IAGOLOVICH ANNA VALERIEVNA (RU)
ARTYKOV ARTEM ALEXANDROVICH (RU)
ISAKOVA ALINA ALEKSEEVNA (RU)
DOLGIKH DMITRY ALEXANDROVICH (RU)
KIRPICHNIKOV MIKHAIL PETROVICH (RU)
S. SH. GAPIZOV; L. E. PETROVSKAYA; L. N. SHINGAROVA; E. A. KRYUKOVA; E. F. BOLDYREVA; E. P. LUKASHEV; S. A. YAKIMOV; E. V. SVIRSHC: "Fusion with an albumin‐binding domain improves pharmacokinetics of an αvβ3‐integrin binding fibronectin scaffold protein", BIOTECHNOLOGY AND APPLIED BIOCHEMISTRY, ACADEMIC PRESS, US, vol. 66, no. 4, 8 July 2019 (2019-07-08), US , pages 617 - 625, XP071713579, ISSN: 0885-4513, DOI: 10.1002/bab.1762
PEDRO P.G. GUIMARãES, STEPHANIE GAGLIONE, TOMASZ SEWASTIANIK, RUBEN D. CARRASCO, ROBERT LANGER, MICHAEL J. MITCHELL: "Nanoparticles for Immune Cytokine TRAIL-Based Cancer Therapy", ACS NANO, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 12, no. 2, 27 February 2018 (2018-02-27), US , pages 912 - 931, XP055655208, ISSN: 1936-0851, DOI: 10.1021/acsnano.7b05876
Формула изобретения 1. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция общей формулы: А - Х - В, где А представляет собой последовательность рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, гомологичную по меньшей мере на 90% последовательности SEQ Ш NO: 2, при этом селективно связывается с рецептором DR5, которая своим С-концом присоединена к X; X представляет собой химическую связь или линкер; В представляет собой пептид, N-концом присоединенный к X, гомологичный по меньшей мере на 75% последовательности SEQ Ш NO: 4 и способный специфически связываться с пите грином avP3. 2. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой X представляет собой линкер формулы (XiXiXiXiX2)n(XiXiXiXiX2)m , где Xi представляет собой остаток глицина, Хг представляет собой остаток серина, причем любой из Xi и Хг могут независимо отсутствовать; п и т имеют целое значение от 0 до 4, причем п+ш имеет целое значение от 1 до 4. 3. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой А имеет последовательность, гомологичную по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% последовательности SEQ ГО NO: 2. 4. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой А имеет последовательность, охарактеризованную в SEQ ГО NO: 2. 5. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой В имеет последовательность, гомологичную по меньшей на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 88% последовательности SEQ ГО NO: 4. 6. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, в которой В представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ГО NO: 4. 7. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 2, в которой линкер представляет собой последовательность, охарактеризованную в SEQ ID NO: 3. 8. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция по и. 1, которая имеет последовательность, охарактеризованную в SEQ ГО NO: 1. 9. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая противоопухолевую гибридную белковую конструкцию по любому из п.п.1-8. 10. Молекула нуклеиновой кислоты по и.9, которая имеет последовательность SEQ ГО NO: 5. 11. Молекула нуклеиновой кислоты по и.9, которая имеет последовательность, гомологичную по меньшей на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% SEQ ГО NO: 5. |
Область техники
Данное изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности, к новым белковым конструкциям на основе рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, специфически связывающегося с рецептором смерти DR5, и может использоваться для приготовления терапевтических препаратов для лечения DR5-no3HTHBHbix солидных опухолей.
Уровень техники
Цитокин TRAIL (TNF-related-apoptosis inducing ligand) является частью системы иммунологического надзора за модифицированными клетками в организме. TRAIL способен селективно вызывать гибель опухолевых клеток, не затрагивая нормальные клетки. TRAIL имеет пять рецепторов, два из которых, DR4 и DR5, способны передавать сигнал апоптоза, в то время как рецепторы-«ловушки» DcRl, DcR2 и OPG блокируют TRAIL-индуцированный апоптоз (O'Leary L. et al. Oncogene. 2016. Vol. 35, pp. 1261-1270). Однако эффективность единственного препарата для таргетной терапии на основе цитокина TRAIL дикого типа, прошедшего 3 фазу клинических испытаний (Dulanermin®) оказалась ограниченной и в основном заключалась в частичных ответах или стабилизации заболевания (Ouyang X. et al. Invest. New Drugs. 36 (2018) 315-322). Основные причины - конкурентное взаимодействие с рецепторами-«ловушками» и короткий период полувыведения из организма.
