Etat de la technique La production de lignées cellulaires immortalisées dérivées de tissus cutanés humains a été décrite antérieurement. En général, les procédés utilisés à cette fin recourent à la transformation de cellules cutanées humaines, par exemple de kératinocytes et de mélanocytes, cultivées in vitro avec des agents qui confèrent la propriété d'immortalisation. L'immortalisation concerne la production de cellules qui peuvent tre cultivées pendant des temps prolongés in vitro, théoriquement indéfiniment. Ces cellules sont également désignées sous le nom de lignées cellulaires continues. A l'opposé, les cellules non-immortalisées sont seulement capables de se multiplier pendant un nombre défini de divisions cellulaires in vitro.

Les cellules immortalisées sont extrmement avantageuses car elles fournissent une source stable, potentiellement infinie, de cellules ayant des caractéristiques définies. Des agents classiques pour la production de lignées cellulaires immorta- lisées et de lignées de cellules cutanées humaines immortalisées comprennent en particulier, par exemple, des virus, des virus recombinants et des plasmides qui contiennent des séquences d'ADN qui confèrent la propriété d'immortalisation.

Le procédé le plus courant pour produire des lignées cellulaires humaines immortalisées comprend probablement l'utilisation de séquences du virus simiesque 40 (SV40) et, plus spécifiquement, de 1'ADN d'antigène T (T-Ag) <BR> <BR> volumineux de SV40 comme agent d'immortalisation. Par exemple, Steinberg et al.<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> J. Cell Phys, 123,117-125 (1985) ; US4885238 (Reddel et al.) ; US4707448<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> (Major) ; Stoner et al., Cancer Res., 51,365-371 (1991) ; Chopra et al., In vitro Cell<BR> <BR> <BR> <BR> Dev. Biol., 30A, 539-546 (1994) ; Chopra et al., In Vitro Cell Dev. Biol., 27A,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 763-765 (1991) ; Christian et al., Cancer Res., 47,6066-6073 (1987) ; Rhim et al.,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Science, 227,1250-1252 (1985) ; et Grubman et al., Gastrointest. Liver Physiol., 29, G1060-G1070 (1994), font connaître l'utilisation de vecteurs SV40 et de vecteurs contenant la séquence d'antigène T volumineux de SV40 pour produire

des lignées cellulaires humaines immortalisées. L'introduction de telles séquences est généralement effectuée par infection au moyen du virus SV40 ou d'un virus hybride adénovirus-12/SV40 ou par transfection de cellules avec un plasmide recombinant contenant la longue répétition terminale du virus de sarcome de Roux et la région précoce Ori-SV40 par coprécipitation en présence de phosphate de strontium (voir Brash et al., Mol. Cell Biol., 7,2031-2034,1987).

Un autre procédé connu pour la production de lignées cellulaires immortalisées, et en particulier de kératinocytes humains immortalisés, comprend la transfection ou l'infection de cellules avec des séquences d'ADN de virus de papillome humain (HPV). Par exemple, US5376542 (Schlegel) décrit l'immortalisation de cellules épithéliales humaines avec les gènes de E6 et E7 isolés de HPV-16,18,31,33 ou 35 ou avec le gène E7 seul pour produire des lignées <BR> <BR> <BR> cellulaires immortalisées non-tumorigènes. En outre, Barbosa et al., Oncogene, 4,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1529-1532 (1989) ; et Miinger et al., J. Virol., 63 (10) : 4417-4421 (1989) font connaître l'utilisation des gènes E6 et E7 de HPV-16 et HPV-18 pour produire des <BR> <BR> <BR> kératinocytes humains immortalisés. En outre, Dùrst et al., Oncogene, 1,251-256 (1987) décrit l'immortalisation de kératinocytes avec le virus du papillome du type 16.

Cependant, bien que de nombreux groupes aient décrit des lignées cellulaires de kératinocytes immortalisés et leur utilisation dans des essais in vitro, les lignées de kératinocytes immortalisés antérieures présentaient habituellement une ou plusieurs propriétés rendant leur utilisation désavantageuse. Par exemple, les kératinocytes immortalisés décrits antérieurement présentaient une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : (i) réduction ou perte d'expression de marqueurs de différenciation, par exemple de protéines qui sont exprimées par les kératinocytes différenciés normaux, (ii) caractéristiques de croissance modifiées en culture de tissus, et (iii) formation d'un épithélium stratifié et polarisé ayant un stratum corneum para-kératosique.

