Es ist bekannt, dass sich Tetraetheriipide mit ihrer natürlichen Kopfgruppenstruktur nicht zur kovalenten Anbindung an Materialoberflächen eignen, sondern erst durch gezielte Aktivierung ihrer Kopfgruppen eine Lipidierung von Materialoberflächen unter bestimmten Bedingungen möglich ist. So beschreibt beispielsweise DE 102 28 857 A1 Tetraetheriipide mit kleinen Kopfgruppen, die zur kovalenten Anbindung an bestimmte Oberflächen geeignet sein sollen. Bei den Tetraetherlipiden dieses Dokumentes handelt es sich chemisch um Derivate des Caldarchaeols. Caldarchaeol ist das Hydrolyseprodukt des Hauptphospholipids aus dem Archaebakterium Thermoplasma acidophilum. Auch DE 10 2004 033 667 AI beschreibt das Tetraetherlipid Caldarchaeol zur Anbindung an Materialoberflächen, wobei diese Lipidierung in organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Chloroform und Methanol durchgeführt wird (vgl. Seite 5-6, [0028] - [0031 ].

Eine Lipidierung unter Benutzung organischer Lösungsmittel ist jedoch für eine breite industrielle Anwendung keine Option. Es hat sich gezeigt, dass im wässrigen Milieu mit Caldarchaeol und auch mit diaktiviertem Caldarchaeol keine Vesikel herstellbar waren und so Caldarchaeol für eine Lipidierung im wässrigen Medium nicht geeignet ist. Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, gut handhabbare Tetraetherlipid- basierte Biosensorchips für Chip-basierte Analysenverfahren bereitzustellen. Daneben soll die zugrunde liegende Immobilisierungsmatrix mittels Lipidierung von Materialoberflächen im wässrigen Milieu durch Selbst-Assemblierung herstellbar sein. Die hergestellten Lipidschichten der Matrix sollen stabil sein und eine effiziente Ankopplung von Liganden, vorzugsweise Proteinen, ermöglichen. Die so hergestellten Biochips sollen hohe Sensitivitäten und geringe Anteile unspezifischer Bindungen aufweisen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird gemäß den unabhängigen Ansprüchen 1 , 5, 1 1 und 14 gelöst. Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausführungsformen dar. Gläser, z. B. Borsilikatgläser (z. B. Borofloat ®33, Schott Jena AG, Deutschland) oder Gläser mit schichtweisem Aufbau aus Borofloat® 33-Glas, Tantal(V)-oxid und SiOx (BIAffinity-Chips, LOS Jenoptik, Jena, Deutschland) eingesetzt. Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird die Immobilisierungsmatrix durch Inkontaktbringen des festen Substrats, das eine zumindest teilweise aminierte

Oberfläche oder eine Gold-, Silber- oder Kupferoberfläche aufweist, mit einer wässrigen Suspension unilameilarer Lipidvesikel des Tetraetherlipids der allgemeinen Formel I hergestellt. Das Inkontaktbringen erfolgt vorzugsweise für 2 bis 15 Stunden, besonders bevorzugt 9 bis 15 Stunden, bei Umgebungstemperatur. Gemäß der Erfindung werden unter„Umgebungstemperatur" 15 - 29°C verstanden, vorzugsweise 18 - 25°C. Die Konzentration der wässrigen Suspension unilameilarer Vesikel beträgt vorzugsweise von 1 bis 10 mg/ml, besonders bevorzugt von 2 bis 4 mg/ml.

Erfindungsgemäß wird die so hefgestellte Immobilisierungsmatrix anschließend getempert. Das Tempern kann beispielsweise bei 80 bis 80 °C für ein bis drei Stunden vorgenommen werden, vorzugsweise bei 70 °C für zwei Stunden. Die wässrige Suspension der unilamellaren Vesikel des Tetraetherlipids der allgemeinen Formel I wird durch mehrmalige Extrusion, vorzugsweise 1 1 - 21 malige Extrusion einer wässrigen Suspension multilamellarer Lipidvesikel dieses Tetraetherlipids durch eine Polycarbonatmembran mit gewünschter und definierter Porengröße hergestellt. Die Porengröße beträgt vorzugsweise zwischen 100 bis 1000 nm. Besonders bevorzugt wird eine Polycarbonatmembran von 100 nm eingesetzt, so dass Lipidvesikel mit einem definierten hydrodynamischen Durchmesser von 100 nm hergestellt werden können.