DR5-oпocpeдoвaннaя гибель клеток представляет особый научно-практический интерес, поскольку в большинстве опухолей TRAIL вызывает апоптоз при взаимодействии с рецептором DR5 (Kelley, R.F., Totpal, К., Lindstrom, S.H., et al., J. Biol. Chem., 2010, vol. 280, pp. 2205-2212). Рецептор DR5 гиперэкспрессирован в большинстве опухолей; это открывает перспективу применения агонистов рецептора DR5 при широком спектре опухолевых заболеваний. Ранее был получен рецептор-специфичный вариант TRAIL с заменами аминокислотных остатков Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266L/D269H в белке TRAIL, который селективно связывается лишь с одним из пяти рецепторов TRAIL, рецептором смерти DR5 (Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV et al. Apoptosis, 2009, 14:778-787). Данный мутантный вариант TRAIL индуцирует апоптоз в опухолевых клетках значительно эффективнее, чем TRAIL дикого типа in vitro и in vivo и преодолевает рецептор-зависимую резистетность опухолевых клеток к TRAIL (Gasparian М.Е. et al. Biochemistry (Mose). 2015;80(8):1080-1091; Yagolovich A.V. et al. Transl Oncol. 2020; 13(4): 100762; патент РФ № 2620165 от 23.05.2017 г.; патент РФ №2727059 от 26.04.2019 г). Благодаря высокой рецепторной специфичности и, следовательно, более низкому связыванию с тканями, указанный препарат обладает улучшенными фармакокинетическими характеристиками: его период полураспада у мышей составляет 12,54 минуты, что в 3 раза дольше, чем у TRAIL (3,64 минуты). Тем не менее, эти показатели могут быть недостаточны для значительного клинического эффекта. В связи с этим существует потребность в разработке модифицированных вариантов агонистов рецептора DR5 с дополнительными свойствами, позволяющими улучшить потенциальный противоопухолевый эффект. Близкими к заявляемому изобретению являются решения Wang X с соавторами, которые получили белковые конструкции RGD-TRAIL и TRAIL-NGR, содержащие на N- либо на С-конце полипептидной цепи TRAIL дикого типа пептиды RGD (ACDCRGDCFC) либо NGR (CNGRCVSGCAGRC) и соединенные линкерной последовательностью GGGGS (Wang X, Qiao X, Shang Y, et al. RGD and NGR modified TRAIL protein exhibited potent antimetastasis effects on TRAIL-insensitive cancer cells in vitro and in vivo. Amino Acids. 2017;49(5):931-941. doi:10.1007/s00726-017-2395-4). Благодаря специфичности пептидов к к интегрину avP3 и CD 13 указанные конструкции лучше связывались с эндотелиальными клетками опухолевых сосудов. Однако, в отличие от DR5-ceлeктивнoгo варианта цитокина TRAIL, данные белковые конструкции не обладают специфичностью рецептору DR5, которая чрезвычайно важна, учитывая, что из всех рецепторов TRAIL, рецептор DR5 играет главную роль в проведении сигнала апоптоза в большинстве опухолей.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание противоопухолевой гибридной белковой конструкции на основе DR5-cпeцифичнoгo мутантного варианта цитокина TRAIL, обладающей повышенным противоопухолевым действием за счет добавления дополнительной валентности для связывания с опухоле-специфичным рецептором (интегрином альфа v бета 3 (avP3)), что приводит к более быстрому накоплению в опухолевых структурах. Также задачей настоящего изобретения является расширение спектра средств для подавления пролиферации и индукции гибели опухолевых клеток, экспрессирующих рецептор DR5 и интегрин avP3 на поверхности.
Указанная задача решается путем создания гибридной белковой конструкции, содержащей на N-конце полипептидной цепи противоопухолевый DR5-ceлeктивный варианта цитокина TRAIL, а на С-конце - пептид CRGDKGPDC (SEQ ID NO: 4), при этом два домена соединены линкерной последовательностью. Ранее было показано, что пептид CRGDKGPDC способен аффинно связываться с интегрином avP3 (Sugahara KN, et al. Cancer Cell 2009; 16:510). Интегрин avP3 гиперэкспрессирован во многих опухолях. Поэтому указанная гибридная белковая конструкция является перспективным средством для индукции гибели опухолевых клеток, характеризующихся присутствием рецептора DR5 и интегрином avP3 на поверхности.
