Es ist bekannt, dass die Immunisierung eines Menschen oder eines Tieres diese gegenüber einer Infektion mit dem gleichen oder einem ähnlichen, verwandten Erreger schützt. Das heißt, dass die auf die Impfung folgende Infektion entweder nicht zur Symptomatik der Er- krankung führt oder dass die Erkrankung wesentlich milder verläuft.

Es ist auch bekannt, dass eine Immunantwort gegen einen viralen Infektionserreger durch verschiedene Verfahren erzeugt werden kann. Dazu gehören Lebend-, Tot-Protein-, Peptidimpfstoffe, Virus- ähnliche Partikel, DNA-Vakzine, virale und bakterielle Vektorimpf- stoffe und Kombinationen dieser Verfahren (Keusch und Bart (1998), "lmmunization principles and vaccine use"in : Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill-Verlag, New York, NY, U. S. A. ). Diese Verfahren und davon abgeleitete Modifika- tionen sind auch für die HIV-Infektion in Erprobung (International AIDS Vaccine Initiative Database of Preventive AIDS Vaccines in Human Trials (URL : http : //www. iavi. org/trialsdb/searchresults. asp ? list =vaccine&vt=. &ts=.).

Lebendvirusimpfstoffe sind abgeschwächte (attenuierte) Viren oder verwandte, apathogene Erreger, die im Geimpften eine Immunant- wort induzieren, die auch gegen das pathogene Virus wirksam ist.

Entscheidender Vorteil von Lebendimpfstoffen ist, dass sie sich im Geimpften vermehren und dadurch die Antigenmenge, mit der der Geimpfte in Kontakt kommt, erhöhen. Lebendimpfstoffe erreichen die Zielzellen im Organismus die am relevantesten für die Erzeugung einer Immunantwort sind. Dadurch werden üblicherweise mehrere Arme der Immunantwort wie Antikörper und zytotoxische T- Lymphozyten (CTL), lokaler und systemischer Immunschutz gleich- zeitig induziert. Lebendimpfstoffe müssen meist nur einmal appliziert werden um eine langanhaltende Immunität zu erzeugen (Keusch und Bart (1998),"Immunization principles and vaccine use"in : Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill- Verlag). Gentechnologisch modifizierte Lebendviren, die eine Im- munantwort gegen die durch Immunschwächeviren hervorgerufene Krankheit bewirken, sind aus dem Tiermodell bekannt (Daniel et al.

(1992), "Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene"Science 258 : 1938-1941). Impfstoffe gegen HIV auf der Basis von replikationsfähigen, abgeschwächten HI-Viren gelten als zu riskant für die Anwendung beim Menschen, da sie, wie durch Tierversuche festgestellt wurde, im Organismus persistieren, sich vermehren und unter bestimmten Bedingungen selbst die tödli- che Immunschwächekrankheit AIDS hervorrufen können (Baba et al.

(1999), "Live attenuated, multiply deleted simian immunodeficiency virus causes AIDS in infant and adult macaques"Nat. Med. 5 (2) : 194- 203).

Totimpfstoffe sind chemisch inaktivierte Viren. Bekannt ist die Imp- fung bereits infizierter Personen mit inaktivierten HI-Viren zur Ver- stärkung der HIV-spezifischen Immunantwort (Kahn et al. (2000), "Evaluation of HIV-1 immunogen, an immunologic modifier, adminis- tered to patients infected with HIV having 300 to 549 x 10 (6) /L CD4 cell counts : A randomized controlled trial"Jama 284 (17) : 2193-202).

Das Verfahren zur Herstellung der HIV-Totimpfstoffe führt allerdings dazu, dass der äußere Teil der Hüllglykoproteine (gp120) verloren geht. Deswegen können solchermaßen hergestellte Impfkonstrukte keine neutralisierenden Antikörper, die eine wesentliche Komponen- te der antiviralen Immunantwort darstellen, induzieren.