Stabilitätstests der erfindungsgemäß hergestellten unilamellaren Vesikel des Tetraetherlipids der Formel I zeigten eine außerordentliche Lagerstabilität über einen Zeitraum von mindestens einer Woche. Dis Herstellung der wässrigen Suspension der muftiiamellaren Lipidvesikel des

Tetraetherlipids der aligemeinen Formel 1 erfolgt durch Hydratation eines evaporierten Lipidfilms und anschließende Behandung im Ultraschallbad. Die Behandlung im Ultraschallbad kann bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 50 und 70 °C, insbesondere bei ca. 60 °C und bevorzugt für einen Zeitraum zwischen 10 und 20 Minuten, vorzugweise für 15 Minuten erfolgen. Die finale Lipidkonzentration der wässrigen Suspension beträgt vorzugsweise 1 bis 10 mg/ml, besonders bevorzugt 2 bis 4 mg/ml. Gemäß der Erfindung muss außer der Gold-, Silber- oder Kupferoberfläche die eingesetzte Oberfläche des festen Substrats zumindest teilweise aminiert sein, um die zuverlässige Anfeindung des Cyanurchloridrestes über die Aminogruppe zu gewährleisten. Verfahren zur Aminierung von Oberflächen sind bekannt. Die Aminierung der Oberfläche kann beispielsweise durch eine Plasmaaktivierung erreicht werden oder durch Inkubation mit einem aminofunktionellen Silan. Vorzugsweise kann ein Aminoalkylsilan angewendet werden, besonders bevorzugt kommen 3-Aminopropyldimethylethoxysilan, 3-Aminopropyltrimethoxysilan oder 3- Aminopropyltriethoxysilan in Frage. Neben der mit dem Verfahren der Erfindung herstellbaren Immobilisierungsmatrix ist auch die Verwendung der Immobilisierungsmatrix des Anspruchs 1 und ihrer bevorzugten Ausführungsformen zur Herstellung eines Biosensorchips Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Als Biosensorchips werden im Sinne der Erfindung Trägermaterialien bezeichnet, die die erfindungsgemäße Immobilisierungsmatrix umfassen, an welche Liganden, beispielsweise Proteine, gebunden sind. Die Liganden sind in der Lage an bestimmte Zielmoleküle (Targets) zu binden und die Zielmoleküle können auf diese Weise detektiert und/oder beeinflusst werden, so dass biochemische Nachweise oder markierungsfreie optische biomolekulare Interaktionsanalysen (RlfS, SPR) ermöglicht werden. Insbesondere sind die Biosensorchips der vorliegenden Erfindung für die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) geeignet. Gegenüber den PEG- und Dextran-Trägern, die in der Oberflächenpiasmonenresonanzspektroskopie (SPR-Spektroskopie) verwendet werden, haben die Biochips der vorliegenden Erfindung den Vorteil, dass sie lager- und säurestabil sind, nicht quellen und somit keine Equilibierungszeit benötigen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung des Biosensorchips ein Ligand, vorzugsweise ein Protein, der über mindestens eine freie NH ₂ -Gruppe verfügt, kovalent, gegebenenfalls über Spacer, an den Cyanurchlorid-, Thiol- oder 1 ,2-Dithiolan-3-yl-Rest der monomolekularen Tetraetherlipidschicht der Immobilisierungsmatrix gebunden. Vorzugsweise wird dazu die Immobilisierungmatrix mit einer Pufferlösung des Liganden inkubiert. Das kann beispielsweise so durchgeführt werden, dass ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom, vorzugsweise für 20 bis 40 Minuten _» besonders bevorzugt 25 Minuten, über die Lipidmatrix geleitet wird. Die Flussrate sollte dabei im Bereich von 5 μΙ/min bis 10 μΙ/min betragen. Vorzugsweise kann dazu eine BIAffinity ®-Flusszeiie (Analytik Jena AG, Deutschland) zur Anwendung kommen. Als Liganden können erfindungsgemäß bevorzugt Proteine angebunden werden. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt werden als Liganden Streptavidin, C- reaktives Protein, Protein G, Protein A, His-Tag oder GFP-Bindeprotein (GBP) gebunden und damit die entsprechenden Proteinchips hergestellt. Erfindungsgemäß können nach Anbindung der Liganden die unspezifischen Bindungsstellen sehr gut mit BSA geblockt werden. Vorzugsweise wird eine BSA- Lösung mit einer Konzentration von 80 - 100 pg/ml BSA im jeweils verwendeten Puffer, der zur Anbindung der Liganden verwendet wurde (insbesondere PBS oder Acetat-Puffer) eingesetzt.

Es hat sich gezeigt, dass die Biosensorchips der vorliegenden Erfindung hoch sensitiv sind und geringe Anteile unspezifischer Bindungsereignisse zeigen. Nachfolgend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.

