184-1199 décrivent l’utilisation de nanoparticules hybrides associant une nanoparticule d’or, un polymère biocompatible, le polyéthylène glycol (PEG), une molécule thérapeutique, la doxorubicine, et un anticorps anti- PD-Li, permettant de cibler les cellules de cancer colorectal qui sur-expriment PD-Li, pour détruire des cellules de la lignée cellulaire de cancer colorectal CT-26. Les auteurs montrent que ces nanoparticules facilitent l’entrée de la doxorubicine dans les cellules CT-26, puisque 66% des cellules subissent une apoptose, et que la combinaison du traitement à la doxorubicine et d’une irradiation dans le proche infrarouge abolit de manière significative et synergique la prolifération in vitro des cellules CT-26 en augmentant l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire. Toutefois, l’efficacité photothermo-thérapeutique de ces nanoparticules n’est pas optimale. En effet, ces mêmes nanoparticules sans doxorubicine ne provoquent la mort que d’environ 20% des cellules après irradiation dans le proche infrarouge. En outre, la combinaison de la doxorubicine et de l’irradiation dans le proche infrarouge ne permet de faire passer le taux de survie des cellules CT-26 que d’environ 20% à environ 10% par rapport au même traitement en l’absence d’irradiation.

De ce fait, tout le potentiel thérapeutique de ce type de nanoparticules hybrides n’est pas encore atteint et il serait donc utile de disposer de nanoparticules hybrides, susceptibles de délivrer des molécules thérapeutiques, ayant des propriétés photothermo-thérapeutiques améliorées.

Résumé de l’invention

La présente invention découle de la mise en évidence inattendue par les inventeurs que des nanoparticules hybrides obtenues par chélation d’acide chloraurique avec un peptide de pénétration cellulaire, en particulier l’un des peptides NFL, TAT ou VIM fonctionnalisé avec une biotine et avec du polyéthylène glycol à terminaison acide dicarboxylique (NFL-BIOTINE- PEG-AuNPs, TAT-BIOTINE-PEG-AuNPs, VIM-BIOTINE-PEG-AuNPs) présentent une grande stabilité et biocompatibilité et sont particulièrement adaptées pour le traitement du cancer.

Avantageusement, le procédé d’obtention des nanoparticules selon l’invention, en particulier des nanoparticules NFL-BIOTINE-PEG-AuNPs, TAT-BIOTINE-PEG-AuNPs, et VIM-BIOTINE-PEG-AuNPs, est un procédé simple comprenant peu d’étapes.

En effet, les inventeurs ont mis en évidence que les nanoparticules hybrides NFL- BIOTINE-PEG-AuNPs aux concentrations de 500 pmol/L et 1000 pmol/L entraînent une diminution significative de la viabilité cellulaire de cellules MiaPaCa-2 (lignée cellulaire cancéreuse du pancréas humain) et de cellules F98 (lignée de glioblastome de rat). Les nanoparticules hybrides NFL-BIOTINE-PEG-AuNPs à 100 pmol/L ont également pour effet une diminution significative de la viabilité cellulaire de cellules MiaPaCa-2 et de cellules F98 irradiées après l’administration des nanoparticules.

Les inventeurs ont également mis en évidence que les nanoparticules hybrides TAT- BIOTINE-PEG-AuNPs et VIM-BIOTINE-PEG-AuNPs entraînent une diminution significative de la viabilité cellulaire de cellules F98 (lignée de glioblastome de rat).

Ainsi, la présente invention concerne une nanoparticule comprenant : une association d’au moins un sel métallique et d’au moins un peptide ; et au moins un polymère biocompatible.

La présente invention concerne également une nanoparticule telle que définie ci-dessus pour une utilisation à titre de médicament et/ou d’agent de diagnostic.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus en tant que principe actif, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention concerne également une composition de diagnostic comprenant au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus.

La présente invention concerne également un dispositif médical comprenant au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus.

La présente invention concerne également un procédé de préparation d’une nanoparticule comprenant : une association d’au moins un sel métallique et d’au moins un peptide ; et au moins un polymère biocompatible, comprenant : une étape dans laquelle le sel métallique est chélaté avec le peptide ; une étape de mélange avec le polymère biocompatible ; et une étape de réduction du mélange par un agent réducteur.

Description détaillée de l’invention

Comme on l’entend ici, le terme « comprenant » est synonyme « d’incluant », « contenant » ou « englobant » c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » un ou plusieurs éléments, d’autres éléments que ceux mentionnés peuvent également être compris dans l’objet. A l’inverse, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » un ou plusieurs éléments, l’objet ne peut pas comprendre d’autres éléments que ceux mentionnés.

On entend par « biocompatible » au sens de l’invention la capacité d’un matériau à être compatible avec un milieu biologique, notamment un tissu ou un fluide d’un organisme vivant. Ainsi, un matériau biocompatible au sens de l’invention peut être utilisé dans une composition pharmaceutique, dans une composition de diagnostic, dans un dispositif médical, par exemple à des fins de diagnostic ou thérapeutique.

On entend par « biopolymère » ou « polymère naturel » au sens de l’invention un polymère qui peut être produit par un organisme vivant, tel que par exemple un animal, un végétal ou un champignon.

Sel métallique

On entend par sel métallique au sens de l’invention, les oxydes de métaux et les sels issus de l’action d’un acide sur un métal. De préférence, le sel métallique selon l’invention est issu de l’action d’un acide sur un métal.

De préférence également, le sel métallique selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué d’un sel de métal de transition, d’un sel de lanthanide, d’un sel de métal alcalino-terreux et des mélanges de ceux-ci.

Plus préférablement, le sel métallique selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué d’un sel d’or (Au), de Selenium (Se) de gadolinium (Gd), de cobalt (Co), d’europium (Eu), de terbium (Tb), de cérium (Ce), de manganèse (Mn), de fer (Fe), de zinc (Zn) et de cuivre (Cu).

De préférence, également le sel métallique selon l’invention est un sel métallique d’acide inorganique. A titre d’exemple de sel métallique d’acide inorganique selon l’invention, il est possible de citer les sulfates, les chlorures, les nitrates, les phosphates et les carbonates.

Plus préférablement, le sel métallique selon l’invention est l’acide chloraurique HAUC1 ₄ .

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le sel métallique selon l’invention n’est pas un sel de fer ou un oxyde de fer. Peptide

De préférence, le peptide selon l’invention est une séquence d’acides aminés isolée ne comprenant pas plus de too acides aminés. De préférence également, le peptide selon l’invention comprend entre 2 et too acides aminés, par exemple entre 2 et 90, entre 2 et 80, entre 2 et 70, entre 2 et 60, entre 2 et 50 et entre 2 et 40 acides aminés. De préférence, le peptide selon l’invention comprend au moins 2 acides aminés, par exemple au moins 3, au moins 4, au moins 5, au moins 6, au moins 7, au moins 8, au moins 9 et au moins 10 acides aminés. Plus préférablement, le peptide selon l’invention comprend entre 2 et 40 acides aminés par exemple, entre 10 et 40 acides aminés ou entre 10 et 30 acides aminés.

Le peptide selon l’invention peut être choisi parmi n’importe quel peptide biocompatible bien connu de l’homme du métier. De préférence, le peptide selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué d’un peptide chimérique, d’un peptide synthétique et d’un peptide dérivé d’une protéine.

De préférence, le peptide selon l’invention est un peptide capable de pénétrer dans les cellules, en particulier de pénétrer la membrane plasmique des cellules. Plus préférablement, le peptide selon l’invention est un peptide de pénétration cellulaire ou « cell penetrating peptide » (CPP).

De préférence également, le peptide selon l’invention est un peptide capable de traverser la barrière hématoencéphalique.

De préférence, le peptide selon l’invention est un peptide de pénétration cellulaire sélectionné dans le groupe constitué d’un peptide polycationique avec une séquence riche en résidus d'acides aminés chargés positivement comme par exemple la lysine ou l'arginine, d'un peptide amphiphile avec une séquence faisant alterner des résidus polaires électriquement chargés et des résidus apolaires hydrophobes et d’un peptide hydrophobe ne contenant que des résidus apolaires électriquement peu chargés ou hydrophobes.