В предпочтительном варианте изобретения гибридная белковая конструкция представляет собой последовательность, охарактеризованную в SEQ ID NO: 1, и имеет общую формулу А-Х-В, где «А» имеет последовательность, охарактеризованную в SEQ Ш: NO: 2, которая своим С-концом присоединена к «X»; «X» представляет собой последовательность, охарактеризованную в SEQ Ш: NO 3, а «В» представляет собой пептид, охарактеризованный в SEQ ГО: NO 4.
В других вариантах изобретения «А» представляет собой последовательность рецептор-специфичного варианта цитокина TRAIL, гомологичную по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или по меньшей мере на 99% последовательности SEQ ГО NO: 2, способного специфически связываться с рецептором DR5 и содержащий замены аминокислотных остатков, способствующие повышению специфичности связывания с рецептором DR5 по сравнению с TRAIL дикого типа.
В некоторых вариантах изобретения «X» представляет собой химическую связь или подходящий линкер формулы(Х1Х1Х1Х1Х2) п (Х1Х1Х1Х1Х2)т , где Xi представляет собой остаток глицина, Хг представляет собой остаток серина, причем любой из Xi и Хг могут независимо отсутствовать; п и т имеют целое значение от 0 до 4, причем n+m имеет целое значение от 1 до 4 (или, в некоторых вариантах изобретения «X» представляет собой химическую связь или подходящий линкер формулы (XiXiXiXiX2)n, при этом Xi представляет собой остаток глицина или отсутствует, Хг представляет собой остаток серина или отсутствует, а п имеет целое значение от 1 до 4).
В некоторых вариантах изобретения «В» представляет собой пептид, N-концом присоединенный к «X», гомологичный по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или по меньшей мере на 88% последовательности SEQ Ш NO: 4, и способный специфически связываться с интегрином avP3.
Указанная задача также решается путем создания молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такую белковую конструкцию.
В предпочтительном варианте изобретения такая молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидную последовательность SEQ Ш NO: 5. В некоторых других вариантах изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такую белковую конструкцию, имеет последовательность, гомологичную по меньшей на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% SEQ ID NO: 5.
При осуществлении изобретения достигаются следующие технические результаты: создана новая биспецифическая гибридная белковая конструкция (в предпочтительном варианте имеющая последовательность SEQ ID NO: 1), способная связывать одновременно рецептор DR5 и интегрин avP3, что позволяет эффективнее чем исходный ОК5-селективный варианта цитокина TRAIL (SEQ ID NO: 2) связываться с опухолевыми структурами и быстрее накапливаться в них;
- разработан новый эффективный способ уничтожения опухолевых клеток в организме субъекта, на поверхности которых находятся рецепторы DR5 и интегрин avP3.
Краткое описание рисунков.
Фиг. 1. Экспрессия (А) исходного ОЕ5-селективного варианта цитокина TRAIL (М =19,61 кДа) и (В) гибридной белковой конструкции (М = 21,29 кДа), содержащей на N- конце полипептидной цепи противоопухолевый DR5-ceлeктивный варианта цитокина TRAIL, а на С-конце - пептид CRGDKGPDC, в штамме E.coli SHuffle В Т7. Дорожки: 1 - маркеры молекулярных масс; 2 -3 - по 20 мкл ночных культур клеток, выращенных в колбах №1 и №2.
Фиг. 2. Анализ чистоты (А) исходного DR5- селективного варианта цитокина TRAIL (М =19,61 кДа) и (В) гибридной белковой конструкции (М=21,29 кДа) в 15% полиакриламидном геле. Дорожки: 1 - маркеры молекулярных масс; 2, 3 - пробы, содержащие по 4 мкг белков.
Фиг. 3. Определение констант диссоциации (Kd) к рецептору смерти DR5 (А) исходного DR5 -селективного варианта цитокина TRAIL и (В) гибридной белковой конструкции.
Фиг. 4. Определение константы диссоциации (Kd) к интегрину avP3 (А) исходного ВВ5-селективного варианта цитокина TRAIL и (В) гибридной белковой конструкции.
Фиг. 5. Оценка жизнеспособности мультиклеточных ЗВ-сфероидов из линии глиобластомы U87MG под действием (А) исходного DR5 -селективного варианта цитокина TRAIL и (В) гибридной белковой конструкции.
