Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно - к микологии и может быть использовано для лечения кандидозов.

Кандидоз (кандидамикоз) — инфекционное заболевание кожи, слизистых оболочек и внутренних органов, вызываемое патогенными грибами из рода Сапdidа. Возбудителем заболевания наиболее часто является Сапdidа аlbiсапs. Кандидоз кожи проявляется в виде подострых дерматитов в складках кожи, изредка с образованием абсцессов. При кандидозе слизистых оболочек обнаруживаются поверхностные, легко отходящие беловато-жёлтые плёнки. Кандидоз внутренних органов (висцеральный кандидамикоз) может быть изолированным (желудочно-кишечный тракт, органы дыхания, мочеполовая система) и генерализованным с единичными или множественными метастазами во внутренних органах, нервной системе, мышцах, костях.

Предшествующий уровень техники Известна композиция для лечения микозов у млекопитающих, в частности человека, инфицированного грибком из группы Сапdidа аlbiсапs (см. заявку РФ JSГs 98 105635 по Кл. МПК А 61K31/505, опуб. 27.01.2000г.). Композиция содержит состав замедленного высвобождения ингибитора синтеза хитина, представляющего собой никомицин или его производные. Состав замедленного высвобождения может содержать различные компоненты. В одном из вариантов он содержит лецитин, этиловый спирт, диметилсульфоксид, кукурузный крахмал, физиологический раствор. В другом варианте состав содержит ланолин, хлопковое масло,

"TWEEN" 4O ₅ стеариновую кислоту, гидроксиметилцеллюлозу, карбопол и физиологический раствор. При этом, композицию вводят либо непрерывно внутривенно, либо перорально, либо подкожно.

Данная противогрибковая композиция является химическим препаратом, вызывающим ряд побочных эффектов. В частности, возможно его аллергизирующее, токсическое воздействие ввиду непереносимости больными некоторых реагентов, входящих в состав препарата. Кроме этого, препарат не решает задачи освобождения организма больного от возбудителя. Известно средство против кандидоза, включающее убитую культуру Сапdidа аlbiсапs (см. заявка РФ Na 97105400 по кл. МПК A61K39/116, опуб. 10.04.99г.). Средство предназначено для предотвращения вагинальных инфекций путём введения его в пищеварительный тракт. Средство получают путем смешивания убитого микроорганизма с фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем, разбавителем и/или другим вспомогательным веществом.

Однако, данное средство готовится из микроорганизмов, выделенных непосредственно от больных и применяется на них же. Такое средство не обладает стабильными антигенными свойствами и не может быть постоянно в наличии в лечебном учреждении.

Известно также лекарственное средство против кожного и висцерального кандидозов млекопитающих (человека и животных) для инъекций (см. Патент РФ Na2219945 по Кл. МПК A61K39/00, oпyб.27.12.2003), содержащее гомогенизированные инактивированные микроконидии дерматофитов и инактивированные дрожжевые бластоспоры или их антигенный материал. При этом, дрожжевые бластоспоры принадлежат к штаммам Сапdidа аlbiсапs HБM-9456 и/или Сапdidа аlbiсапs HБM-9457 и/или Сапdidа аlbiсапs

HБM-9458 и/или Сапdidа аlbiсапs HБM-9459. Препарат может содержать или не содержать адьювант и вещество с иммуномодулирующей активностью. Содержание спор составляет 10- 90 миллионов спор на мл. (l-10 ⁷ -9-l О ⁷ спор/мл). Однако, в данном препарате присутствуют бластоспоры и микроконидии, т.е. карпу скулярный антиген, эффективность которого незначительна. Кроме этого, наличие спор приводит к аллергизации организма человека.

Наиболее близким к заявляемому является лекарственное средство против кандидоза человека (см. Еffесtivепеss оf а vассiпе соmроsеd оf hеаt-killеd Сапdidа аlbiсапs апd а поvеl muсоsаl аdjuvапt, LT (Rl 92G), аgаiпst sуstеmiс сапdidiаsis./Саrdепаs-Frеуtаg L; Сhепg E; Мауеuх P; Dоmеr JE; Сlеmепts JD// Iпfесt. Irшпuп. 1999 Fеb. 67(2):826- 33), содержащее термоубитую цитоплазматическую фракцию гриба из штамма С. аlbiсапs и адьювант, в качестве которого используют детоксинированную форму термолабильного энтеротоксина Е.соli.