Pour pallier ces inconvénients, EP780496 (Société des Produits Nestlé) propose une nouvelle méthode d'immortalisation de kératinocytes ou de mélanocytes humains utilisant, en sus d'un nouveau milieu de culture, le vecteur pLXSHD+SV40 (#328) basé sur le virus SV40, ou bien le vecteur

pLXSHD+E6/E7 basé sur le virus du papillome humain 16 (HPV-16). Les cellulaire immortalisée ainsi obtenues conservent l'aptitude à la différenciation et à 1'expression de protéines et d'enzymes qui sont exprimées par les kératinocytes ou mélanocytes différenciés normaux mme après un taux élevé de passages en culture.

Cependant, malgré les descriptions antérieures, il existe encore un besoin important dans la pratique de disposer de kératinocytes humains immortalisés qui possèdent des propriétés encore améliorées. De telles cellules seraient extrmement avantageuses pour de nombreuses utilisations, en particulier dans des analyses nécessitant des cellules cutanées très différenciées.

Résumé de l'invention A cette fin, la présente invention concerne toute lignée cellulaire de kératinocytes humains immortalisés au moyen d'au moins un gène tumorigène fonctionnel provenant d'un rétrovirus, caractérisée en ce qu'elle (1) est non-tumorigénique, (2) conserve l'aptitude à la différenciation et à 1'expression de protéines et d'enzymes qui sont exprimées par les kératinocytes différenciés normaux après un taux élevé de passages en culture de tissus, et (3) forme un épithélium stratifié et polarisé comportant un stratum corneum ortho- kératosique, lorsqu'elle est cultivée en culture organotypique dans un milieu sans sérum et sans couche de cellules nourricières.

La présente invention a aussi pour objectif de fournir un nouveau procédé pour produire des lignées de kératinocytes immortalisées dérivées de tissus cutanés normaux.

Un objectif supplémentaire de la présente invention consiste à proposer des procédés d'utilisation de ces lignées de kératinocytes selon l'invention, par exemple pour des analyses immunologiques, pharmacologiques, photo-et chimiotoxicologiques de réaction cutanée et pour 1'expression de gènes hétérologues.

Description des figures -La figure 1 représente la construction dérivée du rétrovirus SV40, à savoir le plasmide pLXSHD+SV40 (#328), qui est utilisée pour immortaliser les kératinocytes de la présente invention.

-La figure 2 représente la construction dérivée du rétrovirus du papillome virus 16, à savoir le plasmide pLXSHD+E6/E7 qui est utilisée pour immortaliser les kératinocytes de la présente invention.

Description détaillée de l'invention La présente invention propose des lignées de kératinocytes immortalisés non- tumorigéniques, c'est à dire qui ne forment pas de tumeurs lorsqu'elles sont injectées sous la peau d'un animal à raison d'au moins 2x106 de cellules par injection, par exemple.

Ces lignées conservent également l'aptitude à la différenciation et à 1'expression de protéines de différenciation qui sont exprimées par les kératinocytes normaux mme après un taux élevé de passages. L'expression"taux élevé de passages"désigne au moins 10 passages en culture, avantageusement au moins 20 à 30 passages, de préférence au moins 50 passages et théoriquement un nombre infini de passages. Par exemple, les kératinocytes immortalisés pouvant tre produits conformément à la présente invention expriment les protéines de différenciation consistant en la kératine Kl/10, la kératine K14, l'involucrine, la filaggrine et la loricrine mme après un taux élevé de passages en culture de tissus.

Les kératinocytes immortalisés de la présente invention ont un profil de cytochrome p450 (CYP450) qui est similaire, sinon identique, à celui des kératinocytes normaux. Par exemple, les cellules de la présente invention expriment le CYP450 lAl, 2E1,2C18 et 3A5. En outre, les kératinocytes immortalisés de la présente invention expriment des enzymes de phase II, par <BR> <BR> <BR> exemple la glutation-S-transférase s (GST7z) d'une manière comparable aux kératinocytes normaux non-immortalisés.

En outre, les kératinocytes immortalisés de la présente invention expriment des protéines et des enzymes impliquées dans l'oxydation cellulaire et les réponses inflammatoires, par exemple la superoxyde-dismutase (SOD), et la collagénase de type I et le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) après traitement avec des esters de phorbol d'une manière similaire ou identique à celle des kératinocytes normaux différenciés. Etant donné ces caractéristiques, ces lignées cellulaires représentent une source reproductible extrmement intéressante pour des études immunologiques, pharmacologiques, d'inflammation, photo-et chimio- toxicologique de réactions cutanées.

