NATURAL

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al desarrollo de hidrogeles que comprenden al menos un polímero de origen natural dotado de carga eléctrica negativa y al menos una molécula constituyente natural del organismo humano capaz de actuar como reticulante catiónico del polímero anterior sin establecer enlaces químicos con el mismo.

El carácter natural y las especiales propiedades de los componentes habilita nuevos usos a los geles constituidos de los mismos, bien sea por sí mismos o bien asociando ingredientes activos.

Además la presente invención se refiere al desarrollo de un procedimiento para la preparación de este tipo de hidrogeles y a los usos de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los sistemas poliméricos de tipo hidrogel presentan un enorme potencial claramente reconocido en numerosos campos habiendo despertado un gran interés sobre todo en el ámbito biomédico y cosmético. Sin embargo, pese a los grandes avances experimentados en el diseño de hidrogeles y la enorme versatilidad de algunos de ellos, en la actualidad el potencial de los hidrogeles disponibles se encuentra limitado en algunos campos. Entre estos campos hay que señalar por su enorme interés y repercusiones tan importantes en la salud y economía, el de la ingeniería de tejidos. Concretamente, y a pesar de los significativos avances que ha experimentado este campo, existen desafíos que deben de resolverse si se pretende conseguir una aplicación clínica amplia. Dichos desafíos incluyen la necesidad de disponer de hidrogeles con propiedades mecánicas, químicas y biológicas adecuadas (Khademhosseini et al., PNAS 103, 2006, 2480-2487). Dos son las estrategias a seguir para abordar este desafío, que pueden ser desarrolladas por separado o de modo combinado. Por un lado, la síntesis de nuevos materiales que permitan el desarrollo de geles con características más ventajosas (Langer, Molecular Therapy, 1 , 2000, 12-15). En este sentido, en los últimos años se ha llevado a cabo el desarrollo de numerosos polímeros con tal finalidad. Por otro lado, el desarrollo de estrategias de elaboración de hidrogeles que permitan aprovechar el potencial de biomateriales de reconocido interés, pero que con las técnicas actuales de elaboración de hidrogeles no pueden ser incorporados en un hidrogel de modo eficaz. Esta segunda estrategia se caracteriza por haber sido escasamente explorada.

Un ejemplo ilustrativo de la situación y limitaciones anteriormente descritas es el correspondiente a los hidrogeles basados en ácido hialurónico. Éste es un biomaterial constituyente natural de nuestro propio organismo, conocido por su biodegradabilidad y bioresistencia y su papel en funciones celulares como la adhesión, proliferación y migración, con el consiguiente potencial en ingeniería de tejidos. No obstante, las técnicas de elaboración de hidrogeles actualmente disponibles hacen necesaria su modificación química para poder ser integrado eficazmente en un hidrogel. Es evidente que esta necesidad hace que el producto finalmente empleado no sea ya el constituyente de nuestro propio organismo, sino un producto semisintético sobre el cual habrá que aplicar los criterios de las correspondientes agencias regulatorias antes de pensar en su utilización. Esto ocurre por ejemplo con el hialurónico-metacrilato propuesto recientemente por Gerecht et al. (Gerecht et al., PNAS 104, 2007, 1 1298- 1 1303), quienes también han desarrollado dextrano-metacrilato y polietilenglicol- diacrilato con similar objetivo (Yeh et al., Biomaterials 27, 2006, 5391 -5398).

Tal y como señalan los autores citados anteriormente, una de las técnicas de elaboración de hidrogeles consiste en la reticulación iónica. Esta técnica posee interesantes ventajas, destacando por su suavidad y por ser una técnica rápida, económica, fácilmente reproducible y escalable y que requiere de una tecnología muy simple, aspectos todos ellos de indudable interés para la industria. Con dicha técnica es posible elaborar hidrogeles a base de alginato, material que se retícula iónicamente con iones calcio dando lugar a estructuras insolubles en medio acuoso. No obstante, no ha sido desarrollada para la elaboración de hidrogeles basados en otros materiales de origen natural, con los que únicamente es posible obtener complejos con calcio suspendidos en medios acuosos, pero no sistemas hidrogel, De este modo, para la obtención de auténticos hidrogeles es necesario recurrir a reticulación covalente mediada por agentes químicos como glutaraldehído o carbodiimida cuando lo que se pretende es obtener hidrogeles constituidos por otros biopolímeros hidrosolubles (Ikada, J.R. Soc. Interface 3, 2006, 589-601 ) (Tabata, J.R. Soc. Interface 6, 2009, S31 1 -S324). Esta característica ha conducido a una situación de cierto olvido de la reticulación iónica incluso en revisiones que describen las técnicas de elaboración de hidrogeles para ingeniería de tejidos (Khademhosseini and Langer, Biomaterials 28, 2007, 5087-5092) (Tabata, J.R. Soc. Interface 6, 2009, S31 1-S324). No obstante, es necesario recordar que la reticulación química covalente presenta serios inconvenientes. Concretamente, es una técnica que se basa en la formación de enlaces covalentes estabilizantes debido al empleo de agentes del grupo de los aldehidos, que se caracterizan por su toxicidad y por no ser aceptados para su empleo en humanos. Además, este tipo de agentes pueden dar lugar también a la reticulación e inactivación del propio ingrediente activo que se pretende asociar al sistema, sobre todo si se trata de moléculas con grupos amino, como en el caso de péptidos y proteínas, tales como factores de crecimiento celular. Todos estos problemas de los aldehidos y agentes reticulantes químicos se encuentran descritos en la literatura. En base a lo anteriormente expuesto, los inventores han desarrollado un nuevo tipo de geles que únicamente pueden ser desarrollados utilizando constituyentes de nuestro propio organismo a modo de reticulantes catiónicos. A diferencia de geles como los de alginato, que sí pueden ser reticulados empleando iones inorgánicos, la utilización de tales compuestos permite desarrollar hidrogeles con una gran variedad de componentes que presentan las siguientes características y aportan a los geles formados las ventajas que se mencionan a continuación:

- El hialurónico o condroitina no sólo son altamente biocompatibles, sino que también presentan actividad por sí mismos sin necesidad de asociar ningún ingrediente activo. De hecho, además de su reconocido potencial en cosmética y estética, se ha descrito la utilización de hialurónico para el tratamiento de osteoartritis y en la preparación de lágrimas artificiales, encontrándose comercializadas varias de estas formulaciones. Por otro lado, el acido hialurónico y la condroitina presentan la capacidad de estimular la proliferación celular a través de interacciones con receptores celulares como el CD44 y de proteger al ADN frente a reacciones de oxidación (Zhao et al., International Journal of Oncology, 32, 2008, 1 159-1 167), interacción que puede ser utilizada para dirigir sistemas elaborados a base de dichos componentes hacia células que sobre- expresan dicho receptor, como es el caso de muchas células tumorales (Tool, Nature reviews, 4, 2004, 528-539).

- Además de actuar como potenciales reticulantes catiónicos, Las aminas de origen natural empleadas como reticulantes son componentes naturales de las células y fluidos corporales y desempeñan un papel fundamental en los procesos de proliferación y diferenciación celular y de síntesis de macromoléculas biológicas. Además, recientemente ha sido descrito su capacidad de inhibir el stress oxidativo en seres vivos y promover su longevidad (Eisenberg et al., Nature Cell Biology, 1 1 (1 1 ), 2009, 1305-1314). Aunque las células son capaces de sintetizar las aminas que necesitan para los procesos de crecimiento celular, han sido descritos mecanismos de internalización celular que les permiten obtener estas aminas del torrente sanguíneo. Estos mecanismos están influenciados por proteoglucanos como el sulfato de condroitina y el ácido hialurónico (Belting M. Et al. Biochem J 1999, 338, 317-323). Por lo tanto, parece lógico suponer un efecto biológico sinérgico entre los propios constituyentes de los geles objeto de la presente invención y los agentes reticulantes empleados en su elaboración, sin necesidad de que se encuentre presente otro tipo de ingrediente activo.

Lo anteriormente expuesto supone una clara ventaja en ingeniería de tejidos, medicina regenerativa e incluso cosmética. Por otro lado, la presencia de espermina o espermidina permite la incorporación en la composición de los geles de material genético, debido a la conocida capacidad que presentan de interacción con dicho material (Rider et al., Amino Acids, 33, 2007, 231-240). La posibilidad de incorporación de material genético resulta especialmente atractiva, teniendo en cuenta que se trata de ingredientes activos de enorme versatilidad. Ello ha conducido a que, en los últimos años se haya sugerido el interés de desarrollar plataformas capaces de liberar plásmidos ADN conteniendo genes que codifican factores de crecimiento (Griffith and Naughton, Science 295, 2002, 1009-1014), habida cuenta de la frágil naturaleza de las proteínas en general y de dichos factores en particular. - Los hidrogeles de la presente invención permiten incorporar entre los componentes de los hidrogeles, moléculas proteicas. Este hecho resulta de particular interés. Por un lado, la incorporación de proteínas como la albúmina facilita la asociación de ingredientes activos, especialmente las ingredientes lipofílicas, debido a la conocida capacidad de unión de muchos fármacos a esta proteína plasmática (Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw Hill; Maham A et al. Protein-based nanomedicine platforms for drug delivery. Small. 5, 2009, 1706-21 ) Esto representa una clara ventaja a las ya aportadas por hidrogeles convencionales, habida cuenta que éstos se caracterizan por el elevado contenido en agua y por la consiguiente dificultad de asociar a los mismos ingredientes lipofílicos (Peppas et al., Eur J Pharm Biopharm. 50, 2000, 27-46). Por otro lado, las proteínas incorporadas pueden tener especial interés en medicina regenerativa o ingeniería de tejidos. Así, por ejemplo, existen proteínas con actividad enzimática, como la catalasa y la superóxido dismutasa, que son las encargadas de eliminar de las células las denominadas "especies de oxígeno reactivas" o "ROS", generadas en las células como resultado de la utilización del oxígeno con fines metabólicos, y que pueden causar daños a proteínas y a lípidos intracelulares, los cuales pueden conducir incluso a la muerte celular. Estas enzimas son muy eficientes eliminando de las células elevadas cantidades de las mencionadas ROS, lo cual es especialmente importante en situaciones en las que los niveles de producción de estas sustancias se ven aumentados, como ocurre cuando las células de un tejido se ven sometidas a algún tipo de estrés o contaminación por microorganismos (Li, Z et al. Published-Ahead-of- Print on October 15, 2009 by Journal of Andrology; Shukla MR. Journal of Basic Microbiology 2009, 49, 1-5; Siwale, RC et al. Journal of Drug Targeting, 2009; 17(9): 710-718).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos hidrogeles caracterizados por su simplicidad, versatilidad y por la posibilidad que presentan de incorporar en exclusiva biomateriales que son constituyentes naturales del propio organismo humano. De este modo, la presente invención se dirige a la elaboración de sistemas de tipo hidrogel con aplicaciones tanto biomédicas como cosméticas, de higiene, nutricionales y de recubrimiento de superficies.

El término hidrogel hace referencia a una estructura macromolecular tridimensional hinchada con un medio acuoso que resulta insoluble en dicho medio, debido a su disposición como entramado reticulado Encyclopedia of Controlled Drug Delivery (Edith Mathiowitz, Ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999). Esta definición engloba a estructuras que presentan numerosas aplicaciones biomédicas y farmacéuticas, entre otras. No obstante, es necesario precisar que esta definición no incluye a nanoagregados o microagregados poliméricos que podrían ser encuadrados dentro de conceptos más recientes como los de micro o nanohidrogeles.

A diferencia de lo que ocurre con polímeros como el alginato, que es posible gelificar recurriendo a iones inorgánicos, con los polímeros naturales empleados en la presente invención únicamente es posible llevar a cabo su reticulación bajo la forma de un hidrogel y no un simple complejo en suspensión en un medio líquido, mediante la utilización de compuestos aminados, como la espermina y espermidina. La utilización de tales compuestos, además de resultar indispensable para la formación de los mencionados hidrogeles, aporta a los mismos las ventajas que se mencionan a continuación:

- Permiten la obtención de geles constituidos por biomateriales constitutivos de nuestro propio organismo, como el hialurónico o condroitina, que hasta la fecha sólo podían incorporarse en geles previa modificación de los mismos para dar lugar a productos semisintéticos o mediante el empleo de ingredientes conocidos por su toxicidad. Los inventores han comprobado que los reticulantes iónicos clásicos como el calcio no permiten tal desarrollo, como se recoge en los correspondientes ejemplos. La ventaja del citado desarrollo se encuentra relacionada no sólo con la biocompatibilidad de los materiales mencionados, sino también con las propias características que presentan los mismos de por sí y sin necesidad de asociar ningún ingrediente activo, que los hace útiles en el tratamiento de osteoartritis y en la preparación de lágrimas artificiales, encontrándose comercializadas varias de estas formulaciones.

- Supone la presencia en los hidrogeles de las citadas aminas de origen natural, para las cuales se han descrito la capacidad de inhibir el stress oxidativo en seres vivos y promover su longevidad. Esto supone una clara ventaja en ingeniería de tejidos, medicina regenerativa e incluso cosmética.

- Permite la incorporación en la composición de los geles de proteínas como la albúmina, que a su vez facilita la asociación de ingredientes activos lipofílicos. Esto representa una clara ventaja a las ya aportadas por hidrogeles convencionales, habida cuenta que éstos se caracterizan por la dificultad de asociar a los mismos ingredientes lipofílicos.

- Permite la incorporación en la composición de los geles de proteínas como la catalasa y la superóxido dismutasa, lo cual puede tener especial interés en medicina regenerativa o ingeniería de tejidos, debido a sus especiales propiedades.

- Permite la incorporación en la composición de los geles de material genético, habida cuenta de la conocida capacidad que presentan de interacción con dicho material.

Por lo tanto un primer aspecto esencial de la invención se refiere a hidrogeles que comprenden los siguientes elementos: (a) al menos un polímero aniónico de origen natural; y

(b) al menos un agente reticulante catiónico de origen natural; donde los componentes se encuentran entrecruzados mediante interacciones de tipo electrostático.

Por el término "polímero aniónico" se entiende cualquier polímero con una carga neta negativa, incluyendo en dicha definición aquellos polímeros aniónicos sobre los que se han efectuado modificaciones tales como fragmentación enzimática o química o derivatización. El polímero aniónico se selecciona del grupo formado por ácido hialurónico, ácido colomínico, polisiálico, condroitina, queratano, dextranos, heparina, carragenanos, furceleranos, alginatos, agar agar, glucomanano, goma gelano, goma garrofín, goma guar, goma tragacanto, goma arábiga, goma xantano, goma karaya, pectinas, celulosas, almidones, ésteres de sorbitano, así como sales o fragmentos de los mismos o derivados de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

El hialuronano es un polímero lineal que comprende la repetición de una estructura de disacárido formada por la adición alterna de ácido D-glucurónico y D-N- acetilglucosamina, unidos alternando enlaces beta-1 ,4 y beta-1 ,3 glucosídicos tal como se muestra en la siguiente fórmula:

en la que el número entero n representa el grado de polimerización, es decir, el número de unidades de disacárido en la cadena de hialuronano.

