Die Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung von Antigenen aus Nematoden in einer im wesentlichen reinen Form, die immunologisch mit protektiven Antiseren reagieren, sowie ein Verfahren zur Gewinnung dieser Antigene Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Antigene zur Entwicklung neuer Anthelmintika und Vakzine

Parasitare Nematoden, die lymphatische Gefäße und Gewebe von Mensch und Tier befallen können, verursachen chronische Erkrankungen Humane pathogene Nematodenspezies kommen in tropischen Regionen vor, wo es nach Schätzungen der WHO mehr als 100 Mio infizierte Menschen gibt Nematodenerkrankungen bei landwirtschaftlichen Nutztieren und Haustieren kommen auf der gesamten Welt vor und verursachen hohe wirtschaftliche Schaden und Kosten

Handelsübliche Anthelmintika sind in der Lage, befallene Menschen und Tiere von ihren parasitären Nematoden zu kurieren, vorausgesetzt, die Nematoden haben noch keine Resistenz gegen diese Mittel entwickelt Bei prophylaktischer Gabe wurde die Entwicklung von Resistenzen bereits beobachtet Es besteht daher kein großes Bedürfnis nach der Entwicklung neuer Anthelmintika, die nicht resistenzbrechend sind

Auch eine passive protektive Immunitat durch Verabreichung von Antikörpern gegen Oberflächenstrukturen von Nematoden kann nicht ohne weiteres erreicht werden

So existieren mehrere Veroffentlichungen, in denen Mißerfolge bei der Verwen¬ dung monoklonaler Antikörper oder polyklonaler Antiseren zur passiven Immunisierung gegen Filaπeninfektionen beschrieben sind (Abraham et al (1988) J Parasitol 74 275 - 282, Vickery et al (1983) J Parasitol 69 478 - 485 sowie Tanner und Weiss (1979) Tropenmedizin und Parasitologie, 30 371 - 375) beschneben sind Eine passive Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern kann sogar zur Erhöhung der Parasitenlast fuhren (Janecharut et al (1991) Parasitology Research, 77 668 - 674)

Eisenbeiss et al (J. Immunol. 152 (1994), 735-742) beschreiben, daß die wiederholte Gabe einer geringen Anzahl von Larven der parasitären Filarie A. viteae bei Wüstenrennmäusen (M. unguiculatus) eine signifikante Verringerung in der gesamten Wurmbelastung hervorruft. Diese partielle protektive Immunität scheint mit Antigenen gekoppelt zu sein, die von den post-infektiösen Larven im

L3/L4-Häutungsstadium sekretiert werden. Bei inaktivierten Larven im L3-Stadium oder lebenden Larven im L4-Stadium wurde keine derartige Wirkung festgestellt.

Aus immunisierten Wirtstieren kann ein protektives Antiserum isoliert werden, das gegen antigene Substanzen gerichtet ist, die während der Häutung zwischen dem L3- und dem L4-Stadium sekretiert werden. Diese Sekretion findet jedoch nur während eines sehr kurzen Zeitraums und in sehr geringen Mengen statt, so daß eine Isolierung der Antigene in einer reinen Form nicht möglich ist.

Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, daß die Häutungsantigene, die während des Übergangs vom L3- zum L4-Stadium sekretiert werden, in einer wesentlich größeren Menge von in vitro kultivierten Nematodenlarven im L4-

Stadium produziert werden. Die Menge der auf diese Weise erzeugten Antigene ist so groß, daß eine Isolierung mit Hilfe üblicher Techniken ohne weiteres möglich ist. Weiterhin wurde überraschend festgestellt, daß die auf diese Weise isolierten Antigene in ihren immunologischen Eigenschaften nicht spezies-spezifisch sind, sondern daß eine speziesübergreifende Kreuzreaktion zwischen verschiedenen

Antiseren und verschiedenen Nematodenspezies gefunden wird.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit isolierte Antigene aus Nematoden in einer im wesentlichen reinen Form, die immunologisch mit einem protektiven Antiserum reagieren, das gegen Nematodenlarven im Stadium der Häutung von L3 zu L4 gerichtet ist, wobei die Antigene durch in vitro-

Kultivierung von Nematodenlarven im L4-Stadium und Gewinnung aus dem Kulturüberstand erhältlich sind.