Недостатком такого средства является его низкая иммуногенность Напряженность иммунитета колеблется в пределах 1- 10 ⁴ - 1-Ю ⁵ спор/мл при контрольном внутривенном заражении возбудителем кандидоза. Кроме того, использование в качестве адьюванта термолабильного энтеротоксина, являющегося прежде всего антигеном Е.соli, вызывает вынужденное образование в организме дополнительно и антител к возбудителю колибактериоза. Данное обстоятельство отрицательно влияет на органы и системы иммунитета. Недостатком средства является и то, что образование специфических противокандидозных антител происходит только после искусственного заражения, а не после профилактической иммунизации данным препаратом. При этом, средство вводят интраназально.

Раскрытие изобретения

Изобретение направлено на решение задачи создания эффективного и безопасного лекарственного средства для инъекций против кандидоза человека, которое обладает высокоиммуногенными и низкореактогенными свойствами за счёт наличия в нём большого количества макромолекулярных полипептидов, низкого содержания липидов и высокого уровня полисахаридов.

Для решения поставленной задачи в лекарственном средстве против кандидоза человека, содержащем активную часть в виде инактивированной цитоплазматической фракции гриба из штамма

Сапdidа аlbiсапs и растворитель, согласно изобретению, активная часть представляет собой клеточные стенки и цитоплазму гриба со сроком культивирования 28-36 часов штамма Сапdidа аlbiсапs N°253 с концентрацией клеток гриба 1,85-10 ⁸ - 2,5-10 ⁸ в 1 см ³ дистиллированной воды, индексом иммуногенности 6-9% и содержанием липидов - до 0,2%, полисахаридов - 50 - 76%, пептидов с м.м > 10 Кд - 80 - 87%, средство содержит в качестве инактиватора

- формалин, а в качестве растворителя - дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов (мac.%): Активная часть в виде клеточных стенок и цитоплазмы гриба из штамма Сапdidа аlbiсапs N°253 с концентрацией спор 1,85-10 - 2,5-10 в 1 см ³ дистиллированной воды - 2,0 - 2,7 Формалин - 0,1-0,15

Дистиллированная вода - остальное.

В известных авторам источниках патентной и научно- технической литературы не описано эффективного и безопасного лекарственного средства для инъекций против кандидоза человека,

содержащего в качестве активной части - клеточные стенки и цитоплазму гриба со сроком культивирования 28 — 36 часов штамма Сапdidа аlbiсапs N° 253 с концентрацией клеток гриба 1,85- 10 ⁸ - 2,5-10 ⁸ в 1 см ³ дистиллированной воды, индексом иммуногенности 6 - 9% и определённым содержанием липидов, углеводов и полипептидов. При этом, большое количество макромолекулярных полипептидов (до 87%), низкое содержание липидов (до 0,2%) и высокий уровень полисахаридов (до 76%) позволяют считать заявляемый препарат высокоиммуногенным и обладающим низкой реактогенностью, способствующей освобождению организма человека от возбудителя.

Процентное соотношение компонентов, указанных в формуле изобретения, было подобрано экспериментальным путём.

Штамм Сапdidа аlbiсапs Ne 253, предназначенный для изготовления данного препарата, депонирован во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов

(ВГНКИ) (Справка о депонировании штамма от 12.10.01г. прилагается). На штамм получен патент РФ на изобретение N° 2209243.

Штамм Сапdidа аlbiсапs Ne 253 характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки. Овальные (2:1) или почти круглые клетки с хорошо заметными вакуолями с небольшими ядрами.

Культуральные признаки. На агаре Сабуро через 48 часов культивирования при температуре 28° С образуются выпуклые белые колонии с небольшим кремовым оттенком сметанообразной консистенции с гладкой блестящей поверхностью и ровными краями.

На 5 сутки культивирования поверхность колонии гладкая, матовая, с кремовым оттенком, края слегка волнистые.