En el contexto de la presente invención, se puede emplear ácido hialurónico con un amplio intervalo de pesos moleculares. El ácido hialurónico de elevado peso molecular está comercialmente disponible, mientras que el de peso molecular inferior puede obtenerse mediante la fragmentación del ácido hialurónico de elevado peso molecular, utilizando, por ejemplo, una enzima hialuronidasa.

El término "hialurónico, ácido hialurónico, hialuronano" tal como se utiliza presente descripción incluye o bien el ácido hialurónico o bien una base conjugada del mismo (hialuronato). Esta base conjugada puede ser una sal alcalina del ácido hialurónico que incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, sales orgánicas tales como sales de aminoácidos básicos a pH neutro, preferiblemente dichas sales son farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida de la invención, la sal alcalina es la sal de sodio del ácido hialurónico.

La familia de los ácidos polisiálicos, término que incluye al ácido colomínico, se encuentra integrada por polímeros lineales constituidos por residuos de ácido N- acetilneuraminico (Neu5Ac; también conocido como ácido siálico), un constituyente natural de células y tejidos, unidos por enlaces glicosídicos a-(2→8). Cada residuo de ácido N-acetilneuraminico posee un grupo carboxilo, responsable de la carga negativa del ácido colomínico, tal y como se muestra en la siguiente fórmula:

Se trata de un material de indudable interés en el campo farmacéutico y cosmético, por ser biocompatible y biodegradable, no inmunogénico, cuyos productos de degradación no son tóxicos (Gregoriadis G et al. Cell. Mol. Life Sci. 2000, 57, 1964-1969). Por otro lado, los ácidos polisiálicos están caracterizados por tener, entre otras propiedades, una semivida plasmática muy larga, por lo que han sido propuestos como alternativa a los derivados de polietilenglicol para prolongar el tiempo de permanencia en el plasma de fármacos y sistemas de liberación de ingredientes activos, como los liposomas. De hecho, en la patente "WO/2008/033253 - Liposome complexes containing pharmaceutical agents and methods" se recurre a su empleo para modificar en superficie liposomas preformados. Por último, teniendo en cuenta sus características estructurales, este material ofrece la posibilidad de su modificación, por ejemplo de la introducción de grupos amino y consiguiente cationización.

El sulfato de dextrano es un glucano (polisacárido) complejo constituido por unidades de moléculas de glucosa, cada una de las cuales contiene aproximadament uiente fórmula:

El sulfato de dextrano se prepara mediante sulfatación de dextrano y posterior purificación mediante procedimientos de sobra conocidos por un experto en la materia.

La heparina es una sustancia de origen natural de la familia de los glicosaminoglicanos cuya estructura química comprende la repetición de unidades monoméricas disacáridas de ácido 2-O-sulfo-a-L-idurónico y 2-deoxi-2-sulfamido- a-D-glucopiranosil-6-O-sulfato, representada a continuación:

oscv OH

donde n es un número entero y representa el grado de polimerización, es decir, el número de unidades monoméricas en la cadena de heparina.

En el contexto de la presente invención, es posible emplear tanto la heparina fraccionada como la no fraccionada. La heparina tradicional o no fraccionada se distingue claramente de la heparina fraccionada o de bajo peso molecular. La primera de ellas es una sustancia natural presente en todos los vertebrados. Ambos tipos de heparina se pueden utilizar en forma de base libre o en forma de sal, como por ejemplo su sal sódica o calcica.

La heparina fraccionada o de bajo peso molecular se produce por despolimerización química o enzimática de heparinas convencionales. Ejemplos de este tipo de heparinas son enoxaparina, parnaparina, dalteparina y nadroparina, así como sus sales tales como las sales de sodio y calcio.

Los derivados de heparina también pueden ser empleados en la composición de los hidrogeles de la presente invención. Estos derivados son conocidos en el estado de la técnica y se originan como consecuencia de la reactividad de los diferentes grupos funcionales presentes en la molécula. Así, heparinas N- acetiladas, O-descarboxiladas, oxidadas o reducidas son ampliamente conocidas.

El sulfato de condroitina es un glucosaminoglucano (GAG) sulfatado compuesto por una cadena de azúcares alternados. Se encuentra normalmente unido a proteínas como parte de un proteoglucano. Se representa mediante la siguiente estructura:

en la que n es un número entero y representa el grado de polimerización, es decir, el número de unidades de disacáridos en la cadena de sulfato de condroitina y en la que R-i, R ₂ y R ₃ son independientemente hidrógeno o un grupo S0 ₃ H. Cada monosacárido puede dejarse sin sulfatar, sulfatarse una vez, o sulfatarse dos veces. La sulfatación está mediada por sulfotransferasas específicas.

En el contexto de la presente invención, el término "sulfato de condroitina" incluye todos sus diferentes isómeros y derivados, así como combinaciones de los mismos.

En una realización particular, el sulfato de condroitina se selecciona entre las siguientes sustancias y combinaciones de las mismas:

- sulfato de condroitina A que está sulfatado predominantemente en el carbono 4 del azúcar N-acetilgalactosamina (GalNAc) y que también se conoce como sulfato de 4-condroitina (Ri=H, R ₂ =S0 ₃ H y R ₃ =H)

- sulfato de condroitina B que se denomina también sulfato de dermatano. Esta sustancia está compuesta por unidades de repetición lineales que contienen N-acetilgalactosamina y o bien ácido L-idurónico o bien ácido glucurónico, y cada disacárido puede estar sulfatado una vez o sulfatado dos veces. Está presente mayoritariamente en la piel, pero también se encuentra en vasos sanguíneos, válvulas cardíacas, tendones y pulmones.

- sulfato de condroitina C que está sulfatado predominantemente en el carbono 6 del azúcar GalNAc y que se conoce también como sulfato de 6- condroitina R ₂ =H y R ₃ =H);

- sulfato de condroitina D que está sulfatado predominantemente en el carbono 2 del ácido glucurónico y en el carbono 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de 2,6-condroitina R ₂ =H y R ₃ = S0 ₃ H);

- sulfato de condroitina E que está sulfatado predominantemente en los carbonos 4 y 6 del azúcar GalNAc y se conoce también como sulfato de

4,6-condroitina (R ₁ =S0 ₃ H, R ₂ = S0 ₃ H y R ₃ =H);

El término "sulfato de condroitina" también incluye sales orgánicas e inorgánicas del mismo. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, mediante reacción de la forma básica de este compuesto con una cantidad estequiométrica del ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales inorgánicas incluyen, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y las sales orgánicas incluyen, por ejemplo, sales de etilendiamina, etanolamina, A/,A/-dialquileno-etanolamina, trietanolamina, glucamina y aminoácidos básicos. Preferiblemente las sales son farmacéuticamente aceptables.

Las funciones de la condroitina dependen en buena parte de las propiedades del proteoglucano global del que es una parte. Estas funciones pueden dividirse de forma amplia en papeles reguladores y estructurales. Sin embargo, esta división no es absoluta y algunos proteoglucanos pueden desempeñar papeles tanto estructurales como reguladores.

Con respecto a su papel estructural, el sulfato de condroitina es un componente principal de la matriz extracelular, y es importante para mantener la integridad estructural del tejido. Como una parte de un agrecano, el sulfato de condroitina es un componente principal del cartílago. Los grupos sulfato sumamente cargados y de empaquetamiento compacto del sulfato de condroitina generan repulsiones electrostáticas que proporcionan mucha de la resistencia del cartílago a la compresión.

El sulfato de queratano es un glucosaminoglicano sulfatado similar al sulfato de condroitina en el que el grupo sulfato se encuentra en el glucurónico. Concretamente, se encuentra constituido por galactosa y GlcNAc-6-sulfato, unidos mediante un enlace β-1 ,4.

Se encuentra principalmente en córnea, cartílago y hueso. A nivel de las articulaciones ayuda a absorber impactos mecánicos, disminuyendo los efectos de éstos sobre estructuras circundantes. Participa en el desarrollo del sistema nervioso central y en los mecanismos de protección que se activan cuando en éste se produce un daño.

La carragenina o carragenano está formada por unidades de galactosa y/o de anhidrogalactosa, sulfatadas o no, unidas por enlaces alternos a-1 ,3 y β-1 ,4. Dependiendo del grado de sulfatación, de las posiciones de los grupos sulfato y de la presencia de grupos de anhidrogalactosa se distinguen varios tipos de carragenano, con propiedades como hidrocoloides claramente distintas. A mayor proporción de grupos sulfato, la solubilidad es mayor, y a mayor proporción de grupos de anhidrogalactosa la solubilidad es menor. En el contexto de la presente invención, están incluidos todos los tipos de carrageno. Algunos de estos incluyen por ejemplo los carragenanos kappa, iota y lambda

(k, i y I).

El glucomanano es un polisacárido soluble en agua de origen natural. La estructura de química de este compuesto consiste en una cadena polimérica lineal con una pequeña proporción de ramificaciones. En concreto, está formado por unidades de D-manosa y D-glucosa unidas por enlaces β-1 ,4 en una proporción de 1 .6:1 , respectivamente.

En una realización particular de la invención, el glucomanano empleado es un derivado de glucomanano con carga negativa seleccionado entre los derivados fosforilados, carboximetil y dicarboxi-glucomananos. La goma gelano es un polisacárido soluble en agua de origen natural. La estructura de química de este compuesto consiste en una cadena polimérica formada por unidades de a-L-ramnosio, β-D-acido glucuronico y dos unidades de β-D-glucosa.

Se representa mediante la siguiente estructura:

donde n es un número entero y representa el grado de polimerización, es decir, el número de unidades monoméricas en la cadena de goma gelano. El polímero puede encontrarse en forma parcialmente acetilada. Dependiendo de su grado de acetilación, la goma gelano proporciona geles con propriedades mecánicas distintas.

En el contexto de la presente invención, el término "goma gelano" incluye todos sus diferentes derivados, así como combinaciones de los mismos.

El agente reticulante catiónico es una amina de fórmula general (I):

H ₂ N-[(CH ₂ ) _x -NH-(CH ₂ ) _y ] _z -NH ₂ , donde x, y y z toman, independientemente, un valor comprendido entre 1 y 66. Preferentemente, x, y y z, independientemente, presentan un valor comprendido entre 1 y 10.

De forma más preferente, la amina se selecciona entre espermina, espermidina, sales de las mismas o cualquier combinación de las mismas. Estas aminas son componentes naturales de las células y fluidos corporales y desempeñan un papel fundamental en los procesos de proliferación y diferenciación celular y de síntesis de macromoléculas biológicas.

Por otro lado, la conocida capacidad de estas poliaminas de interaccionar con el material genético y protegerlo (Rider et al., Amino Acids, 33, 2007, 231-240) permite una fácil incorporación del mismo a formulaciones en cuya composición figuren dichas aminas.

Los hidrogeles de la presente invención se caracterizan por haberse formado a través de un mecanismo de interacción iónica que provoca la reticulación de los componentes de dichos geles como consecuencia de la adición de un agente reticulante de carga positiva. Además de ser un procedimiento sencillo, no se requiere el uso de disolventes orgánicos o de sustancias auxiliares tóxicas. La presencia del agente reticulante catiónico permite el entrecruzamiento del polímero aniónico mediante un proceso de gelificación iónica.

Según una realización preferida, la relación en peso agente reticulante/polímero aniónico está comprendida entre 0.05/1 y 0.5/1 , preferentemente entre 0.2/1 y 0.4/1. Según una realización preferida, el hidrogel comprende adicionalmente al menos una proteína. De manera preferida la proteína se selecciona del grupo formado por albúmina, gelatina, colágeno, atelocolageno, proteínas enzimáticas, proteínas globulares del tipo alfa-globulina, proteínas globulares del tipo beta-globulina, glicoproteínas y protaminas, derivados de las mismas o cualquier combinación de las mismas. De manera preferida, las proteínas enzimáticas se seleccionan del grupo formado por fibrina, fibrinógeno, trombina y protrombina. De manera aún más preferida, la proteína enzimática es la protrombina.

De manera preferida, las proteínas globulares de tipo alfa se seleccionan del grupo formado por orosomucoide o alfa-1-glicoproteína, LDL y haptoglobina. De manera preferida, las proteínas globulares de tipo beta-globulina se seleccionan del grupo formado por angiostatina y plasmina.

De manera preferida las glicoproteínas son mucinas.

El colágeno es una proteína fibrosa con estructura de triple hélice. Está presente en el tejido conectivo, donde sus fibras forman estructuras que resisten las fuerzas de tracción, gracias a su capacidad de compactación y de estiramiento. Juega además un papel fundamental en el mantenimiento de la morfología de tejidos y órganos, ya que las células interactúan con el colágeno de la matriz extracelular tanto mecánica como químicamente, lo que produce notables efectos sobre la arquitectura tisular. El colágeno en lugar de ser una proteína única, se considera una familia de moléculas estrechamente relacionadas pero genéticamente distintas. Se describen así varios tipos de colágeno:

Colágeno tipo I: Se encuentra abundantemente en la dermis, el hueso, el tendón, la dentina y la córnea. Se presenta en fibrillas estriadas de 20 a 100 nm de diámetro, agrupándose para formar fibras colágenas mayores. Sus subunidades mayores están constituidas por cadenas alfa de dos tipos, que difieren ligeramente en su composición de aminoácidos y en su secuencia. A uno de los cuales se designa como cadena alfal y al otro, cadena alfa2. Es sintetizado por fibroblastos, condroblastos y osteoblastos. Su función principal es la de resistencia al estiramiento.

Colágeno tipo II: Se encuentra sobre todo en el cartílago, pero también se presenta en la córnea embrionaria y en la notocorda, en el núcleo pulposo y en el humor vitreo del ojo. En el cartílago forma fibrillas finas de 10 a 20 nanómetros, pero en otros microambientes puede formar fibrillas más grandes, indistinguibles morfológicamente del colágeno tipo I. Están constituidas por tres cadenas alfa2 de un único tipo. Es sintetizado por el condroblasto. Su función principal es la resistencia a la presión intermitente. Colágeno tipo III: Abunda en el tejido conjuntivo laxo, en las paredes de los vasos sanguíneos, la dermis de la piel y el estroma de varias glándulas. Es un constituyente importante de las fibras de 50 nanómetros que se han llamado tradicionalmente fibras reticulares. Está constituido por una clase única de cadena alfa3. Es sintetizado por las células del músculo liso, fibroblastos, glía. Su función es la de sostén de los órganos expandibles.

