DESCRIPTION

TITRE : HYDROGELS POUR LE COMBLEMENT DES TISSUS MOUS

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention concerne les gels de comblement (« filler gels » en anglais), notamment à base de polysaccharides réticulés, utilisés dans le domaine esthétique et/ou médical pour combler les rides et/ou donner plus de relief à certaines zones du visage.

TECHNIQUE ANTERIEURE

Les gels de comblement sont par exemple des hydrogels à base de polysaccharide, notamment d’acide hyaluronique (HA) et sont injectés sous la peau à l’aide d’une seringue. Les hydrogels adaptés au comblement des tissus mous sont typiquement des hydrogels réticulés, i.e., le polysaccharide est réticulé au moyen d’un ou plusieurs agent(s) réticulant. Cette réticulation permet d’obtenir un hydrogel avec les propriétés mécaniques souhaitables pour le comblement des tissus mous.

Les fabricants proposent des hydrogels de comblement présentant diverses propriétés rhéologiques en fonction du site d’injection de l’hydrogel. Par exemple, en cas d’injection dans les couches superficielles de la peau, les hydrogels doivent combler légèrement les fines rides et ridules et être capables de suivre facilement les mouvements du visage. Tandis que les hydrogels destinés à implantation profonde, en particulier destinés au comblement des plis et rides plus sévères et/ou à la création de volume, doivent avantageusement présenter une capacité intrinsèque à maintenir durablement leur épaisseur dans les couches de la peau, y compris sous la contrainte des mouvements du visage. Pour des applications intermédiaires, par exemple pour des injections dans les couches médianes de la peau, des gels ayant des propriétés intermédiaires sont choisis, c’est-à-dire des propriétés entre des propriétés de gels destinés à des applications profondes et des propriétés de gels destinés à des applications superficielles.

Les mesures rhéologiques des hydrogels habituellement les plus exploitées sont celles des modules G’ et G”, l’angle de déphasage 5 étant relié à ces mesures (tan 5 = G”/G’). Ces mesures sont communément effectuées sous un faible stress oscillatoire avec une faible amplitude, dans leur zone de viscoélasticité linéaire. Ces mesures ne reflètent pas nécessairement le stress mécanique et de déformation qu’un hydrogel de comblement subit in vivo. Ces mesures ne permettent pas de prédire le comportement en compression de l’hydrogel. Or, il est important de pouvoir prédire le comportement des hydrogels in situ afin de garantir que l’effet recherché soit bien obtenu, tout particulièrement lorsque le gel de comblement est destiné à la création de volume modéré/subtil.

Les hydrogels commerciaux destinés à la création de volume dits « volumateurs » sont des hydrogels réticulés, préparés avec des quantités non négligeables d’agent réticulant. Les hydrogels réticulés peuvent présenter des problèmes de biocompatibilité. Pour optimiser cette biocompatibilité, une des solutions consiste à diminuer le degré de modification du polysaccharide nécessaire à l’obtention du gel afin d’être le plus proche du polysaccharide naturel ou d’opter pour des méthodes de réticulations alternatives, telles que les réticulations par réaction sol-gel. Cependant, avec de telles solutions, les hydrogels préparés peuvent ne pas présenter les propriétés mécaniques adaptées à une utilisation en tant que volumateurs, en particulier ces hydrogels sont susceptibles d’être moins réticulés, peuvent posséder un module G' diminué et une faible capacité de maintien de leur épaisseur dans les tissus.

Un besoin demeure donc pour la mise à disposition d’hydrogels, en particulier d’hydrogels volumateurs, ayant un degré de modification du polysaccharide minimal présentant néanmoins des propriétés mécaniques adaptées à la création de volume et maintenant durablement leur épaisseur dans les couches de la peau, y compris sous la contrainte des mouvements du visage. La présente invention vise ainsi à fournir des hydrogels à base de polysaccharides réticulés qui présentent une capacité volumatrice, notamment adaptée pour la création de volume modéré/subtil, tout en étant hautement biocompatibles, c’est-à-dire aussi naturels et aussi peu modifiés que possible.

RESUME DE L’INVENTION

L’invention propose des hydrogels à base de polysaccharide réticulé présentant un taux de modification inférieur ou égal à 1 % et présentant un indice de projection PIdx allant de 50% à moins de 80%, l’indice de projection étant déterminé selon la méthode décrite ci-dessous en détails.

L’invention porte également sur un hydrogel à base de polysaccharide réticulé présentant un taux de modification inférieur ou égal à 1 % et présentant un indice de projection PIdx allant de 50% à moins de 80%, préparé par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir au moins un polysaccharide ou un sel de celui-ci ; b) fournir au moins un agent réticulant ou un sel de celui-ci ; c) préparer un milieu réactionnel de réticulation comprenant le ou les polysaccharide(s), le ou les agent(s) réticulant et un solvant, la quantité totale d’agent réticulant allant de O,001 à 0,01 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de préférence la durée de l’étape de préparation du milieu réactionnel n’excédant pas 5 heures ; et d) placer le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape c), à une pression P inférieure ou égale à la pression atmosphérique et à une température T supérieure à la température du point eutectique du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P et inférieure à la température du point de congélation du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression

P, de préférence pendant une durée allant de 1 semaine à 17 semaines.

L’invention porte également sur un hydrogel à base de polysaccharide réticulé présentant un taux de modification inférieur ou égal à 1 % et présentant un indice de projection PIdx allant de 50% à moins de 80%, préparé par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir au moins un polysaccharide ou un sel de celui-ci ; b) fournir au moins un agent de fonctionnalisation ou un sel de celui-ci tel que décrit ci-dessous ; c) préparer un milieu réactionnel de réticulation comprenant le ou les polysaccharide(s), le ou les agent(s) de fonctionnalisation et un solvant, la quantité totale d’agent de fonctionnalisation allant 0,001 à 0,01 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de préférence la durée de l’étape de préparation du milieu réactionnel n’excédant pas 5 heures ; et d) placer le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape c), à une pression P inférieure ou égale à la pression atmosphérique et à une température T supérieure à la température du point eutectique du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P et inférieure à la température du point de congélation du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P, de préférence pendant une durée allant de 1 semaine à 17 semaines.

L’invention porte également sur l’utilisation des hydrogels de l’invention pour prévenir et/ou traiter les altérations des propriétés viscoélastiques ou biomécaniques de la peau ; pour combler des rides, des ridules et des cicatrices ; pour atténuer les sillons naso-géniens et plis d’amertumes ; pour augmenter le volume des pommettes, du menton ou des lèvres ou pour réduire l’apparition des rides et ridules.

D’autres aspects de l’invention sont tels que décrits dans les revendications et ci-après. Définitions

Le terme « gel » désigne un réseau de polymères qui est dilaté dans tout son volume par un fluide. Cela signifie qu’un gel est formé de deux milieux, l’un « solide » et l’autre « liquide », dispersés l’un dans l’autre. Le milieu dit « solide » est constitué des longues molécules polymères connectées entre elles par des liaisons faibles (par exemple des liaisons hydrogène) ou par des liaisons covalentes (réticulation). Le milieu liquide est constitué d’un solvant. Un gel correspond généralement à un produit qui possède un angle de phase 5 inférieur ou égal à 45° à 1 Hz pour une déformation de 0,1 % ou une pression de 1 Pa, avantageusement un angle de phase 5 allant de 2° à 45° ou allant de 20° à 45°.

Le terme « hydrogel » désigne un gel tel que défini ci-dessus dans lequel le solvant constituant le milieu liquide est majoritairement de l’eau (par exemple au moins 90%, en particulier au moins 95%, notamment au moins 97%, notamment au moins 98% en poids du milieu liquide). De manière préférée, le milieu liquide comprend, notamment consiste en, une solution tampon, permettant avantageusement un pH du milieu liquide compris entre 6,8 et 7,8, notamment un tampon phosphate salin.

Le terme « gel injectable » désigne un gel qui peut s’écouler et être injecté manuellement au moyen d’une seringue munie d’une aiguille de diamètre allant de 0,1 à 0,5 mm, par exemple d’une aiguille hypodermique de 32G, 30 G, 27 G, 26 G, 25 G. Préférentiellement, un « gel injectable » est un gel présentant une force d’extrusion moyenne inférieure ou égale à 25N, de préférence allant de 5 à 25 N, encore de préférence allant de 8 à 15 N, lors d’une mesure avec un dynamomètre, à une vitesse fixe d’environ 12,5 mm/min, dans des seringues de diamètre externe supérieur ou égal à 6,3 mm, avec une aiguille de diamètre externe inférieur ou égal à 0,4 mm (27 G) et de longueur 1 ”, à température ambiante.

Une « application superficielle » désigne l’administration, par exemple par mésothérapie, d’une composition superficiellement dans la peau, ou sur la peau, pour le traitement des couches superficielles de la peau, de l’épiderme et des parties les plus superficielles du derme, pour réduire les rides superficielles et/ou améliorer la qualité de la peau (telle que son éclat, sa densité ou sa structure) et/ou rajeunir la peau.

Une « application médiane » désigne l’administration d’une composition dans la partie médiane de la peau pour traiter les couches médianes de la peau, ainsi que pour réduire les rides médianes.

Une « application profonde » désigne l’administration d’un hydrogel dans les couches les plus profondes de la peau, l’hypoderme et la partie la plus profonde du derme, et/ou sous la peau (au-dessus du périoste) pour « volumiser » les tissus mous, tels que pour le comblement des rides les plus profondes et/ou des régions partiellement atrophiées du contour du visage et/ou du corps. Les hydrogels dit « volumateur » peuvent typiquement être administrés pour l’application profonde.