De préférence, le peptide selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du peptide NFL ayant la séquence d’acides aminés suivante : YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO : 1), du peptide TAT ayant la séquence d’acides aminés suivante : GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO : 2), du peptide VIM ayant la séquence d’acides aminés suivante : GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO : 3), du peptide transportane ayant la séquence d’acides aminés suivante : GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO : 4), du peptide pénétratine ayant la séquence d’acides aminés suivante : RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO : 5), du peptide MAP ayant la séquence d’acides aminés suivante : KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO : 6), du peptide Pep-1 ayant la séquence d’acides aminés suivante : KETWWETWWTEWSQPKKKRKV (SEQ ID NO : 7), du peptide Pept 1 ayant la séquence d’acides aminés suivante : PLILLRLLRGQF (SEQ ID NO : 8), du peptide Pept 2 ayant la séquence d’acides aminés suivante: PLIYLRLLRGQF (SEQ ID NO : 9), du peptide IW-14 ayant la séquence d’acides aminés suivante : KLWMRWYSPTTRRYG (SEQ ID NO : 10), du peptide Ig(v) ayant la séquence d’acides aminés suivante : MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV (SEQ ID NO : 11), du peptide pVEC ayant la séquence d’acides aminés suivante : LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO : 12), du peptide ppTG20 ayant la séquence d’acides aminés suivante : GLFRALLRLLRSLWRLLLRA (SEQ ID NO : 13), du peptide APP ayant la séquence d’acides aminés suivante : APP GLARALTRLLRQLTRQLTRA (SEQ ID NO : 14), du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante RLWMRWYSPRTRAYGC (SEQ ID NO : 15) ; du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante : WRWYCR (SEQ ID NO : 16), du peptide PepFect 14 ayant la séquence d’acides aminés suivante : stéaryl-AGYLLGKLL00LAAAAL00LL-NH2 (SEQ ID NO : 17), du peptide ayant la séquence d’acides aminés suivante : GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO : 18), du peptide HRSV ayant la séquence d’acides aminés suivante : RRIPNRRPRR (SEQ ID NO : 19) ou d’un dérivé de ceux-ci.

Le peptide selon l’invention peut également être un peptide cyclique tel que par exemple le peptide RGD cyclique.

Plus préférablement, le peptide selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du peptide NFL ayant la séquence d’acides aminés suivante : YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO : 1), du peptide TAT ayant la séquence d’acides aminés suivante : GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO : 2), du peptide VIM ayant la séquence d’acides aminés suivante : GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO : 3) ou d’un dérivé de ceux-ci.

Selon un mode de réalisation de l’invention, le peptide selon l’invention n’est pas un peptide ciblant le récepteur EGFR, en particulier un peptide d'acide -lysine-azidoacétique, ou un peptide ciblant les os.

On entend par dérivé peptidique au sens de l’invention les variants et fragments du peptide auquel ils se réfèrent. De préférence, les dérivés, en particulier les variants ou fragments, du peptide selon l’invention sont biologiquement actifs.

On attend par dérivé biologiquement actif du peptide selon l’invention les variants et fragments conservant l’activité biologique et la spécificité du peptide parent.

Le variant du peptide selon l’invention peut être choisi parmi n’importe quel variant bien connu de l’homme du métier. A titre d’exemple de variant selon l’invention, il est possible de citer un variant allélique du peptide, et un variant peptidomimétique du peptide.

Un variant allélique du peptide selon l’invention a la même séquence d'acides aminés que le peptide selon l’invention, en particulier que SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO =7, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :1O, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18, ou SEQ ID NO : 19 sauf qu’un ou plusieurs acides aminés ont été remplacés par d'autres acides aminés ou supprimés, le peptide final conservant la spécificité du peptide parent.

De préférence, le peptide selon l’invention possède au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide parent, en particulier par rapport à SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO :6, SEQ ID NO =7, SEQ ID NO :8, SEQ ID NO :9, SEQ ID NO :1O, SEQ ID NO :11, SEQ ID NO :12, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15, SEQ ID NO :16, SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :18 ou SEQ ID NO : 19.

De préférence également, le variant selon l’invention a le même nombre d’acides aminés que le peptide dont il dérive.

Le pourcentage d’identité entre deux séquences peptidiques est bien connu de l’homme du métier. A titre d’exemple, le pourcentage d’identité entre deux séquences peptidiques peut être déterminé en effectuant un alignement de séquence sur toute la longueur des séquences similaires et en déterminant le nombre de positions pour lesquelles les acides aminés sont identiques dans chaque séquence et en divisant ce nombre par le nombre total d'acides aminés de la séquence la plus longue.

Le variant peptidomimétique selon l’invention, est de préférence une molécule organique qui imite certaines propriétés du peptide parent. Les variants peptidomimétiques préférés selon l’invention sont obtenus par modification structurelle des peptides selon l'invention, par exemple en utilisant des acides aminés non naturels tel qu’un acide aminé D au lieu d'un acide aminé L, des contraintes conformationnelles, un remplacement isostérique, une cyclisation ou d'autres modifications.

A titre d’exemple d'autres modifications il est possible de citer, les modifications suivantes : remplacement d’une ou plusieurs liaisons amides par une liaison non-amide ; remplacement d’une ou plusieurs chaînes latérales d'acides aminés par une fraction chimique différente ; protection d’une ou plusieurs extrémités N-terminale, C-terminale ou chaîne latérale par un groupe protecteur ; introduction d’une double liaison ou d’un cycle dans la chaîne principale. Avantageusement, les modifications ont pour effet d’augmenter la rigidité, l’affinité de liaison, la résistance à la dégradation enzymatique, la biodisponibilité et plus généralement d’améliorer les propriétés pharmacocinétiques du peptide selon l’invention.

Ainsi, compte tenu des séquences peptidiques du peptide selon l’invention, l'homme du métier est en mesure de concevoir et de produire des variants peptidomimétiques ayant des caractéristiques biologiques similaires ou supérieures aux peptides selon l’invention, en particulier aux peptides de pénétration cellulaire, plus particulièrement aux peptides NFL, TAT et VIM selon l’invention.

Le peptide NFL, aussi nommé NFL-TBS40-63 ci-après, est un polypeptide de 24 acides aminés ayant la séquence suivante : YSSYSAPVSSSLSVRRSYSSSSGS (SEQ ID NO : 1). Ce peptide est bien connu de l’homme du métier et correspond au deuxième site de liaison à la tubuline de la sous-unité des neurofilaments légers (acides aminés 40 à 63 du site TBS de la protéine NFL).

Dans un mode de réalisation de l’invention, le peptide selon l’invention est un dérivé du peptide NFL, en particulier un variant ou un fragment de celui-ci. De préférence, les fragments et variants du peptide NFL sont biologiquement actifs.

De préférence, le fragment du peptide NFL selon l’invention comprend au moins 12 acides aminés successifs du peptide NFL parent, de préférence au moins 16, plus préférentiellement au moins 18 acides aminés.

De préférence, le variant selon l’invention comprend au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide NLF. A titre d’exemple de variant allélique du peptide NFL, il est possible de citer le motif TBS de la sous-unité légère du neurofilament de la caille, qui retient 20 sur 24 acides aminés du peptide NFL-TBS40-63.

Le peptide TAT, aussi nommé TAT48-60 ci-après, est un peptide de 13 acides aminés ayant la séquence suivante GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO : 2). Ce peptide bien connu de l’homme du métier correspond aux résidus 48 à 60 de la protéine TAT impliquée dans la réplication du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1).

Dans un mode de réalisation de l’invention le peptide selon l’invention est un dérivé du peptide TAT, en particulier un variant ou un fragment de celui-ci. De préférence, le dérivé du peptide TAT selon l’invention est biologiquement actif.

De préférence, le fragment du peptide TAT selon l’invention comprend au moins 5 acides aminés successifs du peptide parent TAT, de préférence au moins 6, au moins 7, au moins 8 acides aminés.

De préférence, le variant selon l’invention comprend au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide TAT.

Le peptide VIM est un peptide de 24 acides aminés ayant la séquence suivante : GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ (SEQ ID NO : 3).

Dans un mode de réalisation de l’invention le peptide selon l’invention est un dérivé du peptide VIM, en particulier un variant ou un fragment de celui-ci. De préférence, le dérivé du peptide VIM selon l’invention est biologiquement actif.

De préférence, le fragment du peptide VIM selon l’invention comprend au moins 12 acides aminés successifs du peptide VIM parent, de préférence au moins 14, au moins 16 et plus préférentiellement au moins 18 acides aminés. De préférence, le variant du peptide VIM selon l’invention comprend au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide VIM.

Le peptide pénétratine est un fragment long de 16 résidus ayant la séquence d’acides aminés suivante : RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO : 5). Ce peptide bien connu de l’homme du métier est dérivé de l'homéodomaine du facteur de transcription de la drosophile Antennapedia.

Dans un mode de réalisation de l’invention le peptide selon l’invention est un dérivé du peptide pénétratine, en particulier un variant ou un fragment de celui-ci. De préférence, le dérivé du peptide pénétratine selon l’invention est biologiquement actif.

De préférence, le fragment du peptide pénétratine selon l’invention comprend au moins 5 acides aminés successifs du peptide parent pénétratine, de préférence au moins 6, au moins 7, au moins 8 acides aminés.

De préférence, le variant selon l’invention comprend au moins 70%, au moins 75%, au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% d'identité par rapport au peptide pénétratine.