Colágeno tipo IV: Es el colágeno que forma la lámina basal que subyace a los epitelios. Es un colágeno que no se polimeriza en fibrillas, sino que forma un fieltro de moléculas orientadas al azar, asociadas a proteoglicanos y con las proteínas estructurales laminina y fibronectina. Es sintetizado por las células epiteliales y endoteliales. Su función principal es la de sostén y filtración.

Colágeno tipo V: Presente en la mayoría del tejido intersticial. Se asocia con el tipo I. Colágeno tipo VI: Presente en la mayoría del tejido intersticial. Sirve de anclaje de las células en su entorno. Se asocia con el tipo I.

Colágeno tipo VII: Se encuentra en la lámina basal. Colágeno tipo VIII: Presente en algunas células endoteliales. Colágeno tipo IX: Se encuentra en el cartílago articular maduro. Interactúa con el tipo II. Colágeno tipo X: Presente en cartílago hipertrófico y mineralizado. Colágeno tipo XI: Se encuentra en el cartílago. Interactúa con los tipos II y IX. Colágeno tipo XII: Presente en tejidos sometidos a altas tensiones, como los tendones y ligamentos. Interactúa con los tipos I y III. Colágeno tipo XIII: Se encuentra como una proteína asociada a la membrana celular. Interactúa con los tipos I y III.

El atelocolageno es colágeno de tipo I altamente purificado y tratado con la enzima pepsinasa. La molécula de colágeno posee una secuencia aminoacídica llamada telopéptido, tanto en su extremo N- terminal, como en su extremo C- terminal. Estos telopéptidos son los principales responsables de la antigenicidad del colágeno. El atelocolágeno tratado con pepsinasa tiene por tanto una menor inmunogenicidad, y es usado clínicamente con una gran variedad de aplicaciones, incluyendo curación-regeneración de heridas, prótesis vascular, substitutivo de cartílago óseo y agente hemostático. La gelatina es un polímero de origen natural que se obtiene a partir del colágeno, por hidrólisis parcial irreversible del mismo. Se conocen dos tipos diferentes de gelatina: gelatina tipo A, obtenida por hidrólisis ácida y gelatina tipo B, obtenida por hidrólisis alcalina. En lo que refiere a su estructura molecular, posee algunos grupos funcionales (carboxilo, imidazol, amino, guanidino) que se ionizan en solución acuosa según su valor de pKa y el valor de pH del medio. De esta forma, la gelatina tipo A tiene una mayor cantidad de grupos básicos ionizables que grupos ácidos y su punto isoeléctrico se encuentra entre 9 y 9.4. Durante el proceso de hidrólisis alcalina la mayoría de grupos amida se convierten en grupos carboxilo, presentando puntos isoeléctricos comprendidos entre 4.8 y 5.1 . El punto isoeléctrico es una propiedad importante de las gelatinas ya que da una idea de cuál va a ser su comportamiento en determinadas condiciones de pH. Es un material biocompatible y biodegradable, relativamente barato, que se puede obtener libre de pirógenos y es considerado un excipiente GRAS (Generally Recognized As Safe) por la FDA. Además, se encuentra comercialmente disponible gelatina obtenida mediante tecnología de ADN recombinante, con la cual se evitan eventuales riesgos relacionados con reacciones de tipo alérgico, además de que en esta gelatina el peso molecular es uniforme y no hay variabilidad interlote. Esto es importante, pues normalmente esta variabilidad limita el empleo de biopolímeros naturales para la elaboración de geles, ya que complica mucho la estandarización y escalado de las técnicas de elaboración de los mismos. La gelatina posee, tal como se señaló anteriormente, interesantes propiedades desde el punto de vista físico-químico ya que presenta un amplio rango de puntos isoeléctricos según el proceso por el cual ha sido obtenida, y una gran cantidad de grupos funcionales que permiten su modificación. Por ejemplo, es posible incrementar su carga positiva mediante aminación o disminuirla mediante tiolación, lo que ofrece la posibilidad de mejorar la interacción con las moléculas terapéuticas que serán asociadas en sistemas que contengan este material y, además, permite modular la capacidad de interacción con las superficies biológicas del organismo.

La albúmina es una proteína con un peso molecular de aproximadamente 66.5 kDa y punto isoeléctrico de aproximadamente 4.9. Es la principal proteína presente en el plasma sanguíneo. Al igual que las demás proteínas del plasma, la albúmina es sintetizada en el hígado, siendo la responsable de la presión osmótica de la sangre. Al degradarse, sus aminoácidos proveen nutrientes a los tejidos periféricos. Transporta un gran número de componentes endógenos y exógenos y participa en procesos metabólicos como la solubilización de ácidos grasos, por lo que es esencial en el metabolismo de lípidos. Numerosos ingredientes activos, incluyendo ingredientes lipofílicos se unen a esta proteína plasmática (Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw Hill; Maham A et al. Protein-based nanomedicine platforms for drug delivery. Small. 5, 2009, 1706-21 ).

La albúmina es una proteína tipo ácida muy soluble, estable en un amplio rango de pH (4 - 9) y a temperaturas en que otras proteínas sufrirían desnaturalización. Posee grupos amino y carboxilo que ofrecen la posibilidad de ser modificados químicamente o de acoplar ligandos como otras proteínas, anticuerpos, carbohidratos y fármacos. Por ser un material fácilmente disponible, biodegradable, carente de toxicidad y de respuestas de tipo inmune, la hacen un candidato ideal como biomaterial para vehiculizar ingredientes activos.

Con la introducción de la ingeniería genética en la producción de proteínas, se ha desarrollado albúmina sérica recombinante, la cual ha demostrado ser segura y comparable en términos de farmacocinética y farmacodinamia con la proteína nativa.

El Fibrinógeno es una proteína soluble del plasma sanguíneo, su longitud es de 46 nm y su peso molecular de 340 kDa. Es una molécula fibrilar, y en sus extremos tiene cargas fuertemente negativas. Estos extremos repelen a otras moléculas del compuesto, previniendo la agregación. Está compuesta por tres pares de cadenas de polipéptidos, concretamente 2 cadenas Aa, 2 Ββ y 2γ (Αα,Ββ,γ)2 unidas por enlaces disulfuro. Estas cadenas están genéticamente ligadas y reguladas en forma coordinada en el ser humano.

Es responsable de la formación de los coágulos de sangre. Cuando se produce una herida se desencadena la transformación del fibrinógeno en fibrina, gracias a la actividad de plaquetas. Asimismo, da lugar a un matriz provisional de extrema importancia en los lugares donde se han producido heridas, jugando además un papel crucial en los procesos de reparación de éstas.

La Fibrina es una proteína fibrilar. Tiene la capacidad de formar redes tridimensionales y desempeña un importante papel en el proceso de coagulación

(forma agregados con otras moléculas de fibrina, formando un coágulo blando). Normalmente se encuentra en la sangre en una forma inactiva, el fibrinógeno, el cual por la acción de una enzima llamada trombina se transforma en fibrina. La Trombina es una enzima glucoproteínica, del grupo de las peptidasas. Está formada por dos cadenas de polipéptidos de 36 y 259 aminoácidos respectivamente, unidas por un puente disulfuro. Se obtiene a partir de un precursor, la protrombina, en una reacción catalizada por la enzima tromboplastina, en presencia de iones calcio (Ca++). Tiene un peso molecular de

33.70 kDa. Esta enzima no es parte de la sangre, sino que se forma como parte del proceso de coagulación sanguínea, y ayuda a la degradación del fibrinógeno a monómeros de fibrina.

La Protrombina es una proteína del plasma sanguíneo, forma parte del proceso de coagulación mediante la reacción de ésta con la enzima "tromboplastina", una enzima ubicada en el interior de los trombocitos, liberada al romperse la frágil membrana celular de los trombocitos. En esta etapa también participa el catión Ca ⁺⁺ (calcio), actuando como factor coenzimático.

La LDL es una lipoproteína que transporta el colesterol por el cuerpo, para que sea utilizado por distintas células.

La haptoglobina es una proteína de fase aguda y una proteína transportadora. Transporta a la hemoglobina (Hb) libre hasta su sitio de degradación en el sistema reticuloendotelial. Es una proteína con polimorfismo genético: esencialmente hay tres fenotipos Hp 1 -1 , Hp 2-1 y Hp 2-2. Es una glicoproteína compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas 2 cadenas α livianas y 2 cadenas β .La haptoglobina puede unir oxihemoglobina, metahemoglobina, cadenas a de hemoglobina, dímeros α/β y hemoglobina H sin hemo. Su función fisiológica es prevenir la pérdida renal de hemoglobina y así, de hierro formando un complejo Hb-Hp de alto peso molecular que no es filtrado a nivel glomerular. La angiostatina es un fragmento de 38 kDa una proteína de mayor tamaño, la plasmina (un fragmento de plasminógeno) conformando tres a cinco módulos con dominios Kringle contiguos. Cada módulo contiene dos pequeñas láminas beta y tres enlaces disulfuro.

La mucina es mucopolisacárido, ingrediente principal del moco. La mucina se encuentra en la mayoría de las glándulas secretoras de moco y es el lubricante que protege las superficies corporales de la fricción o erosión.

Según otra realización preferida, el hidrogel comprende adicionalmente, un sistema para la administración de ingredientes activos, que comprende micropartículas y/o nanopartículas. De manera preferida, las micro partículas tienen un tamaño comprendido entre 1 y 1000 micrómetros. De manera preferida, las nanopartículas tienen un tamaño inferior a 1 micrómetro.

En una realización preferida, las micropartículas y/o nanopartículas comprenden a su vez:

- al menos un polímero iónico, y

- al menos un agente reticulante iónico con la condición de que la carga es opuesta a la del polímero, donde los componentes de las micropartículas y/o nanopartículas se encuentran entrecruzados mediante interacciones de tipo electrostático.

En una realización preferida, el polímero iónico se selecciona del grupo formado por ácido hialurónico, ácido colomínico, polisiálico, condroitina, queratano, dextranos, heparina, carragenanos, furceleranos, alginatos, agar agar, glucomanano, goma gelano, goma garrofín, goma guar, goma tragacanto, goma arábiga, goma xantano, goma karaya, pectinas, celulosas, almidones y ásteres de sorbitano, así como sales, fragmentos de los mismos, derivados de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización preferida, el agente reticulante se selecciona entre una amina de fórmula general (I) como se describió anteriormente y sales de citrato, tripol ¡fosfato o sulfato.

Adicionalmente las micropartículas y/o nanopartículas pueden comprender otros polímeros aniónicos o catiónicos que permiten modular la carga superficial de las mismas.

Según otra realización preferida, el hidrogel comprende adicionalmente al menos un ingrediente activo.

El término "ingrediente activo" se refiere a cualquier ingrediente o célula que se utiliza en el tratamiento, cura, prevención o diagnóstico de una enfermedad o que se utiliza para mejorar el bienestar físico y mental de seres humanos y animales, así como aquel ingrediente o célula que se destina a destruir, impedir la acción, contrarrestar o neutralizar, cualquier organismo o entidad nocivos, o bien cualquier ingrediente o célula que se utiliza como cosmético o de higiene, así como aquel ingrediente o célula que se destina a regenerar tejidos o en ingeniería de tejidos o en terapia celular. Los hidrogeles objeto de la presente invención son adecuados para asociar ingredientes activos independientemente de las características de solubilidad de los mismos. La capacidad de asociación dependerá del ingrediente activo correspondiente, pero en términos generales será elevada tanto para ingredientes hidrófilos, como para los de marcado carácter hidrófobo.

En una realización particular, el ingrediente activo se selecciona entre hormonas, péptidos, proteínas, proenzimas o zimógenos, enzimas, coenzimas, vitaminas, compuestos lipidíeos o lipofílicos, compuestos hidrofilicos, compuestos sacarídicos, compuestos de ácidos nucleicos o nucleótidos como oligonucleótidos, polinucleótidos y células o bien combinaciones de los mismos.

De forma preferida, el ingrediente activo puede:

- tener actividad antifúngica, antiséptica o antinflamatoria,

- ser de aplicación, en ingeniería de tejidos, medicina regenerativa o en terapia celular, como por ejemplo un factor de crecimiento, - ser de interés en cosmética o higiene, como por ejemplo un péptido o proteína, o bien un derivado de ácido nucleico, tal como un plásmido de ADN, oligonucleótido, ARN de interferencia o un polinucleótido. El plásmido de ADN es aquel que incorpora material genético para ser introducido en células y expresar proteínas o bien que actúe como precursor de RNA. En este mismo sentido según una realización preferida, el ingrediente activo se selecciona entre un factor de crecimiento, siRNA y un plásmido.

Factor de crecimiento: los factores de crecimiento son una familia de moléculas, la mayoría de naturaleza proteica. La función principal de los factores de crecimiento es la estimulación de la proliferación celular mediante la regulación del ciclo celular. Además contribuyen al mantenimiento de la supervivencia celular, a la estimulación de la migración celular, de la diferenciación celular e incluso la apoptosis. Los factores de crecimiento desempeñan su función a muy baja concentración en el medio ambiente biológico. Actúan uniéndose a receptores celulares situados en la membrana celular que transmiten la señal del exterior al interior de la célula, mediante el acoplamiento de diferentes proteína quinasas que se fosforilan y que activan una cascada de señales que acaba con la activación de uno o varios genes (transducción de señales). Plásmido: Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal, que se replican y transcriben independientemente del ADN cromosómico. Poseen una conformación estructural en doble hélice y su tamaño varía desde 1 a 250 kb. Están presentes normalmente en bacterias, aunque en algunas ocasiones también se encuentran organismos eucariotas (como las levaduras), y su número puede variar desde una sola copia hasta algunos cientos por célula.

El hecho de que sean capaces de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal, así como su relativamente fácil manipulación y la posibilidad de inserción de nuevas secuencias genéticas, han potenciado su creciente uso en ingeniería genética.

Relacionado con el ARN existe en todas las células un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes específicos, denominado ribotransferencia, interferencia por ARN o RNAi (acrónimo del nombre inglés RNA interfence). Ésta es ejercida concretamente por moléculas de ARN que, siendo complementarias a un ARN mensajero, conducen a la degradación de éste. Debe entonces distinguirse entre interferencia por ARN (RNAi), mecanismo biológico o técnica experimental que lo aprovecha, y ARN interferente, molécula de ARN que ejerce interferencia por ARN, y puede ser de varios tipos: siRNA, miRNA o piRNA. Concretamente, el siRNA (acrónimo en inglés de small interfering RNA, en español ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento), es un tipo de ARN interferente con una longitud de 20 a 25 nucleótidos, y es altamente específico para la secuencia de nucleótidos de su ARN mensajero diana. De este modo, el siRNA interfiere con la expresión de un gen específico, reduciéndola. Además, los siRNAs también actúan en otras rutas relacionadas con el RNAi, como en la defensa antiviral o en la organización de la estructura de la cromatina en un genoma.