Фиг. 6. Оценка накопления (А) исходного ВВ5-селективного варианта цитокина TRAIL и (В) гибридной белковой конструкции в опухолевых структурах на основе мультиклеточных ЗО-сфероидов из линии глиобластомы U87MG. Фиг. 7. Экспрессия и очистка гибридной белковой конструкции состава А-Х-В, где А - противоопухолевый DRS-селективный варианта цитокина TRAIL (SEQ Ш NO: 2), X - линкер GGGGSGGGGSGG (SEQ ID NO: 3), а В - пептид AGGCRGDRGPDC, на 75% гомологичный аминокислотной последовательности SEQ Ш NO: 4. Пробы, содержащие 10-15 мкг белка, анализируют в 15% полиакриламидном геле. Дорожки: 1 - маркеры молекулярных масс; 2 - экспрессия белка в штамме E.coli SHuffle В; 3 - растворимая фракция цитоплазматических белков; 4 - фракция белков, не связанных cNi-NTA агарозой; 5 - фракции белков, отмытые буфером, содержащим 20 мМ имидазола; 6 - белок, элюированный буфером, содержащим 250 мМ имидазола, 7 - белковая фракция после очистки на сорбенте SP сефароза; 8 - образец белка после ночного диализа. Расчетная масса мономерной гибридной белковой конструкции составляет 21375 Да.
Фиг. 8. Определение констант диссоциации (Kd) гибридной белковой конструкции с элементом конструкции В состава CRGDKGPDC либо AGGCRGDRGPDC к рецептору VEGFR2 с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Лиганды добавляют в лунки, предварительно покрытые рецептором VEGFR2, и выявляют связывание с помощью моноклональных антител против TRAIL. Значения Kd рассчитывают с помощью опции нелинейной регрессии в программном обеспечении GraphPad Prism 8.0.
Определения и термины
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Рецептором DR5 в настоящем описании называется рецептор смерти, также именуемый TRAIL-R2 либо TNFRSF10B, обозначаемый как O14763-TR10B_HUMAN в базе данных UniProt (https://www.uniprot.org/).
Интегрином avP3 в настоящем описании называются рецепторы, содержащие по одной субъединице интегрина av, Р06756 (ITAV_HUMAN), и по одной субъединице РЗ, Р05106 (ITB3_HUMAN), способные узнавать RGD-мотив на различных лигандах.
Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен, например, с помощью программы NCBI Protein BLAST
Подробное раскрытие изобретения
Описываемая в изобретении гибридная белковая конструкция может быть получена с использованием векторов для рекомбинантной экспрессии и экспрессирующих клеток-продуцентов, известных специалистам. Выбор промоторов и других регуляторных элементов, а также клеток-продуцентов и экспрессионных штаммов может варьироваться. Возможный вариант воплощения изобретения путем экспрессии рекомбинантной гибридной белковой конструкции в клетках E.coli описан в патенте № RU2687435C1. Для создания гибридной белковой конструкции, сначала методами генной инженерии конструируется нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, содержащую DR5 -специфичный вариант цитокина TRAIL на N-конце полипептидной цепи, линкерную последовательность, и пептид CRGDKGPDC на С-конце полипептидной цепи. Указанная нуклеотидная последовательность встраивается в подходящий генетический вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции в виде единой полипептидной цепи в клетках бактериальных штаммов либо эукариотических линий, предназначенных для экспрессии рекомбинантных белков. Очистка экспрессированного целевого белка осуществляется (но не ограничивается) с помощью стандартных методик, к примеру, металл-аффинной и ионобменной хроматографии. Аффинность очищенной гибридной белковой конструкции к рецепторам DR5 и интегрину avP3 определяется методами иммуноферментного анализа, поверхностного плазмонного резонанса, либо другими валидированными методами. Показана высокая аффинность связывания полученного гибридного белка с рецептором DR5 и интегрином avP3. Биологическая активность гибридной белковой конструкции исследуется на моделях опухолей in vitro и in vivo, в частности на мультиклеточных 3 D-моделях сфероидов, полученных из опухолевых клеточных линий. Повышенное противоопухолевое действие белковой конструкции DR5- селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC подтверждается результатами сравнительного исследования скорости накопления в мультиклеточных сфероидах на основе клеточной линии глиобластомы U87MG, экспрессирующей рецептор DR5 и пите грин avP3, а также результатами сравнительного исследования цитотоксической активности в отношении той же культуры мультиклеточных сфероидов. В частном случае реализации изобретения описывается способ индукции гибели опухолевых клеток U87MG с помощью полученного гибридного белка, имеющего повышенный цитотоксический эффект по сравнению с исходным DR5-ceлeктивным вариантом цитокина TRAIL.