Un « polysaccharide réticulé » désigne un polysaccharide modifié au cours d’une réaction de réticulation. La réticulation peut être réalisée au moyen d’un agent de réticulation ou résulter d’une réaction sol-gel. Lorsque la réaction de réticulation est une réaction sol-gel, le polysaccharide est modifié avec un agent de fonctionnalisation.

A contrario, un « polysaccharide non réticulé » désigne un polysaccharide non modifié avec un agent réticulant et/ou agent de fonctionnalisation et qui donc n’a pas subi de réaction de réticulation.

Le terme « agent réticulant » désigne tout composé capable d’introduire une réticulation entre différentes chaines de polysaccharide.

Le terme « agent de fonctionnalisation » désigne tout composé capable de réagir avec un groupe fonctionnel du polysaccharide et de réagir via une réaction sol-gel.

Le « taux de réticulation molaire » (TR), exprimé en %, désigne le rapport molaire de la quantité d’agent réticulant par rapport à la quantité d’unité de répétition du polysaccharide introduite dans le milieu réactionnel de réticulation exprimé pour 100 moles d’unités de répétition du polysaccharide dans le milieu de réticulation.

Le « taux de fonctionnalisation molaire », exprimé en %, désigne le rapport molaire de la quantité d’agent de fonctionnalisation par rapport à la quantité d’unité de répétition du polysaccharide introduite dans le milieu réactionnel de réticulation exprimé pour 100 moles d’unités de répétition du polysaccharide dans le milieu de fonctionnalisation.

L’expression « unité de répétition » d’un polysaccharide désigne un motif structurel constitué d’un ou plusieurs (généralement 1 ou 2) monosaccharides dont la répétition produit la chaîne de polysaccharide complète.

Le « degré de modification » (MOD) d’un polysaccharide, tel que l’acide hyaluronique, correspond à la quantité molaire d’agent réticulant liée au polysaccharide et/ou d’agent de fonctionnalisation liée au polysaccharide, par une ou plusieurs de ses extrémités, exprimée pour 100 moles d’unités de répétition du polysaccharide. Il peut être déterminé par des méthodes connues de l’homme du métier telle que la spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) (voir section expérimentale).

Le terme « polysaccharide » désigne un polymère composé de monosaccharides (préférentiellement des énantiomères D) joints entre eux par des liaisons glycosidiques. Par « température ambiante », il est entendu une température allant de 20 à 25°C, plus particulièrement 25°C.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Les hydrogels à base de polysaccharide réticulé proposés se caractérisent par un taux de modification inférieur ou égal à 1 % et un indice de projection Pldx allant de 50 à moins de 80%, de préférence allant de 60 à moins de 80%, l’indice de projection étant déterminé tel que décrit en détails ci-après. L’indice de projection reflète le comportement rhéologique des hydrogels sous une force dans le temps. En d’autres termes, de tels hydrogels, présentent la capacité de maintenir une épaisseur supérieure ou égale à 50% et inférieure à 80% de leur épaisseur initiale au cours du temps.

Les hydrogels dont l’indice de projection Pidx varie de 50 à moins de 80% présentent une capacité à créer des volumes modérés/subtils qui se maintiennent au cours du temps.

L’indice de projection permet donc de discriminer les hydrogels entre eux, pour retenir celui ou ceux ayant les propriétés les plus intéressantes pour le résultat recherché, notamment lorsque l’on cherche à obtenir des hydrogels destinés à la création de volume dits « volumateurs », en particulier des hydrogels « volumateurs » utiles pour la création de volume modéré/subtil.

Les hydrogels de la présente invention, de par cet indice de projection allant de 50% à moins de 80%, s’avèrent être de bons gels de comblement polyvalents, c’est-à-dire utiles pour la correction de défauts modérés.

Détermination de l’indice de projection

L’indice de projection est déterminé par une méthode comprenant les étapes suivantes :

1) soumettre un bolus d’un gramme d’hydrogel à une force de compression F fixe constante de 2 newtons, ledit hydrogel étant préalablement disposé entre deux plaques circulaires de pression d’un rhéomètre et présentant une épaisseur initiale dO de 700 pm donnée par la distance entre les deux plaques, les deux plaques étant parallèles et ayant un diamètre de 40 mm,

2) acquérir à 25°C l’évolution de la variation de l’épaisseur de l’hydrogel ainsi comprimé pendant 1 heure ;

3) paramétrer un modèle de Maxwell généralisé approximant l’évolution observée à partir de l’acquisition effectuée à l’étape 2), ledit modèle exprimant l’épaisseur de l’hydrogel en fonction du temps d _ge i(t) et répondant à l’équation 1 suivante :

(équation 1) où d~ est l’épaisseur limite obtenue à l’équilibre, A, une constante, Ti un paramètre de relaxation, le nombre de membres i de l’équation étant égal à 2 ;

4) déterminer à partir du modèle une épaisseur limite d~ vers laquelle tend à évoluer l’hydrogel au cours du temps ; et

5) générer l’indice de projection PIdx à partir de l’équation 2 suivante :

(équation 2).

L’épaisseur limite obtenue à l’équilibre (d~) désigne l’épaisseur obtenue au bout d’un temps infini pour la force de compression F appliquée.

La force de compression F appliquée (2N) est, de préférence comprise dans le domaine de déformation viscoélastique linéaire de l’hydrogel c’est-à-dire que la force de compression F appliquée se traduit avantageusement en une pression comprise dans le domaine de viscoélasticité linéaire de l’hydrogel. Une telle force de valeur est adaptée aux gels de comblement dits volumateurs. Le domaine de viscoélasticité linéaire (Linear ViscoElastic Region ou LVER) correspond à la gamme de déformations de l’hydrogel allant d’une valeur initiale de module élastique E' jusqu’à la valeur du module élastique E’ diminué de 10% de sa valeur initiale.

La méthode de détermination de l’indice de projection peut ainsi dans un premier temps comprendre une étape de détermination du domaine de déformation viscoélastique linéaire de l’hydrogel. Cette étape permet de s’assurer que la force de compression F appliquée est bien dans le domaine de déformation viscoélastique linéaire du gel. Avantageusement, cette étape consiste en une mesure de balayage à contrainte oscillatoire en mode compression à une fréquence d’oscillation donnée pour déterminer la région viscoélastique linéaire et encadrer la force normale appliquée. Cette mesure est appliquée sur une gamme de contrainte déterminée dans des conditions identiques aux conditions de mesure de l’indice de projection. De préférence, la gamme de contrainte couvre de 10 Pa à 10000 Pa à 1 Hz à 25°C, géométrie de plaques plates parallèles (diamètre 40mm aluminium anodisé, TA instruments®), la distance entre la plaque de base et la plaque de pression est égale à 700 pm.

Lorsque la force de compression appliquée F est dans le domaine viscoélastique linéaire LVER des hydrogels, l’indice de projection PIdx est une mesure directe de leur capacité à maintenir leur épaisseur initiale sous une contrainte de compression donnée. L’indice de projection reflète ainsi le comportement de l’hydrogel au sein des tissus. Lorsque la force de compression appliquée F est au-delà de leur domaine de déformation viscoélastique linéaire LVER, l’indice de projection PIdx donne une indication sur leur capacité à garder leur épaisseur sur une certaine période ; en théorie, dans une géométrie non confinée, ces hydrogels continueraient à fluer, mais dans la réalité, les tissus environnants apportent un certain confinement bloquant le fluage du gel et ainsi PIdx reste une information d’intérêt pour prédire le comportement du gel in vivo.

Préférentiellement, la mesure de l’indice de projection s’effectue à l’aide d’un rhéomètre DHR2 équipé d’une géométrie de plaques plates parallèles (diamètre 40mm aluminium anodisé, TA instruments®) associé au logiciel TRIOS (TA Instruments®). Plus particulièrement, la détermination de l’indice de projection peut être réalisée de la manière suivante. Un bolus (échantillon) d’1 gramme d’hydrogel est déposé sur une plaque de base du rhéomètre. Une plaque de pression possédant un diamètre de 40 mm applique une force sur l’échantillon, jusqu’à ce que son épaisseur, donnée par la distance entre la plaque de base et la plaque de pression soit égale à 700 pm (do).

Une fois que l’épaisseur a atteint cette valeur prédéfinie d ₀ et que de préférence la force de résistance de l’hydrogel est inférieure ou égale à la valeur de la force F à appliquer, une force de compression F fixe et constante de 2N (Newton) est appliquée et l’évolution de la variation de l’épaisseur de l’hydrogel est acquise. L’acquisition débute en prenant cet instant comme origine des temps de l’acquisition. Cette acquisition est réalisée pendant 1 heure à 25°C. De préférence, le paramètre d~ est calculé à l’aide du logiciel OriginPro® version 9.6.0.172.

Ce logiciel est utilisé pour appliquer un modèle mathématique de manière à avoir le meilleur ajustement du modèle avec l’évolution de l’épaisseur observée.

Le modèle utilisé est celui de Maxwell généralisé, qui donne l’évolution de l’épaisseur de l’hydrogel en fonction du temps t par la formule :

De bons résultats sont obtenus dès la présence de deux termes exponentiels : d~ correspond à l’épaisseur à l’équilibre après un temps infini, A, une constante, Ti un paramètre de relaxation, le nombre de membres i de l’équation étant égal à 2.

Le logiciel OriginPro® permet de calculer/déterminer par itération les valeurs des paramètres A, et Ti. A, et Ti reflètent un phénomène physique de relaxation d’un hydrogel. Ce sont des valeurs positives. En particulier, A, (équivalent à une épaisseur) est supérieur à 0 et inférieur ou égal à 700 pm. En particulier, Ti (équivalent à un temps) est inférieur à 24 heures, de préférence inférieur à 2 heures, de manière plus préférée inférieur à 1 heure. En particulier, l’itération est arrêtée lorsque R ² >0,99.