En otra realización más preferida, el ingrediente activo se selecciona entre superóxido dismutasa, catalasa y prednisolona.

Superóxido dismutasa (SOD): :Esta enzima cataliza la dismutación de superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Existe en las células de los organismos en diferentes isoformas. En humanos existen tres isoformas:

- SOD1 , ubicada en el citoplasma celular, es un homodímero de peso molecular 32.5 KDa y contiene cobre y zinc en su centro activo. - SOD2, localiza en la mitocondria, es un tetrámero, y contiene manganeso en su centro activo.

- SOD3, se encuentra en el líquido extracelular, es un tetrámero, y contiene cobre y zinc en su centro activo. De manera preferida la SOD es la SOD1.

Catalasa: Enzima que cataliza la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y 0 ₂ . Se localiza en los peroxisomas de casi todos los tipos celulares. Es un tetrámero formado por cuatro cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales tiene una longitud de 500 aminoácidos, y a cada una de las cuales se une un grupo porfirina. Coordinado a cada uno de los grupos porfirina existe un átomo de hierro, que será el responsable de la interacción con el peróxido de hidrógeno.

El pH óptimo de actuación de esta enzima se encuentra alrededor de 7, esto hace que tome especial relevancia el hecho de que las composiciones tipo hidrogel descritas en este documento hayan sido obtenidas a un pH 7.4, el cual, como se ha comprobado, no varía con el tiempo.

Prednisolona: Es un corticosteroide (los corticosteroides son hormonas del grupo de los esteroides, y son producidas por la corteza de las glándulas suprarrenales) utilizado terapéuticamente como anti-inflamatorio e inmunosupresor. Es un compuesto liposoluble de peso molecular 360.44 g/mol. Según una realización preferida la proporción del ingrediente activo incorporado en los geles es igual o inferior al 25% en peso con respecto al peso total de los componentes del hidrogel. Sin embargo, la proporción adecuada dependerá en cada caso del ingrediente activo que va a incorporarse, la indicación para la que se utiliza y la eficiencia de administración. Según otra realización preferida, la proporción de ingrediente activo se encuentra entre 1 y 20% en peso.

En otra realización preferida, los hidrogeles de la presente invención comprenden, adicionalmente, al menos un marcador. En la presente invención se entiende como marcador aquel elemento, compuesto, célula o conjunto de células que permita realizar un estudio de localización del mismo, obtener una imagen, señal o información del lugar o los lugares en los que se distribuye, determinar un parámetro bioquímico, inmunológico o metabólico o bien realizar un diagnóstico. Son ejemplos de marcadores una molécula fluorescente, como por ejemplo fluoresceína o Texas Red; quantum dots; un isótopo radiactivo; un agente de contraste, por ejemplo radiológico, de resonancia o de tomografía; un antígeno de membrana; un agente de tinción, etc..

Según otra realización preferida, el hidrogel comprende adicionalmente al menos un compuesto capaz de facilitar o reforzar el efecto del ingrediente activo, tal como por ejemplo un adyuvante, un inmunomodulador (inmunosupresor o inmunoestimulador) o cualquier combinación de los mismos.

Según otra realización preferida, el hidrogel comprende adicionalmente al menos un compuesto que interacciona con componentes biológicos y/o con afinidad por uno o varios receptores existentes en los seres vivos y/o que actúa como receptor de algún componente biológico, tales como un anticuerpo, un aptámero, un receptor de superficie o cualquier combinación de los mismos. Algunas de las funciones de estos compuestos que interaccionan con componentes biológicos pueden ser la realización de un estudio de localización de dichos componentes biológicos o receptores, obtención de una imagen, señal o información del lugar o los lugares en los que se encuentran, determinación de un parámetro bioquímico, inmunológico o metabólico o bien realizar un diagnóstico.

Según otra realización preferida, el hidrogel comprende adicionalmente al menos un compuesto estabilizante de tipo lipídico, graso u oleoso, sacarídico, un derivado de aminoácido o proteico, un derivado de óxido de etileno, un compuesto de tipo morfolino o cualquier combinación de los mismos.

Según otra realización preferida, el hidrogel comprende adicionalmente al menos un compuesto sensible a polimerización química o polimerización inducida por radiación UV/Vis (fotopolimerización), calor (polimerización térmica), microondas, ultrasonidos y rayos X. Según otra realización preferida, el hidrogel comprende adicionalmente agentes emolientes, conservantes, sustancias de fragancia, agentes antiacné, agentes antifúngicos, antioxidantes, desodorantes, antitranspirantes, agentes contra la caspa, despigmentantes, agentes blanqueadores, agentes antiseborreicos, tintes, lociones bronceadoras, absorbentes de luz UV, o cualquier combinación de los mismos. Según otra realización preferida el hidrogel se encuentra en forma liofilizada o deshidratado.

Según otra realización preferida el hidrogel se usa para la preparación de un medicamento. Según otra realización preferida, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un hidrogel como se describe en la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

Otra realización preferida se refiere a una composición de recubrimiento de superficies que comprende al menos el hidrogel de la invención. Otra realización preferida se refiere a una composición nutricional que comprende al menos el hidrogel de la invención.

Dicha composición nutricional puede ser un alimento, un suplemento dietético o un suplemento nutricional. Las composiciones nutricionales pueden incluir leche, yogures, zumos de fruta y de vegetales, postres, productos infantiles o productos deshidratados. La adición de los hidrogeles a la composición nutricional se realiza mediante mezcla y homogenización según el procedimiento técnico para elaborar cada producto. Adicionalmente, otros componentes tales como las vitaminas pueden añadirse a la composición nutricional. Ejemplos de estos compuestos son vitaminas del grupo A, B, C, D, E o mezclas de las mismas. Otra realización preferida se refiere a un producto sanitario que comprende al menos el hidrogel de la invención.

Otra realización preferida se refiere a una composición cosmética que comprende al menos un hidrogel de la invención.

Un segundo aspecto esencial de la presente invención se refiere al uso del hidrogel en la fabricación de un medicamento.

Según otra realización preferida se refiere al uso del hidrogel para su empleo en ingeniería de tejidos, medicina regenerativa y terapia celular.

Según otra realización preferida se refiere al uso del hidrogel como marcador.

Según otra realización preferida se refiere al uso del hidrogel para su administración por vía oral, bucal, sublingual, tópica, ocular, nasal, pulmonar, ótica, vaginal, intrauterina, rectal, entérica, o parenteral. Cuando la composición se administra por vía oral, los hidrogeles presentan la ventaja adicional de ser estables en medio ácido (HCI 0.1 N) y fluido intestinal simulado, por lo que pueden alcanzar el tejido epitelial intestinal sin sufrir degradación alguna y liberar allí el ingrediente activo asociado. Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel en la preparación de un producto cosmético o de higiene personal para la administración sobre piel, sistema piloso y capilar, uñas, labios, órganos genitales externos, dientes o mucosas.

Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel para la asociación al mismo de diferentes formas de liberación de ingredientes activos, tales como sistemas micro y nanoparticulares.

Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel para terapia génica, silenciamiento o interferencia genética, o vacunación genética.

Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel para producir la asociación, expansión o activación de poblaciones celulares o para manipular o alterar las características biológicas de células vivas tanto autólogas, como alogénicas, xenogénicas o de cultivos celulares y posteriormente emplear dichas células o grupos celulares para obtener un efecto terapéutico, diagnóstico, preventivo o con fines regenerativos, o para modificar la producción de compuestos por dichas células, o para adaptarlas y asociarlas de modo efectivo a micropartículas o microcápsulas, matrices y andamiajes.

Un aspecto adicional de la invención está representado por el caso en que la composición de gel se utiliza como tal porque permite la fabricación de una composición viscoelástica. Tal composición viscoelástica es útil, por ejemplo en la cirugía o terapia ocular, como un sustituto de fluido sinovial y como gotas oculares y, como se ha indicado anteriormente, la presente invención hace posible ajustar a medida las propiedades viscoelásticas para tales usos.

Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel para facilitar, estimular o modificar la producción de compuestos por células, con fin de producción biotecnológica. Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel con la finalidad de higiene o estética, para neutralizar o eliminar ectoparásitos, para perfumar, modificar el aspecto de la superficie corporal y/o corregir olores corporales y/o protegerla o mantenerla en buen estado. Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel para modificar, corregir o introducir propiedades organolépticas o mejorar la estabilidad en un medicamento o en un producto cosmético o de higiene personal.

Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel para la fabricación de una composición viscoelástica útil en la cirugía o terapia ocular, como gotas oculares o como un sustituto de fluido sinovial, o de algún componente de las articulaciones.

Según una realización preferida se refiere al uso del hidrogel para acondicionar, modificar o restablecer las características de agua, alimentos o suplementos nutricionales, así como para modificar, corregir o introducir nuevas propiedades organolépticas o mejorar la estabilidad de los mismos y para facilitar o hacer posible la administración de alimentos o nutrientes a seres vivos.

Un tercer aspecto esencial de la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación del hidrogel que comprende las siguientes etapas: a) preparar una disolución acuosa de al menos un polímero aniónico de origen natural; b) preparar una disolución acuosa de un agente reticulante catiónico; y c) mezclar bajo agitación las disoluciones obtenidas en a) y b) con formación espontánea del gel.

La incorporación del polímero o los polímeros aniónicos se lleva a cabo mediante disolución acuosa del mismo o los mismos a una concentración de entre 100 y 0.1 mg/ml, más preferiblemente entre 50 y 1 mg/ml y aún más preferiblemente entre 10 y 5 mg/ml.

El agente reticulante catiónico se disuelve en agua a una concentración de entre 100 y 0.01 mg/ml, preferiblemente entre 50 y 0.05 mg/ml; más preferiblemente entre 10 y 0.1 mg/ml, aún más preferiblemente entre 4 y 1 mg/ml.

Según una realización preferida, adicionalmente se prepara una disolución acuosa de al menos una proteína y se incorpora a una de las soluciones obtenidas en a) y b) cuyos componentes sean de la misma carga eléctrica que la proteína o se adiciona sobre el gel ya formado. La incorporación de la proteína o proteínas se lleva a cabo mediante disolución acuosa de la misma o las mismas a una concentración de entre 100 y 0.1 mg/ml, más preferiblemente entre 50 y 1 mg/ml y aún más preferiblemente entre 10 y 2 mg/ml.

Según otra realización preferida, al menos una de las disoluciones de los constituyentes del hidrogel se calienta antes de ser mezcladas.

Según otra realización preferida, el procedimiento comprende además la adición de un ingrediente activo, y/o un compuesto capaz de facilitar o reforzar el efecto del ingrediente activo, y/o un compuesto capaz de interaccionar con componentes biológicos y/o un compuesto capaz de actuar como receptor de algún componente biológico y/o un compuesto estabilizante, en la disolución a) si es de naturaleza aniónica o en la disolución b) si es de naturaleza catiónica, o bien se adiciona sobre los geles ya formados.

Según otra realización preferida, todos los compuestos que pueden ser incorporados al sistema de geles de la invención mencionados anteriormente, se pueden adicionar a las soluciones de los polímeros constituyentes de los geles previamente a la formación de los mismos o bien pueden ser adicionados a los hidrogeles una vez formados.

El ingrediente activo y/o los componentes citados anteriormente que adicionalmente puede comprender el hidrogel es disuelto o suspendido en una de las disoluciones a) o b), dependiendo de la carga que posea, es decir, si presenta carga negativa se disuelve o suspende en la disolución a) y, si por el contrario, presenta carga positiva, se disuelve o suspende en la disolución b).

En una variante del procedimiento, dicho ingrediente activo y/o componentes se adiciona a los hidrogeles una vez formados.

En otra variante del procedimiento, dicho ingrediente activo y/o componentes se adiciona a los hidrogeles incluido en un sistema micro o nanoparticular. En este caso, el sistema micro o nanoparticular se incorpora al hidrogel del mismo modo que se ha descrito para la incorporación de ingredientes activos, de modo que si carece de carga se puede incorporar en cualquiera de las disoluciones, pero si posee carga negativa se suspende en la disolución a) y, si por el contrario, presenta carga positiva, se suspende en la disolución b).

En otra variante del procedimiento, dicho ingrediente activo y/o componentes se adiciona previamente a la proteína o proteínas que opcionalmente puede incluirse entre sus componentes o a otro de los componentes de los sistemas. En el caso de ingredientes lipofílicos, éstos pueden ser disueltos o suspendidos en primer lugar en un pequeño volumen de un disolvente orgánico, de un aceite o compuesto lipídico o lipofílico, o de una mezcla de agua y los compuestos anteriormente mencionados, el cual seguidamente se adicionará a una de las disoluciones acuosas mencionadas con anterioridad, de forma que la concentración en peso del disolvente orgánico en la disolución final sea siempre menor al 25%. En un caso de este tipo, el disolvente orgánico tiene que extraerse del sistema, a menos que sea farmacéuticamente aceptable. Por otro lado, los ingredientes lipofílicos también pueden asociarse a proteínas incorporadas al hidrogel, como es el caso de la albúmina. Dicha asociación a proteínas puede llevarse a cabo previamente a la formación del hidrogel o bien una vez formado.

Según otra realización preferida, el procedimiento comprende una etapa adicional después de la etapa c) en el que el gel se somete a un proceso de deshidratación total o parcial (liofilización o desecación, respectivamente) con el fin de preservarlas durante su almacenamiento para que conserven sus características iniciales y se reduzcan los volúmenes de producto que van a manipularse. Por otra parte, el grado de reticulación de los hidrogeles puede aumentar con este proceso, ya que puede tener lugar una aproximación entre las cadenas poliméricas, lo que podría facilitar que aumente el grado de entrecruzamiento polimérico, así como que se potencie el efecto del agente reticulante. El proceso de liofilización o desecación conduce, respectivamente, a un producto deshidratado total o parcialmente.

Según otra realización preferida, el procedimiento comprende una etapa adicional en la que se regenera el gel deshidratado parcialmente o liofilizado. De este modo es posible deshidratar el hidrogel para hacerlo más estable durante el almacenamiento y posteriormente regenerar o recuperar el hidrogel mediante un proceso de hidratación. El hidrogel regenerado conserva las propiedades que caracterizan al hidrogel fresco o recién preparado (previo a someterlo a un tratamiento de deshidratación).