En outre, les lignées de kératinocytes immortalisés de la présente invention, lorsqu'elles sont cultivées en culture organotypique dans un milieu sans sérum [par example le milieu NR2 de Biofluids Inc., U. S., enrichi avec de l'EGF (5 ng/ml), de la vitamine C (38 p. g/ml) et du CaCl2 (1,5 mM)] et sans couche de cellules nourricières (sans fibroblastes), forment un épithélium stratifié et polarisé comportant des couches superficielles kératinisées, appelées communément <BR> <BR> <BR> stratum corneum, ayant une morphologie ortho-kératosique, signifiant que ce stratum corneum est dépourvu de cellules nuclées, c'est à dire de cellules contenant leur noyau.

L'obtention d'un épithélium stratifié et polarisé avec des kératinocytes immortalisées avait été obtenu auparavant dans des conditions classiques de culture, c'est-à-dire par une technique utilisant un milieu contenant du sérum de <BR> <BR> <BR> veau et une couche de cellules nourricières (Lechner et al., Virology, 185,536-571, 1991). Cependant, les lignées immortalisées ne formaient pas alors les couches superficielles kératinisées normales. Par exemple, les lignées cellulaires immortalisées avec le virus du papillome 16 ou 18, ou E6/E7, sont connues pour <BR> <BR> <BR> former des épithéliums très désorganisés (Blanton et al., Am. J. Pathol., 138,673-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 685,1991 ; Hudson et al., J Virol., 64,519-526,1990 ; McCane et al., Proc. Natl.<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> Acad. Sci., ; Woodworth et al., Oncogene, 7,619-626,1992).

Par contre, les lignées décrites dans EP780496 (Société des Produits Nestlé), lorsqu'elles étaient cultivées en culture organotypique dans un milieu sans sérum et sans couche de cellules nourricières, formaient un épithélium

stratifié et polarisé comportant des couches superficielles kératinisées normales, mais ayant cependant une morphologie para-kératosique, signifiant que le stratum corneum contenait toujours des cellules avec leur noyau.

Les kératinocytes immortalisés de la présente invention absorbent également des acides gras essentiels (AGE) exogènes et présentent une désaturation et un allongement de chaîne des AGE parfaitement en accord avec ceux des kératinocytes normaux.

En général, les kératinocytes immortalisés de la présente invention peuvent tre obtenus par le procédé suivant : (i) obtention d'un échantillon de peau humaine ; (ii) préparation de l'échantillon de peau pour obtenir des kératinocytes primaires aptes à la culture ; (iii) culture de ces kératinocytes primaires dans un milieu sans sérum, de préférence dans le milieu NR-3 (décrit dans EP780496), sur des plaques de culture portant un revtement qui facilite la fixation et la croissance des cellules, ledit revtement comprenant de la fibronectine, de la SAB et du collagène de type I ; (iv) remplacement du milieu sans sérum de la manière nécessaire pour parvenir à une croissance confluente optimale des kératinocytes sur les plaques de culture tout en maintenant de manière continue le revtement sur les plaques de culture ; (v) séparation des kératinocytes en culture des mélanocytes, et transfert des kératinocytes séparés dans un milieu d'infection, de préférence le milieu NR- 3, et de préférence après traitement des cellules avec une composition contenant la trypsine et de 1'EDTA en utilisant des plaques de culture revtues de manière similaire ; (vi) infection des cellules avec des gènes tumorigènes fonctionnels d'au moins deux rétrovirus différents, comme le virus SV40 et le virus 16 de papillome humain ; (vii) transfert des kératinocytes immortalisés à un milieu de prolifération sans sérum sur des plaques de culture revtues préalablement de manière similaire,

de préférence les milieux NR-2 ou NR-3 (milieux décrits dans EP780496, dont la composition est incorporée par référence à la présente description) ; et (viii) transfert des kératinocytes immortalisés ayant proliféré dans un milieu de différenciation convenable ayant une haute teneur en calcium (1,5 mM), de préférence le milieu NR-2 enrichi avec de l'EGF (5 ng/ml) et de la vitamine C (38 pg/ml).

Plus précisément, l'étape (i) comprend habituellement l'obtention d'échantillons de tissu cutané humain à partir de donneurs humains normaux, par exemple d'échantillons obtenus au cours d'une intervention chirurgicale ou d'une intervention en pédiatrie. L'immortalisation d'un échantillon de cellules cutanées unique, c'est-à-dire d'un échantillon de cellules cutanées autologue, permet la production de lignées de kératinocytes immortalisée qui présentent des caractéristiques définies, par exemple un profil de récepteur particulier qui est caractéristique d'un donneur particulier.

L'échantillon de tissu cutané est ensuite préparé dans l'étape (ii) de telle sorte qu'il soit apte à la culture in vitro. Cette préparation est effectuée de préférence en lavant initialement l'échantillon de tissu cutané, par exemple en utilisant le milieu qui est utilisé pour la culture. De préférence, cette opération est effectuée dans du milieu NR-2, qui est un milieu sans sérum, dont la composition exacte est décrite dans EP780496, qui s'est révélé tre avantageux pour la culture des kératinocytes normaux. Après lavage, l'échantillon de tissu cutané est de préférence rasé, par exemple au moyen d'un dermatome, et est ensuite coupé en petits morceaux.