Le peptide selon l’invention peut être préparé selon n’importe quelle technique bien connue de l’homme du métier, en particulier via une synthèse chimique.

Selon un mode de réalisation, le peptide tel que défini ci-dessus est couplé avec au moins un agent de couplage. Comme on l’entend ici, les expressions « agent de couplage » et « agent de conjugaison » sont interchangeables. Comme on l’entend ici, les termes « couplé », « conjugué », « fonctionnalisé » et « modifié » peuvent être utilisés de manière interchangeable.

L’agent de couplage selon l’invention, peut être choisi parmi n’importe quel agent de couplage bien connu de l’homme du métier.

De préférence, l’agent de couplage selon l’invention est non peptidique.

L’agent de couplage peut être bifonctionnel, de préférence hétérobifonctionnel, tel que l’ester de N-y-maléimidobutyryl-oxysuccinimide (GMBS) et le dérivé sulfo-GMBS, l’ester du m-maléimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimide (MBS) et le dérivé sulfo-MBS, le succinimidyl 4- (N-maléimidométhyl)cyclohexane-i-carboxylate (SMCC), le sulfo-succinimidyl 4-(N- maléimidométhyl)cyclohexane-i-carboxylate (sulfo-SMCC), un carbodiimide, le bisdiazonium-benzidine (BDB) ou le glutaraldéhyde, la biotine, la sulfo-NHS-bitoine ou un fluorophore, aussi connu sous le nom fluorochrome, tel que l’hydroxycoumarine, l’aminocoumarine, la méthoxycoumarine, Cascade Blue, Pacific Blue, Pacific Orange, Lucifer Yellow, NBD, RPhycoerythrin, PE-Cy5 conjugués, PE-Cy7 conjugués, Red 613, PerCP, TruRed, FluorX, fluorescéine, BODIPY-FL, TRITC, X-Rhodamine, Lissamine Rhodamine B, Texas Red, Allophycocyanine, APC-Cy7 conjugués, le 5-carboxytétraméthylrhodamine, le 5.6- carboxytétraméthylrhodamine, le 6-carboxytétraméthylrhodamine, le 5-carboxyfluorescéine, le 5,6-carboxyfluorescéine, le 6-carboxyfluorescéine, et le diméthylaminonaphthylpyridinium.

L’utilisation des agents de couplage est notamment décrite dans le chapitre “Production of Antisera Using Peptide Conjugates” de l’ouvrage de référence “The Protein Protocols Handbook” (2002) qui est incorporé ici par référence.

Lorsque le GMBS, le MBS, le SMCC ou le sulfo-SMCC sont utilisés, ils sont de préférence fixés sur une cystéine (C), qui si elle n’est pas présente dans la séquence du peptide, peut être ajoutée, notamment à son extrémité N-terminale ou C-terminale.

L’agent de couplage selon l’invention peut également être choisi parmi n’importe quel groupement fonctionnel bien connu de l’homme du métier pouvant se lier à un peptide. A titre d’exemple de groupement fonctionnel selon l’invention il est possible de citer le fluor, un groupe phosphate, un groupe acétyle, un groupe alkyl, un résidu d'acide glutamique, un groupe carboxyl, un résidu glycine, un groupe glycosyl, un groupe hydroxyle, un groupe amide et un groupe sulfate.

De préférence, l’agent de couplage selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué de la biotine et de la fluorescéine.

Dans un mode de réalisation, le peptide selon l’invention est fonctionnalisé par au moins une biotine, par exemple par une biotine, par deux biotines ou par trois biotines.

Dans un autre mode de réalisation, le peptide selon l’invention est fonctionnalisé par au moins une fluorescéine, par exemple par une fluorescéine, par deux fluorescéines, par trois fluorescéines.

Le peptide selon l’invention peut être modifié par tout procédé de couplage peptidique classique bien connu de l’homme du métier par exemple par voie chimique ou par voie enzymatique. A titre d’exemple de procédé de modification du peptide selon l’invention, il est possible de citer l’acétylation, l’alkylation, la biotinylation, la glutamylation, la glycylation, la glycosylation, l’hydroxylation, la phosphorylation, la sulfatation, l’amidation, la PEGylation.

De préférence, l’agent de couplage selon l’invention, en particulier la fluorescéine ou la biotine, est lié au peptide selon l’invention de manière covalente.

La fonctionnalisation du peptide selon l’invention par au moins un agent de couplage, en particulier une fluorescéine ou une biotine, peut être effectuée directement sur une amine primaire, une amine secondaire ou les deux.

Dans un mode de réalisation de l’invention, au moins agent de couplage, en particulier une fluorescéine ou une biotine, est lié à l’extrémité N-terminale ou à l’extrémité C-terminale du peptide selon l’invention.

Dans un mode de réalisation de l’invention, la fonctionnalisation du peptide par au moins un agent de couplage, en particulier une fluorescéine ou une biotine, est réalisée avec un intermédiaire bien connu de l’homme du métier sur les fonctions carboxyliques primaires ou secondaires ou les deux. A titre d’exemple d’intermédiaire de liaison, il est possible de citer un carbodiimide tel que le i-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide.

Polymère biocompatible

Le polymère biocompatible selon l’invention peut être un polymère naturel ou synthétique et peut être sélectionné parmi n’importe quel polymère biocompatible bien connu de l’homme du métier.

De préférence, le polymère biocompatible selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué des polymères biocompatibles synthétiques, des biopolymères et des polymères biocompatibles thermosensibles.

Plus préférablement, le polymère biocompatible selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du polyéthylène glycol (PEG), du polyéthylène glycol diacide (PEG- diacide), du polyéthylène glycol diamine (PEG-diamine), du collagène, de l’alginate, de l’élastine, de l’acide hyaluronique, de la cellulose, de la gélatine, de l’acide polylactique, de maltodextrine, d’un polymère de glucose, d’un polymère de lactose, du chitosan, du dextran, d’un polymère thermosensible, du poly(N-isopropylacrylamide), du poly[2- (diméthylamino)éthyl méthacrylate de méthyle] (pDMAEMA), de l'hydroxypropylcellulose , du poly(vinylcaprolactame) et du polyvinyle méthyl éther) ou d’une combinaison de ceux-ci.

Plus préférablement, le polymère biocompatible est le polyéthylène glycol dicarboxylique.

Nanoparticule

De préférence, la nanoparticule selon l’invention a un diamètre compris entre 5 nm et 500 nm, plus préférablement entre 5 nm et 200 nm par exemple entre 5 nm et 150 nm, entre 5 nm et 100 nm, entre 5 nm et 90 nm. Plus préférablement, la nanoparticule selon l’invention à un diamètre compris entre 20 nm et 200 nm, par exemple entre 20 nm et 150 nm, ou entre 20 nm et 100 nm.

De préférence, le peptide selon l’invention est à l’intérieur de la nanoparticule selon l’invention. Ainsi, avantageusement le peptide adopte une configuration stérique permettant de conserver et/ ou d’améliorer l’activité thérapeutique du peptide sans impacter la stabilité de la nanoparticule.

De préférence, le sel métallique est chélaté par le peptide selon l’invention.

De préférence, le sel métallique et le peptide sont encapsulés par le polymère.

De préférence, la nanoparticule selon l’invention est préparée selon le procédé comprenant les étapes suivantes : une étape dans laquelle le sel métallique est chélaté avec le peptide ; une étape de mélange avec le polymère biocompatible ; et une étape de réduction du mélange par un agent réducteur.

De préférence, l’étape dans laquelle le sel métallique est chélaté avec le peptide comprend la dissolution du sel métallique, de préférence dans une solution aqueuse, et l’ajout du peptide dans la solution de sel métallique.

Avantageusement, le polymère biocompatible est utilisé comme agent stabilisant.

De préférence, le procédé de préparation de la nanoparticule selon l’invention est réalisé en l’absence de tensioactif autre que le polymère biocompatible et en l’absence de liant chimique.

De préférence, l’agent réducteur selon l’invention peut être n’importe quel agent réducteur bien connu de l’homme du métier. A titre d’exemple d’agent réducteur selon l’invention il est possible de citer LiAlHq, NaBHq, NaHg, B2H6, SO2. De préférence, l’agent réducteur selon l’invention est NaBHq.

Le procédé de préparation de la nanoparticule selon l’invention peut également comprendre une étape de centrifugation de la solution de nanoparticule, de préférence après l’étape de réduction, afin d’éliminer l’excès de polymère biocompatible.

Avantageusement, la nanoparticule selon l’invention est stable. De préférence, la nanoparticule selon l’invention est stable et son activité biologique, en particulier les propriétés de ciblage et d'internalisation cellulaire du peptide, est maintenue pendant au moins 2 mois, 4 mois, 6 mois, 8 mois, 10 mois, 12 mois, 14 mois, 16 mois, 18 mois, 20 mois, 22 mois, ou 24 mois.