Нижеследующие примеры приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1. Способ получения генетической конструкции, кодирующей аминокислотную последовательность гибридной белковой конструкции DR5-ceлeктивнoгo варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC.
Для получения генетической конструкции, последовательность, кодирующую линкер GGGGSGGGGSGG и пептид CRGDKGPDC, вносят на 3’ -концевую последовательность ДНК, кодирующей ОК5-селективный вариант цитокина TRAIL в составе плазмидного вектора рЕТ32а, с помощью синтетического олигонуклеотида ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggttgtcgtggtgacaaaggtcctgat tgctaa (SEQ ID NO: 6) методом ПЦР. Для исключения случайных мутаций в векторе в ходе ПНР гены гибридных белков переклонируют в исходный вектор по сайтам рестрикции Ndel и Xhol. Последовательность гена, кодирующего гибридную белковую конструкцию ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC, подтверждают секвенированием.
Пример 2. Способ экспрессии рекомбинантной белковой конструкции DR5-ceлeктивнoгo варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC.
Для экспрессии гибридного белка полученный плазмидный вектор рЕТ32а, кодирующий аминокислотную последовательность белковой конструкции, трансформируют в компетентные клетки штамма Е. coli SHuffle В. Экспрессию проводят в среде ТВ в присутствии 100 мкг/мл ампициллина. Максимальная экспрессия наблюдается при индукции с помощью 0.05 мМ ИПТГ при 28°С в течение 18-20 часов при ротации платформы инкубатора 180 об/мин. Клетки собирают центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут при 4°С, отмывают буфером, содержащим 50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия (pH 8.0) и хранят при - 80°С. Экспрессию белка в клеточном лизате оценивают с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза в 15% геле с окрашиванием краской кумасси бриллиантовый синий R-250. В данном примере уровень экспрессии гибридного DR5 -селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC в 1 литре культуры клеток составляет 350-370 мг.
Пример 3. Способ очистки рекомбинантной белковой конструкции ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC.
Клетки ресуспендируют в лизис-буфере, содержащем 50 мМ фосфата натрия и 300 мМ хлорида натрия (pH 8.0), и разрушают с помощью установки «French press» (Spectronic Instruments, Inc., США) под давлением 1700 бар. Клеточный лизат центрифугируют при 75000 g при 4°С в течение 40 минут. В вышеописанном примере белок экспрессируется в растворимой форме, что позволяет проводить очистку из цитоплазматической фракции. На первом этапе очистку проводят путем металл-аффинной хроматографии на сорбенте Ni- NTA агарозе. Затем белки диализуют и проводят дополнительную очистку на ионообменном сорбенте SP сефарозе. После очистки белок диализуют против раствора 150 мМ NaCl и стерилизуют через шприцевой фильтр с порами 0,22 мкм с мембраной PVDF. Чистоту полученного рекомбинантного белка анализируют с помощью ДСН-ПААГ- электрофореза в 15% геле с окрашиванием краской кумасси бриллиантовый синий R-250. Чистота препарата в данном примере составляет не менее 98%, Концентрацию белка в очищенном препарате определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм с учетом молярного коэффициента экстинкции 26025 М -1 , см -1 для ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC, определенного по аминокислотной последовательности с помощью программы ProtParam на сервере ExPASy (www.expasy.org). При очистке вышеописанным способом выход очищенного белка составляет 22-25 мг из 200 мл культуры клеток, при этом препарат проявляет высокую стабильность: при хранении белкового раствора в течение как минимум 6 месяцев не наблюдается ни деградации, ни потери биологической активности.
Пример 4. Анализ аффинности белковой конструкции ОЕ5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC к рецептору DR5 и интегрину avP3.