Les sections cutanées résultantes sont ensuite de préférence séparées en derme et épiderme. Cela peut tre réalisé par un moyen physique et/ou un moyen enzymatique. Par exemple, cela peut tre réalisé par traitement à la trypsine, par exemple en faisant flotter des échantillons de tissu cutané dans une solution de trypsine (par exemple environ 0,5 %) contenant de 1'EDTA (par exemple à environ 0,1 %) pendant un temps suffisant pour provoquer la séparation des cellules, par exemple pendant un temps d'environ 30 à 60 minutes à une température de 37°C ou bien pendant une nuit à 4°C

Le derme est séparé, et l'épidémie est ensuite placé dans un milieu de mise en suspension. De préférence, le milieu de mise en suspension contient une solution d'inhibiteur de trypsine de soja (SBTI), et il est mis en contact avec les cellules pendant un temps suffisant, habituellement d'environ 5 minutes, afin d'inactiver la trypsine et de provoquer la libération des cellules. Un milieu de culture de tissu, de préférence le milieu NR-2 dépourvu de sérum (décrit dans EP780496) et un filtre (par exemple un filtre de 100 mm) sont ensuite ajoutés pour obtenir les cellules désirées, c'est-à-dire les kératinocytes.

Les kératinocytes primaires résultants obtenus dans l'étape (ii) sont ensuite utilisés pour ensemencer un milieu sans sérum, de préférence le milieu NR-3 (décrit dans EP780496), à une concentration cellulaire convenable, de préférence d'environ 1,2 x 104 cellules/cm2, sur des plaques de culture revtues préalablement.

Cependant, il est possible de faire varier cette concentration de cellules dans de larges limites. Les plaques de culture sont de préférence munies d'un revtement continu d'une composition qui s'est révélée accroître la fixation et la croissance des kératinocytes, plus précisément une solution de fibronectine, de SAB et de collagène de type I.

Dans l'étape (iv), le milieu de culture est remplacé aussi souvent que nécessaire pour parvenir à une croissance cellulaire optimale. De préférence, le milieu est remplacé environ tous les deux jours. Cependant, cela peut varier en fonction de l'échantillon de tissu cutané particulier. Après avoir atteint une confluence pratiquement totale, par exemple environ 90 % de confluence, ce qui se produit habituellement après un temps d'environ 10 à 14 jours, les kératinocytes et mélanocytes sont séparés. Cela peut tre réalisé par n'importe quel moyen qui permet une séparation adéquate des cellules sans effet néfaste sur les mélanocytes et kératinocytes. Par exemple, cela peut tre effectué par un traitement différentiel à la trypsine. De préférence, les mélanocytes ou kératinocytes sont traités avec une solution de trypsine/EDTA, puis sont transférés au milieu de sélection. Dans le cas des kératinocytes, les cellules sont de préférence traitées pendant un temps d'environ 5 à 10 minutes avec une solution de trypsine/EDTA (0,025 %/0,01 %) et sont ensuite utilisées à l'étape (v) pour ensemencer du milieu NR-3 sur des plaques revtues préalablement.

Les kératinocytes sont ensuite traitées avec l'agent d'immortalisation. Les cellules peuvent aussi tre congelées jusqu'à ce que l'immortalisation soit effectuée, par exemple dans de l'azote liquide. L'infection et l'immortalisation sont de préfé- rence effectuées en utilisant des gènes tumorigènes fonctionnels d'au moins deux rétrovirus différents, comme le T-Ag du virus SV40 et le E6/E7 du HPV16. Ces gènes peuvent tre portés chacun dans une construction rétrovirale indépendante, par exemple par le vecteur rétroviral pLXSHD+SV40 (#328) qui est représenté à la figure 1 et qui a été décrit par Stockshlaeder et al. (GeneBank, n° accession M64753 ; Human Gen. Therapy, 2,33-39,1991), et le vecteur rétroviral pLXSHD+E6/E7 qui est représenté à la figure 2.

Le vecteur rétroviral pLXSHD+SV40 (#328) contient la séquence T-Ag de SV40, les séquences de longue répétition terminale 5'et 3'de SV40, les séquences de pBR322 qui permettent la réplication de E. coli, un cycle de clonage multiple, une séquence de polyadénylation de SV40, entre autres séquences.

Le vecteur pLXSHD+E6/E7 contient, à la place du gène codant. pour l'antigène T, le fragment NcoI/CfoI du gène E6/E7 provenant du virus 16 du papillome humain.