Les valeurs d’indice de projection sont par la suite calculées comme suit :

Le do correspond à l’épaisseur initiale entre les plaques avant application de la force.

Les paramètres fixés pour l’application de la méthode de détermination de l’indice de projection pour caractériser l’hydrogel selon l’invention permettent une discrimination facilitée des valeurs d’indices de projection tout en appliquant une force de compression comprise dans le LVER des hydrogels dits « volumateurs ».

Hydrogels

Les hydrogels à base de polysaccharide réticulé de la présente invention présentent un taux de modification inférieur ou égal à 1 % et un indice de projection allant de 50 à moins de 80%, de préférence allant de 60 à moins de 80%. L’indice de projection est déterminé par la méthode détaillée ci-avant.

Les hydrogels ayant un indice de projection allant de 50 à moins de 80% présentent une capacité à volumiser les tissus et maintiennent durablement leur épaisseur dans les couches de la peau, y compris sous la contrainte des mouvements du visage. De tels hydrogels sont tout particulièrement utiles en tant gels de comblement polyvalents, c’est-à-dire utiles pour la correction de défauts modérés.

Par ailleurs, les hydrogels ayant un taux de modification inférieur ou égal à 1 % sont hautement biocompatibles.

Les hydrogels selon l’invention sont à base de polysaccharide réticulé. Les hydrogels selon la présente invention comprennent donc un ou plusieurs polysaccharides réticulés. La réticulation permet d’obtenir un hydrogel ayant des propriétés mécaniques souhaitables pour le comblement des tissus mous.

Le polysaccharide peut être tout polymère composé de monosaccharides joints entre eux par des liaisons glycosidiques ou leurs mélanges. De préférence, le polysaccharide est choisi parmi la pectine et les substances pectiques ; le chitosan ; la chitine ; la cellulose et ses dérivés ; l’agarose ; les glycosaminoglycanes tels que l’acide hyaluronique, l’héparosane, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, la chondroïtine et la chondroïtine sulfate ; et leurs mélanges. De manière encore plus préférée, le polysaccharide est choisi parmi l’acide hyaluronique, l’héparosane, la chondroïtine et leurs mélanges, encore plus préférentiellement le polysaccharide est l’acide hyaluronique ou un de ses sels, en particulier un sel physiologiquement acceptable tel que le sel de sodium, le sel de potassium, le sel de zinc, le sel de calcium, le sel de magnésium, le sel d’argent, le sel de calcium et les mélanges de ceux-ci. Plus particulièrement, l’acide hyaluronique est sous sa forme acide ou sous forme de sel de sodium (NaHA). L’hydrogel peut ainsi être un hydrogel à base d’acide hyaluronique et/ou d’un de ses sels.

Le polysaccharide présente généralement une masse moléculaire moyenne en poids allant de 0,03 à 10MDa.

De préférence, si le polysaccharide est l’acide hyaluronique ou un de ses sels, il a une masse moléculaire moyenne en poids (Mw) allant de 0,05 à 10 MDa, préférentiellement allant de 0,5 à 5 MDa, par exemple allant de 0,07 à 10 MDa ou de 0,07 à 5 MDa, ou de 0,5 à 5 MDa ou de 1 à 5 MDa ou de 2 à 4 MDa.

Agents de réticulation

Le polysaccharide peut être réticulé au moyen d’un agent réticulant, de préférence choisi parmi les agents réticulant bi- ou multi-fonctionnels époxydiques ou non époxydiques, c’est-à-dire préparé par réaction du polysaccharide avec un agent réticulant tel que décrit. Parmi les agents époxydiques peuvent être cités le 1 ,4-butanediol diglycidyl éther (BDDE), le 1 ,2,7,8-diépoxy- octane, le 1 ,2-bis(2,3-époxypropyl)-2,3-éthane (EGDGE), le poly(éthylèneglycol)-diglycidyl éther (PEGDG), et leurs mélanges. Parmi les agents non époxydiques peuvent être cités les polyamines endogènes telles que la spermine, la spermidine et la putrescine, les aldéhydes tel que le glutaraldéhyde, les carbodiimides et la divinylsulfone, les dérivés d’hydrazide tel que l’adipic acid dihydrazide, les bisalkoxyamine, les dithiol tel que le polyéthylène glycol dithiol et leurs mélanges. Parmi les agents non époxydiques peuvent être cités les acides aminés tels que la cystéine, la lysine ; des peptides ou protéines contenant des acides aminés tels que la cystéine, la lysine ; des trimétaphosphates, comme par exemple le trimétaphosphate de sodium, le trimétaphosphate de calcium, ou encore le trimétaphosphate de barium.

Dans certains modes de réalisation, l’agent réticulant un agent époxydique, de préférence le 1 ,4- butanediol diglycidyl éther (BDDE) ou le polyéthylèneglycol-diglycidyl éther. Préférentiellement l’agent réticulant est le 1 ,4-butanediol diglycidyl éther (BDDE).

Dans certains modes de réalisation, l’agent réticulant est un agent non époxydique, de préférence choisi parmi les polyamines endogènes, les aldéhydes, les carbodiimides, la divinylsulfone, les acides aminés, les peptides et leurs mélanges. L’hydrogel selon la présente invention est de préférence à base d’un polysaccharide réticulé dont le taux de réticulation molaire est inférieur ou égal à 1 %, encore préférentiellement inférieur ou égal à 0,8% ou 0,5%, notamment allant de 0,1 % à 0,8% ou de 0,1 % à 0,5% (nombre de moles d’agent(s) réticulant pour 100 moles d’unité de répétition du ou des polysaccharides).

Agent de fonctionnalisation

Le polysaccharide peut être réticulé au moyen d’un agent de fonctionnalisation. L’agent de fonctionnalisation permet une réticulation du polysaccharide par réaction sol-gel. Ainsi, l’agent de fonctionnalisation comprend typiquement une seule fonction capable de réagir avec un groupe fonctionnel du polysaccharide et comprend un groupe silylé capable de réagir avec un autre groupe silylé via une réaction sol-gel de sorte à permettre la réticulation du polysaccharide et former un hydrogel.

L’agent de fonctionnalisation est typiquement une molécule de formule Chem. Il telle que présentée ci-après :

Chem. Il ou un sel de celle-ci, dans laquelle :

T représente un groupement isocyanate, amino, époxyde, carboxyle, N-succinimidyloxycarbonyle, N-sulfosuccinimidyloxycarbonyle, halogénocarbonyle, isothiocyanate, vinyle, formyle, hydroxyle, sulfhydryle, hydrazino, acylhydrazino, aminoxy, carbodiimide, ou un résidu d’anhydride d’acide ;

A représente une liaison chimique ou un groupement espaceur ;

R5 et R6, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène ; un atome d'halogène ; un groupement -OR4 avec R4 représentant un atome d'hydrogène, un groupement aryle ou un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone ; un aryle ; ou un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs groupe(s) choisis parmi un atome d’halogène, un aryle et un hydroxyle ;

R10 représente un atome d’hydrogène, un groupement aryle ou un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone. De préférence, dans la formule Chem. Il, T représente un groupement isocyanate, sulfhydryle, amino, époxyde, vinyle, formyle, ou carbodiimide, plus avantageusement, T représente un groupement époxyde ou amino, encore plus avantageusement T représente un groupement époxyde.

De préférence, dans la formule Chem. Il, A représente un groupement espaceur, plus préférentiellement une chaîne divalente hydrocarbonée aliphatique, notamment linéaire ou ramifiée et saturée, comportant de 1 à 12 atomes de carbone :

- dans laquelle sont éventuellement intercalés, entre deux atomes de carbone de ladite chaîne, un ou plusieurs (notamment 1 , 2, 3 ou 4) motifs divalents choisis parmi les arylènes,-O-, -S-, - S(O)-, -C(=O)-, -SO2- et -N(R9)- avec R9 représentant un atome d'hydrogène, un groupement hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone, ou un aryl-(C1-C6)alkyle,

- ladite chaîne étant non substituée ou substituée par un ou plusieurs groupes monovalents choisis parmi un atome d'halogène, un hydroxyle, un aryl-(C1-C6)alkyle.

Avantageusement, A est une chaîne divalente hydrocarbonée aliphatique, notamment linéaire ou ramifiée et saturée, dans laquelle sont éventuellement intercalés, entre deux atomes de carbone de ladite chaîne, un ou plusieurs motifs divalents -O-, plus avantageusement de 1 à 4 motifs divalents -O-, encore plus avantageusement un motif divalent O.

De préférence, A est une chaîne (C1-C12)alkylène dans laquelle sont éventuellement intercalés, entre deux atomes de carbone de ladite chaîne, un ou plusieurs motifs divalents -O-, plus préférentiellement de 1 à 4 motifs divalents -O-, encore plus préférentiellement un motif divalent -O-.

En particulier, A représente une chaîne divalente -(C1-C6)alkylène-O-(C1-C6)alkylène-, notamment -(C1-C4)alkylène-O-(C1-C4)alkylène-, plus particulièrement une chaine divalente -CH2-O-(CH2)3-, le groupe CH2 étant lié à T et le groupe (CH2)3 étant lié à Si dans la molécule de formule Chem. II.

Avantageusement, le groupement espaceur permettra également d’éviter une gêne stérique entre le groupement silylé et le groupement T de la molécule de formule Chem. Il, tout en assurant une liaison stable entre ces deux groupements.