Die Angabe "protektives Antiserum" im Sinne der vorliegenden Anmeldung be¬ deutet, daß das Serum aus Tieren gewonnen wird, deren Immunsystem aufgrund einer entsprechenden Vorimmunisierung eine Neuinfektion vollständig eliminieren kann.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß immunologisch mit protektiven Antiseren reagierende Antigene aus einer Vielzahl von Nematodenspezies, ins¬ besondere aus Filarienspezies, isoliert werden können, z B aus freilebenden Nematodenspezies, wie Caenorhabditis elegans, oder parasitären Nematoden, wie etwa Acanthocheilonema viteae, Monanema martini, Dirofϊlaria immitis,

Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Loa loa, Onchocerca volvulus, Onchocerca ochengi, Dracunculus medinensis, Litomosoides sigmodontis, Haemonchus contortus, Trichinella spiralis oder Trichuris muris, stammen

Protektive Antiseren sind erhältlich aus Wirtstieren, die einer Primarinfektion mit lebenden Nematodenlarven vor dem L3/L4-Hautungsstadium ausgesetzt werden, und die bei einer zweiten Belastungsinfektion mit Nematodenlarven der gleichen Spezies oder einer unterschiedlichen Spezies, deren Entwicklung mindestens teilweise hemmen Vorzugsweise können protektive Antiseren aus der Wusten- rennmaus M unguiculatus, der afrikanischen Streifenmaus Lemniscomys striatus oder anderen naturlichen Wirten von Nematoden gewonnen werden Zur Primar¬ infektion wird vorzugsweise eine wiederholte Gabe einer genngen Anzahl von Nematodenlarven eingesetzt, wobei der Abstand der Larvenverabreichung und die Larvenanzahl je nach Nematodenspezies variieren können Bei der Immunisierung von M unguiculatus können beispielsweise lebende infektiöse L3-Larven der Nematodenspezies A viteae 3 mal im Abstand von jeweils 3 Tagen und in einer

Anzahl von 5-10 Larven verabreicht werden, um eine gute Immunisierung zu erzielen

Weiterhin können protektive Antiseren auch durch Voπmmunisierung mit lebenden L4 A vitaea Larven, mit lebenden in vitro kultivierten L3/L4 bzw L4 A vitaea Larven, mit lebenden in vitro kultivierten "exsheathed" L3 H contortus

Larven umd mit lebenden in vitro kultivierten L3 (80 % Lethargus) C elegans Larven erhalten werden

Mit dem auf diese Weise gewonnenen protektiven Antiserum können nicht nur Antigene der zur Immunisierung verwendeten Nematodenspezies, sondern auch Antigene anderer Nematodenspezies nachgewiesen und isoliert werden

So zeigt beispielsweise ein aus dem naturlichen Wirt der Filaπe A viteae, der Wustenmaus Meriones unguiculatus, gewonnenes protektives Antiserum eine immunologische Kreuzreaktivitat gegen Antigene aus den Nematodenspezies M

martini, L. sigmodontis, D. immitis, H. contortus und sogar der freilebenden Nematodenspezies C. elegans.

Die erfindungsgemäßen Antigene sind vorzugsweise Polypeptide, die gegebenen¬ falls glykolysiert sein können. Es werden unterschiedliche Antigene sekretiert, die nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt und in isolierter Form gewonnen werden können. Die Menge der gewonnenen Antigene reicht ohne weiteres für eine Teilbestimmung der Aminosäuresequenz aus. Auf Basis dieser Information können dann mittels rekombinanter DNA-Techniken auch DNA-Moleküle isoliert werden, die für die jeweiligen Antigene kodieren. Nach Isolierung der kodierenden DNA- Sequenzen können die erfindungsgemäßen Antigene auch durch rekombinante

Methoden in geeigneten Wirtszellen, z.B. Bakterien, Hefen oder Insektenzell- kulturlinien, oder mit transgenen C. elegans produziert werden.

Bevorzugte Antigene sind Antigene, die aus A. viteae erhältlich sind und Molekulargewichte von etwa 4, 14, 18, 25, 29-30, 40, 44, 52, 56, 60, 66 oder 68 kD nach Siebgelchromatographie aufweisen, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene. Weiterhin bevorzugt sind Antigene, die aus A viteae erhältlich sind und Molekulargewichte von etwa 17, 40, 52, 56, 60, 63, 67, 90, 94, 1 16, 180, 212, 400 oder 800 kD nach SDS-PAGE aufweisen, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene. Immunologisch kreuzreagierende Antigene konnten beispielsweise schon in D. immitis, M. martini, L. sigmodontis,

H. contortus oder C. elegans nachgewiesen werden

Ebenfalls bevorzugt sind Antigene, die aus C elegans erhältlich sind und Molekulargewichte von etwa 14, 16, 26, 28, 30, 46, 49, 58 und 66 kD nach Siebgelchromatographie aufweisen, oder Antigene, die aus C. elegans erhältlich sind und Molekulargewichte von 46, 60, 97, 109, 212 oder 400 kD nach SDS-

PAGE aufweisen, oder damit immunologisch kreuzreagierende Antigene. Immunologisch kreuzreagierende Antigene konnten beispielsweise schon in A. vitaea nachgewiesen werden.