Protein-Vakzine sind synthetisch hergestellte Kopien einzelner viraler Proteine oder aufgereinigte Virusbestandteile. Sie induzieren in ers- ter Linie eine Antikörperantwort. Experimentelle und Klinische Stu- dien zeigen, dass HIV-Glykoproteine in der Lage sind, neutralisie- rende Antikörper, das sind Antikörper, die eine Virusinfektion blo- ckiern können, zu induzieren (Belshe et al. (1993), "Safety and im- munogenicity of a fully glycosylated recombinant gp160 human im-

munodeficiency virus type 1 vaccine in subjects at low risk of infec- tion"J Infect Dis 168 (6) : 1387-95 ; Gorse et al. (1999),"HIV-1MN re- combinant glycoprotein 160 vaccine-induced cellular and humoral immunity boosted by HIV-1MN recombinant glycoprotein 120 vac- cine"AIDS Res Hum Retroviruses 15 (2) : 115-32 ; McElrath et al.

(2000), "A phase 11 study of two HIV type 1 envelope vaccines, com- paring their immunogenicity in populations at risk for acquiring HIV type 1 infection"AIDS Res Hum Retroviruses 16 (9) : 907-19). Neben Glykoproteinen von HIV-Laborstämmen werden zur Immunisierung Proteine, deren Aminosäuresequenz denen von Wildtyp-Viren ent- sprechen, verwendet (Mascola et al. (1996),"Immunization with en- velope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies a- gainst laboratory-adapted but not primary isolates of human immu- nodeficiency virus type 1"J Infect Dis 173 (2) : 340-8). Außerdem sind auch Impfungen mit anderen HIV-Proteinen bekannt (Le Buanec et al. (1998), "A prophylactic and therapeutic AIDS vaccine containing as a component the innocuous Tat toxoid"Biomed Pharmacother 52 (10) : 431-5).

Peptid-Impfstoffe enthalten einzelne Peptide oder Ketten mehrerer Sequenzen von 10-25 Aminosäuren Länge, die Proteinabschnitte repräsentieren, die besonders häufig oder effizient durch das Im- munsystem erkannt werden (immunogene Epitope). Um sie dem Immunsystem in optimaler Weise zu präsentieren, werden die Pepti- de chemisch an weitere Molekülen, z. B. in Form von Lipopeptiden, gekoppelt oder unter Zusatz geeigneter Adjuvanzien appliziert (Gor- se et al. (1996), "A dose-ranging study of a prototype synthetic HIV- 1MN V3 branched peptide vaccine"J Infect Dis 173 (2) : 330-9. ; Kelle- her et al. (1997), "Safety and immunogenicity of UBI HIV-1MN oc- tameric V3 peptide vaccine administered by subcutaneous injection"

AIDS Res Hum Retroviruses 13 (1) : 29-32. ; Pialoux et al. (2001), "Li- popeptides induce cell-mediated anti-HIV immune responses in se- ronegative volunteers"Aids 15 (10) : 1239-49.).

Pseudovirionen (Virus-like particles, VLP) sind in ihrer äußeren Struktur dem Virus ähnliche Partikel. Sie werden gentechnisch her- gestellt, indem virale Strukturgene, insbesondere die HIV-gag-Gene, in Zellen zur Expression gebracht werden. Zusätzlich zu den Gag- Proteinen können Pseudovirionen auch weitere HIV-Proteine enthal- ten, insbesondere Pol-und Env-Proteine (Paliard et al. (2000), "Priming of strong, broad, and long-lived HIV type 1 p55gag-specific CD8+ cytotoxic T cells after administration of a virus-like particle vaccine in rhesus macaques"AIDS Res Hum Retroviruses 16 (3) : 273-82. ; Montefiori et al. (2001),"Induction of neutralizing anti- bodies and gag-specific cellular immune responses to an R5 primary isolate of human immunodeficiency virus type 1 in rhesus macaques" J Virol 75 (13) : 5879-90. ; Buonaguro et al. (2002),"Induction of neu- tralizing antibodies and cytotoxic T lymphocytes in Balb/c mice im- munized with virus-like particles presenting a gp120 molecule from a HIV-1 isolate of clade A"Antiviral Res 54 (3) : 189-201. ; Dale et al.

(2002), "Chimeric Human Papilloma Virus-Simian/Human Immuno- deficiency Virus Virus-like-Particle Vaccines : Immunogenicity and Protective Efficacy in Macaques"Virology 301 (1) : 176. ). Pseudovirio- nen enthalten kein Genom und sind nicht infektiös (Griffiths et al.

