L'invention a pour objet des solutions salines.

Elle vise également leur procédé de préparation et les médicaments à base de ces solutions.

On connaît déjà des solutions salines et leur mise en oeuvre en tant que médicaments.

On peut citer à cet égard le sérum physiologique et les solutions d'eau de mer isotonique ; ces produits sont utilisés entre autres pour le lavage des plaies, des yeux et fosses nasales obstruées par des sécrétions muqueuses ou mucopurulentes.

La Société Demanderesse a mis au point de nouvelles solutions salines.

Ces nouvelles solutions salines sont caractérisées par le fait qu'elles sont hypoosmotiques et qu'elles présentent : - un pH de 7,0 à 8, 30, - une résistivité de 52 à 370 Q et de préférence de 57 à 85 S2, - une densité de 1,002 à 1,008, - une teneur en matière sèche de 0, 5% à 1%, - une osmolarité comprise entre 100 mOs et 305 mOs/kg (milliosmoles/kg), de préférence entre 140 et 240 mOs/kg, et - une constitution chimique dont les principaux éléments résultent du tableau I ci-après : TABLEAU I Sodium (Na) de 600 à 2000 mg/1 Potassium (K) de6à40mg/l Chlorures (Cl) de 2000 à 5800 mg/1 Calcium (Ca) de 200 à 300 mg/1 Magnésium (Mg) de 1000 à 1200 mg/1 Sulfates (S04) de 2000 à 3000 mg/1

L'invention vise également l'utilisation en tant que médicament des solutions salines conformes à l'invention.

Elle a donc pour objet les médicaments ou compositions pharmaceutiques caractérisés par le fait qu'ils sont à base des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention.

Plus particulièrement, l'invention a pour objet l'utilisation des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention pour l'obtention d'un médicament destiné à un traitement propre à la prévention et à la limitation de la libération dans l'organisme des médiateurs chimiques responsables du déclenchement des phénomènes inflammatoires des muqueuses en général et plus particulièrement des muqueuses des voies respiratoires, notamment nasales et bronchiques, des muqueuses buccales, vaginales, intestinales et anales.

Il a été trouvé que les médiateurs chimiques en question sont libérés sous l'influence d'agents pro- inflammatoires qui, dans le cas notamment des voies respiratoires et buccales, font partie du groupe comprenant les substances d'origine bactérienne, les virus, bactéries, pollens et autres éléments irritants et allergisants transportés par l'air respiré.

L'invention a également pour objet l'utilisation des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention pour l'obtention de médicaments destinés au traitement céruménolytique du conduit auditif externe, autrement dit à un traitement de dissolution des bouchons de cérumen.

L'invention a encore pour objet : - un médicament à base d'une solution saline hypoosmotique selon l'invention, propre à prévenir et à limiter la libération, sous l'influence des substances d'origine bactérienne, des virus, bactéries, pollens et autres éléments irritants et allergisants transportés par l'air respiré, des médiateurs chimiques responsables du déclenchement des phénomènes inflammatoires des muqueuses en

général et plus particulièrement des muqueuses des voies respiratoires, notamment nasales et bronchiques, des muqueuses buccales, vaginales, intestinales et anales, et - un médicament céruménolytique à base d'une solution saline hypoosmotique selon l'invention.

Pour préparer les solutions hypoosmotiques, conformes à l'invention, on peut procéder comme indiqué ci-après.

On utilise comme matière première une eau de mer prélevée de préférence par une profondeur de 5 à 10 mètres dans une zone à forts mouvements de courant, et caractérisée par une teneur en sels supérieure à 32 g/l.

Cette eau est analysée, décantée puis rapidement : désodée par la technique d'électrodialyse jusqu'à ce que l'osmolarité soit amenée à une valeur comprise entre 100 et 305 mOs/kg, filtrée, stockée dans des conditions stériles, notamment en cuve en acier inoxydable.

Elle est de nouveau analysée à ce stade pour vérifier : sa stérilité, "son osmolarité.

Enfin, elle peut être conditionnée de façon stérile dans un local spécialement traité en atmosphère contrôlée.

Les travaux qui ont permis d'illustrer certains aspects de l'invention comportent des expériences relatives à la capacité des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention à prévenir et à limiter la libération des médiateurs chimiques responsables du déclenchement des phénomènes inflammatoires des muqueuses des voies respiratoires ; ces expériences montrent la supériorité des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention par rapport à trois produits de référence bien connus, à savoir le sérum physiologique, le tampon PBS et les eaux de mer isotoniques.

Cette supériorité se traduit tant par une toxicité

plus faible que par une activité améliorée du point de vue des effets recherchés.

Les toxicités respectives des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention, du sérum physiologique, du tampon PBS et de l'eau de mer isotonique ont été définies par le biais d'une étude comparative portant sur la viabilité des cellules respiratoires humaines, c'est- à-dire des cellules que l'on rencontre dans les muqueuses respiratoires, en présence des solutions hypoosmotiques d'une part et des trois produits de référence d'autre part.

Pour faire cette étude, on a utilisé des cellules épithéliales glandulaires respiratoires humaines issues de prélèvements bronchiques.