Besonders bevorzugt sind Antigene, die ein Molekulargewicht von ca. 60 kD und

(a) eine N-terminale Aminosäuresequenz

Xaa-Thr-(Val, Leu)-Lys-Glu- (Glu, Leu)-Ile-Ala-(Phe, Val)-Leu-

(Phe, Leu)-Xaa-Leu-Leu-Gly- wobei Xaa eine beliebige Aminosäure bedeutet, oder

(b) eine zur Sequenz aus (a) zu mindestens 80 % und insbesondere mindestens 90 % homologe N-terminale Aminosäuresequenz auf- weisen.

Diese Antigene können eine Serin/Threonin-Proteinkinase-Aktivität aufweisen.

Im Zusammenhang mit den obengenannten Molekulargewichten mit der erfin¬ dungsgemäßen Antigene ist anzumerken, daß die Zahlenwerte nur ungefähre Werte sind und daher als Zahlenbereich von + 10 % und vorzugsweise + 5 % djes jeweils angegebenen Werts zu verstehen sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Ge¬ winnung von Antigenen aus Nematoden, die immunologisch mit einem protektiven Antiserum reagieren, das gegen Nematodenlarven im Stadium der Häutung von L3 zu L4 gerichtet sind, wobei man Larven von Nematoden im L4-Stadium in vitro kultiviert, den Kulturüberstand abtrennt und die Antigene aus dem Kultur¬ überstand isoliert. Vorzugsweise umfaßt die Isolierung einen Siebgelchromato¬ graphieschritt. Weiterhin ist die Verwendung von A. viteae-Larven im Stadium 13 Tage post infectionen bevorzugt. Bei anderen Organismen lassen sich geeignete Larvenstadien, in denen die Produktion der erfindungsgemäßen Antigene stattfin- det, auf einfache Weise durch Bestimmung der immunologischen Aktivität aus

Überständen von in vitro kultivierten Larven ermitteln.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine pharma¬ zeutische Zusammensetzung, die ein oder mehrere der zuvor genannten Antigene als Wirkstoff sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Zusatz-, Träger- und Hilfsstoffe umfaßt. Die Antigene oder eine diese enthaltende pharmazeutische

Zusammensetzung kann zu Diagnostik, Prävention und Therapie von Nematoden- infektionen verwendet werden. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Immunisierung gegen eine Nematodeninfektion, bei dem man ein oder mehrere der zuvor genannten Antigene in pharmazeutisch verträglicher Form verabreicht. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise in einer parenteralen oder oralen Formulierung in einer Dosis zwischen 0,5 und 250 mg/kg, besonders

bevorzugt zwischen 10 und 100 mg/kg an 1 bis 4 aufeinanderfolgenden Tagen. Besonders bevorzugt ist eine einmalige Verabreichung.

Weiterhin wurde überraschenderweise festgestellt, daß eine Verabreichung von attenuierten Larven parasitärer Nematoden im L4-Stadium, vorzugsweise von mindestens 2 Tage in vitro kultivierten Nematodenlarven, zu einer sterilen

Immunität führt. Die attenuierten Larven können sich nach der in vitro- Kultivierung im Körper nicht mehr weiterentwickeln, führen aber zu einem wirksamen Schutz gegen nachfolgende Infektionen mit Nematoden. Auf diese Weise wird erstmals eine sterile Immunität gegen Filarienlarven erreicht. Die Erfindung betrifft somit auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die attenuierte Larven parasitärer Nematoden im L4-Stadium als Wirkstoff sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Zusatz-, Hilfs- und Trägerstoffe enthalt.

Die attenuierten Larven sowie eine diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung können zur Prävention und Therapie von Nematodeninfektionen eingesetzt werden, gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren der zuvor genannten Antigene.

Weiterhin soll die Anmeldung durch die folgenden Beispiele erläutert werden.