(1993), "Hybrid human immunodeficiency virus Gag particles as an antigen carrier system : induction of cytotoxic T-cell and humoral re- sponses by a Gag : V3 fusion"J Virol 67 (6) : 3191-8. ; Martin et al.

(1993),"Immunization of human HIV-seronegative volunteers with recombinant p17/p24 : Ty virus-like particles elicits HIV-1 p24-specific cellular and humoral immune responses"Aids 7 (10) : 1315-23. ; Kelle-

her et al. (1998), "Safety and immunogenicity of a candidate thera- peutic vaccine, p24 virus-like particle, combined with zidovudine, in asymptomatic subjects"Aids 12 (2) : 175-82.).

Induktion einer HIV-spezifischen Immunantwort durch Applikation von DNA (DNA-Vakzine). Das Prinzip der Immunisierung mit DNA- Plasmiden beruht auf der Beobachtung, dass die Applikation von DNA eine Immunantwort gegen ein auf dem Plasmid kodiertes Pro- tein induzieren kann (Wolff et al. (1990), "Direct gene transfer into mouse muscle in vivo"Science 247 (4949 Pt 1) : 1465-8). In bestimm- ten Tiermodellen können DNA-Impfstoffe eine protektive Immunant- wort hervorrufen (Ulmer et al. (1993),"Heterologous protection a- gainst influenza by injection of DNA encoding a viral protein"Science 259 (5102) : 1745-9). Verschiedene Verfahren zur DNA- Immunisierungen gegen das HI-Virus oder das mit ihm verwandte Affenimmunschwächevirus (SIV) sind bekannt (Akahata et al. (2000), "DNA vaccination of macaques by a full genome HIV-1 plasmid which produces noninfectious virus particles"Virology 275 (1) : 116-24 ; Weber et al. (2001),"Phase I clinical trial with HIV-1 gp160 plasmid vaccine in HIV-1-infected asymptomatic subjects"Eur J Clin Micro- biol Infect Dis 20 (11) : 800-3 ; Graham (2002),"Clinical trials of hiv vaccines*"Annu Rev Med 53 : 207-21). Unter anderem werden neben Plasmiden mit natürlicher HIV-oder SIV-Sequenz Plasmide mit mo- difizierter, synonymer Virus-Gensequenz (Deml et al. (2001),"Multi- pie effects of codon usage optimization on expression and immuno- genicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunode- ficiency virus type 1 Gag protein"J Virol 75 (22) : 10991-1001 ; Shiver et al. (2002),"Replication-incompetent adenoviral vaccine vector eli- cits effective anti-immunodeficiency-virus immunity"Nature 415 (6869) : 331-5) verwendet. Zusätzlich sind Verfahren bekannt, bei

denen die DNA zusammen mit immunogenen Hilfsstoffen wie CpGs (Deml et al. (2001),"Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encod- ing the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein"J Virol 75 (22) : 10991-1001) oder Zytokinen (Barouch et al. (2000),"Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cy- tokine-augmented DNA vaccination"Science 290 (5491) : 486-92) ap- pliziert werden. In einer weiteren Variante der DNA-Immunisierung wird zur Immunstimulation zusätzlich zur HIV-DNA gleichzeitig die DNA des Glykoprotein-Gens des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) appliziert (Marsac et al. (2002), "Enhanced presentation of major histocompatibility complex class 1-restricted human immunodefi- ciency virus type 1 (HIV-1) Gag-specific epitopes after DNA immuni- zation with vectors coding for vesicular stomatitis virus glycoprotein- pseudotyped HIV-1 Gag particles"J Virol 76 (15) : 7544-53).

Präsentation von HIV-Antigenen durch Trägerviren (Virale Vektoren).