Après l'immortalisation, les cellules sont ensuite soumises au nombre de passages nécessaires au cours de la culture et les cellules immortalisées résultantes sont ensuite transférées à un milieu de prolifération dans l'étape (vii). Ce transfert est de préférence effectué au deuxième passage. Ce milieu de prolifération peut tre un milieu sans sérum, de préférence le milieu NR-2 ou NR-3. Les cellules immortalisées sont ainsi cultivées sur des plaques de culture revtues préalablement de manière continue, le revtement comprenant de nouveau une solution de fibronectine, de SAB et de collagène de type 1.

Après multiplication des cellules immortalisées dans le milieu de prolifération (de préférence NR-2), les kératinocytes sont transférés dans l'étape (viii) dans un environnement qui provoque la différenciation des kératinocytes normaux et immortalisés, de préférence dans un environnement qui simule les conditions retrouvées dans la peau, provoquant ainsi l'organisation des kératinocyte en un épithélium stratifié et polarisé comportant des couches superficielles kératinisées

normales. Pour cela, on peut cultiver les cellules dans un milieu sans sérum à haute teneur en calcium, comme le milieu NR-2 comprenant environ 1,5 mM de calcium, environ 5 ng/ml d'EGF et environ 38 pLg/ml de vitamine C, la culture étant effectuée sur des plaques pendant 2-3 semaines à l'interphase air-liquide, par exemple sur les plaques de 12 puits Falcon No. 3043, chaque puit comportant un insert Falcon No. 3180 dans lequel les kératinocytes se développent à l'interface air/liquide. L'air est constitué de l'atmosphère contenu dans 1'espace interne de l'insert lorsque celui-ci est dépourvu de milieu nutritif. Le liquide est le milieu nutritif contenu dans le puit, ce milieu traversant la membrane de l'insert sur laquelle les kératinoytes se développent.

Eu égard aux propriétés des kératinocytes immortalisés de la présente invention, ceux-ci sont parfaitement aptes à des études immunologiques, pharmacologiques, photo-et chimio-toxicologiques de réactions cutanées. Par exemple, les lignées de kératinocytes immortalisés de la présente invention peuvent tre utilisés dans des analyses qui nécessitent des cellules cutanées différenciées, par exemple des études de fonction de barrière (kératinisation) d'un tissu cutané reconstruit, des études de métabolisme des kératinocytes différenciés (métabolisme des acides gras, métabolisme anti-oxydant), des études concernant les effets du rayonnement ultraviolet sur les cellules cutanées, des études concernant les effets d'irritants et sensibilisants cutanés potentiels sur les cellules cutanées, des études de métabolisme des lipides, un traitement topique et/ou par de milieu avec des agents xénobiotiques (par exemple des huiles cosmétiques, en sélectionnant les composés protecteurs éventuels, par exemple des photoprotecteurs), des études d'inflammation et d'irritation cutanée, etc.

En outre, les lignées de kératinocytes produits conformément à la présente invention sont utiles pour sélectionner des composés anti-cancéreux potentiels et des composés potentiels pour le traitement de maladies cutanées. Cela comporte habituellement la mise en contact de la lignée cellulaire avec de tels composés pendant un temps donné et la détermination de l'induction éventuelle de quelconques effets néfastes, par exemple une génotoxicité, une formation d'un produit d'addition d'ADN, une mutagénicité, une transformation cellulaire ou une cytotoxicité.

En outre, les lignées de kératinocytes immortalisés de la présente invention présentent une utilité dans des essais de mutagénèse d'ADN, des essais de sélection d'agents mutagènes cutanés, des essais d'identification d'agents d'altération des chromosomes, des études de transformation maligne, des études de biochimie cellulaire (par exemple des essais d'activation de CYP450), la sélection de composés et de compositions, par exemple de cocktails d'acides gras essentiels qui sont impliqués dans des réactions inflammatoires et allergiques, des essais d'activation de collagénase (en rapport avec l'inflammation), impliquant le TNFa, et la détection d'interleukine.

Eu égard au fait que les lignées selon la présente invention forment un stratum corneum ortho-kératosique, celles-ci sont ainsi particulièrement bien adaptées pour participer à la préparation d'une peau artificielle destinée aux études de mutagenicité, immunologiques, pharmacologiques, photo-et chimio- toxicologiques sus-mentionnées. Cette peau peut tre constituée uniquement par un épithélium de kératinocytes selon l'invention, mais de préférence comprend aussi du collagène, des fibroblastes, voire mme des mélanocytes, de sorte à se rapprocher au mieux de la structure de la peau normale de l'homme, par exemple.