Beispiel 1

Gewinnung von protektiven Antiseren aus Meriones unguiculatus

Wustenrennmause (M unguiculatus) wurden einer primären Infektion durch subkutane Verabreichung von jeweils 10 - 20 lebenden infektiösen Larven von A viteae im Abstand von jeweils drei Tagen unterzogen Die Serumentnahme erfolgte 25 Tage nach der Erstinfektion

ln den infizierten Tieren wurden protektive Antikörper gebildet, die einen Schutz gegen nachfolgende Sekundarinfektionen mit A viteae-Larven verliehen Diese Prozedur ist detailliert bei Eisenbeiss et al (J Immunol 152 (1994), , 735-742) beschrieben Auf analoge Weise konnten protektive Antiseren auch durch

Verwendung von lebenden L4-Larven sowie von in vitro kultivierten L3/L4- und L4-Larven von A viteae erhalten werden

Auch durch 3 subkutane Infektionen mit je 1000 lebenden "exsheathed" H contortus L3 + 6 + 7 Larven ("exsheathed" L3 werden für 6 Tage in vitro kultiviert, das Medium verworfen und in fnschem Medium für weitere 7 Tage inkubiert) in Abstanden von jeweils 3 Tagen und Entnahme des Serums 25 Tage nach der Erstinfektion konnten protektive Antiseren aus M unguiculatus gewonnen werden

Weiterhin konnten durch 3 subkutane Infektionen mit je 1000 lebenden C elegans L3 80 % Lethargus + 3 Stunden (L3-Larven-populatιonen, die sich zu 80 % in der

Lethargusphase vor ihrer Häutung zu L4 befinden, werden für 3 h in vitro kultiviert) in Abstanden von jeweils 14 Tagen und Entnahme des Serums 46 Tage nach der Erstinfektion protektive Antiseren aus M unguiculatus gewonnen werden

Die auf diese Weise gewonnenen Antiseren erkennen Nematodenantigene, die wahrend des Hautungsstadiums von L3 zu L4 sekreüert werden

Beispiel 2

In vitro-Kultivierung von Nematodenlarven

Die Isolierung von A viteae-Larven aus M unguiculatus erfolgte wie bei Eisenbeiss, J Parasitol 77 (1991) 580-586, beschrieben Hierzu wurden die Korper von infizierten und anschließend getöteten Wüstenrennmäusen in

RPMI1640-Medium gegeben und zerkleinert Die Larven wurden aus den Gewebefraktionen isoliert und in RPMI aufbewahrt

Es wurden Larven in unterschiedlichen Reifestadien isoliert und zwar Larven im L3 -Stadium (0-6 Tage p i ), Larven im Hautungsstadium von L3 zu L4 (6-7 Tage p i ) und Larven im L4-Stadium (mehr als 8 Tage p I )

Die in vitro-Kultivierung der Larven erfolgte in einer Konzentration von 500-1000 Larven/ml Kulturmedium RPMI 1640 bei 37°C und 5% CO ₂

Beispiel 3

Gewinnung von Antigenen aus dem Überstand von Kulturmedien

Im überstand des Kulturmediums von 13 Tage alten Larven (L4-Stadιum) konnten überraschenderweise Antigene in hoher Ausbeute nachgewiesen werden und zwar bei einer Kultivierungsdauer von 0-2, 2-4, 4-6 und 6-8 Tagen

1 1 bzw 17 Tage alte Larven im L4-Stadιum zeigten hingegen keinerlei Sekretion von Antigenen 14 Tage alte L4-Larven und 6-7 Tage alte mL3 -Larven zeigten eine schwache Sekretion von Antigenen in Mengen, die für eine Isolierung zu gering waren

Der Nachweis der Antigene erfolgte durch einen ELISA wie folgt Mikro- titerplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit 100 μl Rohkulturmedium von 1000 Larven/ml über Nacht bei 4°C inkubiert Dabei wurden drei verschiedene Verdünnungen des Rohkulturmediums, namiich 1 10, 1 100 und 1 1000 in

Elutionspuffer (0,1 M K-Phosphatpuffer pH 7,0), eingesetzt Alle Vertiefungen wurden mit 150 μl 3% Rinderserumalbumin (RSA), 10% Milchpulver und 0,05% Tween 20 in Elutionspuffer blockiert Als erster Antikörper wurde protektives anti-

mL3-Antiserum aus M. unguiculatus, dessen Gewinnung in Beispiel 1 beschrieben ist, 1 :400 verdünnt, in Elutionspuffer mit 1% RSA und 0,05% Tween 20 eingesetzt. Als zweiter Antikörper diente Kaninchen-Anti-M. unguiculatus- Immunglobulin IgG, 1 : 1500 verdünnt, und als dritter Antikörper ein Konjugat von Peroxidase und Anti-Kaninchen IgG aus Ziege, 1:2000 verdünnt. Zwischen den

Antikörperzugaben wurde jeweils dreimal mit 100 μl Elutionspuffer + 0,05% Tween 20 gewaschen. Zuletzt wurde als Chromogen o-Phenylendiamin (0,4 mg/ml in 200 mM Phosphatpuffer pH 5,0) und 0,05% H ₂ O ₂ zugegeben und die Farbreaktion nach einer Minute mit 10 μl 11 M H ₂ S0 ₄ gestoppt.