Es ist bekannt, dass zur Immunisierung Virusproteine über virale Vektoren in einen Organismus eingebracht werden können. Virale Vektoren sind Derivate von apathogenen Viren, die gentechnisch so verändert werden, dass sie Gene fremder Organismen tragen kön- nen. Im Falle einer Immunisierung gegen HIV ist es Aufgabe der Trägerviren, HIV-Gene in den Organismus einzubringen. Diese Gene werden in virusinfizierten Zellen abgelesen (transkribiert) und daraus HIV-Proteine hergestellt, die dem Immunsystem anschließend prä- sentiert werden. Virale Vektoren können vemehrungsfähig oder ver- mehrungsunfähig sein. Nach Infektion durch vermehrungsunfähige Vektoren werden keine vollständigen Viruspartikel sondern nur ein- zelne Gene des Virusvektors einschließlich der eingeschleusten Fremdgene aktiviert und exprimiert. Für HIV-Impfstudien wurden un-

ter anderem verschiedene Vakzinia-Virus-und Vogel-Pockenvirus- Konstrukte, die eines oder mehrere HIV-Gene beinhalten, herge- stellt, sowie rekombinante Viren auf Basis von Adenovirus, Rhabdo- viren, Herpes-simplex-Virus, Poliovirus, Adenoassoziiertes Virus und Alphaviren, wie Semliki-Forest-, Sindbis-und Venezuelanisches Pferdeenzephalitis-Virus, konstruiert (Robinson (2002), "New hope for an AIDS vaccine"Nat Rev Immunol 2 (4) : 239-50). Vakzinia-und Kanarienpockenviruskonstrukte, die HIV-Gene tragen, sowie Impf- verfahren auf Basis eines Adenovirus Typ 5 werden zur Zeit am Menschen getestet (Zagury et al. (1988), "A group specific anamnes- tic immune reaction against HIV-1 induced by a candidate vaccine against AIDS"Nature 332 (6166) : 728-31 ; Graham et al. (1993), "Augmentation of human immunodeficiency virus type 1 neutralizing antibody by priming with gp160 recombinant vaccinia and boosting with rgp160 in vaccinia-naive adults"J Infect Dis 167 (3) : 533-7 ; Bel- she et al. (1998),"Induction of immune responses to HIV-1 by ca- narypox virus (ALVAC) HIV-1 and gp120 SF-2 recombinant vaccines in uninfected volunteers"Aids 12 (18) : 2407-15 ; Clements-Mann et al.

(1998),"Immune responses to human immunodeficiency virus (HIV) type 1 induced by canarypox expressing HIV-1MN gp120, HIV-1SF2 recombinant gp120, or both vaccines in seronegative adults"J Infect Dis 177 (5) : 1230-46 ; Hanke und McMichael (2000), "Design and con- struction of an experimental HIV-1 vaccine for a year 2000 clinical trial in Kenya"Nat Med 6 (9) : 951-5 ; Johnston und Flores (2001), "Progress in HIV vaccine development"Curr Opin Pharmacol 1 (5) : 504-10. ). Die Expression des HIV-Gens gag zusammen mit pol und env durch Pockenviruskonstrukte führt zur Bildung von Pseudo- virionen (Karacostas et al. (1989), "Human immunodeficiency virus- like particles produced by a vaccinia virus expression vector"Proc

Natl Acad Sci U S A 86 (22) : 8964-7 ; Haffar et al. (1990), "Human immunodeficiency virus-like, nonreplicating, gag-env particles as- semble in a recombinant vaccinia virus expression system"J Virol 64 (6) : 2653-9).

Präsentation von HIV-Antigenen durch Trägerbakterien (Bakterielle Vektoren). Bekannt ist, attenuierte oder apathogene Bakterien, zum Beispiel Salmonella typhi (Impfstamm CVD 908) und Streptococcus gordonii, die molekulargenetisch so modifiziert wurden, dass sie HIV- Gene tragen, zur Immunisierung über die Schleimhäute zu verabrei- chen (Di Fabio et al. (1998),"Vaginal immunization of Cynomolgus monkeys with Streptococcus gordonii expressing HIV-1 and HPV 16 antigens"Vaccine 16 (5) : 485-92 ; Johnston et al. (2001), "Progress in HIV vaccine development"Curr Opin Pharmacol 1 (5) : 504-10).