Ausführungsbeispiele

Alle Chemikalien wurden, sofern nicht anders angeben, bei Sigma Aid rieh, Taufkirchen, Deutschland, gekauft und ohne weitere Aufreinigung verwendet.

Beispiel 1 : Isolierung des Main Phospholipids (MPL) aus der Archaeentrockenmasse von Sulfolobus acidocaldarius und Aktivierung der Lipidkopfgruppen mit Cyanurchlorid

15 g lyophilisierte Trockenmasse wurden mit 400 mi einer Chloroform/Methanol 1 :1 Extraktionslösung per Soxhlet-Extraktion innerhalb von 24 Stunden extrahiert. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung (Eluent: Benzinether/Chloroform 5/1) wurden 143,5 ± 8,5 mg SuffolobusMPL erhalten.

Die terminalen Hydroxylgruppen des MPLs wurden mit Cyanurchlorid aktiviert. Hierfür wurde das Lipid in Chloroform gelöst und NaHC0 ₃ (1 ,5 g pro 100 mg Lipid) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde unter Rückfluss gerührt. Anschließend wurden 5 eq. Cyanurchlorid hinzugeben und eine Woche unter Rückfluss erhitzt. Der Verlauf der Reaktion wurde per Dünnschichtchromatographie verfolgt, wobei R _f - Werte (Laufmittel: Petroiether/Diethylether/Eisessig 5/5/0,1) von 0,67 ± 0,0173 für das reine MPL und 0,75 ± 0,0824 für das aktivierte MPL gefunden wurden. Nach dem Abkühlen des Reaktiongemisches wurde es filtriert und das Produkt per Säulenchromatographie (Silicagel 60, Eluent: Benzinether/Chloroform 5/1) aufgereinigt. Das Produkt zeigte eine honigartige Konsistenz und Farbe. Zur komplementären chemischen Charakterisierung wurde für das aktivierte MPL folgendes FT-IR-Spektrum aufgenommen:

FT-IR-Spektrum des Sulfolobus MPL im We!lenzahlbereich zwischen 4000 und 800 cm ^"1 Die prominenten Schwingungsbanden sind in dem IR-Spektrum eindeutig vertreten und charakterisierten das isolierte Molekül als das Sulfolobus MPL:

3400 cm ^"1 (O-H), 2920 cm ^"1 , 2870 cm ^"1 (CH ₃ , CH ₂ ), 2780 cm ^"1 (Fermi-Resonanz C=0), 1700 cm ^"1 (C=0), 1460 cm ^"1 , 1400 cm ^"1 (CHA**). 1250 cm ^"1 , 1217 cm ^"1 (OH), 1066 cm ^"1 (C-O), 1012 cm ^"1 (P-O-Alkyl), 926 cm ^"1 (P-O)

Beispiel 2: Liposomenherstellung

Es wurde eine definierte Masse des Lipids in Chloroform/Methanol gelöst, in einen Einhalsrundkolben überführt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der entstandene Lipidfilm wurde nun mit dem entsprechenden Volumen deion. Wasser hydratisiert um eine finale Lipidkonzentration von c = 2 mg/ml einzustellen. Die wässrige Liposomensuspension wurde im Ultraschallbad 15 min bei 60°C behandelt, wobei sich multilamellare Vesikel bilden, die eine breite Größenverteilung aufweisen (siehe Abbildung unten). Mit einem Liposomenextruder wurde die Suspension 21 mal durch eine Polycarbonatmembran mit definierter Porengröße 100 nm extrudiert und die jeweiligen Liposomensuspensionen vor und nach Extrusion per Dynamischer Lichtstreuexperimente analysiert:

10 100 1000

Hydrodynamischer Durchmesr -

Hydrodynamische Durchmesser von diaktivierten Sulfolobus MPL Liposomen vor (rechte Kurve) und nach (linke Kurve) der Extrusion In obiger Abbildung sind die hydrodynamischen Durchmesser der Vesikel des diaktivierten Sulfolobus MPLs dargestellt und es wird deutlich, dass sich mit diesem Lipid Vesikel mit definierten Durchmessern von 100 nm herstellen lassen.