Bei diesen Testbedingungen konnten immunreaktive Antigene bereits bei einer Verdünnung des Rohkulturmediums von 1 : 100 nachgewiesen werden.

Beispiel 4

Gewinnung der sekretierten Antigene

Aus den gesammelten Kulturüberständen von in vitro kultivierten Larven konnten über eine FPLC-Gelfiltrationsmethode insgesamt 12 Fraktionen aufgetrennt werden. Davon waren sieben Fraktionen von besonderem Interesse, weil sie entweder dominant auftraten und/oder als Antigen von Antikörpern aus dem Serum von zu 100% immun geschützten Tieren erkannt wurden. Die Auftrennung erfolgte über eine Superdex 75 HR 10/30 Gelfiltrationssäule in 0,5 ml Fraktionen. Eluiert wurde mit einem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0. Die immunologisch relevanten Fraktionen wurden mittels ELISA mit Seren aus geschützten Tieren bestimmt.

Es waren immunologisch reaktive Komponenten mit 68 kD, 66 kD, 60 kD, 56 kD, 52 kD, 44 kD, 40 kD, 29-30 kD, 25 kD, 18 kD, 14 kD und < 4 kD zu erkennen Am stärksten waren die Peaks für die Komponenten mit Molekulargewichten

< 4 kD und 60 kD. Ein zur Kontrolle für die FPLC-Säule isoliertes Kulturmedium war frei von Proteinkomponenten.

Beispiel 5

Aufbereitung von Proteinproben für die Aminosaureanalyse

Proteine in den in Beispiel 4 gewonnenen FPLC-Fraktionen wurden über SDS- PAGE in Banden konzentriert und anschließend elektrophoretisch auf eine Tragermembran transferiert

Vorexperimente mit Proben aus rohen (unfraktionierten) Kulturuberstanden von 13 Tage alten L4-Larven ergaben 14 Proteinbanden mit einer Molekulargewichtsver¬ teilung im Bereich von 800, 400, 212, 180, 1 16, 94, 90, 67, 63, 60, 56, 52, 40 und 17 kD

Die resultierenden Proteinbanden wurden auf eine Nitrocellulose-membran mit

0,1 μm Porengroße elektrophoretisch transfenert Eine anschließende "Western- Analyse" mit protektivem M unguiculatus-Antiserum, Kaninchen-Anti-M unguiculatus Immunglobulin IgG und Peroxidase-markiertem Anti-Kaninchen IgG sowie einem geeigneten Chromophor lieferte die immunologisch relevanten Proteinbanden

Proteinhaltige FPLC-Fraktionen wurden anschließend für die Pröteinsequenz- analyse ausgewählt Die einzelnen Fraktionen enthielten ca 7 pmol Protein in 400 μl Elutionspuffer

Die ausgewählten Fraktionen wurden mit einer Absaugvorπchtung, mit der große Auftragsvolumina durch kleine Membranflachen gefiltert werden können, in konzentrierter Form auf PVDF -Membranen transferiert Die Filter wurden in Wasser gewaschen und in Argonatmosphare bis zur Proteinsequenzierung aufbewahrt

Eine Sequenzierung des Antigens ergab folgende n-terminale Aminosaureteil- sequenz

Xaa-Thr-(Val, Leu)-Lys-Glu-(Glu, Leu)-Ile-Ala-(Phe, Val)-Leu-(Phe, Leu)-Xaa-

Leu-Leu-Gly- wobei Xaa eine beliebige Aminosäure bedeutet

Der identifizierte Sequenzbereich beginnt nicht mit einem Methionin, obwohl das native Protein N-terminal ansequenziert wurde. Folglich besaß das Protein vermutlich ursprünglich eine Leadersequenz.

Beispiel 6

Immunisierungsexperimente

Überstände des Kulturmediums von 13 Tage alten L4-Larven (800 μl Überstand von 48 Larven als Immunisierungsdosen) zeigten einen wirksamen Schutz von M. unguiculatus gegen nachfolgende Belastungsinfektionen.