Es ist bekannt, aus Retroviren, einschließlich Vertretern der retrovira- len Subfamilie der Lentiviren, durch gentechnische Manipulationen Konstrukte herzustellen, die infektiös sind jedoch unfähig zur Ver- mehrung (Curran et al. (2000), "Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodeficiency virus vectors"Mol Ther 1 (1) : 31-8 ; Negre et al. (2000), "Characterization of novel safe lentivi- ral vectors derived from simian immunodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells"Gene Ther 7 (19) : 1613-23 ; Ailles und Naldini (2002),"HIV-1-derived lentiviral vectors"Curr Top Microbiol Immunol 261 : 31-52). Solche Konstrukte entsprechen in ihrer Größe und Form ihren Ursprungsviren und wer- den vermehrungsunfähige (replikationsinkompetente) retrovirale Vektoren genannt. Lentivirale Vektoren sind gentechnisch von Lenti- viren abgeleitete Konstrukte, die unter anderem aus dem Humanen Immunschwächevirus (HIV) sowie dem Affenimmunschwächevirus

(SIV) entwickelt wurden. Die Vektoren tragen meist einen Teil, nie jedoch das vollständige Genom des Ausgangsvirus (Kim et al.

(1998), "Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1"J Virol 72 (1) : 811-6). Es ist bekannt, retrovirale Vektoren einschließlich Vektoren hergeleitet von HIV und SIV solchermaßen genetisch zu gestalten, dass sie ein Fremdgen enthalten, welches in infizierten Zellen zur Expression kommt. Das Fremdgen (Transgen) stammt in der Regel von einem anderen Or- ganismus oder Virus und steht unter der regulatorischen Kontrolle eines eigenen Promotors. Die Infektion (Transduktion) von Zellen durch einen lentiviralen Vektor führt zur Expression des Transgens in der infizierten (transduzierten) Zelle. (Curran et al. (2000), "Efficient transduction of nondividing cells by optimized feline immunodefi- ciency virus vectors"Mol Ther 1 (1) : 31-8 ; Negre et al. (2000), "Char- acterization of novel safe lentiviral vectors derived from simian im- munodeficiency virus (SIVmac251) that efficiently transduce mature human dendritic cells"Gene Ther 7 (19) : 1613-23 ; Ailles et al. (2002), "HIV-1-derived lentiviral vectors"Curr Top Microbiol Immunol 261 : 31- 52).

Replikationsinkompetente retrovirale Vektoren zeichnen sich da- durch aus, dass die Vektoren zwar in der Lage sind, Zielzellen ein- malig zu infizieren und ein Transgen zu exprimieren, dass die virale Replikation jedoch unterdrückt ist. Hierzu können beispielsweise Ge- ne von Strukturproteinen (zum Beispiel das env-Gen) deletiert und in separaten Expressionsplasmiden oder Verpackungszellinien in trans zur Verfügung gestellt werden. Außerdem können regulatorische Gene (bei HIV beispielsweise das tat-Gen) entfernt oder unterdrückt werden. Ebenso können alternativ oder ergänzend Gene für kritische Virulenzfaktoren (bei HIV beispielsweise das vif-Gen) entfernt oder

unterdrückt werden. Schließlich können auch regulatorische Se- quenzen im Bereich des Long Terminal Repeat entfernt werden, die dazu führen, dass ein sogenannter"selbst-inaktivierender"lentiviraler Vektor gebildet wird (Kim et al. (1998),"Minimal requirement for a lentivirus vector based on human immunodeficiency virus type 1"J Virol 72 (1) : 811-6). Durch solche gentechnischen Manipulationen veränderte Virusvektoren sind in ihrer Replikationsfähigkeit und der Fähigkeit zur homologen Rekombination eingeschränkt und gelten als apathogen hinsichtlich der urspünglichen Pathogenität der Aus- gangsviren (Ailles et al. (2002),"HIV-1-derived lentiviral vectors"Curr Top Microbiol Immunol 261 : 31-52).

Es sind mehrere Verfahren bekannt, wie retrovirale Vektoren in vitro hergestellt werden. Es ist möglich, Zielzellen, sogenannte Vektorpro- duktionszellen, mit zwei oder mehr Plasmiden gleichzeitig transient zu transfizieren und anschließend die Vektoren dem Zellkulturüber- stand zu entnehmen. Es ist auch möglich, Vektorproduktionszellli- nien herzustellen, die konstitutiv oder nach Induktion einzelne oder alle Bestandteile für die Vektorproduktion generieren (Zufferey (2002), "Production of lentiviral vectors"Curr Top Microbiol Immunol 261 : 107-21).