De préférence, dans la formule Chem. Il, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un groupement -OR4 avec R4 représentant un atome d'hydrogène, un groupement aryle ou un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone ; ou un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi un atome d’halogène, un aryle et un hydroxyle. En particulier, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un groupement -OR4 avec R4 représentant un groupe (C1-C6)alkyle ; ou un groupe (C1-C6)alkyle.

Avantageusement, R5 et R6, identiques ou différents, représentent un groupement -OR4 avec R4 représentant un atome d'hydrogène, un groupement aryle ou un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence avec R4 représentant un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone, tel qu’un groupe (C1-C6)alkyle.

De préférence, dans la formule Chem. Il, R10 représente un atome d’hydrogène ou un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone tel qu’un groupe (C1-C6)alkyle, plus avantageusement R10 représente un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone tel qu’un groupe (C1-C6)alkyle.

De préférence, la molécule de formule Chem. Il est telle que :

- T est tel que défini ci-dessus et représente avantageusement un groupement amino ou époxyde, de préférence un groupement époxyde ;

- A est une chaîne divalente -(C1 -C6)alkylène-O-((C1 -C6)alkylène-, notamment -(C1 -C4)alkylène- O-(C1-C4)alkylène-, telle que -CH2-O-(CH2)3-, le groupe CH2 étant de préférence lié à T et le groupe (CH2)3 étant lié à Si dans la molécule de formule Chem. Il ;

- R5 et R6, identiques ou différents, sont chacun un groupement -OR4 avec R4 représentant un groupement (C1-C6)alkyle, de préférence un méthyle ou un éthyle ; ou un groupement (C1-C6)alkyle, de préférence un méthyle ou un éthyle ; et

- R10 est un groupement (C1-C6)alkyle, de préférence méthyle ou éthyle ; les groupes R5, R6 et OR10 pouvant être identiques.

En particulier, la molécule de formule Chem. Il est choisi parmi le (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES), le (3-glycidyloxypropyl)triméthoxysilane (GPTMS), le 3- Glycidoxypropyldimethoxymethylsilane, le 3-Glycidoxypropyldimethylethoxysilane, le (3- glycidyloxypropyl)éthoxydiméthoxysilane, le (3-glycidyloxypropyl)triéthoxysilane, le diéthoxy(3- glycidyloxypropyl)méthylsilane, et leurs mélanges ; de préférence parmi le (3- glycidyloxypropyl)triméthoxysilane (GPTMS), le (3-glycidyloxypropyl)éthoxydiméthoxysilane, le (3-glycidyloxypropyl)triéthoxysilane, le diéthoxy(3-glycidyloxypropyl)méthylsilane, et leurs mélanges ; encore plus de préférence le (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES), le (3- glycidyloxypropyl)triméthoxysilane (GPTMS) et leurs mélanges.

L’hydrogel selon la présente invention est de préférence à base d’un polysaccharide réticulé dont le taux de fonctionnalisation molaire est inférieur ou égal à 1 %. De manière plus préférée, l’hydrogel selon la présente invention est à base d’un polysaccharide réticulé dont le taux de fonctionnalisation molaire va de 0,1 à 1 % (nombre de moles d’agent(s) de fonctionnalisation pour 100 moles d’unité de répétition du ou des polysaccharides).

L’hydrogel selon la présente invention est à base d’un polysaccharide réticulé présentant un degré de modification (MOD) inférieur ou égal à 1 %.

L’hydrogel selon la présente invention possède avantageusement un ratio degré de modification (MOD) / PIdx inférieur ou égal à 0,020, de préférence inférieur ou égal à 0,017, de manière plus préférée inférieur ou égal à 0,015.

L’hydrogel selon la présente invention peut comprendre de 0,1 à 5% en poids, de préférence de

1 à 3% en poids de polysaccharide (par exemple d’acide hyaluronique), par rapport au poids total de l’hydrogel, le polysaccharide (par exemple l’acide hyaluronique) étant présent sous forme réticulée. L’hydrogel peut en outre comprendre un polysaccharide sous forme non réticulée. En particulier, la teneur en polysaccharide (par exemple en acide hyaluronique) non réticulé peut varier de 0,5 à 40% en poids, préférentiellement de 1 à 40% en poids, plus préférentiellement de

2 à 30% en poids, de manière plus préférée de 2 à 20% par rapport au poids total de polysaccharide (par exemple d’acide hyaluronique) présent dans l’hydrogel.

La concentration en polysaccharide totale dans l’hydrogel varie avantageusement de 1 mg/g à 50 mg/g d’hydrogel, plus avantageusement de 5 mg/g à 35 mg/g d’hydrogel, encore plus avantageusement de 10 mg/g à 30 mg/g d’hydrogel. Préférablement ce polysaccharide est de l’acide hyaluronique, encore plus préférentiellement du hyaluronate de sodium.

L’hydrogel selon la présente invention est de préférence un hydrogel stérile, notamment stérilisé à la chaleur, typiquement à une température au plateau de 121 °C à 135°C, de préférence pendant une durée au plateau allant de 1 minute à 20 minutes avec F0 > 15. La valeur stérilisatrice F0 correspond au temps nécessaire, en minutes, à 121 °C, pour inactiver 90% de la population de microorganismes présente dans le produit à stériliser. Alternativement, la stérilisation peut être réalisée par radiation aux rayons gamma, UV ou au moyen d’oxyde d’éthylène

L’hydrogel présente un pH physiologique, i.e., allant de 6,8 à 7,8. Le pH de Thydrogel selon la présente invention est de préférence supérieur ou égal à 6.9 et inférieur ou égal à 7,4 ; 7,3 ; 7,2 ; 7,1 ou 7.

L’hydrogel selon la présente invention est de préférence un hydrogel injectable, c’est-à-dire qui peut s’écouler et être injecté manuellement au moyen d’une seringue munie d'une aiguille de diamètre allant de 0,1 à 0,5 mm, par exemple d’une aiguille hypodermique de 32G, 30 G, 27 G, 26 G, 25 G. Composants additionnels

Dans certains modes de réalisation, l’hydrogel de la présente invention comprend en outre un composant additionnel choisi dans le groupe constitué par les agents anesthésiants, les antioxydants, les acides aminés, les peptides, les protéines tels que l’élastine, les vitamines, les minéraux, les acides nucléiques, les nucléotides, les nucléosides, les co-enzymes, les dérivés adrénergiques, le dihydrogénophosphate de sodium mono-hydraté et/ou di-hydraté, le chlorure de sodium et un de leurs mélanges.

Les polysaccharides non réticulés, en particulier l’acide hyaluronique non réticulé, l’héparosan non réticulé ou leur mélange, peuvent être cités à titre d’exemple d’agent lubrifiant.

Des exemples d’anesthésiants incluent de manière non limitative l’Ambucaïne, l’Amoxécaïne, l’Amyléine, l’Aprindine, l’Aptocaïne, l’Articaïne, la Benzocaine, la Bétoxycaïne, la Bupivacaïne, la Butacaïne, le Butamben, la Butanilicaïne, le Chlorobutanol, la Chloroprocaïne, la Cinchocaïne, la Clodacaïne, la Cocaïne, la Cryofluorane, la Cyclométhycaïne, la Dexivacaïne, la Diamocaïne, le Dipérodon, la Dyclonine, l’Etidocaïne, l’Euprocine, la Fébuvérine, la Fomocaïne, le Guafécaïnol, l’Heptacaïne, l’Hexylcaïne, I’ Hydroxy procaine, l’Hydroxytétracaïne, l’Isobutamben, la Leucinocaïne, la Lévobupivacaïne, le Lévoxadrol, le Lidamidine, la Lidocaine, la Lotucaïne, le Menglytate, la Mépivacaïne, la Méprylcaïne, la Myrtécaïne, l’Octacaïne, l’Octodrine, l’Oxétacaïne, l’Oxybuprocaïne, la Paréthoxycaïne, la Paridocaïne, la Phénacaïne, la Pipérocaïne, la Piridocaïne, le Polidocanol, la Pramocaïne, la Prilocaïne, la Procaine, la Propanocaïne, la Propipocaine, la Propoxycaïne, la Proxymétacaïne, la Pyrrocaïne, la Quatacaïne, la Quinisocaïne, la Risocaïne, la Rodocaïne, la Ropivacaïne, la Tétracaïne, la Tolycaïne, la Trimécaïne, et un de leurs sels, en particulier un sel de chlorhydrate, ou un mélange de ceux-ci. De préférence, l’hydrogel selon l’invention comprend un agent anesthésiant tel que défini ci-dessus et en particulier la lidocaine, la mépivacaïne ou l’un de leurs sels tel que le chlorhydrate. Dans certains modes de réalisation, l’hydrogel selon l’invention comprend un agent anesthésiant, en particulier la mépivacaïne, la lidocaine ou un de leurs sels ; plus particulièrement un sel de chlorydrate ; préférablement dans des quantités allant de 0,1 à 30 mg/ml, par exemple de 0,5 à 10 mg/ml ou plus préférentiellement de 2 à 5 mg/ml.

Des exemples d’antioxydants incluent de manière non limitative le glutathion, le glutathion réduit, l’acide ellagique, la spermine, le resvératrol, le rétinol, la L-carnitine, les polyols, les polyphénols, les flavonols, les théaflavines, les catéchines, la caféine, l’ubiquinol, l’ubiquinone, l’acide alpha-lipoïque et leurs dérivés, et un mélange de ceux-ci.