Utilisation

Les nanoparticules selon l’invention sont particulièrement adaptées à une utilisation à titre de médicament et/ou d’agent de diagnostic chez un individu.

Les nanoparticules selon l’invention sont particulièrement adaptées à une utilisation à titre d’agent théranostique.

Les nanoparticules selon l’invention sont également particulièrement adaptées à une utilisation dans un dispositif médical destiné à être utilisé chez un individu.

Ainsi, un mode de réalisation de la présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant au moins une nanoparticule selon l’invention en tant que principe actif, éventuellement en association avec un véhicule ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une nanoparticule selon l’invention pour la fabrication d’un médicament, en particulier un médicament pour la prévention ou le traitement du cancer, notamment pour la prévention ou le traitement du glioblastome ou du cancer du pancréas.

La présente invention concerne également l’utilisation d’au moins une nanoparticule selon l’invention pour le ciblage, la détection et la destruction des cellules cancéreuses. La présente invention concerne également une méthode de traitement du cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas, chez un individu comprenant l’administration à l’individu d’une quantité efficace d’au moins une nanoparticule ou d’une composition pharmaceutique ou d’un médicament selon l’invention.

La présente invention concerne également une composition de diagnostic comprenant au moins une nanoparticule selon l’invention en tant que principe actif, éventuellement en association avec un véhicule ou un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Le dispositif médical selon l’invention comprend de préférence au moins une nanoparticule selon l’invention. De préférence, le dispositif médical selon l’invention est utilisé pour le diagnostic, la prévention ou le traitement du cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas. Le dispositif médical selon l’invention peut être choisi parmi n’importe quel dispositif médical bien connu de l’homme du métier. De préférence, le dispositif médical selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué d’un dispositif d’imagerie médicale ou d’un dispositif implantable tel qu’un implant, un stent, un cathéter. Par dispositif implantable, on entend tout appareil destiné à être introduit totalement ou partiellement, par une intervention médicale, dans le corps humain ou animal.

Selon un mode de réalisation de l’invention la nanoparticule, la composition pharmaceutique, le médicament ou le dispositif médical selon l’invention est utilisé pour la prévention ou le traitement du cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas.

Selon un mode de réalisation de l’invention la nanoparticule, la composition de diagnostic ou le dispositif médical selon l’invention est utilisé pour la détection de cellules cancéreuses ou de tumeurs, pour le diagnostic d’un cancer, pour le suivi de l’évolution d’un cancer et/ou pour le suivi d’un traitement thérapeutique du cancer.

Selon un mode de réalisation de la présente invention, la nanoparticule, la composition pharmaceutique, la composition de diagnostic, le médicament, ou le dispositif médical est utilisé comme agent de contraste pour l’imagerie de diagnostic telle que la radiographie, l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la spectroscopie Raman, l'imagerie optique, la tomographie par cohérence optique, les rayons X, la tomodensitométrie, la tomographie par émission de positons ou des combinaisons de celles-ci.

Un mode de réalisation de la présente invention concerne, la surveillance de l’administration de la nanoparticule, de sa biodistribution et sa biodisponibilité, de la composition pharmaceutique, du médicament, ou de la composition de diagnostic selon l’invention à un individu par un dispositif de diagnostic et le diagnostic de l’individu.

De préférence, les nanoparticules, le médicament la composition pharmaceutique ou de diagnostic, le dispositif médical selon l’invention sont utilisées dans au moins l’une des situations suivantes : diagnostiquer un cancer, en particulier le glioblastome ou le cancer du pancréas ; déterminer l’état ou l’évolution d’un cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas,

- traiter un cancer, en particulier le glioblastome ou le cancer du pancréas, effectuer le suivi d’un traitement thérapeutique d’un cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas.

Cancer

Le cancer prévenu ou traité selon l’invention peut être n’importe quel cancer connu de l’homme du métier.

Le cancer prévenu ou traité selon l’invention peut être au stade 1, stade 2, stade 3 ou stade 4.

De préférence, le cancer prévenu ou traité selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué des cancers du système nerveux central, du système endocrinien et du système digestif.

De préférence, le cancer prévenu ou traité selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du cancer de la thyroide, du cancer de la parathyroide, du cancer du thymus, du cancer de l’ovaire, du cancer des testicules, du cancer des îlots pancréatiques, du cancer de la vésicule biliaire, du cancer de l’estomac, du cancer de l’œsophage, du cancer du côlon, du glioblastome, du cancer du foie, du cancer du pancréas, du cancer du rectum, du cancer de l’intestin, du cancer de l’intestin grêle. Plus préférablement, le cancer prévenu ou traité selon l’invention est sélectionné dans le groupe constitué du glioblastome et du cancer du pancréas.

Selon un mode de réalisation de l’invention, la nanoparticule, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical selon l’invention est particulièrement adapté pour une utilisation en thérapie photothermique, en particulier, pour le traitement du cancer par photothermie.

La photothermie est une méthode de traitement de cancer bien connue de l’homme du métier. De préférence, la nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique ou le médicament selon l’invention est injecté dans la circulation sanguine de l’individu, de préférence par injection intraveineuse. La nanoparticule pénètre ensuite dans la tumeur ou les cellules cancéreuses à traiter qui sont exposées à des rayonnements infra-rouges entraînant leur destruction.

Composition pharmaceutique

Comme on l’entend ici, le « véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable » se réfère à tout matériau approprié pour une utilisation dans une composition pharmaceutique. De préférence, le véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable selon l'invention convient à une utilisation avec des nanoparticules selon l’invention, de préférence sous forme de liquide.

De préférence, le véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable selon l’invention est adapté à une administration par voie orale, parentérale, intradermique, intraveineuse, artérielle, intramusculaire, nasale, rectale ou sous-cutanée.

De préférence, le véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable selon l’invention, comprend mais n'est pas limité à tout véhicule ou excipient standard bien connu de l'homme du métier tel que l'eau, la glycérine, l'alcool, une émulsion d'huile, une émulsion d'eau, du sérum physiologique, une solution tampon, un conservateur, un stabilisant etc.

Individu

De préférence, l’individu selon l’invention est un animal, de préférence un mammifère, tel qu'un humain, un canin, en particulier un chien, un félin, en particulier un chat, un équin, un bovin, un porcin, un caprin, en particulier une chèvre ou un mouton, un camélidé, un rongeur en particulier une souris ou un rat. Plus préférablement l’individu selon l’invention est un humain.

De préférence, l’individu selon l’invention a un cancer, en particulier un cancer du système nerveux central, un cancer du système endocrinien et un cancer du système digestif.

Plus préférablement, l’individu selon l’invention souffre d’un glioblastome ou d’un cancer du pancréas.

De préférence également, l’individu selon l’invention est suspecté d’avoir un cancer, en particulier un glioblastome ou un cancer du pancréas.

Administration

De préférence, la nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, la composition de diagnostic, le médicament, ou le dispositif médical selon l’invention est administré en une quantité prophylactique ou thérapeutique efficace pour détecter, prévenir ou traiter un cancer tel que défini ci-dessus.

De préférence, la nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical selon l’invention peut être administré par voie orale, parentérale, intradermique, intraveineuse, artérielle, intramusculaire, nasale, rectale ou sous-cutanée.

La nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical peut être formulé sous la forme de suspension injectable, de gels, d’huile, de suppositoire, de capsule, etc... La nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical peut être administré à l’individu en une dose comprise entre 10 pmol/L et 2000 pmol/L, de préférence entre 50 pmol/L et 1500 pmol/L, plu préférablement entre 100 pmol/L et 1000 pmol/L, par exemple entre 200 pmol/L et 1000 pmol/L, entre 300 pmol/L et 1000 pmol/L entre 400 pmol/L et 1000 pmol/L, entre 500 pmol/L et 1000 pmol/L.

L’homme du métier est capable d’ajuster la dose de nanoparticule ou de composition pharmaceutique, de composition de diagnostic ou de médicament en fonction du poids de l’individu à traiter.

Composé additionnel

La nanoparticule selon l’invention, la composition pharmaceutique, le médicament, la composition de diagnostic ou le dispositif médical peut être administré avec un composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer.

La nanoparticule selon l’invention peut être utilisée comme transporteur d’un composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer. En particulier, la nanoparticule selon l’invention peut être utilisée pour délivrer un composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer de manière intracellulaire. Avantageusement, la nanoparticule selon l’invention peut être utilisée pour transporter une molécule thérapeutique jusqu’aux cellules cibles, en particulier jusqu’aux cellules cancéreuse de la tumeur à traiter.