En outre, les lignées de kératinocytes de la présente invention sont aptes à 1'expression de protéines recombinantes, par exemple de protéines et polypeptides humains, ainsi qu'à la production d'ARN et d'ADN.

Parmi les lignées de kératinocytes immortalisés produites conformément à la présente invention, seule la lignée DK7-NR a été déposée selon le traité de Budapest, à titre d'exemple, le 19 mars 1998 à la Collection Nationale de Culture de Microorganisme (C. N. C. M.), dont l'adresse est 25 rue de Docteur Roux 75724 Paris, France, et à laquelle a été attribué le numéro de dépôt CNCM 1-1996. Ce dépôt a été effectué conformément au Traité de Budapest. Toutes les restrictions concernant la disponibilité de cette lignée cellulaire seront irrévocablement levées lors de la délivrance d'un brevet correspondant à la présente demande ou une autre demande qui revendique le bénéfice de priorité sur cette demande.

D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront au cours des descriptions suivantes d'exemples de formes de réalisation qui sont fournis à des

fins d'illustration de la présente invention et qui ne sont pas destinés à tre limitatifs. La manipulation des cellules, la préparation des vecteurs, la transformation de cellules, et toutes les autres procédures techniques sont, en l'absence de précisions contraires, effectués selon les protocoles décrits dans l'ouvrage de Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U. S. A., 1989).

Exemple 1 Préparation et caractérisations des lignées On prélève des tissus cutanés du sein. Après séparation du compartiment dermique et du compartiment épidermique, le derme est coupé en petits fragments de 0,2 x 0,2 mm et est fixé sur une plaque de culture de 6 cm avec du sérum. Du milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM, 10% de sérum de foetus de veau) est ajouté au bout de 2 à 4 heures. Cette culture d'explant est ensuite mise en incubation jusqu'à ce que la croissance excessive des fibroblastes soit visible. Les cultures de fibroblastes confluentes sont scindées et multipliées pour obtenir des cultures de réserve congelées.

On ensemence avec les cellules primaires des boîtes de culture qui sont revtues de manière continue avec un revtement"cocktail"décrit antérieurement <BR> <BR> <BR> <BR> pour les cellules bronchiques (Lechner et al., J. Tiss. Cult. Meth., 9 : 43-49 (1985)).

Après avoir atteint une confluence pratiquement totale, par exemple environ 90 % de confluence, ce qui se produit habituellement après un temps d'environ 10 à 14 jours, les kératinocytes et mélanocytes sont séparés. Pour cela, la culture est traitée avec une solution de trypsine/EDTA (0,025 %/0,01 %) pendant 5 min, puis on récolte les mélanocytes qui se sont séparés en premier des kératinocytes. Les kératinocytes primaires sont ensuites cultivées aux nombres de cellules désirés dans un milieu NR-3 sans sérum au moyen des boîtes de culture revtues décrites (le milieu NR-3 favorise la croissance des kératinocytes par rapport au mélanocytes.

Puis, on transfecte les cellules d'encapsidation"packaging cell line 3T3- fibroblasts"avec les plasmides pLXSHD+SV40 (#328) et pLXSHD+E6/E7 suivant le protocole de Pfeifer et al. (Meth. Cell Sci., 17,83-89,1995) à la différence près que le virus est collecté après encapsidation dans une lignée cellulaire se développant dans du milieu DMEM à 10 % de sérum bovin foetal. Puis, on infecte

les kératinocytes avec les virus de sorte à provoquer une immortalisation. Au cours de l'infection, le milieu sans sérum PC-1 décrit dans l'article de Pfeifer et a/. est égalementutilisé.

Après immortalisation, les kératinocytes immortalisées sont transférées dans le milieu de prolifération NR-2 ou NR-3 en utilisant des boîtes de culture revtues préalablement. Après prolifération des cellules jusqu'aux nombres de cellules désirés, les cellules sont transférées à un milieu de différenciation convenable pour la culture des kératinocytes normaux et immortalisés (NR-2).

Il est démontré que les kératinocytes immortalisés présentent une croissance cellulaire améliorée à des taux de passages élevés, qui est comparable à celles décrites pour les lignées cellulaires de EP780496.

L'expression de CYP450 lAl, 1A2,3A5,2E1,2B6,2A6 et 2D6 est analysée dans les cellules cutanées consistant en kératinocytes normaux et immortalisés par transfert d'empreintes par réaction en chaîne avec l'ADN-polymérase à température ambiante (expression d'ARMm,). Le profil en CYP450 exprimé dans les kératinocytes immortalisés est particulièrement similaire, voir identique, à celui des kératinocytes normaux.