Es ist schließlich auch bekannt, das Genom replikationsinkompeten- ter retroviraler Vektoren in anderen Viren zu verpacken. So wurden Teile replikationsinkompetenter retroviraler Vektoren in rekombinante Semliki-Forest-Viren (Wahifors et al. (1997),"Semliki Forest virus- mediated production of retroviral vector RNA in retroviral packaging cells"Hum Gene Ther 8 (17) : 2031-41 ; Li und Garoff (1998),"Packag- ing of intron-containing genes into retrovirus vectors by alphavirus vectors"Proc Natl Acad Sci U S A 95 (7) : 3650-4), Herpesviren (Sa-

vard et al. (1997), "Defective herpes simplex virus type 1 vectors harboring gag, pol, and env genes can be used to rescue defective retrovirus vectors"J Virol 71 (5) : 4111-7), Adenovirale Vektoren (Feng et al. (1997),"Stable in vivo gene transduction via a novel adenovi- ral/retroviral chimeric vector"Nat Biotechnol 15 (9) : 866-70) und Viren aus der Familie der Pockenviren (Holzer et al. (1999), "Poxvi- ral/retroviral chimeric vectors allow cytoplasmic production of trans- ducing defective retroviral particles"Virology 253 (1) : 107-14 ; Konet- schny et al. (2002),"Retroviral vectors produced in the cytoplasmic vaccinia virus system transduce intron-containing genes"J Virol 76 (3) : 1236-43) (US Patent 6,352, 856) verpackt.

Lentivirale Vektoren auf der Basis von Immunschwächeviren wurden bisher für die virologische Grundlagenforschung sowie für die In vitro-und In-vivo-Anwendung in der experimentellen Gentherapie hergestellt. Die experimentelle Gentherapie zielt in erster Linie auf den Ersatz defekter Gene im menschlichen Organismus sowie der Tumortherapie (Amado und Chen (1999),"Lentiviral vectors--the promise of gene therapy within reach ?" Science 285 (5428) : 674-6 ; Holzer et al. (1999),"Poxviral/retroviral chimeric vectors allow cyto- plasmic production of transducing defective retroviral particles"Virol- ogy 253 (1) : 107-14 ; Klimatcheva et al. (1999),"Lentiviral vectors and gene therapy"Front Biosci 4 : D481-96 ; Deglon et al. (2000),"Self- inactivating lentiviral vectors with enhanced transgene expression as potential gene transfer system in Parkinson's disease"Hum Gene Ther 11 (1) : 179-90 ; Deglon und Aebischer (2002),"Lentiviruses as vectors for CNS diseases"Curr Top Microbiol Immunol 261 : 191-209 ; Galimi und Verma (2002), "Opportunities for the use of lentiviral vec- tors in human gene therapy"Curr Top Microbiol Immunol 261 : 245- 54 ; Konetschny et al. (2002),"Retroviral vectors produced in the cy-

toplasmic vaccinia virus system transduce intron-containing genes"J Virol 76 (3) : 1236-43 ; Maurice et al. (2002), "Efficient gene transfer into human primary blood lymphocytes by surface-engineered lenti- viral vectors that display a T cell-activating polypeptide"Blood 99 (7) : 2342-50 ; Nguyen et al. (2002),"Highly efficient lentiviral vector- mediated transduction of nondividing, fully reimplantable primary he- patocytes"Mol Ther 6 (2) : 199-209) (US Patente 6,013, 516 ; 6,352, 856 ; 6,451, 595). Darüber hinaus wird auch erprobt, die HIV- Infektion mit lentiviralen Vektoren zu behandeln. Ziel dieser Entwick- lungen ist es, durch Gentherapie die Zielzellen für die HIV-Infektion, die Lymphozten, widerstandsfähig gegen eine HIV-Infektion zu ma- chen (Klimatcheva et al. (2001), "Defective lentiviral vectors are effi- ciently trafficked by HIV-1 and inhibit its replication"Mol Ther 3 (6) : 928-39 ; Amado et al. (2002),"Lentiviral vectors for gene therapy of HIV-induced disease"Curr Top Microbiol Immunol 261 : 229-43).