Des exemples d’acides aminés incluent de manière non limitative l’arginine (e.g., L-arginine), l’isoleucine (e.g., L-isoleucine), la leucine (e.g., L-leucine), la lysine (e.g., L-lysine ou L-lysine monohydratée), la glycine, la valine (e.g., L-valine), la thréonine (e.g., L-thréonine), la proline (e.g., L-proline), la méthionine, l’histidine, la phénylalanine, le tryptophane, la cystéine, leurs dérivés (e.g., dérivés N-acétylés comme la N-acétyl-L-cystéine) et un mélange de ceux-ci. Des exemples de vitamines et de leurs sels incluent de manière non limitative les vitamines E, A, C, B, spécialement les vitamines B6, B8, B4, B5, B9, B7, B12, et mieux la pyridoxine et ses dérivées et/ou sels, de préférence le chlorhydrate de pyridoxine.

Des exemples de minéraux incluent de manière non limitative les sels de zinc (e.g., acétate de zinc, notamment déshydraté, citrate de zinc), les sels de magnésium, les sels de calcium (e.g., l’hydroxyapatite, notamment sous forme de bille), les sels de potassium, les sels de manganèse, les sels de sodium, les sels de cuivre (e.g., sulfate de cuivre, notamment pentahydraté), éventuellement sous une forme hydratée, et les mélanges de ceux-ci.

Des exemples d’acides nucléiques incluent de manière non limitative l’adénosine, la cytidine, la guanosine, la thymidine, la cytodine, leurs dérivés et un mélange de ceux-ci. En tant que co-enzymes, la coenzyme Q10, la CoA, le NAD, le NADP, et les mélanges de ceux-ci peuvent être cités.

En tant que dérivés d’adrénaline, l’adrénaline, la noradrénaline et un mélange de ceux-ci, peuvent être cités.

Procédé de préparation de l’hydrogel

L’hydrogel selon l’invention est typiquement préparé par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir au moins un polysaccharide ou un sel de celui-ci ; b) fournir au moins un agent réticulant ou un sel de celui-ci ; c) préparer un milieu réactionnel de réticulation comprenant le ou les polysaccharide(s), le ou les agent(s) réticulant et un solvant, la quantité totale d’agent réticulant allant de 0,001 à 0,01 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de préférence la durée de l’étape de préparation du milieu réactionnel n’excédant pas 5 heures ; et d) réaction de réticulation : placer le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape c) dans des conditions permettant la réticulation du polysaccharide par réaction du polysaccharide avec le ou les agent(s) de réticulation, à savoir à une pression P inférieure ou égale à la pression atmosphérique et à une température T supérieure à la température du point eutectique du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P et inférieure à la température du point de congélation du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P, de préférence pendant une durée allant de 1 semaine à 17 semaines ou de 2 semaines à 17 semaines.

Dans une variante du procédé de préparation de l’hydrogel décrit ci-dessus, l’agent réticulant est remplacé par un agent de fonctionnalisation. Dans une telle variante, la réaction de réticulation d) est réalisée par réaction sol-gel du polysaccharide fonctionnalisé, le polysaccharide fonctionnalisé étant obtenu par réaction du polysaccharide avec le ou les agent(s) de fonctionnalisation ; la réaction de réticulation d) est réalisée à une pression P inférieure ou égale à la pression atmosphérique et à une température T supérieure à la température du point eutectique du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P et inférieure à la température du point de congélation du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P, de préférence pendant une durée allant de 1 semaine à 17 semaines ou de 2 à 17 semaines. Dans une telle variante du procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention, l’étape b) comprend la fourniture d’au moins un agent de fonctionnalisation et l’étape c) comprend la préparation d’un milieu réactionnel comprenant le ou les polysaccharide(s), le ou les agent(s) de fonctionnalisation et un solvant, la quantité totale d’agent de fonctionnalisation allant typiquement de 0,001 à 0,01 , préférentiellement de 0,001 à 0,005 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide.

Dans une telle variante du procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention, la quantité totale d’agent de fonctionnalisation dans le milieu réactionnel de l’étape c) varie typiquement de 0,001 à 0,01 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide.

Les hydrogels à base de polysaccharide réticulé préparés par les procédés décrits ci-dessus sont hautement biocompatibles. En effet, de tels hydrogels sont préparés avec des quantités faibles d’agent réticulant. Ils présentent néanmoins des propriétés mécaniques adaptées à la création de volume.

Fourniture d’au moins un polysaccharide ou un sel de celui-ci (étape a))

L’étape a) du procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention comprend la fourniture d’au moins un polysaccharide ou un sel de celui-ci, en particulier un sel physiologiquement acceptable de celui-ci.

Le polysaccharide est tel que décrit ci-dessus. De préférence, le polysaccharide est l’acide hyaluronique ou un sel d’acide hyaluronique, de préférence un sel de sodium.

Le polysaccharide peut être fourni sous forme hydratée, totalement ou partiellement, ou sous forme sèche, telle que sous forme de poudre ou de fibres. Plus particulièrement, dans l’étape a), le polysaccharide est fourni sous forme sèche telle que sous forme de poudre ou de fibres. Lorsque le polysaccharide est fourni sous forme hydratée, il se trouve sous forme d’un gel non réticulé ou d’une solution. En particulier, lorsque le polysaccharide est sous forme hydratée, il s’agit d’un gel non réticulé aqueux ou d’une solution aqueuse. Plus particulièrement, le polysaccharide est mélangé à de l’eau, éventuellement additionnée d’un tampon phosphate ou d’un tampon phosphate supplémenté, c’est-à-dire comprenant possiblement des composants additionnels tels que définis ci-dessus. Il doit donc être compris que le gel non réticulé aqueux ou la solution aqueuse de polysaccharide ne comprend pas d’hydroxyde de sodium.

Fourniture d’au moins un aqent réticulant ou un sel de celui-ci et/ou aqent de fonctionnalisation

L’étape b) du procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention comprend la fourniture d’au moins un agent réticulant ou un sel de celui-ci et/ou d’au moins un agent de fonctionnalisation, l’agent de fonctionnalisation permettant une réticulation du polysaccharide par réaction sol-gel. L’agent réticulant et l’agent de fonctionnalisation sont tels que décrits ci-dessus.

Préparation du milieu réactionnel de réticulation (étape c))

L’étape c) du procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention comprend la préparation d’un milieu réactionnel de réticulation. Le milieu réactionnel comprend le ou les polysaccharide(s), le ou les agent(s) réticulant et/ou agent(s) de fonctionnalisation et un solvant.

Le solvant est typiquement de l’eau ou un mélange comprenant de l’eau et un solvant organique (typiquement un mélange comprenant au moins 90% en poids d’eau, ou au moins 95% ou au moins 98% en poids d’eau par rapport au poids total du solvant). Par exemple, un solvant organique tel qu’un alcool, en particulier l’éthanol, ou le DMSO, peut être utilisé pour solubiliser l’agent réticulant, par exemple lorsqu’il s’agit du poly(diméthylsiloxane) terminé à chaque extrémité par un diglycidyl éther (numéro CAS : 130167-23-6), avant son addition au milieu réactionnel aqueux.

Le milieu réactionnel peut en outre comprendre des sels, des ajusteurs de pH, par exemple une base de Bronsted, plus préférentiellement un sel d’hydroxyde, tel que l’hydroxyde de sodium ou de potassium, des composants additionnels tels que décrits ci-dessus et leurs mélanges. L’addition d’une base de Bronsted peut être tout particulièrement nécessaire lorsque les groupements fonctionnels de l’agent réticulant présentent un groupement époxyde ou un groupement vinyle. Dans ces cas, la réticulation a lieu à un pH supérieur ou égal à 10, plus avantageusement supérieur ou égal à 12, ce qui requiert l’addition d’une base de Bronsted au milieu réactionnel (par exemple de l’hydroxyde de sodium), typiquement à une concentration comprise entre 0,10M et 0,30M.

La quantité totale d’agent réticulant dans le milieu réactionnel varie de 0,001 à 0,01 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide, de manière encore plus préférée de 0,001 à 0,008 ou de 0,001 à 0,005 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide. Lorsque le polysaccharide est un glycosaminoglycane tel qu’un acide hyaluronique, l’unité de répétition est une unité disaccharidique.

La quantité totale d’agent de fonctionnalisation dans le milieu réactionnel varie typiquement de 0,001 à 0,01 mole ou de 0,001 à 0,005 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide. Par exemple, la quantité totale de formule Chem. Il ou un sel de celle-ci dans le milieu réactionnel varie typiquement de 0,001 à 0,01 , préférentiellement de 0,001 à 0,005 mole pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide. Typiquement, plus la masse moléculaire moyenne en poids Mw du polysaccharide sera élevée, plus le taux de fonctionnalisation sera faible en vue d’obtenir un hydrogel ayant des propriétés mécaniques équivalentes, en particulier des propriétés viscoélastiques analogues (notamment module élastique G’, contrainte au croisement des G’ et G” et/ou angle de phase 5). En d’autres termes, plus la masse moléculaire moyenne en poids Mw du polysaccharide sera élevée, plus la quantité molaire en agent de fonctionnalisation, par exemple en molécule de formule Chem. Il, dans le milieu réactionnel sera faible. La fonctionnalisation du polysaccharide est typiquement réalisée dans un milieu réactionnel aqueux.

La concentration massique en polysaccharide ou en sel de polysaccharide dans le milieu réactionnel varie avantageusement de 50 à 300 mg/g de solvant, de préférence de 100 à 200 mg/g.

L’étape c) du procédé comprend typiquement une étape d’homogénéisation du milieu réactionnel. L’homogénéisation est généralement réalisée par agitation tridimensionnelle, l'agitation avec un mélangeur, agitation avec pales ou agitation à la spatule.

Le milieu réactionnel est typiquement préparé à partir du polysaccharide ou des polysaccharides sous une forme sèche. Lorsque le milieu réactionnel est préparé à partir du polysaccharide ou des polysaccharides sous une forme hydratée, le gel non réticulé aqueux ou la solution aqueuse de polysaccharide utilisé(e) pour la préparation du milieu réactionnel ne comprend pas d’hydroxyde de sodium.