Les lignées cellulaires répondent à l'inducteur de CYP450 consistant en benz (a) pyrène comme les cellules non immortalisées mme à des taux élevés de passages Les marqueurs de différenciation sont analysés au moyen d'anticorps spécifiques contre le T-Ag, l'involucrine, la filaggrine, la loricrine, la vimentine et les kératinea K4, K7, K8, K10/1, K13, K14, K17, K18 et K19. La plus forte capacité de différenciation a pu tre démontrée pour la lignée DK7-NR La glutathion-S-transférase (GST) est analysée par Western-Blot et Nothern- Blot. Toutes les lignées de kératinocytes expriment fortement des ARN messagers pour GSTTi. Le profil d'exposition de GSTa, GST et GSTs dans les lignées cellulaires est similaire à celui des kératinocytes normaux.

Pour analyser et comparer la désaturation et l'allongement de AGE ajoutés dans des kératinocytes, des kératinocytes immortalisés (et des kératinocytes normaux sont traités avec de l'acide linoléique (LA, 15 uM) et de l'acide a- linolénique (LN, 15 Plu). Pour ces expériences, le milieu NR-2 (Biofluids Inc.) déficient en AEG est utilisé. Les cultures cellulaires sont traitées après avoir atteint la confluence et sont passées du milieu à un milieu NR-2 à haute teneur en calcium (1,5 mM). Les cellules sont traitées pendant 4 jours avec les AGE (renouvelés au bout de 2 jours). L'analyse des AGE est effectuée par extraction et séparation des phospholipides par CCM (chromatographie sur couche mince) et quantification des esters méthyliques d'acides gras par CGL (chromatographie gaz-liquide). La formation de la désaturation et des produits d'allongement de LA (20 : 4n-6 et 22 : 4n- 6) et de LN (20 : 5n-3,22 : 5n-3 et 22 : 6n-3) a pu tre démontrée. Ce profil métabolique était en accord avec celui observé dans les kératinocytes normaux.

Toutes les lignes cellulaires étaient hypodiploïdes, avec la plupart des comptages de chromosomes dans l'intervalle des cellules diploïdes. Des cellules autres que celles des lignées cellulaires analysées n'ont pas été détectées dans les cultures. Ce résultat confirme la pureté des lignées cellulaires et l'absence de contamination celullaire par d'autres sources.

La tumorigénicité des kératinocytes immortalisés est déterminée par injection sous-cutanée (1-2 mio de kératinocytes) dans des souris nues. Les lignées de kératinocytes testées, et notamment la lignée DK7-NR ne sont pas tumorigènes chez les souris nues.

Exemple 2 Construction d'un épithélium On prépare du milieu NR2 contenant 750.000 cellules d'une lignées cellulaire selon 1'exemple 1, on dépose 0,5 ml de ce milieu dans des inserts Falcon No. 3180, on les place dans les puits de plaques Falcon No. 3043 contenant déjà 2 ml de milieu NR-2 frais, et on cultive les kératinocytes pendant 2 jours dans des conditions favorisant la croissance des kératinocytes. Au troisième jour, on enlève le milieu contenu dans l'insert et on laisse les cellules a l'air libre. On change le milieu dans les puits périodiquement tous les 2 jours avec du milieu NR-2 enrichi avec de l'EGF (5ng/ml), de la vitamine C (38pg/ml) et du CaCl2 (1,5mM). Après 2

à 3 semaines de culture à l'interphase air-liquide, on collecte l'épithelium ainsi formé, on le fixe dans l'acide picrique et on analyse sa morphologie.

Les résultats montrent que les lignées cellulaires de kératinocytes, notamment la lignée DK7-NR, forment un épithélium stratifié et polarisé comportant des couches superficielles kératinisées (stratum corneum). La couche basale de l'épithelium stratifié et polarisé, appelée communément stratum basale, contient des cellules ayant une morphologie cuboïdale identique à celle de cellules normales. Le stratum corneum présente une morphologie ortho-kératosique, signifiant qu'il est dépouvu de cellules contenant un noyau. La formation de la couche de cellules ortho-kératosiques n'a jamais été possible avec les autres lignées cellulaires immortalisées connues à ce jour. Par exemple, la lignée DK2-NR (EP780496) forme dans des conditions identiques un stratum corneum para- kératosique, signifiant que la couche de cellules cornifiées contient encore toujours des cellules avec un noyau. Seul la morphologie ortho-kératosique du stratum corneum reflète la situation normale de la peau humaine. En effet, un stratum corneum para-kératosique est caractéristique d'une hypertrophie anormale de l'épithélium conduisant à des désordres, tels qu'un psoriasis ou une néoplasie, par exemple.