При культивировании на жидких питательных средах через 48 часов при 28° С заметно помутнение бульона и образование компактного осадка.

Ферментативные свойства. Ферментативная активность проявляется на полужидкой среде Гисса: с глюкозой - образованием кислоты и газа; с мальтозой - также кислоты и газа; с сахарозой - только кислоты; с лактозой активность не проявляется. Активность штамма - начало спорообразования на 2 сутки культивирования.

Антигенные свойства. Антигены штамма - комплекс специфических белков, полисахаридов и липидов.

Лучший вариант осуществления изобретения Способ изготовления лекарственного средства против кандидоза человека заключается в следующем.

1. Выращивают культуру штамма Сапdidа аlbiсапs N° 253. Для этого штамм Сапdidа аlbiсапs N° 253 засевают в пробирки с агаром Сабуро и культивируют в термостате при 28° С в течение 3 суток.

2.Bыpocшyю культуру смывают стерильным физиологическим раствором, и отбирают ту, у которой урожайность спор составляет 4,7-10 - 5,2-10 в 1 см физиологического раствора.

3. Высевают полученную культуру в бактериологические матрасы с питательной средой, содержащей (мac.%): глюкозу 4 -5; пептон 0,95 - 1,05; агар 3,5 - 3,6; сыворотку крови крупного рогатого скота 9 - 11; солевой раствор Хенкса - остальное.

4. Проводят её культивирование в термостате при 28° С в течение 28 - 36 часов. Полученные клетки гриба смывают

стерильной дистиллированной водой и доводят их концентрацию в 1 см ³ дистиллированной воды до 1.85-10 ⁸ - 2,5-10 ⁸ .

При этом, концентрацию спор (по п.l) и клеток гриба (по п.З) определяют путём подсчета в камере Горяева с использованием фазоконтрастного устройства.

5. Осуществляют выделение цитоплазматической фракции из этих клеток в виде клеточных стенок и цитоплазмы.

Для этого используют метод разрушения клеточных мембран микроорганизмов с помощью ультразвукового дезинтегратора «Solana» (Еrlап iпdustriеs). Воздействие дезинтегратором осуществляют в течение 60 минут. Освобождение от разрушенных и не разрушенных клеток проводят методом фильтрации через мембрану «Bлaдипop» МФА - MA JsfeЗ при помощи вакуум-насоса. Полученный фильтрат представляет собой растворимый комплекс белково-полисахаридных антигенов.

6. Осуществляют оценку свойств полученной цитоплазматической фракции по индексу агломерации лейкоцитов и содержанию липидов, полисахаридов и пептидов.

7. Выбирают те фракции, индекс агломерации лейкоцитов которых составляет 6 - 9%, содержание липидов - до 0,2%, полисахаридов - 50 - 76%, пептидов с м.м. > 10 Кд - 80 - 87%.

Для выявления фракций с индексом агломерации лейкоцитов 6 - 9% берут пробу фильтрата, разводят её физиологическим раствором в соотношении 1:5. В пробирки вносят по 0,04 мл полученной смеси и туда же добавляют по 0,02 мл комплемента морской свинки. Смесь выдерживают 30 минут при 37° С, затем вносят по 0,2 мл цитратной крови кролика-донора. При этом контролем являются пробирки с антигеном с изотоническим раствором хлорида натрия вместо комплемента и стабилизированной

кровью кролика. Другим контролем служат пробирки со стабилизированной кровью кролика, комплементом морской свинки и изотоническим раствором хлорида натрия вместо антигена. Содержимое пробирок встряхивают и инкубируют при 37° С в течение 45 минут.

Смесь из пробирок наносят на предметные стекла и делают мазки, которые подсушивают и затем фиксируют метиловым спиртом в течение 20 минут. Окраску мазков проводят 0,1% раствором метиленовой сини в течение 5 минут. Окрашенные мазки просматривают под микроскопом при увеличении x450. Для анализа выбирают 100 лейкоцитов и выявляют среди них число агломерированных (склеенных не менее 3-х). При наличии склеенных (агломерированных) лейкоцитов от 6 до 9% от общего числа лейкоцитов - 100 фракцию считают наиболее иммуногенной.