La formación de los hidrogeles objeto de la presente invención es consecuencia de un proceso controlado de entrecruzamiento ionotrópico de los componentes que presentan carga opuesta. Fruto de dicho proceso controlado, denominado reticulación iónica o ionotrópica, se obtienen hidrogeles de propiedades físico-químicas predeterminadas, homogéneas, ajustables y reproducibles, con independencia de que se asocie o no ingrediente activo alguno.

En una variante de la invención la reticulación se realiza en un medio a pH y/o fuerza iónica controlados, que se lleva a cabo mediante disolución de los contituyentes de los geles en medios acuosos tamponados. De forma preferente el pH de dichas disoluciones esta comprendido entre 5 y 8.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

A continuación, para una mayor comprensión de las características y ventajas de la presente invención, se hará referencia a una serie de ejemplos que de forma explicativa completen la descripción anterior, sin suponer en modo alguno que ésta se vea limitada a los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.

Figura 1. Representa el uso de espermidina en la preparación de hidrogeles a base de polímeros aniónicos de origen natural, preparación que no resulta posible empleando iones inorgánicos como el calcio: Imagen fotográfica en la que se observa cómo empleando espermidina se forma un hidrogel que conserva su consistencia y no cae al voltear el tubo de ensayo en el que se ha formado, quedando en la parte superior (imagen de la izquierda). Por el contrario, en la imagen de la derecha se observa una disolución no gelificada con iones calcio y que, consiguientemente, al voltear el tubo de ensayo cae como tal solución a la parte baja del tubo.

Figura 2. Representa la variación de la viscosidad (η) de los geles (F14, F15 y F16) frente al esfuerzo de corte (y).

Figura 3. Representa la modulación de las propiedades viscoelásticas de los hidrogeles mediante una adecuada selección de sus componentes: Variación de los módulos elástico (G') y viscoso (G") de los geles (F14, F15 y F16) frente a la frecuencia (f).

Figura 4: Representa hidrogeles desarrollados capaces de liberar un ingrediente activo previamente asociado a los mismos, incluso teniendo éste carácter lipofílico: Liberación de prednisolona a partir de hidrogeles elaborados empleando goma gelano y sulfato de condroitina. (n=3).

Figura 5: Representa hidrogeles desarrollados capaces de asociar eficazmente y de manera homogénea material genético: Imágenes fotográficas en las que se evidencia la incorporación de siRNA marcado con el marcador de fluorescencia cy3 con el característico color rosáceo que muestra a luz natural (A) o bien con la fluorescencia emitida por dicho siRNA marcado cuando se recurre a la técnica de microscopía de fluorescencia (microscopio ECLIPSE-NIKON 80j, Japan) (B).

Figura 6. Representa las curvas de flujo de las formulaciones F34, F33 y F32, que presentan diferentes concentraciones de albúmina en su composición (5, 12.5 y 20 mg/ml, respectivamente).

Figura 7. Representa las curvas de oscilación de las formulaciones F34, F33 y F32, que presentan diferentes concentraciones de albúmina en su composición (5, 12.5 y 20 mg/ml, respectivamente).

Figura 8. Imagen de la formulación F32 tras el análisis reológico a 37° C.

Figura 9. Representa las curvas de flujo de las formulaciones F35, F36, F37 y F32, que presentan diferentes concentraciones de espermidina en su composición (0.5, 0.65, 1 y 2 mg/ml, respectivamente).

Figura 10. Representa las curvas de oscilación de las formulaciones F35, F36, F37 y F32, que presentan diferentes concentraciones de espermidina en su composición (0.5, 0.65, 1 y 2 mg/ml, respectivamente).

Figura 11. Representa las curvas de flujo de las formulaciones con diferentes glicosaminoglicanos en su composición: F38, sulfato de dextrano; F39, ácido hialurónico; F32, sulfato de condroitino.

Figura 12. Representa las curvas de oscilación de las formulaciones con diferentes glicosaminoglicanos en su composición: F38, sulfato de dextrano; F39, ácido hialurónico; F32, sulfato de condroitino.

Figura 13. Representa las curvas de liberación a pH = 7.4 de los ingredientes activos modelo teofilina, vitamina B ₁₂ y mioglobina de la formulación F32.

Figura 14. Representa las curvas de liberación a pH = 5.4 de los ingredientes activos modelo teofilina, vitamina B ₁₂ y mioglobina de la formulación F32.

Figura 15. Representa las curvas de liberación a pH = 5.5 de la vitamina B ₁₂ de la formulación F32, a dos T ^as 25° C y 37° C.

Figura 16. Imagen del hidrogel F32 cargado con vitamina B12 después de haber sido analizado en el reómetro.

Figura 17. Perfil de liberación del ketoconazol de la formulación F32.

Figura 18. Comparación de los espectros STD-MNR del complejo albúmina- ketoconazol y de la albúmina libre con el espectro ¹ H-RMN del ketoconazol libre.

Figura 19. Comparación de los espectros STD-MNR del complejo albúmina- prednisolona y de la albúmina libre con el espectro ¹ H-RMN de la prednisolona libre. Figura 20. Imagen obtenida mediante microscopía confocal (20 aumentos) de la formulación F32 conteniendo células marcadas con el fluorocromo DAPI (izda.) y de la formulación F32 natural (dcha). Figura 21. Imágenes obtenidas mediante SEM (300 aumentos) de la formulación F32 (izquierda) y de la formulación F35 (derecha).

Figura 22. Imágenes obtenidas mediante SEM (300 aumentos) de la formulación F32 (arriba izquierda), de la formulación F35 (arriba derecha) y de la formulación F40 (abajo centro).

Figura 23. Representa las curvas de liberación (pH = 7.4) del ingrediente activo modelo vitamina B ₁₂ , a partir del gel F32 fresco o deshidratado mediante liofilización o desecación en estufa (n=3).

Figura 24. A) Curva de oscilación de la formulación F32 conteniendo dos cantidades diferentes de precursor de la hidroxiapatita fosfato octocálcico (5 y 20 mg). B) Imagen del hidrogel F32 incorporando en su estructura 20 mg de precursor de la hidroxiapatita fosfato octocálcico.

Figura 25. Perfil de liberación en agua del factor de crecimiento VEGF ₁₂ 6 a partir de la formulación F32 (n=3).

Figura 26. Perfil de liberación en PBS (pH = 7.4) del factor de crecimiento VEGF ₁₂ 6 asociado en nanopartículas incluidas en la formulación de hidrogel F32 (n=3).

Figura 27. Curvas de flujo de las formulaciones de hidrogeles que incluyen diferentes proteínas en su composición: F16 con albúmina (G1 ), F17 con gelatina (G2) y F17 ^' con gelatina succinilada (G3).

Figura 28. Curvas de oscilación de las formulaciones de hidrogeles que incluyen diferentes proteínas en su composición: F16 con albúmina (G1 ), F17 con gelatina (G2) y F17 ^' con gelatina succinilada (G3).

Figura 29. Imágenes fotográficas de un hidrogel que incluye ácido colomínico tras su preparación (A) y cortado con una espátula (B).

Figura 30. Curvas de liberación (pH = 7.4) de los ingredientes activos modelo vitamina B ₁₂ y teofilina simultáneamente a partir de la misma formulación hidrogel (F32) (n=3). Figura 31. Biodistribución del agente de contraste Gadolinio incluido en el hidrogel en secciones cervicales de ratón, haciendo uso de la técnica fSEMS-MRI (Fast Spin-Echo Multi-Slice). Imágenes tomadas de dos secciones o slices de diferente profundidad (12 y 8) tras 40, 50 y 70 minutos de aplicación del Gadolinio asociado al hidrogel.

Figura 32. Imágenes fotográficas en las que se aprecia el aspecto de la piel de la zona cervical rasurada de un ratón (arriba) e imagen de la misma zona rasurada sobre la que se ha administrado la formulación hidrogel cargada con el agente de contraste paramagnético gadolinio (abajo).

Figura 33. Curva de oscilación de la formulación F32 a medida que aumenta la temperatura. Figura 34. Imagen obtenida mediante microscopía de fluorescencia (16 aumentos) de la formulación F32 sin colonización celular (imagen superior) o colonizada con fibroblastos (imagen inferior). Los puntos fluorescentes se deben al producto derivado de la metabolización de calceína por parte de las células viables incluidas en el gel. Figura 35: Perfil de liberación de vitamina B12 a partir de la formulación F32 (reticulada con espermidina) y a partir de una formulación F42, de composición similar a la F32 pero reticulada con espermina (liberación en tampón fosfato pH 7.4)

EJEMPLOS Como procedimiento común a los ejemplos detallados a continuación, se han caracterizado los hidrogeles en función de sus propiedades viscoelásticas, utilizando para tal fin un reómetro Haake RheoStress 300 Rotational (Alemania) equipado con un termostato Haake DC10 a una temperatura de 37.0 ± 0.1 °C.

Los diferentes polímeros, tal y como se utilizan en los siguientes ejemplos, fueron adquiridos a diferentes casas comerciales: carragenina (Gelymar, Providencia, Santiago, Chile), sulfato de condroitina (Sigma Aldrich, Madrid Spain), sulfato de dermatano (Calbiochem, Merck, CA, USA), glucomanano (Shimizu Chemical, Japan), goma gelano (Sigma Aldrich, Madrid Spain), albúmina bovina (Sigma Aldrich, Madrid Spain), gelatina (Sigma Aldrich, Madrid Spain), poliglicerol (Hyperpolymers GmbH, sod (Sigma Aldrich, Madrid, España), catalasa (Sigma Aldrich, Madrid, España), espermidina (Sigma Aldrich, Madrid, España), espermina (Sigma Aldrich, Madrid, España). La prednisolona fue adquirida en Sigma Aldrich (Italia) y el siRNA en MWG Biotech AG (Ebersbeg, Alemania).

En los siguientes ejemplos, así como durante toda la presente memoria descriptiva, las cantidades de cada uno de los ingredientes se expresan en porcentaje en peso referido a la masa total de ingredientes empleados.

Ejemplo 1 : Uso de espermidina para preparar hidrogeles a base de polímeros aniónicos de origen natural, preparación que no es posible empleando iones inorgánicos como el calcio. Se prepararon hidrogeles empleando como ingredientes goma gelano, sulfato de condroitina y albúmina, según el procedimiento previamente descrito. Como agentes reticulantes se emplearon la molécula catiónica espermidina o bien cloruro de calcio. Para ello se prepararon disoluciones de goma gelano (5 mg/mL), sulfato de condroitina (6 mg/mL), espermidina (0,67 mg/mL) y albúmina (5 mg/mL) en tampon HEPES 20 mM pH 7,4. Todos los componentes de carga negativa se mezclaron dando lugar a una relación en masa goma gelano:albúmina:sulfato de condroitina de 1 :1 :0,72. La disolución resultante se mezcló con 1 ,2 mL (0,8 mg) de la disolución de espermidina o bien con 1 ,2 mL (2,4 mg) de la disolución de calcio en tampon HEPES 20 mM pH 7,4, bajo agitación magnética. Empleando espermidina como agente reticulante se obtuvieron de modo espontáneo geles, como muestra la Figura 1. No obstante, cuando se empleó CaCI ₂ no se produjo gelificación, observándose en la misma Figura 1 un medio totalmente líquido.

Ejemplo 2: Preparación de hidroqeles a base de diferentes polímeros aniónicos de origen natural mediante reticulación con espermidina.

Se prepararon diversas formulaciones de hidrogeles empleando diferentes polímeros aniónicos de origen natural mediante reticulación con espermidina. Opcionalmente se incorporó a la composición una o varias proteínas, concretamente albúmina o gelatina. Las Tablas 1 -5 recogen los componentes de los geles formados.

Tabla 1. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina (Formulaciones F1 a F4).

FORMULACION F1 F2 F3 F4

INGREDIENTES % peso % % %

peso peso peso

Carragenina 0.2 0.2 0.2 0.2

Sulfato de condroitina 0 0.036 0.072 0.1

Gelatina 0.1 0.1 0.1 0.1

Albúmina 0.1 0.1 0.1 0.1

Espermidina 0.024 0.024 0.024 0.024

Tabla 2. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina (Formulaciones F5 a F8).

Tabla 3. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina (Formulaciones F9 a F13).

FORMULACION F9 F10 F11 F12 F13

INGREDIENTES % peso % % % %

peso peso peso peso

Carragenina 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Sulfato de dermatano 0.4 0.1 0.06 0.036 0.072 Albúmina 0 0.2 0.2 0.1 0.1

Gelatina 0.25 0 0 0 0

Espermidina 0.04 0.02 0.024 0.024 0.024

Agua desionizada 99.1 99.48 99.52 99.64 99.6

Tabla 4. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina (Formulaciones F14 a F17).

Tabla 5. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina (Formulaciones F18 a F21 ).

FORMULACION F18 F19 F20 F21

INGREDIENTES % peso % % % peso peso peso

Goma gelano 0.1 0.1 0.14 0.14

Sulfato de dermatano 0.1 0.1 0.1 0.1

Albúmina 0.14 0 0.14 0

Gelatina 0 0.14 0 0.14

Espermidina 0.034 0.034 0.034 0.034

Agua desionizada 99.63 99.63 99.59 99.59

Ejemplo 3: Modulación de las propiedades viscoelásticas de los hidroqeles mediante una adecuada selección de sus componentes.

Los hidrogeles elaborados a base de sulfato de condroitina y goma gelano descritos en el ejemplo anterior como formulaciones F14, F15 y F16 fueron sometidos a evaluación de sus propiedades viscoelásticas. Como muestra la Figuras 2, independientemente de la composición todas las formulaciones presentan una viscosidad similar, la cual resulta adecuada para una aplicación tópica de dichos hidrogeles. Sin embargo, tal y como muestra la Figura 3, las propiedades viscoelásticas de dichos hidrogeles pueden ser moduladas mediante una adecuada selección de su composición.