Exemple 3 Test d'irritation On cultive les lignées cellulaires obtenues à 1'exemple 1, notamment la lignée DK7-NR, dans du milieu NR-2. L'induction du"gène de stress"TNFa (facteur de nécrose tumorale alpha) après traitement avec des irritants cutanés, consistant en du PMA (12-myristate-13-acétate de phorbol) et des UV-B (rayons ultraviolets B), est analysée par la méthode de transfert d'empreintes Northern et par des essais biologiques. Les résultats montrent que les lignées cellulaires, et tout particulièrement la lignée DK7-NR, répondent au PMA et aux UV-B et expriment la protéine TNFa mme un nombre élevé de passages.

Exemple 4 Construction d'une peau artificielle On remplace la membrane d'un insert Falcon No. 3180, par une feuille d'ester benzylique d'acide hyaluronique (Hyaff 11). On ensemence le fond de l'insert avec

des fibroblastes primaires humain (0,1x106 cellules dans 0,2 ml de milieu), on laisse reposer pendant 30 min, on remplit l'insert avec du milieu DMEM contenant 10% de sérum foetal de veau, on l'incube à 37°C sous une atmosphère contenant 5% de dioxyde de carbone pendant plusieurs jours, on vide l'insert, et on y dépose 0,5 ml de milieu NR2 contenant 750.000 cellules de la lignée cellulaire DK7-NR, on place les inserts dans les puits de plaques Falcon No. 3043 contenant déjà 2 ml de milieu NR-2 frais, et on cultive les cellules pendant 2 jours dans des conditions favorisant la croissance des kératinocytes. Au troisième jour, on enlève le milieu contenu dans l'insert et on laisse les cellules a l'air libre. On change le milieu dans les puits périodiquement tous les 2 jours avec du milieu NR-2 enrichi avec de l'EGF (5 ng/ml), de la vitamine C (38 pg/ml) et du CaCl2 (1,5mM). Après 2 à 3 semaines de culture à l'interphase air-liquide, on observe la formation d'une peau artificielle présentant les caractéristiques d'une peau normale.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE Société des Produits Nestle S. A..

PO Box 353.

CH-1800 Vevey,<BR> Switzerland.

NAME AND ADDRESS OF DEPOSITOR INTERNATIONAL FORM RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7.1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page I. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM identification reference given by the Accession number given by the DEPOSITOR : INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY : Saccharomyces cerevisiae NCIMB 41002 (FCL313) II. SCIENTIFIC DESCRIPTION AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION The microorganism identified under I above was accompanied by : 1 a sciendfic description 03 a proposed taxonomic designation (Mark with a cross where applicable) 111. RECEIPT AND ACCEPTANCE This Intemational Depositary Authority accepts the microorganism identified under I above, which was received by it on 12 January 1999 (date of the original deposit) ! IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION The microorganism identified under I above was received by this International Depositary Authority on (date of the original deposit) and a request to convert the original deposit to a deposit under the Budapest Treaty was received by it on (date of receipt of request for conversion) V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : NCIMB Ltd., Signature (s) of person (s) having the power to represent the International Depositary Authority or of authorised official (s):'"7 Address : 23 St Machar Drive,/ Aberdeen, Date : 14 Aínuary 1999 AB24 3RY, Scotland.

'where Rule 6/4 (d) appuies, such date is the date on which the status of International Depositary Authority was acquired.

BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL R » OGNITION OF THE DEPOSI OF MICRGORGANISmS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDURE Société des Produits Nestlé S. A., PO Box 353.

CH-1800 Vevey, Switzeriand.

NAME AND ADDRESS OF THE PARTY TO WHOM THE VIABILITY STATEMENT IS ISSUED INTERNATIONAL FORM<BR> <BR> VlABILITy STATEMENT issued pursuant to Rule 10.2 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified on the foilowing page I. DEPOSITOR II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM Name : Accession number given by the AS ABOVE INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Address : NCIMB 41002 Date of the deposit or of the transferl : 12 January 1999 III. VIABILITY STATEMENT The viability of the microorganism identified under II above was tested on 13 January 1999 2. On that date, the said microorganism was : 3 viable 3 no longer viable Indicate the date of the original deposit or, where a new deposit or a transfer has been made, the most recent relevant date (date of the new deposit or date of the transfer).

2 In the cases referred to in Rule 10.2 (a) (ii) and (iii), refer to the most recent viability test.

3 Mark with a cross the applicable box. IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABILITY TEST HAS BEEN PEPFORNIED4 V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY Name : NCIMB Ltd., Signature (s) of person (s) having the power to represent the International Depositary Address : 23 St Machar Drive, Authority or of auth, ped official (s) : Aberdeen,' A24 3RY, Scotland. D : 14 January 1999 4 Fill in if the information has been requested and if the results of the test were negative.