Биохимический состав цитоплазматической фракции грибов определяли с предварительным концентрированием проб в 100 раз с осаждением ацетоном. Содержание белка устанавливали по методу Бредфорда, с денатурированием в однократном буфере, содержащем I M трис, рН 6,8; 10% SDS, 8M мочевины; 0,1% меркаптоэтанола; 5% глицерина бромфенолового синего, с последующим кипячением в течение 5 минут. Белковый электрофорез поводили в 12,5% ПААГ по методу Lаеmli на аппарате ЕС 120 Мiпi Vеrtiсаl GeI Sуstеm (США). Использовали маркеры с м.м 225, 150, 100, 75, 50, 35, 25, 15, 10 кД. Пробы загружали в трёх концентрациях: по 40, 20 и 10 мкл на лунку. Электрофорез проводили при напряжении 120 В, силе тока 50 мА и толщине геля - 0,75 мм, с экспозицией 1 час. Содержание азота определяли с ТХУ и 3% фосфорно-молибденовой кислотой. Липиды и их кислотный состав определяли согласно «Meтoдaм δ

биохимического исследования растению). Определение растворимых и легкогидролизуемых углеводов проводили согласно ГОСТ 26176-91 по методу Бертрана.

8. Осуществляют инактивирование отобранных фракций с использованием раствора формалина 36,5 - 37,5 % -ной концентрации в количестве 0,1 - 0,15% от общего объема препарата.

Проверку лекарственного средства на стерильность и безвредность проводят общепринятыми методами, а оценку иммуногенных свойств препарата - на лабораторных животных. Для оценки иммуногенных свойств препарата его вводят внутримышечно двукратно с интервалом 7 -10 дней в дозе: мышам - по 0,5 мл, морским свинкам — по 3 мл и кроликам — по 5 мл.. Напряженный иммунитет наступает через 14 дней после последнего введения препарата. Способ лечения кандидоза человека заключается в следующем.

Препарат вводят внутримышечно двукратно в дозе 5 мл с интервалом 7 - 10 дней. При необходимости, проводят два курса лечения. Возможно и трёхкратное введение препарата - через 7 дней после первого введения и через 14 дней после второго. Пример 1.

Больная А., 19 лет, болеет кандидозным вульвовагинитом. Заболевание было диагностировано три года назад. Лечение традиционными препаратами не давало результатов.

Проведено два курса лечения: 1 курс - внутримышечное введение препарата в дозе 5 мл двукратно с интервалом 7 дней. 2 курс - спустя две недели после первого курса, при этом повторное двукратное введение препарата осуществляли с интервалом 7 дней между инъекциями.

В результате лечения клинические признаки заболевания отсутствовали, улучшилось общее состояние больной. Микроскопические исследования свидетельствовали об отсутствии возбудителя. Пример 2.

Больная Б., 48 лет, диагноз — кандидозный вульвовагинит. Болеет более 7 лет. Проведено 2 курса лечения по схеме, указанной в примере 1.

Спустя 30 дней по завершении 2 курса лечения проявления кандидоза полностью исчезли.

Подобно описанному в примере 1, проводилось лечение ещё 5- ти больных с аналогичным диагнозом. Результаты лечения положительные.

Пример 3. Больная В., 54 года. Диагноз - дрожжевой стоматит.

Проведено трехкратное введение препарата в дозе 5 мл: в 1-й, 7-й и на 21-й день после первого введения.

Через 3 месяца наступило полное выздоровление. Отсутствовали клинические признаки заболевания и характерные поражения ротовой полости.

Пример 4.

Больной Г., 40 лет. Диагноз - кандидозный баланит. Заболевание диагностировано два года назад. Лечение традиционными препаратами не давало результатов. Проведено два курса лечения:

1 курс - внутримышечное введение препарата в дозе 5 мл двукратно с интервалом 7 дней; 2 курс - спустя две недели после первого курса повторное двукратное введение препарата с интервалом 7 дней между инъекциями.

В результате лечения улучшилось общее состояние больного. Клинические признаки заболевания отсутствовали.

Таким образом, заявляемое лекарственное средство эффективно, безопасно, даёт положительный результат уже через 30 дней после начала лечения.