Selon un mode de réalisation, l’invention concerne un produit comprenant : au moins une nanoparticule telle que définie ci-dessus ; au moins un composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer, en particulier, le glioblastome et le cancer du pancréas comme produit de combinaison pour une utilisation, notamment simultanée, séparée ou étalée dans le temps, pour la prévention ou le traitement du cancer, en particulier du glioblastome ou du cancer du pancréas.

Comme on l’entend ici, « combiné » ou « en combinaison » signifie que la nanoparticule selon l’invention est administrée en même temps qu’un autre composé, soit ensemble, c’est-à-dire au même site d’administration, soit séparément ou à des moments différents, sous réserve que la période de temps pendant laquelle la nanoparticule selon l’invention exerce ses effets chez l’individu et la période de temps pendant laquelle le composé additionnel produit ses effets pharmacologiques chez l’individu se recoupent au moins partiellement.

Le composé additionnel pour la prévention ou le traitement du cancer peut être n’importe quel composé bien connu de l’homme du métier. De préférence, le composé additionnel est sélectionné dans le groupe constitué par le cyclophosphamide, le docétaxel, la doxorubicine, l'épirubicine, le fluoro-uracile, le méthotrexate, le paclitaxel, l’everolimus, l’alectinib, le melphalan, le brigatinib, le nilutamide, l’acétate de cyprotérone, l’anastrozole, l’exemestane, le lomustine, le bosutinib, l’encorafenib, le cabozatinib, le vandénatib, le bicalutamide, l’etopositde, le chlorambucil, le cobimetinib, l’enzalutamide, l’idarubicie, le capécitabine, le tamoxifène, la déxaméthasone, le bisulfan, le lenvatinib, le gemcitabine, le 5-FU, l’irinotécan, le témozolomide, l’oxaliplatine, le nab- paclitaxel et des combinaison de ceux-ci. L’invention sera davantage explicitée de manière non limitative à l’aide des Figures et Exemples qui suivent.

Description des figures

Fig. 1

La figure 1 représente le spectre UV-visible de la synthèse de nanoparticule NFL-BIOTINE- PEG-AuNPs avec la longueur d’onde (nm) en fonction de l’absorbance (a.u).

Fig. 2

La figure 2 représente le spectre UV-visible de nanoparticule NFL-BIOTINE-PEG-AuNPs à To, et à To + 11 mois (Test 1 et Test 2).

Fig. 3

La figure 3 représente l’augmentation de température (en °C) de l’eau (H2O), d’une solution de peptide NFL fonctionnalisé avec une biotine (NFL-BIOT), d’une solution de complexe du sel d’or avec le peptide fonctionnalisé avec une biotine (AuNPs) et d’une solution de nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG- AuNPs en fonction du temps (en min).

Fig. 4

La figure 4 représente l’activité mitochondriale de cellules MiaPaCa-2, de cellules MiaPaCa-2 traitées avec de la colchicine, de cellules MiaPaCa-2 traitées pendant 24b avec 50, 100, 250, 500 et 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL- BIOTIN. L’activité mitochondriale est exprimée en % moyen par rapport à l’activité des cellules MiaPaCa-2 témoin.

Fig. 5

La figure 5 représente l’activité mitochondriale de cellules MiaPaCa-2, de cellules MiaPaCa-2 traitées avec de la colchicine, de cellules MiaPaCa-2 traitées pendant 72I1 avec 50, 100, 250, 500 et 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL- BIOTIN. L’activité mitochondriale est exprimée en % moyen par rapport à l’activité des cellules MiaPaCa-2 témoin.

Fig. 6

La figure 6 représente l’activité mitochondriale de cellules F98, de cellules F98 traitées avec de la colchicine, de cellules F98 traitées pendant 24I1 avec 50, 100, 250, 500 et 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL-BIOTIN. L’activité mitochondriale est exprimée en % moyen par rapport à l’activité des cellules F98 témoin. Fig. 7

La figure 7 représente l’activité mitochondriale de cellules F98, de cellules F98 traitées avec de la colchicine, de cellules F98 traitées pendant 72I1 avec 50, 100, 250, 500 et 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL-BIOTIN. L’activité mitochondriale est exprimée en % moyen par rapport à l’activité des cellules F98 témoin.

Fig. 8

La figure 8 représente la viabilité cellulaire des cellules MiaPaCa-2, traitées par le peptide seul (NFL-BIOT) à 0,1 pM, par la nanoparticule PEG-AuNP (AuNPs) à 100 pM et par la nanoparticule NFL-BIOTINE-Au-NPs à 100 pM, après irradiation et internalisation des nanoparticules pendant 24b. La viabilité cellulaire est exprimée en % par rapport à la viabilité cellulaire des cellules non traitées.

Fig. 9

La figure 9 représente la viabilité cellulaire des cellules MiaPaCa-2, traitées par le peptide seul (NFL-BIOT) à 0,1 pM, par la nanoparticule PEG-AuNP (AuNPs) à 100 pM et par la nanoparticule NFL-BIOTINE-Au-NPs à 100 pM, après irradiation et internalisation des nanoparticules pendant 48I1. La viabilité cellulaire est exprimée en % par rapport à la viabilité cellulaire des cellules non traitées.

Fig. 10

La figure 10 représente la viabilité cellulaire des cellules F98, traitées par le peptide seul (NFL- BIOT) à 0,1 pM, par la nanoparticule PEG-AuNP (AuNPs) à 100 pM et par la nanoparticule NFL-BIOTINE-Au-NPs à too pM, après irradiation et internalisation des nanoparticules pendant 24b. La viabilité cellulaire est exprimée en % par rapport à la viabilité cellulaire des cellules non traitées.

Fig. 11

La figure 11 représente la viabilité cellulaire des cellules F98, traitées par le peptide seul (NFL- BIOT) à 0,1 pM, par la nanoparticule PEG-AuNP (AuNPs) à 100 pM et par la nanoparticule NFL-BIOTINE-Au-NPs à too pM, après irradiation et internalisation des nanoparticules pendant 48b. La viabilité cellulaire est exprimée en % par rapport à la viabilité cellulaire des cellules non traitées.

Fig. 12

La figure 12 représente l’activité mitochondriale in vitro de cellules de glioblastome de rat (F98) (cells) comme témoin, de cellules F98 traitées avec de la colchicine (Col, 1 pg/mL) comme contrôle positif et de cellules F98 traitées pendant 24 heures avec des nanoparticules PEG-AuNPs, BIOT-TAT-PEGAuNPs et BIOT-VIM-PEG-AuNPs à différentes concentrations (o, 50, 100, 250, 500 or 1000 pmol/L). L’activité mitochondriale a été évaluée par le test MTS. Les expériences ont été réalisées au moins en triplicats. Le symbole # signifie aucune cellule présente à l'issue du traitement d’incubation. Les données représentent la moyenne ± erreur type par rapport à l’activité des cellules F98 témoins. L’analyse statistique a été réalisée avec le test t de Student (*p < 0.05 and ***p < 0.001).

Fig. 13

La figure 13 représente l’activité mitochondriale in vitro de cellules de glioblastome de rat (F98) comme témoin, de cellules F98 traitées avec de la colchicine (Col, 1 pg/mL) comme contrôle positif et de cellules F98 traitées pendant 72 heures avec des nanoparticules PEG- AuNPs, BIOT-TAT-PEGAuNPs et BIOT-VIM-PEG-AuNPs à différentes concentrations (o, 50, 100, 250, 500 or 1000 pmol/L). L’activité mitochondriale a été évaluée par le test MTS. Les expériences ont été réalisées au moins en triplicats. Le symbole # signifie aucune cellule présente à l'issue du traitement d’incubation. Les données représentent la moyenne ± erreur type par rapport à l’activité des cellules F98 témoins. L’analyse statistique a été réalisée avec le test t de Student (*p < 0.05 and ***p < 0.001).

Fig. 14

La figure 14 représente une image de microscopie électronique à transmission illustrant l’internalisation de nanoparticules d’or (PEG-AuNPs) dans des cellules de glioblastome de rat (F98). Les cellules F98 ont été traitées avec les nanoparticules à 250 pmol/L durant 24 heures. N pour noyau et V pour vacuoles. Barre d’échelle (à gauche) : 2 pm. Barre d’échelle (à droite) ; 50 nm.

Fig. 15

La figure 15 représente une image de microscopie électronique à transmission illustrant l’internalisation de nanoparticules d’or (PEG-AuNPs) couplées avec le peptide TAT-BIOTIN (BIOT-TAT-PEGAuNPs) dans des cellules de glioblastome de rat (F98). Les cellules F98 ont été traitées avec les nanoparticules à 250 pmol/L durant 24 heures. N pour noyau et V pour vacuoles. Barre d’échelle (à gauche) : 2 pm. Barre d’échelle (à droite) ; 50 nm.