Immunisierungsdosen von 36-48 in vitro kultivierten Larven pro Inokulation ergaben einen Schutz gegen eine nachfolgende Belastungsinfektion von 80-100%. Interessanterweise überlebten keine der mindestens zwei Tage in vitro kultivierten L4-Larven im Wirt. Hierbei handelt es sich um eine "sterile Immunität", die erstmals gegen eine Filariose beobachtet wurde.

Beispiel 7

Identifizierung immunreaktiver Komponenten in anderen Nematoden

7.1. Wustenrennmause (M. unguiculatus) wurden mit jeweils 15-20 mL3-Larven der Nematodenspezies Monanema martini und Litomosoides sigmodontis immunisiert. Diese Immunisierung ergab signifikanten Schutz gegen nach¬ folgende Belastungsinfektionen mit A. viteae.

Gleichermaßen ergab eine Immunisierung von afrikanischen Streifenmäusen

(Lemniscomys striatus) mit mL3-Larven von A. viteae einen signifikanten Schutz gegen nachfolgende Belastungsinfektionen mit M. martini.

Die den vorimmunisierten Tieren bei der Belastungsinfektion verabreichten Larven wurden völlig inaktiviert oder in ihrer Entwicklung stark behindert. Die Reaktion der Wirtstiere gegen heterologe Spezies war sogar noch stärker als gegen homologe Spezies.

7.2 Auf analoge Weise konnte bei einer primären Infektion von M unguiculatus mit den Nematodenspezies Haemonchus contortus und Dirofilaria immitis Schutz gegen eine nachfolgende Belastungsinfektion mit A viteae erzielt werden

7 3 Auch mit freilebenden Nematoden, wie Caenorhabditis elegans kann eine

Kreuzimmunisierung gegen A viteae in der Wüstenrennmaus M unguiculatus erzielt werden Hierzu wurden C elegans Larven im L3/L4- Stadium (L3/S0% Letharguslarven), die vorzugsweise zuvor 1,5 bis 3 Std in vitro inkubiert worden waren, zur Immunisierung von M. unguiculatus gegen eine nachfolgende Infektion von A viteae eingesetzt Eine

Verbesserung des Immunschutzes wurde durch eine Verlängerung der Zeiträume zwischen den Immunisierungsdosen, z B Verabreichung an den Tagen 0,30 und 73, erzielt

Beispiel 8

Immunologischer Nachweis von Antigenen aus anderen Nematodenspezies

8.1 Seren von M unguiculatus, die mit mL3-Larven der Nematodenspezies M martini, L sigmodontis und H contortus immunisiert worden waren und geringe Ruckfindungsraten von A viteae nach einer Belastungsinfektion aufwiesen, zei gten i m ELISA (B ei spi el 3 ) hohe sp ezifi sch e Kreuzreaktivitaten gegen Antigene aus A viteae Vergleichbar mit dem als

Positivkontrolle verwendeten homologen Antiserum reagierten sowohl das Anti-L sigmodontis-Serum sowie das Anti-C elegans-Serum Auch die Anti-M martini und Anti H contortus-Seren erkannten Antigene im Kulturmedium von 13 Tage alten L4-A viteae-Larven

8.2 Von hautenden L3-Larven der Nematodenspezies C elegans (L3 80 %

Lethargus + 1,5 bzw 3 Stunden in vitro Kultivierung) sekretierte Antigene wurden von protektiven Antiseren erkannt, die aus M unguiculatus gewonnen wurden, die zuvor mit A viteae, M martini und L sigmodontis immunisiert wurden

Eine Western-Blot- Analyse der C elegans- Antigene ergab Banden von ca

46 kD, 60 kD, 97 kD, 109 kD, 212 kD und

400 kD (SDS-PAGE). Das 60 kD-Antigen wird von adulten C. elegans-Würmern sowie von häutenden C. elegans L3-Larven exprimiert. Auch die anderen Antigene werden von adulten C. elegans- Würmern sowie von mL3-Larven exprimiert und sind immunologisch kreuzreagierend mit entsprechenden Antigenen, die von 13 Tage alten L4- A. viteae-Larven exprimiert werden. Weiterhin konnten durch siebgel- chromatographische Analyse der Kulturüberstände Antigene mit Mole¬ kulargewichten von ca. 14, 16, 26, 28, 30, 46, 49, 58 und 66 kD identifiziert werden.