L’étape c) est typiquement réalisée à une température allant de 4 à 35°C, de préférence 15°C à 25°C. De préférence la durée de l’étape c) n’excède pas 5 heures. Elle varie généralement de 15 minutes à 4 heures, de préférence de 30 min à 2 heures. Ainsi, le temps maximal de contact du polysaccharide avec de l’hydroxyde de sodium avant engagement de l’étape d), que le polysaccharide soit fourni sous forme sèche ou hydratée, est généralement de 5 heures, ou de 15 minutes à 4 heures ou de 30 min à 2 heures.

Le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape c) est avantageusement directement placée dans les conditions de l’étape d) selon l’invention.

Réticulation à la température T et pression P (étape d)

L’étape d) de réticulation des procédés décrits ci-dessus consiste en la réticulation du ou des polysaccharide(s). Elle consiste à faire réagir le milieu réactionnel pour obtenir un hydrogel à base de polysaccharide réticulé.

La réticulation peut être réalisée par réaction du ou des polysaccharide(s) avec l’agent de réticulation (ou par réaction sol-gel du polysaccharide fonctionnalisé par réaction du polysaccharide avec l’agent de fonctionnalisation).

La réticulation est réalisée en plaçant le milieu réactionnel obtenu à l’issue de l’étape c) dans des conditions permettant la réticulation du polysaccharide, à savoir à une pression P inférieure ou égale à la pression atmosphérique et à une température T supérieure à la température du point eutectique du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P et inférieure à la température du point de congélation du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P, de préférence pendant une durée allant de 1 semaine à 17 semaines ou de 2 semaines à 17 semaines.

La pression P est avantageusement égale à la pression atmosphérique ou inférieure à la pression atmosphérique.

La température du point de congélation du milieu réactionnel désigne la température à laquelle le mélange des composants du milieu réactionnel, à l’échelle macroscopique, se solidifie, c’est-à-dire qu’il devient non fluide. En dessous du point de congélation, le mélange est dans un état de congélation qui se caractérise par la coexistence de composants sous forme solide et liquide. L’état de congélation est maintenu jusqu’à la température du point eutectique du milieu réactionnel.

La température du point eutectique du milieu réactionnel désigne la température en dessous de laquelle le mélange des composants du milieu réactionnel passe d’un état congelé (coexistence de phases liquides et solides) à un état complètement solide, c’est-à-dire un état dans lequel tous les composants du mélange sont sous forme solide. Le point de congélation et le point eutectique d’un mélange dépendent de la pression à laquelle le mélange est soumis donc le point de congélation et le point eutectique sont mesurés à la pression P. Le point de congélation et le point eutectique peuvent être déterminés par calorimétrie différentielle à balayage. Cette méthode permet de déterminer les transitions de phase. Pour cela, le produit à étudier est progressivement refroidi jusqu’à observer ses transitions de phases.

La température T est de préférence supérieure ou égale à -55°C et inférieure ou égale à -5°C, de préférence elle va de -35°C à -10°C. De manière encore plus préférée, la température T est d’environ -20°C.

La pression P est, de préférence, la pression atmosphérique. La « pression atmosphérique » est la pression qu’exerce l’air constituant l’atmosphère sur une surface quelconque en contact avec elle. Elle varie en fonction de l’altitude. A une altitude de 0m, la pression moyenne atmosphérique est de 101 325 Pa. De préférence, la pression P est la pression atmosphérique et la température T est supérieure ou égale à -55°C et inférieure ou égale à -5°C, de préférence T varie de -35°C à -10°C ou est d’environ -20°C.

La réticulation du polysaccharide selon l’étape d) peut être réalisée sous vide, notamment à une pression P inférieure à la pression atmosphérique, de préférence à une pression P comprise entre 0,7.10 ⁵ et 0,9.10 ⁵ Pa (entre 0,7 et 0,9 bar), de préférence comprise entre 0,7.10 ⁵ et 0,8.10 ⁵ Pa (entre 0,7 et 0,8 bar).

L’étape d) de réticulation est typiquement conduite pendant une durée d’au moins 1 heure, de préférence d’au moins 3 heures, de préférence d’au moins 72 heures, de préférence d’au plus 27 semaines.

De préférence, l’étape d) de réticulation est conduite pendant une durée allant de 1 semaine à 25 semaines ou de 1 à 20 semaines ou de 1 à 17 semaines ou encore de 2 à 25 semaines, de préférence allant de 2 à 20 semaines ou de 2 à 17 semaines, de manière encore plus préférée de 3 à 8 semaines ou de 4 à 7 semaines et à la température T, à la pression P.

La réticulation du polysaccharide a principalement lieu lors de l’étape d) (elle peut néanmoins débuter dès l’étape c)). Cette étape permet donc de réticuler les chaines polysaccharidiques entre elles. Les groupes fonctionnels de l’agent réticulant réagissent avec des groupements fonctionnels présents sur les polysaccharides de sorte à lier les chaines polysaccharidiques entre elles et à les réticuler en formant des liaisons intermoléculaires. L’agent réticulant peut également réagir avec des groupements fonctionnels présents sur une même molécule de polysaccharide de sorte à former des liaisons intramoléculaires. Notamment, les groupements fonctionnels de l’agent réticulant réagissent avec les groupes -OH ou -COOH, ou encore -CHO, présents sur les polysaccharides tels que l’acide hyaluronique. Des polysaccharides réticulés comprenant au moins un lien de réticulation entre deux chaines polysaccharidiques, ledit lien de réticulation étant le résidu de l’agent réticulant sont ainsi obtenus. La réticulation peut être réalisée en présence de plusieurs agents réticulant. Lorsque la réticulation est réalisée en présence de plusieurs agents réticulant, les agents réticulant peuvent être ajoutés de manière simultanée ou séparée dans le temps au milieu réactionnel. L’étape d) peut ainsi comprendre des étapes de réticulation répétées. La réticulation est alors réalisée en présence d’une quantité totale d’agents réticulant allant de 0,1 à 1 mole ou de 0,1 à 0,8 mole ou de 0,1 à 0,5 moles d’agents réticulant (ou leurs sels) pour 100 moles d’unité de répétition du polysaccharide. Les conditions de réticulation, en particulier les teneurs en agent réticulant, durée et températures ainsi que les masses moléculaires moyennes en poids (Mw) du polysaccharide, utilisées sont interdépendantes.

Plus la teneur en agent réticulant est faible, plus la durée de réaction doit être longue pour obtenir des propriétés mécaniques analogues du gel résultant. Autrement dit, plus le pourcentage molaire en agent réticulant est faible, moins il y a de fonctions réactives dans le milieu réactionnel et plus la probabilité que 2 groupes se rencontrent et réagissent ensemble est faible, ainsi plus la durée de réaction doit être longue pour permettre aux fonctions de réagir entre elles et former des liens de réticulation, et ainsi obtenir un hydrogel avec des propriétés souhaitables.

Dans une variante du procédé de préparation de l’hydrogel, la présente étape d) peut être réalisée à température ambiante (20-25°C) pendant une durée pouvant être plus courte que celle décrite ci-dessus, par exemple pendant une durée allant de 1 heure à 7 jours.

Réticulation sol-gel

Fonctionnalisation du polysaccharide

Lorsque la réticulation est réalisée par réaction sol-gel, la réaction de réticulation d) est réalisée par réaction sol-gel du polysaccharide fonctionnalisé, le polysaccharide fonctionnalisé étant obtenu par réaction du polysaccharide avec le ou les agent(s) de fonctionnalisation. La fonctionnalisation du polysaccharide et la réaction sol-gel peuvent être séquentielles ou au moins pour partie concomitante.

Le polysaccharide est typiquement fonctionnalisé avec au moins une molécule de formule Chem. Il telle que présentée ci-dessus de manière à devenir porteur de groupements Si-OR qui vont pouvoir réagir ensemble et conduire à un polysaccharide réticulé. La molécule de formule Chem. Il comprenant une seule fonction réactive vis-à-vis du polysaccharide et permettant une réticulation uniquement via une réaction sol-gel, elle ne présente pas la toxicité des agents réticulants conventionnels : la molécule de formule Chem. Il ne peut pas réticuler directement des molécules biologiques (protéines, ADN, etc.). Plus spécifiquement, le groupe fonctionnel T de la molécule de formule Chem. Il réagit avec un groupement fonctionnel présent sur les polysaccharides de sorte à fonctionnaliser les chaines polysaccharidiques. Notamment, le groupe fonctionnel T de la molécule Chem. Il réagit ainsi avec un groupe -OH ou -COOH, ou encore une fonction CHO, présent sur les polysaccharides tels que l’acide hyaluronique. On obtient ainsi des polysaccharides fonctionnalisés comprenant des liens pendants sur une chaine polysaccharidique, lesdits liens pendants comprenant un groupe -A-Si(R5)(R6)OR10, le groupe - A-Si(R5)(R6)OR10 provenant de la molécule de formule Chem. Il pouvant apporter des propriétés biologiques à l’hydrogel.

Le solvant est typiquement de l’eau ou un mélange comprenant de l’eau et un solvant organique (par exemple un alcool, en particulier l’éthanol, ou le DMSO ; typiquement un mélange comprenant au moins 90% en poids d’eau, ou au moins 95% ou au moins 99% en poids d’eau par rapport au poids total du solvant).

Le milieu réactionnel comprend typiquement de 0,001 à 0,01 , préférentiellement de 0,001 à 0,005 mole de molécule de formule Chem. Il ou un sel de celle-ci pour 1 mole d’unité de répétition du polysaccharide.