Fig. 16

La figure 16 représente une image de microscopie électronique à transmission illustrant l’internalisation de nanoparticules d’or (PEG-AuNPs) couplées avec le peptide VIM-BIOTIN (BIOT-VIM-PEGAuNPs) dans des cellules de glioblastome de rat (F98). Les cellules F98 ont été traitées avec les nanoparticules à 250 umol/L durant 24 heures. N pour noyau et V pour vacuoles. Barre d’échelle (à gauche) : 2 pm. Barre d’échelle (à droite) ; 50 nm.

Fig. 17 La figure 17 représente le nombre moyen de vacuoles contenant plus de 20 nanoparticules d’or dans des cellules F98 incubées pendant 24 heures avec 250 pmol/L de nanoparticules PEG- AUNPs (barre noire), de nanoparticules BIOT-TAT-PEG-AUNPs (barre gris foncé), et de nanoparticules BIOT-VIM-PEG-AuNPs (barre gris clair). Le comptage des nanoparticules se fait manuellement sur les images de microscopie électronique.

Exemple 1

Les inventeurs ont synthétisé et caractérisé des nanoparticules d’or NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs selon l’invention selon le précédé ci-dessous.

A. Matériel et méthode

1.Préparation d’une nanoparticule NFL-Biotine-PEG-AuNP

Les nanoparticules d'or sont principalement préparées par réduction d'acide chloraurique (HAUC1 ₄ , Sigma-Aldrich) à une concentration de 1 mmol/L.

Après dissolution du sel d'or, la solution est agitée vigoureusement, puis 0,08 mL de peptide NFL biotinylé (NFL-BIOTIN) à une concentration de 1 mg/ mL est ajouté. Le peptide NFL a été dilué préalablement dans de l’éthanol à 10 %. La complexation du peptide aux sels d’or HAUC1 ₄ se fait par chélation.

Puis, 250 pL d’un agent stabilisant, PEG-COOH 600 (Poly-Ethylène-Glycol dicarboxylique, Sigma-Aldrich) a été ajouté à température ambiante.

Pour finir, 1,2 mL à 3 mg/mL d'agent réducteur NaBH ₄ (Sodium tétrahydruroborate, Sigma- Aldrich) est ajouté, réduisant ainsi les ions Au3+ en atomes d'or neutres (Au ⁰ ).

La formation des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs est observée grâce à un changement de couleur de la solution passant du jaune pâle au violet rose vif après l'addition de l'agent réducteur.

Les produits de chaque étape de synthèse sont stockés à 27-29°C et caractérisés par spectroscopie UV-visible, spectroscopie Raman et microscopie électronique à transmission (MET).

La solution de NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs a été centrifugée à 10 000 tours/min 3 fois pendant 10 min, puis le surnageant a été éliminé. Le culot a été redispersé dans une quantité équivalente d'eau. Ceci a été répété deux fois pour éliminer l'excès de PEG dicarboxylique non conjugué au peptide NFL-BIOTIN.

2. Caractérisation des nanoparticules

2.1. Spectroscopie d'absorption UV-visible

Les mesures de spectroscopie d'absorption ont été réalisées avec un spectrophotomètre UV- visible (Uvikon 941 de Kontron instruments) piloté par le logiciel Thermalys Uvikon 900. Les spectres d'absorption ont été enregistrés dans le domaine spectral compris entre 200 et 900 nm. Les solutions ont été placées dans des cuves en quartz de 1 cm de trajet optique. 2.2. Spectroscopic Raman

Les spectres Raman ont été enregistrés en utilisant un microspectromètre Raman Xplora (Horiba Scientifics) et traités à l’aide du logiciel Labspec. Le spectromètre a été réglé avec un laser HeNe (Hélium-Néon) à 66o nm, une caméra CCD pour l’acquisition des données et un filtre optique réglé à too % pour une puissance du laser de 8 mW et un réseau de 6oo traits.

2.3. Mesures du potentiel zêta

Le potentiel zêta des NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs dispersés dans l'eau a été mesuré en utilisant le mode électrophorétique d'un Zetasizer NanoZS (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK).

2.4. La diffusion dynamique de la lumière (Dynamic Light Scattering ou DLS)

Les diamètres hydrodynamiques moyens des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs dispersées dans de l’eau ont été caractérisés à l'aide d'une analyse de suivi des nanoparticules. Développé par NanoSight (Malvern Instruments Ltd), cet équipement utilise les propriétés de diffusion de la lumière et du mouvement brownien pour obtenir des distributions granulométriques d'échantillons en suspension liquide. La mesure a été réalisée au moyen d'un système NS500 équipé d'un laser 405 nm, avec la version 3.0. Six vidéos de soixante secondes ont été enregistrées à une concentration de nanoparticules suffisante pour obtenir un minimum de 200 pistes terminées par vidéo pour une signification statistique. Les données ont été enregistrées en mode ± écart type.

2.5. Microscopie électronique à transmission

Les nanoparticules d’or complexés ou non avec le peptide NFL-BIOTIN ont été observées par microscopie électronique à transmission. Pour cela, 2 pL d’échantillons ont été déposés sur des grilles de cuivre de 150 mailles, elles-mêmes recouvertes d’un film de Formvar pendant 1 min. Puis les grilles ont été contrastées avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 1 min. Les échantillons ont été observés avec un microscope Jeol (modèle JEM-1400 avec une tension d'accélération de 120 kV ; Japon) équipé d’une caméra modèle 832 Orius SC-1000 de la marque Gatan.

B. Résultats

1. Caractérisation UV-visible

La complexation d’HAuCl ₄ avec le peptide NFL-BIOTINa pu être observée avec une bande à 300 nm qui représente l’HAuCl ₄ et une bande à 280 nm représentant le peptide NFL-BIOTIN (voir la figure 1). Une bande UV-visible à 525 nm représentant la bande plasmon des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs a été observée. Ces résultats confirment la formation des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs. La bande 280 nm, représentant le contrôle du peptide est présente dans toutes les étapes de la synthèse ce qui confirme que le peptide est correctement greffé.

Les résultats de DLS et du potentiel zêta montrent que les nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG- AuNPs ont un diamètre d’environ 91 ± 2 nm et un potentiel zêta de -24 ± 1 mV.

2. Caractérisation par spectroscopie RAMAN

Le greffage réussi du peptide a également été démontré par spectroscopie Raman. Les spectres Raman du peptide NFL-BIOTIN libre (contrôle) présentent des bandes attribuées aux acides aminés qui composent le peptide (tyrosine). Une bande 1449 cm ¹ représente le groupement CH2 de la biotine et une bande 1656 cm ¹ est attribuée à l’amide I. Une large bande observée autour de 1600 cm ¹ est attribuée à l'eau. Il a été observé qu’avec la formation des nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs, on a une empreinte plus claire de la signature du peptide, en comparaison au complexe. Comme le prouve ces résultats, la formation de nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs est confirmée, puisque la formation de nanoparticules permet d’exalter le signal.

3. Observation des nanoparticules au microscope électronique à transmission

Les nanoparticules d’or pegylées (PEG-AuNPs) complexées ou non au peptide NFL-BIOTIN ont été observées au microscope électronique à transmission. Ces observations permettent de noter une différence au niveau de la forme des nanoparticules en absence ou en présence du peptide NFL-BIOTIN. Les nanoparticules PEG-AuNPs ont une forme ronde avec des tailles relativement homogènes.

Dès lors que ces mêmes particules sont complexées au peptide NFL-BIOTIN, différentes formes de particules (ronds, bâtonnets, hexagone) sont observées avec des tailles assez hétérogènes.

4. Stabilité

On constate que la couleur rouge-violet vive des nanoparticules et les spectres UV-visibles restent inchangés après stockage à température ambiante pendant 11 mois confirmant ainsi que la formation de la suspension de nanoparticules reste stable (voir la figure 2). Exemple 2

Les inventeurs ont évalué l’effet des nanoparticules d’or NFL-Biotin-PEG-AuNP sur deux lignée cellulaires cancéreuses.

A. Matériel et méthode

1. Lignées cellulaires utilisées

Deux lignées cellulaires obtenues auprès d’ American Tissue Culture Collection (ATCC) ont été utilisées pour cette étude :

- les cellules MiaPaCa-2, une lignée de cellules cancéreuses du pancréas humain, et

- les cellules F98, une lignée de glioblastome de rat.

Les deux lignées cellulaires ont été cultivées dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium Gibco, Bio-Sciences Ltd, Ireland) supplémenté de 10% de FBS Fœtal Bovine Serum ; Sigma-Aldrich), d’1% d’antibiotiques (pénicilline à 50 UI/mL et streptomycine à 50 pg/mL) et de la L-glutamine (2 mmol/L).

2. Mesures de l’activité mitochondriale cellulaire

Pour étudier les effets des nanoparticules d’or complexées ou non avec le peptide NFL-BIOTIN sur la viabilité cellulaire, des tests de viabilité cellulaire MTS (abi97010; Abeam, Paris, France) mesurant l’activité mitochondriale des cellules ont été réalisés.