Анализ аффинности гибридного белка к рецептору смерти DR5 проводят методом иммуноферментного анализа. Для этого коммерческий препарат рекомбинантного внеклеточного домена рецептора DR5 иммобилизуют в количестве 100 нг на лунку 96- луночного планшета и определяют связывание гибридного ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC в диапазоне концентраций от 0,1 до 50 нМ. В качестве контроля используют исходный DR5-ceлeктивный вариант цитокина TRAIL в тех же концентрациях. Связывание определяют с помощью первичных анти-TRAIL антител с последующей инкубацией с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. После 15-минутной инкубации с колориметрическим субстратом OPD реакцию останавливают раствором IN H2SO4. Оптическую плотность определяют спектрофотометрически при 450 нм. Значения константы диссоциации (Kd) рассчитывают с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8, используя опцию нелинейной регрессии в разделе XY-анализа. В результате оценки аффинности таким способом показывают, что аффинность гибридного белка к рецептору DR5 сопоставима с исходным ОК5-селективным вариантом цитокина TRAIL (Kd 1,43 ± 0,31 нМ и 1,66 ± 0,41 нМ для исходного и гибридного белков, соответственно). Это доказывает, что внесение пептида CRGDKGPDC на С- конец ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL не влияет на сродство к рецептору смерти DR5.
Определение аффинности гибридного белка к интегрину avP3 проводят методом иммуноферментного анализа, иммобилизуя по 200 нг коммерческого препарата интегрина avP3 на лунку 96-луночного планшета. Связывание гибридного белка определяют в диапазоне концентраций от 0, 1 до 400 нМ. В качестве контроля используют аналогичные концентрации исходного ОК5-селективного варианта цитокина TRAIL. Связывание гибридного белка с интегрином avP3 детектируют аналогичным образом, как описано выше для связывания с рецептором DR5. Исходный DR5- селективный вариант цитокина TRAIL практически не связывается с интегрином avP3, тогда как гибридный белок с пептидом CRGDKGPDC показывает высокую аффинность с константой диссоциации 1,89 ± 0,59 нМ, что сопоставимо с аффинностью самого пептида (Kd 10-20 нМ). Это доказывает, что пептид CRGDKGPDC в составе гибридного белка не теряет аффинности к интегрину avP3.
Пример 5. Анализ противоопухолевой активности гибридной белковой конструкции DR5- селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC.
Противоопухолевая активность гибридной белковой конструкции исследуется методом WST-1 теста на мультиклеточных 3 D-сфероидах, полученных из линии опухолевых клеток глиобластомы U87MG. Клеточные сфероиды культивируют в питательной среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Далее в культуральную среду добавляют по 10 мкл среды с разведениями исходного DR5- селективного варианта цитокина TRAIL и гибридного белка с пептидом CRGDKGPDC в диапазоне от 0,05 до 500 нМ. После 24 ч или 48 ч инкубации в каждую лунку добавляют по 10 мкл реагента WST-1 и планшеты выдерживают в течение 2 ч при 37°С. Оптическую плотность измеряют с помощью планшетного спектрофотометра при длине волны 450 нм с вычитанием фона при 655 нм. В результате получают значения IC50 273.1 нг/мл и 12.09 нг/мл для исходного и гибридного белков, соответственно, спустя 24 часа инкубации, и 5.5 нг/мл и 184.8 нг/мл, соответственно, спустя 48 часов инкубации, что свидетельствует о повышенной противоопухолевой активности гибридной белковой конструкции.
Пример 6. Сравнительный анализ скорости накопления белков в опухолевых 3D- структурах. Чтобы оценить скорость накопления гибридной белковой конструкции DR5- селективного варианта цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC в опухолевых 3D- структурах, проводят анализ накопления методом сканирующей конфокальной микроскопии клеток в ЗО-модели клеточной линии глиобластомы U87MG. Мультиклеточные сфероиды на основе линии U87MG культивируют в питательной среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Питательную среду в лунках заменяют средой без сыворотки, содержащей краситель Hoechst 33258 (10 мкг/мл). Затем клетки инкубируют в течение 15-20 мин в СОг-инкубаторе (5% СОг, 37° С), после чего удаляют раствор красителя и промывают 2-3 раза 0,5 мл физ. раствора от несвязавшихся молекул красителя. Далее к клеткам добавляют белки-лиганды в концентрации 1000 нг/мл. Для визуализации белки предварительно модифицируются аминокислотной заменой Vall l4Cys Ha N-коице полипептидной цепи, после чего конъюгируются с флуоресцентным красителем сульфо-цианин-3-малеимидом (СуЗ) (Lumiprobe, Россия). После инкубирования клеток с белками-лигандами в течение временных периодов 15 мин и 1 ч, проводится трехкратная отмывка клеток от несвязавшихся белков с помощью 0,5 мл физ. раствора. Сфероиды аккуратно переносят на покровные стекла, после чего фиксируют с помощью CC/Mount™. Образцы изучают на инвертированном микроскопе Nikon ТЕ-2000 (Япония), снабженном конфокальной лазерной системой. Таким образом показывают, что гибридный DR5-ceлeктивный вариант цитокина TRAIL с пептидом CRGDKGPDC способен быстрее накапливаться в опухолевых 3 D-структурах по сравнению с исходным DR5- селективным вариантом цитокина TRAIL.