La concentration massique en polysaccharide du milieu réactionnel est comprise avantageusement entre 50 et 300 mg/g de solvant, de préférence entre 100 et 200 mg/g.

Dans certains modes de réalisation, notamment lorsque T est un époxyde, la fonctionnalisation est réalisée à un pH supérieur ou égal à 9, ou supérieur ou égal à 10, plus avantageusement supérieur ou égal à 12, et notamment à un pH inférieur à 14, par exemple inférieur ou à égal à 13,5. Pour cela, le milieu réactionnel comprend de préférence une base de Bronsted, plus préférentiellement un hydroxyde, encore plus préférentiellement l’hydroxyde de sodium ou de potassium. Avantageusement, le milieu réactionnel comprend de l’hydroxyde de sodium ou de potassium à une concentration comprise entre 0,10M et 0,30M.

Dans certains modes de réalisation, notamment lorsque T est un groupement amino, la fonctionnalisation est réalisée à un pH inférieur à 7, plus avantageusement supérieur ou égal à 4,5 et inférieur à 7 ou inférieur ou égal à 6,5. Pour cela, le milieu réactionnel comprend de préférence un acide de Bronsted, plus préférentiellement de l’acide chlorhydrique, de l’acide sulfurique, ou de l’acide acétique.

Dans certains modes de réalisation, la fonctionnalisation du polysaccharide est réalisée à pression atmosphérique et à une température comprise entre 4°C et 60°C, plus préférentiellement entre 10°C et 50°C. Dans ces modes de réalisation, la durée de la réaction de fonctionnalisation peut varier de 1 heure à 2 semaines, plus particulièrement de 3 heures à 1 semaine, encore plus particulièrement de 3 heures à 96 heures, par exemple de 3 heures à 80 heures, notamment de 3 heures à 75 heures.

Dans certains modes de réalisation, en particulier lorsque la fonctionnalisation et la réticulation du polysaccharide sont concomitantes ou en partie concomitante, la fonctionnalisation du polysaccharide peut être, au moins en partie, réalisée à une température T supérieure à la température du point eutectique du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P et inférieure à la température du point de congélation du milieu réactionnel telle que mesurée à la pression P. Ici, la pression P est avantageusement la pression atmosphérique.

Plus la température de fonctionnalisation est élevée, plus la durée de fonctionnalisation pourra être faible pour obtenir le même degré de modification par fonctionnalisation.

Réaction sol-gel

La « réaction sol-gel » consiste à former des liaisons Si-O-Si à partir de groupements Si-OR avec R représentant un atome d’hydrogène, un groupement aryle ou un groupe hydrocarboné aliphatique comportant de 1 à 6 atomes de carbone. Cette réaction se déroule comme suit :

(i) si R n’est pas un atome d’hydrogène, une étape d’hydrolyse d’au moins une partie des groupements Si-OR pour donner des groupements Si-OH ; puis

(ii) une étape de condensation des groupements Si-OH deux à deux ou d’un groupement Si-OH avec un groupement Si-OR pour former des liaisons Si-O-Si.

Le polysaccharide fonctionnalisé est réticulé par réaction sol-gel pour donner un hydrogel.

Cette étape permet de réticuler les chaines polysaccharidiques entre elles lorsqu’elles sont fonctionnalisées avec des molécules de formule Chem. II. En effet, lors de cette étape, au moins une partie des groupes Si-OR10 et optionnellement au moins une partie des groupes SiOR4 vont réagir deux à deux, éventuellement après hydrolyse de ces groupes, pour former des liaisons Si-O-Si. Cela implique que deux molécules de formule Chem. Il greffées sur des chaines polysaccharidiques vont réagir ensemble via leurs groupes terminaux Si-OR10 (voire SiOR4 le cas échéant) et se lier de manière covalente via la formation de liaison Si-O-Si permettant ainsi de lier les chaines polysaccharidiques ensemble et de les réticuler.

On obtient ainsi des polysaccharides réticulés comprenant des liens de réticulation entre deux chaines polysaccharidiques, lesdits liens de réticulation comprenant un groupement divalent -Si-O-Si-,

La pression P est avantageusement inférieure ou égale à la pression atmosphérique.

La réticulation du polysaccharide selon l’étape d) peut être réalisée sous vide, notamment à une pression P inférieure à la pression atmosphérique, de préférence à une pression P comprise entre 0,7.10 ⁵ et 0,9.10 ⁵ Pa (entre 0,7 et 0,9 bar), de préférence comprise entre 0,7.10 ⁵ et 0,8.10 ⁵ Pa (entre 0,7 et 0,8 bar).

La pression P est avantageusement la pression atmosphérique.

Dans certains modes de réalisation, le polysaccharide peut être réticulé par un agent réticulant et par réaction sol-gel (au moyen d’un agent de fonctionnalisation). Les réactions peuvent être successives ou concomitantes.

Etapes additionnelles

Le procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention peut comprendre une ou plusieurs étapes additionnelles, telles que par exemple des étapes d’addition d’un ou plusieurs composants additionnels, de purification, de stérilisation, de tamisage, de gonflement et/ou de conditionnement.

Le procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention peut comprendre une étape d’ajout d’au moins un composant additionnel. Le composant additionnel peut être choisi parmi les agents lubrifiants ; les principes actifs cosmétiques tels que les antioxydants, les co-enzymes, les acides aminés, les vitamines, les minéraux, et les acides nucléiques ; les principes actifs thérapeutiques tels que les anesthésiants, les antibiotiques, les antifongiques et l’adrénaline et ses dérivés, et les mélanges de ceux-ci. Les composants additionnels peuvent être tels que décrits ci-dessus.

Le procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention peut comprendre au moins une étape de purification. La purification peut être réalisée par dialyse.

Le procédé de préparation de l’hydrogel selon l’invention peut comprendre une étape de stérilisation de l’hydrogel. La stérilisation est de préférence réalisée par la chaleur. La stérilisation est généralement effectuée en augmentant la température du milieu de stérilisation jusqu’à une température dite « température au plateau », qui est maintenue pendant une durée déterminée dite « durée au plateau ». La stérilisation est de préférence réalisée à une température au plateau allant de 121 °C à 135°C, de préférence d’une durée au plateau allant de 1 minute à 20 minutes avec F0 > 15. La valeur stérilisatrice F0 correspond au temps nécessaire, en minutes, à 121 °C, pour inactiver 90% de la population de microorganismes présente dans le produit à stériliser. Alternativement, la stérilisation peut être notamment réalisée par radiation aux rayons gamma, UV ou au moyen oxyde d’éthylène. Le procédé peut comprendre une étape de tamisage de l’hydrogel, plus particulièrement avec un tamis d’une porosité comprise entre 50 et 2000 pm. Cette étape de tamisage permet d’obtenir un hydrogel plus homogène avec une force d’extrusion la plus constante possible, i.e., la plus régulière possible. L’homme du métier sait sélectionner un tamis avec une taille de pores adaptée en fonction des propriétés mécaniques de l’hydrogel en cours de préparation.

Le procédé peut comprendre une étape de gonflement de l’hydrogel. Lors de l’étape de gonflement de l’hydrogel, la concentration en polysaccharide de l’hydrogel est adaptée. En particulier, un solvant est ajouté, par exemple, de l’eau, un tampon phosphate, de l’eau pour préparation injectable. Plus particulièrement, le solvant ajouté a un pH autour du pH physiologique (6, 8-7, 8). La concentration en polysaccharide obtenue suite à l’étape de gonflement varie avantageusement de 1 mg/g à 50 mg/g d’hydrogel, plus avantageusement de 5 mg/g à 35 mg/g d’hydrogel, encore plus avantageusement de 10 mg/g à 30 mg/g d’hydrogel.

Le procédé peut comprendre une étape de conditionnement de l’hydrogel, par exemple dans un dispositif d’injection.

Le cas échéant, l’étape d’addition d’un ou plusieurs composants additionnels a lieu préférentiellement après l’étape de purification.

Le cas échéant, l’étape d’addition d’un ou plusieurs composants additionnels a lieu préférentiellement avant l’étape de stérilisation.

En particulier, l’étape d’addition d’un ou plusieurs composants additionnels peut comprendre également l’ajout d’au moins un principe actif thérapeutique, ou au moins un principe actif cosmétique, ou leur mélange. Lorsqu’au moins un principe actif thérapeutique et/ou au moins un principe actif cosmétique est ajouté, l’étape d’addition d’un ou plusieurs composants additionnels a lieu de préférence après l’étape d).

Le cas échéant, l’étape de purification a lieu préférentiellement après l’étape d’addition d’un ou plusieurs composants additionnels.

Le cas échéant, l’étape de purification a lieu préférentiellement avant l’étape de stérilisation.

Le cas échéant, l’étape de purification a lieu préférentiellement avant l’étape de tamisage. L’étape de stérilisation est de préférence réalisée après les étapes a) à d) et les éventuelles étapes additionnelles. En particulier, l’hydrogel est stérilisé après avoir été conditionné dans son dispositif d’injection et le conditionnement de l’hydrogel a lieu suite à toutes les étapes du procédé et avant la stérilisation.

Applications

L’hydrogel selon l’invention peut être injecté en utilisant l’un quelconque des modes connus de l'homme du métier. Notamment, un hydrogel selon l'invention peut être administré au moyen d'un dispositif d'injection adapté à une injection intra-épidermique et/ou intradermique et/ou sous-cutanée et/ou supra-périostée. Le dispositif d'injection peut notamment être choisi parmi une seringue, un ensemble de micro-seringues, un fil, un dispositif laser ou hydraulique, un pistolet d'injection, un dispositif d'injection sans aiguille, ou un rouleau à micro-aiguilles.