Ejemplo 4: Los hidroqeles capaces de asociar un ingrediente activo, incluso cuando éste tiene carácter lipofílico v, asimismo, son capaces de dar lugar a la liberación posterior del ingrediente activo asociado. Se prepararon geles de gelano y sulfato de condroitina asociando un ingrediente activo, seleccionando para tal fin la prednisolona. Teniendo en cuenta que se trata de una molécula lipofílica se procedió previamente a asociarla a albúmina. Para ello se disolvieron 20 mg de prednisolona en una disolución de albúmina en metanol (10 mg/ml). Tras la evaporación del metanol, el sistema albumina-prednisolona fue resuspendido en tampon HEPES 20 mM pH 7,4 (5 mg/ml) y la dispersión coloidal obtenida se mezcló con una disolución en tampon HEPES 20 mM pH 7,4 de gelano (5 mg/ml) y sulfato de condroitina (6 mg/ml). A la mezcla resultante se adicionaron 1 ,2 mL de una disolución de espermidina en tampon HEPES 20 mM pH 7,4 (2 mg/ml), bajo agitación magnética, dando lugar a la formación espontánea de hidrogeles asociando el ingrediente activo prednisolona (proporción de 7 % en peso con respecto a los componentes). Los geles obtenidos fueron sometidos a un estudio de liberación in vitro en tampón fosfato pH 7,4. Para ello, se tomaron 3,2 g de dichos geles y se incubaron en condiciones sink a 37.0±0.1 °C en 500 mi de dicho medio de liberación en un aparato de disolución (Sotax AT7 Smart, Switzerland) sometidos a agitación de 100 rpm. A diferentes tiempos se determinó la prednisolona liberada al medio, mediante una técnica HPLC (Perkin-Elmer Series 200 LC pump, 235 Diode Array Detector, USA) Merck Hibar LiChrocart (250-4, 5μιη) columna RP ^"18 ,mezcla MeOH/H ₂ 0 (7:3), flujo 0.6 mL/min y se cuantificó a una λ=245 nm frente a la correspondiente recta de calibrado (y = 91 ,168 x - 0,1008). La Figura 4 muestra el correspondiente perfil de liberación. Como puede comprobarse, los geles desarrollados son capaces de liberar el ingrediente activo lipofílico previamente asociado a los mismos.

Ejemplo 5: Incoporación en la composición de los hidrogeles de enzimas de interés en cosmética, medicina reqenerativa e ingeniería de tejidos.

Se prepararon hidrogeles en cuya composición se incluyeron las enzimas antioxidantes catalasa y superóxido dismutasa. Para ello se procedió a su disolución en tampón HEPES 20 mM (pH 7.4) y 1 mi de esta solución de concentración 5 mg/ml se mezcló con 1 mi de solución de carragenina en tampón HEPES 20 mM pH 7.4 (5 mg/ml). Sobre la mezcla resultante se adicionaron 0.3 mi de una disolución de espermidina en tampón HEPES 20 mM (2 mg/ml), bajo agitación magnética, dando lugar a la formación espontánea de hidrogeles. Los componentes de dichos hidrogeles se recogen en las Tablas 6-7.

Tabla 6. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina, incluyendo en su composición enzimas de interés en cosmética, medicina regenerativa e ingeniería de tejidos (Formulaciones F22 a F24).

FORMULACION F22 F23 F24

INGREDIENTES % peso % %

peso peso Carragenina 0.17 0.17 0.17

Sulfato de condroitina 0 0.03 0

Albúmina 0.1 0.17 0 superóxido dismutasa 0.05 0.05 0.17

Espermidina 0.02 0.02 0.02

Agua desionizada 99.66 99.56 99.64

Tabla 7. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina, incluyendo en su composición enzimas de interés en cosmética, medicina regenerativa e ingeniería de tejidos (Formulaciones F25 a F27).

FORMULACION F25 F26 F27

INGREDIENTES % peso % %

peso peso

Carragenina 0.17 0.17 0.17

Sulfato de condroitina 0 0.03 0

Albúmina 0.1 0.17 0

Catalasa 0.05 0.05 0.17

Espermidina 0.02 0.02 0.02

Agua desionizada 99.66 99.56 99.64 Tabla 8. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina, incluyendo en su composición enzimas de interés en cosmética, medicina regenerativa e ingeniería de tejidos (Formulaciones F28 a F29).

Ejemplo 6: Preparación con espermidina de hidrogeles capaces de asociar material genético.

Se prepararon hidrogeles en cuya composición se incluyó ARN de interferencia, marcado con el marcador de fluorescencia cy3 (longitud de onda de excitación: 550 nm y longitud de onda de emisión: 570 nm). Para ello se procedió a la preparación del gel del ejemplo F16 (Tabla 4) y se incorporó a éste una cantidad de siRNA que se correspondía con un 2.5 % de la masa total del mismo. El siRNA se añadió a la solución de componentes negativos, previamente a la formación del gel.

Del gel resultante se obtuvieron imágenes fotográficas en las que se evidencia la incorporación de siRNA marcado con el marcador de fluorescencia cy3 con el característico color rosáceo que muestra a luz natural (Figura 5A) o bien con la fluorescencia emitida por dicho siRNA marcado cuando se recurre a la técnica de microscopía de fluorescencia (microscopio ECLIPSE-NIKON 80j, Japan) (Figura 5B). Ejemplo 7: Empleo de espermidina para preparar hidroqeles constituidos exclusivamente por componentes naturales del organismo humano.

Se prepararon hidrogeles empleando como ingredientes atelocolágeno (Koken, Japan) y albúmina, según el procedimiento previamente descrito. Como agente reticulante se empleó la molécula catiónica espermidina. Para ello se prepararon disoluciones de atelocolágeno (5 mg/mL en HCL 0.001 M pH = 3), albúmina (5 y 10 mg/mL), y espermidina (4 mg/mL) en tampon HEPES 20 mM pH 7,4. En la preparación de los hidrogeles se añadió 1 mL de la solución de espermidina sobre 2 mL de la solución de atelocolágeno bajo agitación magnética y, a continuación, se añadieron 1.2 mL de la solución de albúmina, resultando la relación de componentes la indicada en la Tabla 9 y un pH final de 7.4. Dichos hidrogeles presentan aspecto y características reológicas similares a las ya descritas en los ejemplos previos.

Tabla 9. Componentes de los hidrogeles obtenidos mediante reticulación con espermidina y constituidos exclusivamente por componentes naturales del organismo humano (Formulaciones F30 a F31 ).

Ejemplo 8. Modulación de las propiedades viscoelásticas v mecánicas de los hidroqeles mediante modificación de parámetros de formulación (temperatura, agitación, superficie de contacto v concentración de componentes).

Con objeto de modular las propiedades mecánicas de los hidrogeles se procedió a la modificación de los parámetros de formulación temperatura, agitación, superficie de contacto y concentración de componentes con respecto a los recogidos en los ejemplos anteriores. Como resultado de dicho estudio se desarrolló la formulación F32. Para su elaboración se prepararon disoluciones en HEPES 20 mM pH 7.4 de los distintos componentes. Seguidamente, se mezclaron en un vaso de precipitados 1 mi de solución de gelano (5 mg/ml) y 0.6 mi de solución de sulfato de condroitino (6 mg/ml) previamente calentadas a 60 °C, manteniéndose la mezcla a 60 °C bajo agitación magnética constante en baño de agua termostatizado. Paralelamente se procedió a mezclar en otro vaso de precipitados 1.3 mi de solución de albúmina (20 mg/ml) y 0.6 mi de solución de espermidina (2 mg/ml), manteniéndose esta mezcla a 37°C unos minutos. A continuación se incorporó esta segunda mezcla sobre la primera. La mezcla final se mantuvo bajo agitación magnética unos segundos, refrigerándose después en nevera a 4 °C durante 20 minutos, produciéndose la completa gelificación del sistema.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente se prepararon diferentes hidrogeles variando los siguientes parámetros de formulación:

I) Contenido de albúmina de la formulación: Concentraciones de albúmina de 20 mg/ml, 12.5 mg/ml y 5 mg/ml dieron lugar a las formulaciones denominadas F32, F33 y F34, respectivamente. Como se aprecia en las Figuras 6 y 7, estas formulaciones vieron aumentados los valores de los parámetros tanto viescoelásticas como mecánicos estudiados con respecto a las descritas en los ejemplos anteriores, aumentando asimismo estos parámetros a medida que aumentó la cantidad de albúmina incorporada a los sistemas. Además, y pese a su elevado contenido en agua (superior al 98 %), la consistencia de estos hidrogeles se mantiene incluso tras haber sido sometidos a ensayos de reología. Concretamente, la Figura 8 muestra una imagen de la formulación F32 tras haber sido recogida del reómetro con una espátula, observándose su transparencia y consistencia.

II) Contenido de reticulante empleado: Los parámetros de formulación del hidrogel F32 fueron modificados reduciendo el contenido de reticulante empleado, dando lugar a las formulaciones F35, F36 y F37 (concentraciones de espermidina 0.5, 0.65 y 1 mg/ml, respectivamente). En las Figuras 9 y ÍO se puede ver la variación de las características viscoelásticas y mecánicas de los diferentes sistemas, apreciándose una clara disminución de los valores del módulo elástico (G') de los hidrogeles con la disminución del contenido de reticulante.

III) Finalmente, la sustitución del sulfato de condroitino por sulfato de dextrano o ácido hialurónico dio lugar a las formulaciones F38 y F39, respectivamente. En las Figuras 11 y 12 podemos ver la variación en las características viscoelásticas y mecánicas de los sistemas en función del glucosaminoglucano utilizado, apreciándose que en los tres casos éstas serían potencialmente interesantes para su aplicación en el campo biomédico.

Ejemplo 9. Análisis de la textura de los hidroqeles.

Para realizar el análisis de textura se prepararon diferentes formulaciones hidrogel atendiendo al diseño de mezclas indicado en la Tabla 10, y se sometieron a ensayos de compresión a una velocidad constante (Texturometro T.A. XT Plus, Stable Micro Systems Ltd. Surrey, U. K.). Los resultados se recogen en la Tabla 11.

Tabla 10. Diseño de mezclas de las formulaciones hidrogel estudiadas en este e emplo.

Tabla 11. Resultados del análisis texturométrico de los hidrogeles descritos diseño de mezclas Tabla ~\ 0).

M12 1 ,32 0,60 0,80 0,32 M30 0,39 0,25

M13 0,56 0,38 M31 0,41 0,29

M14 0,57 0,36 M32 0,43 0,31

M15 0,64 0,47 0,36 0,27 M33 0,90 0,56 0,51

M16 0,51 0,30 M34 0,36 0,85 0,27

M17 0,84 0,73 0,49 0,46 M35 0,95 0,59 0,59

M18 0,81 0,43 M36 0,54 1 ,05 0,41

Ejemplo 10. Ensayo de carga de norfloxacino.

A partir de los datos de textura obtenidos, se seleccionaron los hidrogeles M13 a M24 del diseño de mezclas para llevar a cabo un estudio de carga del ingrediente activo norfloxacino, agente antimicrobiano de elevada afinidad por la albúmina.

Para la realización de este experimento se cortaron fragmentos de hidrogel de 1 1 .6 mm y se sumergieron durante 3 horas en 5 mi una disolución de concentración fija de norfloxacino (0.01 mg/mL), registrándose la absorbancia (273 nm) de la solución de carga tras este tiempo y correlacionándose ésta con la cantidad de fármaco incorporada por la formulación (Tabla 12).

Tabla 12. Cantidad de norfloxacino incorporada por cada formulación estudiada tras 3 horas de ensayo de carga.

Cantidad de norfloxacino

Formulación

incorporada (mg)

M13 0,0015 ± 0,0002

M14 0,0013 ± 0,0001

M15 0,0014 ± 0,0000

M16 0,001 1 ± 0,0000

M17 0,0013 ± 0,0003

M18 0,0012 ± 0,0001

M19 0,0014 ± 0,0000

M20 0,0012 ± 0,0001

M21 0,0014 ± 0,0000

M22 0,0012 ± 0,0000 M23 0,0013 ± 0,0001

M24 0,0013 ± 0,0004

Ejemplo 11. Incorporación v liberación de fármacos hidrosolubles.

Para evaluar el potencial de la formulación F32 como sistema de liberación de fármacos hidrosolubles de baja estabilidad, como vitaminas o proteínas, se ha planteado la incorporación a los hidrogeles de teofilina, vitamina B12 y mioglobina (de menor a mayor tamaño molecular) como los ingredientes activos modelo y el estudio de sus perfiles de liberación. Para la realización de estos estudios los ingredientes activos modelo fueron incorporadas en el hidrogel en una cantidad correspondiente al 20 % de la masa total del sistema, previa disolución de los mismas en la solución de condroitín sulfato, con anterioridad a la formación del hidrogel. Como medio de liberación se utilizaron 50 mi (manteniendo Condiones Sink) de dos tampones de diferente pH: tampón SIF pH = 7.4 (0.05 M), que proporciona un valor de pH considerado como fisiológico, y tampón acetato pH = 5.4 (0.01 M), el cual se puede considerar similar al pH a nivel de la superficie de la piel y de algunas mucosas. Además, se ha querido evaluar la influencia de la temperatura en el proceso, para lo cual se ha estudiado el perfil de liberación de vitamina B12 en tampón acetato (pH = 5.4) a dos temperaturas diferentes, 25° C y 37° C.

A diferentes tiempos se retiraron 5 mi de muestra de medio de liberación del sistema, restituyendo de inmediato 5 mi de medio nuevo. Posteriormente, se procedió a la medida de la absorbancia de las muestras a la longitud de onda adecuada (276 nm teofilina, 361 nm vitamina B12 y 210 nm mioglobina) y, con ayuda de la recta de calibrado correspondiente, se determinó la concentración del ingrediente activo modelo en las muestras de liberación.

En las Figuras 13, 14 y 15 se representan gráficamente las comparaciones de los perfiles de liberación de los tres ingredientes activos indicados anteriormente, a los diferentes pHs y temperaturas estudiadas. Además, en la Figura 16 podemos ver una imagen de la formulación F32 cargada con vitamina B12 tras haber sido analizada en el reómetro, en la cual se aprecia claramente la distribución homogénea del fármaco, de color rojizo, en el hidrogel y como éste mantiene su consistencia tras la incorporación de dicho fármaco. Queda así evidenciada la capacidad de los hidrogeles para incorporar y liberar ingredientes activos de baja estabilidad. Ejemplo 12. Incorporación v liberación de fármacos liposolubles.

Se ha querido evaluar si la formulación F32 conserva la capacidad de vehiculización de fármacos liposolubles indicada en el Ejemplo 4, para ello en este caso se ha seleccionado el ingrediente activo ketoconazol. El procedimiento de incorporación del fármaco en el hidrogel ha pasado por la preparación de complejos albúmina-fármaco, para lo que se disolvieron 20 mg de ketoconazol en 5 mi de MeOH (la concentración final será de 4 mg/ml). A continuación se disolvieron 100 mg de albúmina en 278 mi de agua, y se mezclaron ambas disoluciones, evaporando el disolvente orgánico y liofilizando el conjunto. El liófilo obtenido se resuspendió en 5 mi de HEPES 20 mM (pH=7.4), y se utilizó en la preparación de la formulación F32 en el lugar de la solución de albúmina natural.