Beispiel 3; Aminierung von Glasoberflächen und Liposomenspreitung Zur Aminierung wurden die Glassubstrate (Borofloat ^® 33 oder BIAffinity-Chips) in einer speziell angefertigten PTFE-Kammer positioniert. In einem Becherglas wurde eine Chloroformlösung mit 1 Vol.% Aminopropyldimethyfethoxysilan (APDMES) hergestellt. Die Kammer wurde vollständig mit der Silaniösung befüllt und mit einem Deckel verschlossen. Die Kammer wurde über Nacht bei 60°C in einem Trockenofen inkubiert. Danach wurde die Kammer aus dem Ofen genommen und nach dem Abkühlen wurden die Substrate aus der Kammer entfernt und für jeweils 10 min im Ultraschallbad nacheinander in Chloroform, Methanol und Wasser gespült. Die auf diese Weise silanisierten Glassubstrate wiesen Wasserkontaktwinkel von Θ =60° auf. Zur Lipidierung der mit APDMES aminosilanisierten Glasoberflächen wurden die Glassubstrate in einer frisch extrudierten Sulfolobus MPL Liposomensuspension (siehe Beispiel 2) über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss daran wurden die Substrate nochmals zwei Stunden bei 70°C gelagert bevor sie im Ultraschallbad in Chloroform gereinigt wurden. Die auf diese Art und Weise hergestellten Lipidsubstrate wiesen Wasserkontaktwinkel von Θ « 75° auf.

Beispiel 4: Chipherstellung und Funktionalitätsprüfung mittels RlfS Alle RifS-Analysen wurden mit einem BIAffinity System (Analytik Jena AG, Jena, Deutschland) durchgeführt. Bei der Funktionalitätsprüfung erfolgte die Detektion der komplementären Analyten mittels RrfS, wobei das Verhältnis Unspezifität/Spezifität quantifiziert wurde. Zudem wurden die Chipmodifikationen im Hinblick auf Regenerierbarkeit getestet und die Zyklenstabilität der bindungsaktiven Oberfläche geprüft. Schließlich wurden die kinetischen Parameter, wie die Dissoziationskonstante K _D ermittelt und mit den Literaturwerten verglichen.

Die Liganden (Fängermoleküle) Streptavidin (Biomol, Hamburg, Deutschland), GFP- Bindeprotein (Chromotek, München, Deutschland), Protein G und C-reaktives Protein (CRP) wurden in der Flusszelle (Dimension 6 mm x 1 mm x 125 μιη) innerhalb des BIAffinity Systems auf den lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 immobilisiert. Alle Puffer für die Immobilisierungen und Messungen wurden entgast und filtriert.

4.1 Streptavidin-Chip Zur Immobilisierung von Streptavidin auf den lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 wurden 200 μΙ einer Streptavidinlösung in PBS 7.4 mit c=500 nM und einer Flussrate von 10 μΐ/min injiziert.

Bei der Funktionalitätsprüfung wurden als komplementäre Analyten ein Anti- Streptavidin Antikörper und eine biotinylierte HRP (horseradish peroxidase) mittels RlfS detektiert. Die Unspezifität lag bei kleiner 20%, der Chip war für das System Streptavid in/Anti-Strepta vid i n Antikörper regenerierbar und die Dissoziationskonstante KD stimmte mit den Literaturwerten überein.

10 μΙ/min injiziert.

Bei der Funktionalitätsprüfung wurde als komplementärer Analyt ein Anti-CRP Antikörper mittels RIfS detektiert. Die Unspezifität lag bei kleiner 30%, der Chip war regenerierbar und die Dissoziationskonstante K _D stimmte mit den Literaturwerten überein. 4.3 Protein G-Chip

Zur Immobilisierung des Protein G auf lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 wurden 200 μΙ einer Protein G-Lösung in PBS 7.4 mit c=500 nM und einer Flussrate von 10 μΙ/min injiziert. Bei der Funktionalitätsprüfung wurden als komplementäre Analyten ein Änti-GST und ein Anti-CRP Antikörper mittels RIfS detektiert. Die zwei Antikörper konnten gerichtet über die Fc-Region immobilisiert werden und jeweils konnten die finalen Analyten GST bzw. CRP nachgewiesen werden. Die Unspezifität AntiCRP/CRP lag bei kleiner 5%, AntiGST/GST bei ca. 10%. Der Chip war regenerierbar und die Dissoziationskonstante K _D stimmte mit den Literaturwerten überein

4.4 GFP-Bindeprotein (GBP)-Chip

Zur Immobilisierung des GBPs auf lipidierten Glastransducern des Beispiels 3 wurden 200 μΙ einer GBP-Lösung in Acetatpuffer 5.5 mit c=500 nM und einer Flussrate von 10 μΙ/min injiziert.

Bei der Funktionalitätsprüfung konnte als komplementärer Analyt GFP mittels RifS detektiert werden. Der Chip war regenerierbar.