La présente invention porte également sur un dispositif d’injection comprenant un hydrogel selon l’invention.

L’hydrogel selon l’invention est de préférence injecté en sous-cutané.

L’hydrogel selon l’invention peut avoir des applications thérapeutiques et/ou cosmétiques.

Dans certains modes de réalisation, la présente invention concerne également un hydrogel pour son utilisation non-thérapeutique dans le comblement et/ou le remplacement de tissus, en particulier de tissus mous, notamment par injection de l’hydrogel dans le tissu.

Dans le domaine cosmétique, l’hydrogel selon l’invention peut tout particulièrement être utile pour compenser des pertes de volume des tissus dues au vieillissement.

L’hydrogel selon la présente invention peut être utilisé dans la prévention et/ou le traitement cosmétique d’une altération de l’aspect de surface de la peau. Par exemple, l’hydrogel selon l’invention peut être utilisé dans le domaine cosmétique pour prévenir et/ou traiter l’altération des propriétés viscoélastiques ou biomécaniques de la peau ; pour combler des défauts volumiques de la peau, notamment pour combler des rides, des ridules et des cicatrices ; pour atténuer les sillons naso-géniens et plis d’amertumes ; pour augmenter le volume des pommettes, du menton ou des lèvres ; pour rétablir les volumes du visage, notamment des joues, des tempes, de l’ovale du visage, et du pourtour de l’œil ; pour réduire l’apparition des rides et ridules.

La présente invention porte également sur l’utilisation cosmétique d’un hydrogel tel que décrit précédemment pour le comblement des tissus, en particulier des tissus mous, en particulier pour compenser des pertes de volume des tissus dues au vieillissement. EXEMPLES

1. Matériels

- Hyaluronate de sodium non réticulé de 1.5MDa,

- BDDE,

- NaOH 0,25M,

- Divinylsulfone (DVS),

- HCl 1 M,

- Tampon Phosphate,

- Chlorhydrate de Lidocaine,

- Agitateur tridimensionnel,

- Rhéomètre DHR-2 - TA Instrument ®,

- Dynamomètre et banc d’essai,

- Homogénéisateur Broyeur à palettes,

- Poche stérile en polyéthylène.

2. Méthodes

Sauf stipulation contraire, les étapes décrites ci-dessous sont réalisées à température ambiante (21 °C).

1

Préparation d‘un hydrogel selon l’invention (hydrogel A)

Le DVS et le hyaluronate de sodium (1 .5 MDa, 120 mg/g) sont dissous dans une solution agueuse de soude à 0,25M dans une poche stérile. Le mélange a ensuite été homogénéisé dans un broyeur à palettes jusgu’à dissolution complète du hyaluronate de sodium (i.e., jusgu’à l’absence d’agglomérat et l’obtention d’une couleur uniforme). Le mélange obtenu est maintenu à pression atmosphérigue et aux températures et durées présentées au Tableau 1. Le pH du mélange obtenu était d’environ 13.

Une solution d’HCI 1 N a ensuite été ajoutée dans la poche stérile jusgu’à obtenir un pH de 7,3 ± 0,5. Le mélange obtenu est dilué avec du tampon phosphate PBS jusgu’à une concentration de 23 mg d’acide hyaluronigue par gramme de produit pour le Gel B. Le mélange obtenu est homogénéisé durant 24 h au moyen d’un agitateur tridimensionnel. Le mélange est dialysé. Une solution de hyaluronate de sodium sous forme non réticulé de haut poids moléculaire a été ajouté en tant que lubrifiant.

Une solution aqueuse de chlorhydrate de lidocaine est ajoutée pour obtenir 0,3% en poids de chlorhydrate de lidocaine par rapport au poids du produit résultant.

Le produit ainsi obtenu a été tamisé de l’ordre du micron puis conditionné en seringue.

Enfin, le produit a été stérilisé à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121 °C et 135°C avec FO > 15).

Les conditions de réticulations des hydrogels selon l’invention sont présentées dans le tableau 1 suivant.

Tableau 1 : conditions de réticulation

On applique le modèle de Maxwell généralisé, qui donne l’évolution de l’épaisseur de l’hydrogel en fonction du temps t par la formule : où d~ est l’épaisseur limite obtenue à l’équilibre, A, une constante, Ti un paramètre de relaxation, le nombre de membres i de l’équation égal à 2 .

Les résultats sont obtenus avec la présence de deux termes exponentiels :

Les valeurs d’indice de projection sont par la suite calculées comme suit : 100 do étant l’épaisseur initiale soit 700 pm et d~ étant obtenu grâce à l’application du modèle de Maxwell généralisé.

Le MOD de l’hydrogel est mesuré par ¹ H RMN Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 : résultats

L’hydrogel selon l’invention, hydrogel A, présente un indice de projection Pi _dx compris dans la gamme allant de 50% à moins de 80% traduisant une bonne capacité à la création de volume, au comblement des tissus. L’hydrogel selon l’invention présente un faible MOD (<1 %) traduisant une forte biocompatibilité.

Exemple 2

Un hydrogel selon l’invention (Hydrogel B) est comparé à des hydrogels volumateurs commerciaux Juvederm Voluma® - 20 mg/g (Allergan®), Teosyal RHA® 4 - 23 mg/g (Teoxane®), Belotero® Volume - 26 mg/g (Merz Pharma®), Restylane® Lyft - 20 mg/g (Galderma®). Les cinq hydrogels comparés sont stériles.

Préparation d’un hydrogel selon l’invention (hydrogel B)

Le BDDE et le hyaluronate de sodium (1 ,5 MDa, 120mg/g) ont été dissous dans une solution aqueuse de soude à 0,25M dans une poche stérile. Le mélange a ensuite été homogénéisé dans un broyeur à palettes jusqu’à dissolution complète du hyaluronate de sodium (i.e., jusqu’à l’obtention d’un produit transparent et parfaitement homogène (i.e., absence d’agglomérat)). Le mélange obtenu est maintenu à pression atmosphérique et aux températures et durées présentées au Tableau 3. Le pH du mélange obtenu était d’environ 13.

Une solution d’HCI 1 N a ensuite été ajoutée dans la poche stérile jusqu’à obtenir un pH de 7,3 ± 0,5. Le mélange obtenu est dilué avec du tampon phosphate PBS jusqu’à une concentration de 18mg d’acide hyaluronique par gramme de produit pour l’hydrogel B. Le mélange obtenu est homogénéisé durant 24 h au moyen d’un agitateur tridimensionnel. Le mélange est dialysé.

Une solution de hyaluronate de sodium sous forme non réticulé de haut poids moléculaire a été ajouté en tant que lubrifiant.

Une solution aqueuse de chlorhydrate de lidocaine est ajoutée pour obtenir 0,3% en poids de chlorhydrate de lidocaine par rapport au poids du produit résultant. Le produit ainsi obtenu a été tamisé de l’ordre du micron puis conditionné en seringue.

Enfin, le produit a été stérilisé à l’autoclave (température au plateau comprise entre 121°C et 135°C avec F0 > 15).

Les conditions de réticulations des hydrogels selon l’invention sont présentées dans le tableau 3 suivant. : conditions de réticulation

La force de 2 Newton appliquée dans la méthode de détermination de l’indice de projection est incluse dans l’intervalle LVER des 5 hydrogels à évaluer. Les valeurs d’indice de projection de ces 5 hydrogels sont mesurées à 25°C à l’aide d’un rhéomètre DHR2 équipé d’une géométrie de plaques plates parallèles (diamètre 40mm, aluminium anodisé, TA instruments®) associé au logiciel TRIOS (TA Instruments®). 1 gramme d'hydrogel est appliqué entre les plaques et l’écart entre ces plaques correspond à une épaisseur initiale de 700 pm. Une force de compression de 2 Newton est alors appliquée pendant 1 heure et l’évolution de la variation de l’épaisseur de l’hydrogel est acquise. Le paramètre d~ est calculé à l’aide du logiciel OriginPro® 2019 version 9.6.0.172.

On applique le modèle de Maxwell généralisé, qui donne l’évolution de l’épaisseur de l’hydrogel en fonction du temps t par la formule : où d~ est l’épaisseur limite obtenue à l’équilibre, A, une constante, Ti un paramètre de relaxation, le nombre de membres i de l’équation égal à 2 .

Les résultats sont obtenus avec la présence de deux termes exponentiels :

Les valeurs d’indice de projection sont par la suite calculées comme suit : 100 do étant l’épaisseur initiale soit 700 pm et d~ étant obtenu grâce à l’application du modèle de Maxwell généralisé.

Les MOD de chacun des hydrogels sont mesurés par ¹ H RMN. L’hydrogel est précipité dans l’isopropanol et séchés pendant 6 heures sous vide. Les résidus d’acide hyaluronique résultants sont dissous à 10 mg/mL dans du D2O. De la hyaluronidase de 50 pL (Type Vl-S de testicules bovins, 3 kU/mL dans D2O) a été ajoutée pour dégrader les gels pendant 18 heures à 37°C. L'analyse est effectuée sur un spectromètre Bruker Avance de 400 MHz. Le MOD est déterminé selon l’équation suivante :

MOD (%) = (I ^8H16 - ^L7 /4)/(I ^6H2 ' ^O ’ ²¹ /3)'1OO

La limite de quantification minimale du MOD est de 1 %.

Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous.

Tableau 4 : résultats

L’hydrogel selon l’invention, hydrogel B, présente un indice de projection Pi _dx compris dans la gamme allant de 50% à moins de 80% traduisant une bonne capacité à la création de volume, au comblement des tissus. A la différence des hydrogels commerciaux, l’hydrogel selon l’invention présente un très faible MOD (<1 %) traduisant une forte biocompatibilité.