Пример 7. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ Ш NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции путем внесения нуклеотидных замен в последовательность ДНК, кодирующую элемент А конструкции, а именно рецептор-специфичный вариант цитокина TRAIL (SEQ ID NO: 2), таким образом, чтобы в аминокислотную последовательность были введены замены D267Q и H269D. Полученная аминокислотная последовательность на 98% гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Указанные замены производят в плазмидном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт- специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ctgtaacaaatgagcgcttgctagacatggaccatgaagccag (SEQ ID NO: 7) и ctggctcatggtccatgtctagcaagcgctcattgtacag (SEQ ID NO: 8) с помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции А, содержащая замены D267Q и H269D, имеет молекулярную массу 21152 Да и стабильность, аналогичную гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции А, содержащая замены D267Q и H269D, сохраняет специфичность к рецептору DR5 аналогично гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Пример 8. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ Ш NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции путем замены последовательности ДНК ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggt (SEQ ID NO: 9), кодирующей элемент X конструкции, а именно линкер с аминокислотной последовательностью GGGGSGGGGSGG (SEQ Ш NO: 3), на последовательность ggtggaggtagtggaggaggtagtggtggtggtagt (SEQ ID NO: 10), кодирующей линкер с аминокислотной последовательностью GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 11). Указанную замену производят в плазмид ном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт-специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ggggcctttttagttggcggtggaggtagtggaggaggtagtggtggtggtagttgtcgt ggtgac (SEQ ГО NO: 12) и gtcaccacgacaactaccaccaccactacctcctccactacctccaccgccaactaaaaa ggcccc (SEQ ID NO: 13) c помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции X состава GGGSGGGSGGGS имеет молекулярную массу 21191 Да и стабильность, аналогичную гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ГО NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции X состава GGGSGGGSGGGS связывается с интегрином avP3 с той же аффинностью, что и гибридная белковая конструкция с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Пример 9. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ ГО NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции путем замены последовательности ДНК ggtggaggtggctcaggaggtggtgggagtggcggt (SEQ ID NO: 9), кодирующей элемент X конструкции, а именно линкер с аминокислотной последовательностью GGGGSGGGGSGG (SEQ ГО NO: 3), на последовательность ggtagtggaggtggaggaagtggtggtggtggtagt (SEQ ID NO: 14), кодирующей линкер с аминокислотной последовательностью GSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 15). Указанную замену производят в плазмидном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт-специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ggggcctttttagttggcggtagtggaggtggaggaagtggtggtggtggtagttgtcgt ggtgac (SEQ ГО NO: 16) и gtcaccacgacaactaccaccaccaccacttcctccacctccactaccgccaactaaaaa ggcccc (SEQ ID NO: 17) c помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции X состава GSGGGGSGGGGS имеет молекулярную массу 21191 Да и стабильность, аналогичную гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ГО NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции X состава GSGGGGSGGGGS связывается с интегрином avP3 с той же аффинностью, что и гибридная белковая конструкция с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Пример 10. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ ГО NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридной белковой конструкции путем замены последовательности ДНК tgtcgtggtgacaaaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 18), кодирующей элемент В конструкции, а именно пептид с аминокислотной последовательностью CRGDKGPDC (SEQ ГО NO: 4), на последовательность gcatgtcgtggtgacagaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 19), кодирующей пептид с аминокислотной последовательностью ACRGDRGPDC (SEQ ID NO: 20), который на 90% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ГО NO: 4. Указанную замену производят в плазмидном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт- специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ggtggtgggagtggcgcatgtcgtggtgacagaggtcctgattgctaa (SEQ ID NO: 21) и ttagcaatcaggacctctgtcaccacgacatgcgccactcccaccacc (SEQ ID NO: 22) с помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции В состава ACRGDRGPDC имеет молекулярную массу 21260 Да и стабильность, аналогичные гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ ГО NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции В состава ACRGDRGPDC связывается с интегрином avP3 с той же аффинностью, что и гибридная белковая конструкция с аминокислотной последовательностью SEQ ГО NO: 1.