La determinación de la cantidad de ketoconazol liberado se llevó a cabo mediante HPLC, a partir de las áreas de los picos obtenidos a 240 nm (tiempo de retención = 7.2 min), utilizando la columna RP-18 Merck Hibar LiChrocart (250-4, 5μιη) y una mezcla de MeOH:H ₂ 0:(CH ₃ -CH ₂ )2NH (80%-19%-1 % v/v/v) como fase móvil. El flujo se mantuvo constante a 0.8 ml/min. La recta de calibrado se obtuvo previamente, partiendo de una solución estándar de ketoconazol. La Figura 17 demuestra la capacidad del sistema de incorporar y liberar el fármaco liposoluble estudiado.

Ejemplo 13. Caracterización de la interacción albúmina-fármaco liposoluble.

Con el objeto de determinar si existe interacción entre el fármaco liposoluble y la albúmina de los hidrogeles se sometieron muestras de dos fármacos liposolubles modelo (ketoconazol y prednisolona), junto con la albúmina y con mezclas físicas de los mismos, al análisis mediante resonancia magnética nuclear, utilizando la técnica espectroscópica Diferencia de la Transferencia de Saturación (STD-NMR, según sus siglas en inglés) (Espectrómetro Varían Inova 750, Varían Corporation, USA). Gracias a esta técnica es posible identificar la interacción entre potenciales ligandos, en este caso fármacos liposolubles, y su proteína-receptor, que en este caso sería la albúmina, ya que sólo muestra señales de moléculas que presentan cierta afinidad de unión.

Para la preparación de la muestra problema se disolvieron 50 mg de albúmina en 500 mi de D ₂ 0, tras lo cual se incorporaron 0.3 mi EtOH conteniendo una cantidad de fármaco disuelto equivalente al 20% en peso de la albúmina (lo que se corresponde con 10 mg de fármaco). Se utilizaron además dos muestras control, correspondientes a una solución de albúmina tratada con EtOH (5 mg) en D ₂ 0 (0.6 mi) y a una suspensión de fármaco (5 mg) en D ₂ 0 (0.6 mi), la cual se sometió a la determinación de su espectro ¹ H-RMN.

En las Figuras 18 y 19 se señalan los picos que no aparecen cuando se analiza el espectro STD de la solución de albúmina, pero que sí lo hacen cuando se analiza el espectro STD correspondiente al complejo albúmina-fármaco liposoluble, y que se presentan además a nivel de desplazamientos químicos coincidentes con los del espectro ¹ H-RMN de la suspensión del fármaco, quedando así evidenciada la formación de un complejo albúmina-fármaco liposoluble mediante la interacción de ambos componentes.

Ejemplo 14. Pruebas de colonización celular del hidroqel.

Utilizando la formulación F32 a modo de base se cultivaron en placa células de cornea (medio de cultivo DMEM/F-12 con GlutaMAX, incubación a 37° C en atmósfera de 5% de C0 ₂ y 95% de aire). Tras 48 horas de incubación se retiró el medio de cultivo, realizándose posteriormente una tinción fluorescente del hidrogel y las posibles células asociadas o incluidas en el mismo, con el fluorocromo DAPI (358/461 nm), el cual posee elevada afinidad por el material genético (material incluido en el interior de todas las células). La fluorescencia emitida por este hidrogel y las posibles células asociadas o incluidas en el mismo fue analizada al microscopio confocal (Microscopio Confocal Espectral Leica TCS-SP2, LEICA Microsystems Heidelberg GmbH, Mannheim, Alemania), utilizándose el hidrogel sin células asociadas como control negativo. La Figura 20, que compara la fluorescencia emitida por el hidrogel que incluye células con la que emite el hidrogel sin ellas, demuestra que se ha producido la colonización del mismo por parte de las células de córnea estudiadas.

Ejemplo 15. Desarrollo de hidrogeles utilizando espermina como reticulante.

Se ha preparado la formulación F32 utilizando espermina como reticulante, en lugar de espermidina, lo que dio lugar a una nueva formulación hidrogel que denominaremos F42. Así, se observó que la nueva formulación F42 presenta un valor de G' menor, respecto a la reticulada con espermidina (alrededor de 400 Pa en el caso de F42, frente a los 1200 Pa en el caso de la formulación F32) (Gráficos no mostrados) pero que, como en el caso de ésta, al disminuir la concentración de reticulante disminuía el G' del sistema, aunque en menor medida (datos no mostrados).

Asimismo, se realizaron con F42 estudios de liberación utilizando las mismas moléculas, el mismo procedimiento y los mismos medios tamponados que en el caso de F32 (Ejemplo 11). Los resultados mostraron unos perfiles de liberación similares, como se aprecia en la figura 35 para la liberación de la vitamina B12 a partir de dichos hidrogeles

Ejemplo 16. Análisis de la microestructura de los hidrogeles mediante Microscopía Electrónica de Barrido.

Diferentes formulaciones de hidrogeles recogidas en la Tabla 13 fueron deshidratados parcial o totalmente. Para ello se recurrió, respectivamente, a desecación en estufa o a liofilización. Posteriormente se analizó su microestructura con ayuda de un Microscopio Electrónico de Barrido (EVO LS15 Cari Zeiss SMT, Alemania).

Tabla 13. Composición de las formulaciones hidrogel estudiadas en este ejemplo.

Las formulaciones hidrogel secadas en estufa, a 37°C durante 3 horas, no presentan la estructura porosa descrita para los hidrogeles naturales, como muestra la Figura 21. Por el contrario, como muestra la Figura 22, el análisis de los hidrogeles liofilizados

(ciclo largo de liofilización de 48 horas) demostró que éstos sí mantienen una estructura porosa, así como que existen diferencias en las cantidades de un determinado componente en función de la región analizada, cosa que no ocurre en el caso de las formulaciones desecadas en estufa.

Ejemplo 17. Deshidratación y posterior hinchamiento de los hidrogeles desecados.

Diferentes formulaciones de hidrogeles fueron deshidratadas parcial o totalmente (Tabla 13). Para ello se recurrió a desecación en estufa o a liofilización, respectivamente. Posteriormente se evaluó la capacidad de los hidrogeles deshidratados de reincorporar fluidos acuosos en su estructura, mediante la determinación de su grado de hinchamiento.

I) Hidrogeles desecados en estufa:

Las formulaciones hidrogel indicadas en la Tabla 13 se secaron en estufa, a 37°C durante 3 horas. Posteriormente se pesaron y se colocaron en 75 mi de solución acuosa, manteniéndose el sistema en incubación a 37° C durante 24 horas. Al cabo de este tiempo se volvieron a pesar las diferentes formulaciones.

El grado de hinchamiento de los hidrogeles (Q) se calculó como la diferencia entre el peso tras el hinchamiento (W) y el peso inicial del hidrogel seco (W ₀ ):

W - Wo

Q (%) = x 100

Wo

Durante el estudio de las propiedades de hinchamiento se utilizaron diferentes medios:

- Agua miliQ

- NaCI 0,1 M

- Tampón SIF pH = 7,4

- Tampón MES 50 mM, pH = 5.5

- HCI 0.1 M, pH = 1.

Los resultados permitieron comprobar que todas las formulaciones estudiadas presentan capacidad de hinchamiento tras su desecación en estufa (Tabla 14), asimismo se observó que la variación de las concentraciones de reticulante (espermidina) o de principal polímero negativo (goma gelano) da lugar a variaciones en el grado de hinchamiento de los sistemas, mientras que la variación de las concentraciones de proteína (albúmina) o de glucosaminoglucano (sulfato de condroitino) apenas tiene influencia en el mismo.

Tabla 14. Datos de hinchamiento en agua de las formulaciones de la Tabla 10 desecadas en estufa.

Formulación Grado de hinchamiento (Q %)

F32 1070,16 ± 75,71 F35 1860,15 ± 51 ,03

F40 553,16 ± 10,73

Los datos de hinchamiento en diferentes medios han permitido concluir (Tabla 15) que a pHs intermedios el grado de hinchamiento sufre ligeras diferencias, sin embargo una bajada acusada del pH da lugar a una disminución importante del mismo, efecto probablemente debido a la desnaturalización de la proteína constituyente del sistema en estas condiciones. También se aprecia en la Tabla 15 que la fuerza iónica apenas influye en el grado de hinchamiento.

Tabla 15. Datos de hinchamiento en diferentes medios de la formulación F32.

II) Hidrogeles liofilizados.

Los geles recién preparados se congelaron en diferentes condiciones y se sometieron a un ciclo largo de liofilización de 48 horas. Posteriormente se pesaron y se colocaron en 75 mi de fluido acuoso. El conjunto se mantuvo en incubación a 37° C durante 24 horas. Al cabo del este tiempo se volvieron a pesar las diferentes formulaciones. El índice de hinchamiento se calculó utilizando la ecuación descrita en el apartado anterior.

Los resultados se muestran en la Tabla 16, donde se aprecia que, como en el caso de los geles desecados en estufa, la variación de la concentraciones de reticulante o del principal polímero negativo dan lugar a variaciones en el grado de hinchamiento de los sistemas, mientras que la variación de las concentraciones de proteína o glucosaminoglucano apenas influyen en el mismo.

Tabla 16. Datos de hinchamiento en agua de las formulaciones de la Tabla 10 liofilizadas. Formulación Grado de hinchamiento (%)

F32 1592,98 ± 83,32

F35 3364,31 ± 48,85

F40 899,18 ± 1 1 ,01

Ejemplo 18. Liberación de ingredientes activos por parte de los hidroqeles previamente deshidratados de forma total o parcial mediante liofilización o desecación en estufa, respectivamente.

Para este ensayo se tomó como modelo la vitamina B12 (Sigma, España), que se incorporó a la formulación F32 según lo descrito en el Ejemplo 11. Posteriormente los hidrogeles cargados con vitamina B12 se deshidrataron mediante liofilización o bien en estufa según las condiciones anteriormente descritas. Tras la deshidratación se sometieron las formulaciones a ensayos de liberación en tampón SIF pH = 7.4 (0.05 M), también según lo descrito en el Ejemplo 11. La Figura 23 muestra una comparación de los perfiles de liberación de la vitamina B12 a partir de los geles frescos (inmediatamente tras su elaboración) y de los geles tras ser sometidos a deshidratación total o parcial, mediante liofilización o desecación en estufa, respectivamente. Los resultados presentados en dicha figura evidencian la capacidad de los geles deshidratados total o parcialmente mediante cualquiera de las técnicas empleadas (liofilización o desecación en estufa) de liberar los ingredientes activos asociados a los mismos.

Ejemplo 19. Modificación de las propiedades organolépticas de los hidroqeles. Los hidrogeles descritos en la presente invención son capaces de incorporar ingredientes modificadores de las propiedades organolépticas en su estructura, siendo susceptibles a los cambios que éstas provocan en dichas propiedades. Así, se han hecho diversos ensayos de inclusión del ingrediente aromatizante vainillina en las formulaciones, comprobándose que éstas adquieren aroma a vainilla tras dicha inclusión, sin que su estructura o consistencia muestre signos aparentes de modificación. Para la incorporación del aromatizante se incorporó la vainilla en polvo (Sigma, España) a la solución de polímeros negativos de la formulación F32 en una cantidad equivalente al 10% de la masa total polimérica del sistema. Ejemplo 20. Preparación de hidroqeles a partir de polímeros modificados con grupos fosfato.

En ejemplos anteriores se ha descrito la formación de hidrogeles utilizando como principal polímero negativo del sistema compuestos con grupos sulfato o con grupos carboxilato en su estructura. Sin embargo, dado los efectos positivos que han demostrado tener los polímeros fosfatados para determinadas aplicaciones, en una realización particular se ha modificado el polímero aniónico goma gelano, que contiene grupos carboxilato, transformando parte de estos grupos carboxilato en grupos fosfato. Para ello, primero se disolvieron 60 mg de gelano en 30 mi de la solución de MES pH=5.5 (50 mM) y, a continuación, se añadieron los reactivos EDC (180 mg) y NHS (53.88 mg). Posteriormente se disolvieron 300 mg de O-phosphoethanolamine en 3 mi de MES pH=5.5 (50 mM), dando lugar a una disolución transparente que se añadió a la disolución anteriormente descrita. Se dejó el conjunto reaccionando 24 horas, tras las cuales se sometió a 48 horas de diálisis frente a agua destilada. La incorporación de grupos fosfato al polímero natural fue confirmada mediante el análisis de los correspondientes espectros de Resonancia Magnética Nuclear (Bruker 750, USA). Todos los reactivos citados anteriormente se obtuvieron de Sigma (España).

Tras la modificación del polímero se ha preparado una formulación similar en composición a la F32 pero incluyendo la goma gelano modificada con grupos fosfato en el lugar de la goma gelano natural, comprobándose la obtención de hidrogeles transparentes y de consistencia similar a los descritos para la goma gelano natural y que se aprecia en la Figura 8.

Ejemplo 21. Incorporación de precursores de la hidroxiapatita a los hidrogeles.

El fosfato octacálcico (Ca ₈ H2(P0 ₄ )6.5H ₂ 0), (OCP), ha sido propuesto como precursor en la formación de minerales hidroxiapatíticos en hueso y diente. Por ello, en una realización particular, hemos incluido este compuesto en los hidrogeles. Para ello, en primer lugar se ha sintetizado OCP, siguiendo el procedimiento que se describe a continuación: Se prepararon 50 mi de una disolución 0,04M de NaH ₂ P0 ₄ en agua destilada previamente calentada hasta los 70 °C, posteriormente se adicionaron a esta disolución, lentamente y bajo agitación magnética constante, 50 mi de una solución 0,04M de Ca(CH ₃ COO) ₂ . El compuesto sólido obtenido es el OCP que, una vez liofilizado, ha sido incorporado a la formulación de hidrogel F32. La incorporación de OCP al hidrogel se efectuó empleando dos cantidades diferentes de OCP (5 y 20 mg), que se han incorporado a la solución de polímeros negativos del sistema, previamente a la formación del gel. En la Figura 24 se muestran los valores de G' y G" obtenidos mediante el análisis reológico de las formulaciones. Asimismo, en la Tabla 17 se muestran los valores numéricos correspondientes al análisis texturométrico de las formulaciones. En la Figura 25 se puede ver, además, el aspecto de una de estos nuevos hidrogeles.

Tabla 17. Resultados del análisis texturométrico de la formulación F32 incluyendo el precursor de la hidroxiapatita fosfato octocálcico en su estructura.

E= modulo de Young

σ= fuerza de compresión

Ejemplo 22. Liberación de factores de crecimiento a partir de los hidrogeles.