Ces tests ont été réalisés sur les deux types cellulaires. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 1000 ou 3000 cellules par puits (nombre de cellules variables en fonction de la durée du traitement) et ont été incubées pendant 24 heures à 37°C et à 5% de C0 ₂ . Puis, les différents traitements ont été mis en contact avec les cellules : la colchicine (1 pg/mL, C9754; Sigma-Aldrich) ou des concentrations de nanoparticules d’or complexées ou non au peptide NFL-BIOTIN(entre 50 et 1000 pmol/L) pendant 24 ou 72 heures à 37°C et à 5% de C0 ₂ . A la fin du traitement (24 ou 72 heures), 20 pL de réactif MTS ont été ajoutés dans chaque puits pendant 4 heures. L'absorbance à 490 nm a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre Spectra Max M2 (Molecular Devices, San José, Californie, USA). 3. Internalisation des nanoparticules observée par microscopie électronique à transmission

Les cellules (MiaPaCa-2 et F98) ont été ensemencées en plaques 6 puits à raison de 400000 cellules par puits et ont été incubées pendant 24 heures à 37°C et à 5% de C0 ₂ . Ensuite, les nanoparticules à 100 ou à 500 pmol/L sans ou avec le peptide à 0,08 mmol/L ont été incubées avec les cellules pendant 24 ou 72 heures. Après l’incubation, les cellules ont été lavées avec du tampon phosphate à 0,1 mol/L (pH 7,4) et ont été fixées toute la nuit à 4°C, avec une solution de glutaraldéhyde 2,5 % dans du tampon phosphate à 0,1 mol/L (pH 7,4). Puis, les cellules ont été rincées avec du tampon phosphate 0,1 mol/L. Les cellules ont ensuite été rincées avec de l'eau distillée et post-fixées dans une solution de tétroxyde d'osmium 1% pendant 1 heure. Elles ont, par la suite, été rincées 3 fois 5 min avec de l'eau, et incubées 15 min dans de l'éthanol 50°, 15 min dans de l'éthanol 70°, 15 min dans de l'éthanol 95 ⁰ et 3 fois 30 min dans de l'éthanol 100°. Ensuite, elles ont été mises dans un mélange 50% éthanol 1OO°/5O% résine Epon (volume/volume) et incubées toute la nuit. Le lendemain, la résine d'Epon diluée restant a été retirée et remplacée par un bain d'Epon pur pendant 4 heures, puis ce bain d'Epon a été remplacé à son tour par un autre bain d'Epon pur. La plaque avec les cellules dans l'Epon a été placée 24 heures à 37°C, puis 24 heures à 45°C et enfin 72 heures à 6o°C. Une fois la résine polymérisée à 6o°C, des coupes ultrafines de 60 nm d'épaisseur ont été réalisées avec un ultramicrotome UC7 (Leica, Wetzlar, Allemagne) et déposées sur des grilles de cuivre 150 Mesh. Les coupes ont ensuite été contrastées avec une solution d'acétate d'uranyle 3% dans de l’éthanol 50° pendant 15 min puis rincées avec de l'eau ultrapure. Les échantillons ont ensuite été observés au microscope Jeol (modèle JEM-1400 avec une tension d'accélération de 120 kV ; Japon) équipé d’une caméra modèle 832 Orius SC-1000 de la marque Gatan.

4. Photothermie sur les lignées cellulaires

Les cellules MiaPaCa-2 et F98 ont été ensemencées à une densité de 200000 cellules/mL dans des flacons de culture de 25 cm ² et ont été cultivées à 37°C et à 5% de C0 ₂ . Les cellules ont, par la suite, été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 200 pL de cellules par puits, et laissées pendant 24 ou 48 heures. Ensuite, 50 pL de milieu par puits ont été retirés pour les remplacer par les solutions des nanoparticules qui ont été incubées pendant 24 heures. Le milieu a par la suite été retiré, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS (Phosphate Buffered Saline), pour enlever l’excès de nanoparticules non internalisées. Puis, le même volume de milieu par puits a été ajouté. Chaque puits de la plaque a été soumis à une source laser de 808 nm avec une puissance 0,5 W/cm ² . Des expériences ont été faites en amont pour définir les paramètres optimaux, pour ne pas risquer d’avoir d’artefact dû au paramètre du laser. Les études ont été menées à deux temps : 5 et 10 min, pourvoir si le paramètre « temps » pouvait avoir un impact sur les résultats. Après avoir soumis les cellules aux radiations du laser proche infrarouge de 808 nm, le milieu a été changé et laissé pendant 24 heures, puis un test de viabilité cellulaire a été effectué pour vérifier que les nanoparticules avaient le même effet sur les cellules avant et après le traitement par irradiation. Pour réaliser la photothermie, 1 mL de la solution de nanoparticules a été déposée dans une cuve et à l’aide d’un laser infrarouge les nanoparticules ont été chauffées. Une sonde thermique permet alors de collecter l’élévation de température pendant 15 min.

B. Résultats

1. Photothermie des nanoparticules seules

Sur la figure 3, il est observé que la température augmente au-delà du seuil de 4°C. Les nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs sont donc de très bons candidats pour des tests de photothermie.

2. Impact des NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs sur des lignées cellulaires

2.1. Impact des nanoparticules sur l’activité mitochondriale

Pour évaluer l'activité mitochondriale, les deux lignées cellulaires ont été traitées avec 1 pg/mL de colchicine ou avec 0, 50, 100, 250, 500 ou 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide NFL-BIOTIN pendant 24 ou 72 heures. L'action de la colchicine est d’interagir avec la tubuline et de perturber l'assemblage des microtubules (Bhattacharyya et al., 2008), ce qui provoque la mort cellulaire. La colchicine sert donc de contrôle positif.

Pour les cellules MiaPaCa-2 traitées pendant 24 heures le test MTS n’a montré aucun effet des PEG-AuNPs, cependant une diminution de l’activité mitochondriale a été observée à partir d’un traitement à 500 pmol/L de NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs, et une très forte diminution a été observé à la dose de 1000 pmol/L (figure 4).

Pour les cellules MiaPaCa-2 traitées pendant 72 heures, le test MTS montre des résultats similaires, à savoir pas d’effet des PEG-AuNPs, et une diminution de l’activité mitochondriale à partir d’un traitement à 500 pmol/L de NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs (figure 5).

Les mêmes tests ont été réalisés sur des cellules de glioblastome de rat, les F98. Des résultats similaires ont été observés, à savoir lors d’un traitement de 24 heures, pas d’effets des PEG- AuNPs sur l’activité mitochondriale et une réduction drastique de l’activité mitochondriale lorsque les cellules ont été traitées avec 1000 pmol/L de NFL-BIOTIN-PEG-Au-NPs (figure 6).

Lorsque les cellules F98 ont été traitées pendant 72 heures avec les nanoparticules, une réduction de l’activité mitochondriale avec les deux types de particules est observée à 1000 pmol/L (figure 7).

2.2. Internalisation cellulaire des nanoparticules

Les cellules MiaPaCa-2 et F98 ont été traitées pendant 72 heures avec les PEG-AuNPs ou avec les NFL-BIOTIN-PEG-AuNPs à 500 pmol/L. Concernant les cellules MiaPaCa-2, les nanoparticules sans ou avec peptide entrent dans les cellules et majoritairement dans des vacuoles. Certaines nanoparticules se retrouvent piégées dans des espaces entre les cellules. Ces observations permettent également de retrouver les différentes formes de particules tout comme l’hétérogénéité des tailles de particules.

Les mêmes observations ont été faites avec les cellules F98.

2.3. Photothermie sur les lignées cellulaires de pancréas MiaPaCa-2 et de glioblastome F98 Sur les figures 8 à 11, on observe que le traitement par irradiation n’a aucun effet sur les cellules seules sans nanoparticules (contrôle, viabilité cellulaire à 100%). Avec le peptide un effet similaire avec ou sans irradiation a été observé quel que soit le temps d’internalisation. Pour les nanoparticules PEG-AuNPs sans peptide, une diminution de la viabilité cellulaire est observée, la viabilité cellulaire d’environ 60% par rapport à la viabilité cellulaire obtenu avec le contrôle après 24b et 48I1 d’internalisation. Pour les nanoparticules NFL-BIOTIN-PEG- AuNPs, une diminution significative de la viabilité cellulaire est observée, la viabilité cellulaire est d’environ 60% pour 5 min d’irradiation et d’environ 45% pour 10 min d’irradiation après 24I1 d’internalisation. De plus, la viabilité cellulaire est d’environ 40 % pour une irradiation de 5 min et d’environ 30 % pour 10 min après 48I1 d’internalisation.