Пример 11. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ ГО NO: 1.
Конструируют плазмидный вектор для экспрессии гибридного белка путем замены последовательности ДНК tgtcgtggtgacaaaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 18), кодирующей элемент В конструкции, а именно пептид с аминокислотной последовательностью CRGDKGPDC (SEQ ID NO: 4), на последовательность gcaggtgggtgtcgtggtgacagaggtcctgattgc (SEQ ID NO: 23), кодирующей пептид с аминокислотной последовательностью AGGCRGDRGPDC (SEQ ID NO: 24), который на 75% гомологичен аминокислотной последовательности SEQ ГО NO: 4. Указанную замену производят в плазмидном векторе рЕТ32а, кодирующем аминокислотную последовательность белковой конструкции, методом сайт-специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидных праймеров ggtggtgggagtggcgcaggtgggtgtcgtggtgacagaggtcctgattgctaa (SEQ ГО NO: 25) и ttagcaatcaggacctctgtcaccacgacacccacctgcgccactcccaccacc (SEQ ID NO: 26) с помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. Показывают методом электрофореза в полиакриламидном геле, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции В состава AGGCRGDRGPDC имеет молекулярную массу 21375 Да и стабильность, аналогичные гибридной белковой конструкции с аминокислотной последовательностью SEQ Ш NO: 1. Показывают методом иммуноферментного анализа, как описано в примере 4, что полученная гибридная белковая конструкция с элементом конструкции В состава AGGCRGDRGPDC связывается с интегрином avP3 с той же аффинностью, что и гибридная белковая конструкция с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
Пример 12. Противоопухолевая гибридная белковая конструкция, имеющая последовательность, отличающуюся от охарактеризованной в SEQ Ш NO: 1.
В плазмидный вектор рЕТ32а, содержащий последовательность молекулы нуклеиновой кислоты SEQ Ш NO: 5, вносят кодирующие альтернативные кодоны нуклеотидные замены A126G, А129Т, A132G, G135A, Т138С, G141C, Т144С, А147Т, С150Т, G153C с использованием праймеров ggccgcaaaataaactcctgggagtcttcgagaagcggccactcttttctcagcaacttg c (SEQ ID NO: 27) и gcaagttgctgagaaaagagtggccgcttctcgaagactcccaggagtttattttgcggc c (SEQ ID NO: 28), и T381C, C384G, C387A, T390C, A393G, G396C, A399T, A402T, T405A, G408A, T411A c использованием праймеров gcagaatatggactctactcgatataccagggcggtattttagaactaaaggaaaatgac (SEQ ID NO: 29) и gtcattttcctttagttctaaaataccgccctggtatatcgagtagagtccatattctgc (SEQ ID NO: 30) с помощью полимеразной цепной реакции. Полученным плазмидным вектором трансформируют бактериальный штамм E.coli SHuffle В, экспрессируют и очищают гибридную белковую конструкцию, как описано в примерах 2 и 3, соответственно. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле показывают, что с полученной молекулы нуклеиновой кислоты, гомологичной на 95% последовательности SEQ Ш NO: 5, экспрессируется белковая конструкция по п.1.
Конкретные подробно описанные примеры экспериментов приведены для иллюстрации настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
Белковую конструкцию по изобретению можно использовать в качестве активного действующего вещества в фармацевтических композициях, предназначенных для лечения солидных онкологических заболеваний, характеризующихся экспрессией рецептора DR5 и интегрина avP3 на поверхности опухолевых клеток, таких как, например, глиобластома, аденокарцинома поджелудочной железы и другие. Изобретение позволяет обеспечить повышенный уровень эффективности за счет двойной опухолеспецифичности и усиленному накоплению в опухолевых тканях по сравнению с DR5 -специфичным мутантным вариантом противоопухолевого цитокина TRAIL.
Next Patent: METHOD FOR DETECTING AND EXTINGUISHING FIRES AND SYSTEM FOR CARRYING OUT SAME