On a ensemencé ces cellules épithéliales respiratoires à la même densité cellulaire dans des plaques de culture de 12 puits.

On les a cultivées pendant 48 heures dans un milieu de culture DMEM/F12 supplémenté d'une part avec 2% d'un nutriment constitué par le produit commercialisé sous la marque ULTROSER G et d'autre part avec une dose d'antibiotiques suffisante pour éviter la contamination bactérienne ; on obtient ainsi des cultures en monocouche homogènes et confluentes, soit 310 000 cellules par puits de culture après 48 heures de culture.

Au moment où la confluence est atteinte, les cellules sont lavées avec une solution physiologique (PBS/Ca2+, pH 7,4) et mises en présence d'une part de huit solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention et d'autre part des trois produits de référence constitués par le sérum physiologique, le tampon PBS et l'eau de mer isotonique désignée par K ; on a également utilisé le susdit milieu de culture cellulaire de référence connu sous la désignation DMEM/F12.

Les huit solutions hypoosmotiques testées sont caractérisées respectivement par des résistivités égales à 57,30 Q, 64,93 Q, 74,34 S2, 84,90 S2, 107 Q, 134,40 S2,

192,30 Q et 361 Q et désignées respectivement par les lettres J, I, H, G F, E, D et C.

Les principaux éléments constitutifs des solutions hypoosmotiques G, H, I et J apparaissent dans le tableau II ci-après.

TABLEAU II Constituants Unités G H I J Sodium (Na) mg/l 600 765 1130 1370 Potassium (K) m/1 6, 9 11, 2 20, 8 27, 4 Chlorures (Cl)mg/12556293037974248 Calcium (Ca) mg/l 265 290 310 330 Magnésium (Mg) mg/l 1100 1130 1200 1200 Sulfates (SO4) mg/l 2570 2570 2570 2600 A l'issue de plusieurs périodes d'incubation, c'est- à-dire de contact cellulaire, à savoir 16 heures et 24 heures, on a évalué la viabilité cellulaire en présence des milieux dont il vient d'être question.

Cette viabilité cellulaire est exprimée par le pourcentage de cellules viables à la fin de chaque période d'incubation dans les solutions salines hypoosmotiques selon l'invention, dans le sérum physiologique, dans le tampon PBS et dans le milieu K, par rapport au nombre de cellules viables dans le milieu de culture DMEM/F12 servant de milieu de référence.

Elle a été évaluée à l'aide du test d'exclusion dit au bleu de Trypan, en solution à 0, 4%, suivi d'un comptage cellulaire avec une cellule de Malassez.

Conformément au test en question, on détache les cellules du support de culture en utilisant de la trypsine ; les cellules vivantes sont ensuite comptées dans une solution aqueuse à 0, 4% de bleu de Trypan ; en effet, le bleu de Trypan est un colorant cellulaire qui ne pénètre pas à l'intérieur d'une cellule vivante, seules les cellules non viables laissant entrer le bleu de Trypan.

Le nombre de cellules vivantes dans le milieu de culture DMEM/F12 étant par définition rapporté à 100, il est possible d'exprimer la viabilité cellulaire dans les autres milieux, en pourcentage par rapport audit milieu de culture.

Les résultats enregistrés sont réunis dans les figures 1 et 2 qui montrent respectivement les résultats enregistrés après 16 heures et 24 heures de contact, à savoir le pourcentage de cellules vivantes après contact avec chacune des solutions hypoosmotiques conformes à l'invention et chacun des produits de référence, étant rappelé que la viabilité dans le milieu de culture DMEM/FI2 est de 100%.

Les pourcentages en question sont également réunis dans le tableau III : TABLEAU III Pourcentage de cellules viables Sérum DME physio- C D E F G H I J K M logique PBS 16 heures 57 60 64 80 94 91 95 82 79 100 72 66 24 heures 29 43 44 45 60 62 70 62 59 100 49 0 L'examen des figures 1 et 2 et des valeurs réunies dans le tableau III montre que les solutions salines hypoosmotiques préférentielles conformes à l'invention sont les solutions G, H, I et J qui, sur des périodes d'incubations de 16 et 24 heures, permettent une meilleure viabilité cellulaire que les produits de référence.

Pour la mise en évidence de la capacité des solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention, à prévenir et à limiter la libération, sous l'influence des agents pro- inflammatoires comprenant les substances d'origine bactérienne, les virus, les bactéries et tous autres éléments irritants et allergisants transportés par l'air respiré, des médiateurs chimiques responsables du déclenchement des phénomènes inflammatoires des muqueuses des voies respiratoires humaines, on soumet des cultures cellulaires

provenant des muqueuses en question à un ensemble d'expériences comprenant une étape de mise en présence avec des agents pro-inflammatoires et une étape d'incubation des cultures cellulaires ainsi traitées dans un milieu de contrôle, dans des milieux de référence et dans les solutions hypoosmotiques selon l'invention.