Exemple 3

Les inventeurs ont synthétisé des nanoparticules d’or TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs et VIM- BIOTIN-PEG-AuNPs selon l’invention selon un précédé résumé ci-dessus similaire au procédé décrit dans l’Exemple 1 précédent.

Les nanoparticules d'or sont préparées par réduction d'acide chloraurique (HAUC1 ₄ , Sigma- Aldrich) à une concentration de 1 mmol/L.

Après dissolution du sel d'or le peptide TAT biotinylés (TAT.48-60 peptide ; TAT-BIOTIN- peptide ; BIOT-GRKKRRQRRRPPQ-CONH2 ; Millegen, Toulouse, France) ou le peptide VIM biotinylés (VIM-BIOTIN-peptide ; BIOT-GGAYVTRSSAVRLRSSVPGVRLLQ-CONH2 ; Millegen, Toulouse, France) est ajouté. La solution est agitée vigoureusement pendant 10 min. La complexation du peptide aux sels d’or HAUC1 ₄ se fait par chélation.

Un agent stabilisant, PEG-COOH 600 (Poly-Ethylène-Glycol dicarboxylique, Sigma-Aldrich) est ensuite ajouté à température ambiante.

Puis, un agent réducteur NaBH ₄ (Sodium tétrahydruroborate, Sigma-Aldrich) est ajouté, réduisant ainsi les ions Au ³⁺ en atomes d'or neutres (Au ⁰ ).

La formation des nanoparticules TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs et VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs est observée grâce à un changement de couleur de la solution passant du jaune pâle au violet rose vif après l'addition de l'agent réducteur.

Exemple 4

Les inventeurs ont évalué l’effet des nanoparticules d’or TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs et VIM- BIOTIN-PEG-AuNPs sur une lignée cellulaire cancéreuse.

A. Matériel et méthode

1. Lignée cellulaire utilisée

Pour cette étude, la lignée cellulaire F98, une lignée de glioblastome de rat, obtenue auprès d’ American Tissue Culture Collection (ATCC) a été utilisée.

La lignée cellulaire a été cultivée dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium ; Sigma-Aldrich) supplémenté de 10% de FBS (Fœtal Bovine Serum ; Sigma-Aldrich), d’1% d’antibiotiques (pénicilline à 50 UI/ mL et streptomycine à 50 pg/mL) et de la L-glutamine (2 mmol/L).

2. Mesures de l’activité mitochondriale cellulaire

Pour étudier les effets des nanoparticules d’or complexées ou non avec le peptide TAT-BIOTIN ou VIM-BIOTIN sur la viabilité cellulaire, des tests de viabilité cellulaire MTS (abi97010; Abeam, Paris, France) mesurant l’activité mitochondriale des cellules ont été réalisés.

Ces tests ont été réalisés sur les cellules de la lignée F98. Brièvement, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à raison de 1000 ou 3000 cellules par puits (nombre de cellules variables en fonction de la durée du traitement) et ont été incubées pendant 24 heures à 37°C et à 5% de CO2. Puis, les différents traitements ont été mis en contact avec les cellules : la colchicine (1 pg/mL, C9754 ; Sigma-Aldrich) ou des concentrations de nanoparticules d’or complexées ou non au peptide VIM-BIOTIN ou TAT-BIOTIN (entre 50 et 1000 pmol/L) pendant 24 ou 72 heures à 37°C et à 5% de CO2. A la fin du traitement (24 ou 72 heures), 20 pL de réactif MTS ont été ajoutés dans chaque puits pendant 4 heures. L’absorbance à 490 nm a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre Spectra Max M2 (Molecular Devices, San José, Californie, USA).

3. Internalisation des nanoparticules observée par microscopie électronique à transmission

Les cellules F98 ont été ensemencées en plaques 12 puits à raison de 100000 cellules par puits et ont été incubées pendant 24 heures à 37°C et à 5% de CO2. Ensuite, les nanoparticules PEG- AuNPs (à 500 pmol/L), VIM-BIOTIN-PEG-AuNP (à 250 pmol/L) ou TAT-BIOTIN-AuNPs (à 250 |umol/L) ont été incubées avec les cellules pendant 24 ou 72 heures. Après l’incubation, les cellules ont été lavées avec du tampon phosphate à 0,1 mol/L (pH 7,4) et ont été fixées toute la nuit à 4°C, avec une solution de glutaraldéhyde 2,5 % dans du tampon phosphate à 0,1 mol/L (pH 7,4). Puis, les cellules ont été rincées avec du tampon phosphate 0,1 mol/L. Les cellules ont ensuite été rincées avec de l'eau distillée et post-fixées dans une solution de tétroxyde d'osmium 1% pendant 1 heure. Elles ont, par la suite, été rincées 3 fois 5 min avec de l'eau, et incubées 15 min dans de l'éthanol 50°, 15 min dans de l'éthanol 70°, 15 min dans de l'éthanol 95° et 3 fois 30 min dans de l'éthanol ioo°. Ensuite, elles ont été mises dans un mélange 50% éthanol ioo°/5O% résine Epon (volume/volume) et incubées toute la nuit. Le lendemain, la résine d'Epon diluée restant a été retirée et remplacée par un bain d'Epon pur pendant 4 heures, puis ce bain d'Epon a été remplacé à son tour par un autre bain d'Epon pur. La plaque avec les cellules dans l'Epon a été placée 24 heures à 37°C, puis 24 heures à 45°C et enfin 72 heures à 6o°C. Une fois la résine polymérisée à 6o°C, des coupes ultrafines de 60 nm d'épaisseur ont été réalisées avec un ultramicrotome UC7 (Leica, Wetzlar, Allemagne) et déposées sur des grilles de cuivre 150 Mesh. Les coupes ont ensuite été contrastées avec une solution d'acétate d'uranyle 3% dans de l’éthanol 50° pendant 15 min puis rincées avec de l'eau ultrapure. Les échantillons ont ensuite été observés au microscope Jeol (modèle JEM-1400 avec une tension d'accélération de 120 kV ; Japon) équipé d’une caméra modèle 832 Orius SC- 1000 de la marque Gatan.

B. Résultats

1. Impact des nanoparticules sur l’activité mitochondriale

Pour évaluer l'activité mitochondriale, les cellules F98 ont été traitées avec 1 pg/mL de colchicine ou avec o, 50, 100, 250, 500 ou 1000 pmol/L de nanoparticules PEG-AuNPs complexées ou non avec le peptide VIM-BIOTIN ou le peptide TAT-BIOTIN pendant 24 ou 72 heures. De façon similaire aux expériences décrites dans l’exemple 2 ci-dessus, la colchicine a été employée comme contrôle positif.

Pour les cellules F98 traitées pendant 24 heures, le test MTS n’a montré aucun effet des PEG- AuNPs sur l’activité mitochondriale. En revanche, une diminution significative de l’activité mitochondriale a été observée à partir d’un traitement à 1000 pmol/L de VIM-BIOTIN-PEG- AuNPs, et une très forte toxicité a été observée pour les traitements à 500 pmol/L et 1000 pmol/L de TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs. En effet, pour ces deux concentrations de traitement avec les nanoparticules TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs, plus aucune cellule n’était encore viable après 24 heures (Figure 12).

Pour les cellules F98 traitées pendant 72 heures, le test MTS montre des résultats similaires pour des concentrations moindres. En effet, une diminution significative de l’activité mitochondriale est observée à partir d’un traitement à 1000 pmol/L de PEG-AuNPs, de 250 pmol/L de TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs ou de 500 pmol/L de VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs. En outre, la forte toxicité induite est retrouvée pour à partir de 500 pmol/L de TAT-BIOTIN-PEG- AuNPs et se manifeste également à partir de 1000 pmol/L de VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs (Figure 13).

Ni la fonction ni l’activité biologique des peptides VIM-BIOTIN et TAT-BIOTIN n’a pas été affectée par la combinaison avec les nanoparticules PEG-AuNPs.

2. Internalisation cellulaire des nanoparticules

Les cellules F98 ont été traitées pendant 24 heures avec les nanoparticules VIM-BIOTIN-PEG- AuNPs ou TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs à 250 pmol/L. Les images de microscopie électronique à transmission représentent les cellules F98 traitées avec des nanoparticules PEG-AuNPs (Figure 14), VIM-BIOTIN-PEG-AuNP (Figure 15) ou TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs (Figure 16).

Pour les cellules traitées avec les nanoparticules VIM-BIOTIN-PEG-AuNPs ou TAT-BIOTIN- PEG-AuNPs, davantage de vacuoles ont été détectées. Les nanoparticules ont été quantifiées par comptage manuel (Figure 17). Il peut être observé que le nombre moyen de vacuoles contenant plus de 20 nanoparticules est plus élevée pour les nanoparticules VIM-BIOTIN - PEG-AuNPs et TAT-BIOTIN-PEG-AuNPs en comparaison des nanoparticules PEG-AuNPs.