Se estudió la liberación de un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, según sus siglas en inglés), concretamente del factor VEGF ₁₂ 6 (Merck, USA), a partir de la formulación hidrogel F32. Para ello se preparó 1 mi de hidrogel de acuerdo con lo descrito en el Ejemplo 8, adicionándose 25 μΙ de disolución en agua destilada del factor VEGF-I26 (concentración 20 ng/ml) a la disolución de polímeros negativos. Una vez formado el hidrogel se incorporó como medio de liberación 3 mi de agua destilada y se mantuvo el medio a T ^a ambiente (25 °C) en condiciones estáticas. Tras 2 y 4 horas de incubación se retiraron 300 μΙ del medio de liberación y se restituyeron al sistema 300 μΙ de agua destilada. El VEGF ₁₂ 6 liberado en ambas muestras fue cuantificado con ayuda de un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, según sus siglas en inglés) específico para este factor (Calbiochem, Canadá), pudiendo determinarse así el porcentaje de factor liberado de la formulación F32 a los dos tiempos estudiados. Para ello se determinó por espectofotometría, con ayuda de un lector de placas (Biorad 680 Microplate Reader, Japan), la absorbancia de las muestras y de los patrones de calibrado, siguiendo las instrucciones del Kit de ELISA. A los valores de absorbancia obtenidos se restó la absorbancia proporcionada por los correspondientes blancos y los valores definitivos se introdujeron en la curva de calibración (obtenida siguiendo el protocolo descrito por el kit), con la cual se determinaron los valores de concentración. Los resultados muestran (Figura 25), al igual que en ejemplos anteriores, una liberación gradual del ingrediente activo incorporado a la formulación. Ejemplo 23. Incorporación de nanopartículas a los hidroqeles v liberación de factores de crecimiento a partir de las mismas.

Se preparó una formulación de nanopartículas asociando el factor de crecimiento VEGF-126. Los componentes de dichas nanopartículas fueron el polímero aniónico natural dextrano y la poliamina endógena catiónica espermina y la técnica de elaboración empleada fue la gelificación iónica, siguiendo el procedimiento descrito en la solicitud de patente WO2010049562 A1 . Para su preparación se adicionaron 300 μΙ de una disolución de espermina en agua (concentración 0.5 mg/ml) a 600 μΙ de una disolución de dextrano en agua (concentración 1 mg/ml) sobre los que previamente se habían incorporado 25 μΙ de disolución en agua del factor de crecimiento VEGF ₁₂ 6 (20 ng/ml). El conjunto se mantuvo bajo agitación magnética constante, a temperatura ambiente, durante 30 minutos. La suspensión coloidal resultante (tamaño medio de 100 nm, Zetasizer® 3000HS, Malvern Instruments, UK) se centrifugó durante una hora, a 4° C y 14000 rpm, tiempo tras el cual se retiró el sobrenadante. Los sobrenadantes resultantes de la centrifugación de las suspensiones de nanopartículas fueron analizadas con ayuda de un kit de ELISA específico para este factor (Calbiochem, Canadá), restándose el valor de los correspondientes blancos (la absorbancia de sobrenadantes de suspensiones de nanopartículas blancas). Así, con ayuda de la curva de calibrado correspondiente, elaborada de acuerdo a las instrucciones del kit de ELISA, se determinó que la cantidad de factor presente en los sobrenadantes estudiados era de un 5.6% de la cantidad de factor incluida durante la formación de las nanopartículas. Es decir, un 95.4 % de VEGF ₁₂ 6 se encontraba asociado a las nanopartículas presentes en los sedimentos.

En una segunda etapa se preparó la formulación hidrogel F32 incluyendo la suspensión de las nanopartículas anteriores asociado el factor de crecimiento. Teniendo en cuenta que las nanopartículas presentan una carga superficial (potencial zeta, determinado haciendo uso de un Zetasizer® 3000HS, Malvern Instruments, UK) negativa (-25±3 mV), se incorporaron en la disolución de los polímeros negativos, gelano y condroitin sulfato. Seguidamente, se pusieron los hidrogeles (25 mg) a liberar en 6 mi de PBS pH = 7.4. y se tomaron 10 μΙ de muestra de medio de liberación a las 8, 24 y 48 horas, incorporándose en cada ocasión 10 μΙ de PBS fresco al medio de liberación. Posteriormente, con ayuda de la curva de calibrado correspondiente y haciendo las correcciones adecuadas con los correspondientes blancos (medio de liberación de nanopartículas blancas incluidas en hidrogeles), se calculó la concentración de factor en las diferentes muestras. En la Figura 26 podemos ver el perfil de liberación del VEGF _{1 2} 6 de las nanopartículas incorporadas en la formulación F32.

Ejemplo 24. Incorporación de proteínas qlicosiladas naturales a los hidrogeles.

Se preparó una formulación hidrogel similar a la F32 pero utilizando la proteína glicosilada mucina (mucina de estómago porcino tipo III Sigma, Italia) en lugar de la proteína globular albúmina, en igual concentración. Se obtuvo así un hidrogel muy similar en apariencia al hidrogel F32 (Figura 8) pero más translúcido, lo cual se puede asociar a las características de las disoluciones de este tipo de proteínas glicosiladas.

Ejemplo 25. Incorporación de proteínas modificadas a los hidrogeles.

Se sintetizó gelatina succinilada. Para ello se solubilizaron 2 g de gelatina en 16 mi de DMSO anhidro a una temperatura de 37° C. Una vez finalizado el proceso de disolución, se añadieron 9 mi de una disolución de anhídrido succínico (6 mg/ml) en DMSO anhidro. El conjunto se mantuvo a 37° C durante una hora, bajo agitación magnética constante. Transcurrido este tiempo, el polímero fue sometido a diálisis exhaustiva en agua destilada, y a continuación fue liofilizado. La incorporación de grupos succinilo a la gelatina fue comprobada por diferentes métodos (punto isoeléctrico, TBNS, resonancia magnética). Con esta proteína modificada se procedió a la preparación de una formulación de hidrogel similar a la FU, incorporando gelatina succinalada en lugar de gelatina natural, en igual concentración, y se denominó a esta nueva formulación FU'. En las figuras 27 y 28 podemos ver la comparación de los análisis reológicos de tres formulaciones similares, pero que incluyen una proteína diferente en cada caso: albúmina (F16), gelatina (F17) y gelatina succinilada (F17').

Ejemplo 26. Incorporación de compuestos sensibles a fotopolimerización en los hidrogeles.

Se han preparado hidrogeles conteniendo el polímero dextrano-metacrilato (DS-MET) (donado por investigadores de la Sapienza Universitá di Roma), sensible a fotopolimerización en presencia de luz UV. Para ello se prepararon 1 .8 mi de disolución 6 mg/ml de condroitin sulfato en HEPES 20 mM (pH = 7.4) y 1.6 mi de disolución 5 mg/ml de gelano en HEPES 20 mM, a los que se añadieron 200 mg de DS-MET disueltos en 0.6 mi de HEPES 20 mM (pH = 7.4), manteniendo el conjunto a 60° C. Posteriormente se añadieron 0.75 mi de solución 2 mg/ml de espermidina en HEPES 20 mM (pH = 7.4). Tras 20 minutos en nevera el conjunto gelificó. De esta forma se obtuvo un hidrogel que fue sometido a análisis reológico en fresco o bien tras su exposición a luz UV. Además se preparó y analizó reológicamente un hidrogel conteniendo un catalizador de la polimerización, mediante incorporación de 150 μΙ de solución al 20 % p/v del catalizador Irgacure en N-metilpirrolidona.

El análisis reológico de las formulaciones anteriores no permitió determinar grandes diferencias entre ellas. No obstante, una propiedad en la que sí se observó variación de modo cualitativo, fue en la adhesividad, que en los sistemas que incluían DEX-SE se veía aumentada. De estos últimos sistemas se espera por otra parte que tengan un mayor tiempo de biodegradación, lo que podría ser interesante para determinadas aplicaciones.

Ejemplo 27. Hidroqeles que incluyen ácido colomínico.

Se desarrollaron diferentes hidrogeles que incluyen ácido colomínico.

Por un lado, se desarrollaron hidrogeles utilizando gelano y ácido colomínico como componentes negativos del sistema, siendo la espermidina el reticulante del mismo. Para ello, se mezclaron 0.71 mi de disolución de goma gelano en HEPES pH 7.4 20 mM (5 mg/ml) y 0.71 mi de disolución de ácido colomínico en HEPES pH 7.4 20 mM (6 mg/ml), manteniéndose el conjunto en un baño de agua a 60° C bajo agitación magnética constante durante unos segundos, tras los cuales se añadieron 0.43 mi de disolución de espermidina en HEPES pH 7.4 20 mM (2.62 mg/ml). El sistema se dejó 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se mantuvo 20 minutos a 4° C, tiempo tras el cual se completó la gelificación. Se obtuvo así un hidrogel totalmente transparente y de buena consistencia, la cual le permitió, por ejemplo, quedar suspendido en una espátula sin romperse.

También se pudo preparar una formulación parecida en composición a la F32, sustituyendo el condroitin sulfato por ácido colomínico, en igual concentración y volumen. Esta formulación resultó muy similar en apariencia a la F32. La Figura 29 muestra una imagen fotográfica de dicho gel tras su preparación y cortado con una espátula.

Asimismo, se preparó otra formulación similar en composición a la F32 pero en la que que, adicionalmente, se incorporaron 0.43 mi de disolución de ácido colomínico en HEPES pH 7.4 20 mM (6 mg/ml), lo cual dio lugar a una formulación similar en apariencia y consistencia a F32. Ejemplo 28. Liberación simultánea de varios ingredientes activos a partir de los hidroqeles.

Para este ensayo se tomó como ingredientes activos modelo la vitamina B12 y la teofilina (Sigma, España), que se incorporaron a la formulación F32 según lo descrito en el Ejemplo 11, en cantidad de 5 mg cada una, sumando un total de 10 mg de ingredientes activos incorporados a la formulación F32. Una vez formados, los hidrogeles se sometieron a ensayos de liberación en tampón SIF pH = 7.4 (0.05 M), también según lo descrito en el Ejemplo 11. La Figura 30 muestra una comparación de los perfiles de liberación de ambos ingredientes activos modelo incorporados en la misma formulación. Los resultados presentados en dicha figura evidencian la capacidad de dicha formulación de incluir y liberar más de un ingrediente activo al mismo tiempo.

Ejemplo 29. Biodistribución de un agente de contraste paramaqnético para Resonancia Magnética de Imagen (MRI) asociado a los hidroqeles tras su administración tópica e inocuidad de dicha formulación hidroqel.

El presente ejemplo se refiere a la aplicación de los hidrogeles en diagnosis. Para ello se incorporó un agente de contraste paramagnético, la sal trisódica pentahidratada del Gadolinio trietiletertetraminohexaacetato (Sigma, España) a la formulación F32 según lo descrito en el Ejemplo 11, en cantidad de 5 mg. Una vez formado, el hidrogel se tomó la cuarta parte del mismo y se colocó en la región cervical rasurada de un ratón anestesiado (anestesia con gas isofluorano) y monitorizado mediante un sistema de control de signos vitales. Al cabo de 40, 50 y 70 minutos se siguió la evolución del contraste en secciones cervicales del animal a diferentes profundidades, haciendo uso de la técnica fSEMS-MRI (Fast Spin-Echo Multi-Slice-Magnetic Resonance Imaging) con contraste T1 (TR= 500 ms (TR tiempo de repetición entre scans sucesivos), TE= 10 ms (TE duración del eco de espín), tiempo acumulación = 6 min.) para los ROIs seleccionados, en un equipo espectrómetro Agilent Varían VNMRS de 1 1 .7 T (500 MHz frecuencia resonancia protón) y distintos accesorios utilizados para estudios de MRI in vivo. Cada imagen se adquirió con 256 x 256 puntos. Del análisis de las imágenes que muestra la Figura 31 se puede concluir que el agente de contraste (gadolinio), que se ve sin dificultad porque genera una zona más clara en la imagen MRI, penetra hasta las capas internas de la piel del animal, confirmando el potencial de los hidrogeles para la administración de ingredientes por vía tópica en general, y de agentes de contraste en particular. Gracias a la realización de este experimento también se ha podido constatar la inocuidad de la formulación hidrogel estudiada, al comprobarse que la misma no causó ningún tipo de alteración en la piel del ratón durante la realización de experimento, como se aprecia en la Figura 32.

Ejemplo 30. Efecto de la variación de la temperatura sobre la estructura de los hidroqeles.

Para comprobar el posible efecto de variaciones de la temperatura del entorno sobre las características de estas nuevas formulaciones hidrogel se ha procedido al análisis del comportamiento mecánico, en régimen oscilatorio, del hidrogel F32 variando la temperatura del reómetro. Para ello se ha ido aumentando dicha temperatura del reómetro desde los 10 a los 60°C en 30 pasos de 1 minuto, manteniendo constante la frecuencia de oscilación (1 Hz). Así se ha podido comprobar que, para temperaturas que van desde los 10 a los 60° C, los módulos G' y G" del hidrogel no varían, como se puede apreciar en la Figura 33. Por lo tanto, de dichos resultados es posible deducir el interés de los hidrogeles de la presente invención en aplicaciones en las que una variación de temperatura puede modificar las características de hidrogeles convencionales haciéndolos inadecuados o no útiles.

Ejemplo 31. Pruebas de viabilidad celular tras la colonización del hidrogel con fibroblastos. Utilizando las formulaciones F32 y F39 a modo de base se cultivaron en placa fibroblastos W3T3 (medio de cultivo DMEM enriquecido con suero fetal bovino, incubación a 37° C en atmósfera de 5% de C0 ₂ y 95% de aire). Tras 48 horas de incubación se retiró el medio de cultivo, determinándose la viabilidad de las células incluidas en dichos hidrogeles. Para ello se añadió al hidrogel incluyendo fibroblastos 3 ml_ de calceína disuelta en medio de cultivo (concentración de calceína 100 mM). Tras 20 minutos de incubación se observó al microscopio de fluorescencia el hidrogel incluyendo fibroblastos. El efecto de la calceína sobre las células permite comprobar la viabilidad celular, habida cuenta de que únicamente cuando las células permanecen vivas internalizan la calceína y son capaces de metabolizarla, dando lugar a un compuesto fluorescente. De este modo, de la observación de puntos fluorescentes en el miscroscopio de fluorescencia es posible deducir la viabilidad celular. En la Figura 34 se observa la imagen en microscopio de fluorescencia del gel F32 sin células incluidas y el gel colonizado con fibroblastos, observándose en esta última imagen los puntos de fluorescencia que demuestran la viabilidad celular. Resultados similres se obtuvieron en el caso del gel F39.