Il a plus particulièrement été montré que, sous l'action de certains agents pro-inflammatoires d'origine bactérienne, tels que par exemple le lipopolysaccharide de P. aeruginosa ou LPS, sérôtype 10, utilisé à la concentration de 1 g/ml, les cellules épithéliales, glandulaires, respiratoires humaines libèrent des médiateurs chimiques tels que l'interleukine-8, qui déclenchent les phénomènes inflammatoires.

Et la Société Demanderesse a trouvé que, de façon surprenante et inattendue, une très forte prévention et limitation de la libération des médiateurs chimiques, en l'occurrence l'interleukine-8, est obtenue lorsqu'après une stimulation par des agents pro-inflammatoires, on incube les cultures cellulaires concernées dans les solutions salines hypoosmotiques utilisées selon l'invention.

Les susdites expériences ont été effectuées sur des cultures de cellules sécrétoires glandulaires isolées de la sous-muqueuse bronchique humaine.

Les cellules en question sont cultivées dans un milieu constitué, par exemple, par celui connu sous la désignation RPMI 1640 ; ce milieu est additionné de 2% de milieu ULTROSER G ; lorsque les cultures ont atteint une confluence de 90%, on introduit l'agent pro-inflammatoire identifié plus haut, puis on élimine le milieu de culture.

Après lavage des cellules ainsi traitées, on les réincube : - dans le même milieu de culture RPMI 1640 seul qui joue le rôle de milieu de contrôle, - dans le sérum physiologique (milieu de référence), - dans 1'eau de mer isotonique (milieu de référence),

- dans les solutions salines hypoosmotiques selon l'invention identifiées plus haut et désignées par H, I et J.

La production d'interleukine-8 par les cellules épithéliales glandulaires est estimée par la méthode de dosage ELISA (en utilisant le kit de dosage vendu sous la marque MEDGENIX DIAGNOSTIC, Belgique) après une période de temps de contact d'une heure dans les surnageants des milieux identifiés ci-dessus.

Les résultats enregistrés d'une part pour les trois solutions hypoosmotiques H, I et J conformes à l'invention et d'autre part pour le milieu de culture DMEM/F12, ainsi que pour les milieux de référence, à savoir le sérum physiologique et l'eau de mer isotonique, sont : - de 282 pg/ml/heure dans le cas du milieu DMEM/F12, - de 76 pg/ml/heure dans le cas du sérum physiologique, - de 42 pg/ml/heure dans le cas d'eau de mer isotonique, - de 29 pg/ml/heure dans le cas de la solution J, - de 16 pg/ml/heure dans le cas de la solution I, et - de 7 pg/ml/heure dans le cas de la solution H.

Ces résultats montrent la supériorité des solutions conformes à l'invention du point de vue de leur capacité à prévenir et à limiter la libération sous l'influence des agents pro-inflammatoires des médiateurs chimiques responsables du déclenchement des phénomènes inflammatoires des muqueuses.

Il a été possible de confirmer ces résultats par des expériences réalisées sur la culture d'une lignée cellulaire de l'épithelium respiratoire de surface (ligne respiratoire 16-HBE).

Dans la pratique, et dans le cadre de leur utilisation pour l'obtention des médicaments dont il vient d'être question, les solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention peuvent être administrées sous forme d'aérosols ou de nébulisats ou par instillation sous forme de gouttes.

I1 s'agit de compositions pharmaceutiques ou médicaments destinés au traitement prévenant et limitant la libération des médiateurs chimiques responsables du déclenchement des phénomènes inflammatoires des muqueuses des voies respiratoires humaines survenant dans les affections rhinopharyngées et pulmonaires.

Les solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention peuvent être présentées sous la forme d'aérosols pour administration nasale et buccale à action locale exerçant son effet sur les muqueuses des voies respiratoires humaines, notamment au niveau des fosses nasales et des bronches.

La posologie habituelle peut être de 2 bouffées espacées d'une trentaine de secondes, répétées deux à trois fois par jour en inhalation buccale selon l'état et l'âge du patient.

Dans le cas d'une inhalation nasale, elle est habituellement d'une à deux bouffées dans chaque narine 3 à 4 fois par jour selon l'état et l'âge du patient.

On peut également envisager d'utiliser telles quelles les solutions hypoosmotiques conformes à l'invention en vue de prévenir et de limiter la libération des médiateurs chimiques responsables du déclenchement des phénomènes inflammatoires dans le cas des muqueuses buccales, vaginales, intestinales et anales.

La posologie sera adaptée en fonction du type d'affection traitée.

Dans le cadre de leur utilisation pour l'obtention de médicaments pour le traitement céruménolytique du conduit auditif externe, s'agissant alors de médicaments céruménolytiques, les solutions salines hypoosmotiques conformes à l'invention, peuvent être appliquées par pulvérisation ou par instillation sous forme de gouttes dans le conduit auditif externe de l'oreille.

En présence de bouchons de cérumen, on peut

avantageusement les appliquer à raison de deux pulvérisations ou instillations quotidiennes pendant une période 3 à 4 jours.

A titre d'hygiène régulière, on peut les appliquer avantageusement deux à trois fois par semaine, et plus dans le cas des porteurs de prothèses auditives, afin de favoriser le bon fonctionnement de l'appareil.