Neben Anwendungen in virologischer Grundlagenforschung und ex- perimenteller Gentherapie sind Verfahren bekannt, bei denen HIV- Vektoren für die Sensitivitäts-und Resistenztestung von HIV gegen antivirale Substanzen eingesetzt werden (Järmy et al. (2001), "Phe- notypic analysis of the sensitivity of HIV to revese transcriptase, pro- tease and integrase inhibitors using a self-inactivating virus vector system"J. Med. Virol. 64 (3) : 223-231) (U. S : Patente 6,103, 462 ; 6,242, 187).

In Hinsicht auf eine Immunreaktion gegenüber retroviralen Vektoren ist bekannt, dass ähnlich wie bei der Verwendung von Vektoren auf der Basis anderer, nicht-retroviraler Viren die Immunantwort, die nach der Applikation eines retroviralen Vektorkonstrukts erzeugt wird, gegen die Vektorstrukturproteine selbst gerichtet sein kann.

Dieser Effekt wird in Hinsicht auf die Verwendung von retroviralen Vektoren für die Gentherapie als unerwünscht und hinderlich ange- sehen (McCormack et al. (1997), "Anti-vector immunoglobulin in- duced by retroviral vectors"Hum Gene Ther 8 (10) : 1263-73).

Unter Pseudotypisierung versteht man die Bildung von viralen Vekto- ren, welche die Hüllglykoproteine einer anderen Virusgattung tragen.

Lentivirale Vektoren können mit Glykoproteinen verschiedener Viren kombiniert werden. Es ist bekannt, dass Dendritische Zellen, durch replikationsinkompetente HIV-Vektoren, die mit dem Glykoprotein des Vesikulären Stomatitisvirus (VSV-G) pseudotypisiert wurden, in vitro infiziert werden. Werden Dendritische Zellen infiziert, können sie eine virusspezifische T-Lymphozyten-Immunreaktion gegen HIV- Strukturen in Zellkultur erzeugen (Granelli-Piperno et al. (2000), "Dendritic cells, infected with vesicular stomatitis virus-pseudotyped HIV-1, present viral antigens to CD4+ and CD8+ T cells from HIV-1- infected individuals"J Immunol 165 (11) : 6620-6 ; Gruber et al. (2000), "Dendritic cells transduced by multiply deleted HIV-1 vectors exhibit normal phenotypes and functions and elicit an HIV-specific cytotoxic T-lymphocyte response in vitro"Blood 96 (4) : 1327-33).

Es ist bekannt, retrovirale Vektoren auf der Basis von Murinen Leu- kämieviren, die als Transgen ein oder mehrere HIV-Gene enthalten, als Immunstimulans zur therapeutischen Immunisierung bei HIV- Infizierten anzuwenden. Die Immunstimulation wird dabei entweder durch direkte Verabreichung der Vektoren in den Organismus erzielt oder durch Injektion von autologen Zellen, die zuvor in vitro mit retro- viralen Vektoren, die HIV-Gene tragen, transduziert wurden (Warner et al. (1991),"Induction of HIV-specific CTL and antibody responses in mice using retroviral vector-transduced cells"AIDS Res Hum Ret-

roviruses 7 (8) : 645-55 ; Irwin et al. (1994), "Direct injection of a re- combinant retroviral vector induces human immunodeficiency virus- specific immune responses in mice and nonhuman primates"J Virol 68 (8) : 5036-44 ; Ziegner et al. (1995), "Cytotoxic T-lymphocyte induc- tion in asymptomatic HIV-1-infected patients immunized with Ret- rovector-transduced autologous fibroblasts expressing HIV-1111B Env/Rev proteins"Aids 9 (1) : 43-50 ; Warner et al. (1998), "Human immunodeficiency virus immunotherapy using a retroviral vector" Curr Top Microbiol Immunol 226 : 145-60) (U. S. Patent 5,716, 826).

Die bekannten Verfahren zur Immunisierung gegen Proteine des Hi- Virus und die bisher dazu verwendeten Reagenzien haben unter an- derem die folgenden Nachteile : Lebendimpfstoffe auf der Basis von Immunschwächeviren sind zwar die potentesten unter den bekann- ten Immunogenen, doch tragen sie ein hohes Pathogenitätsrisiko und sind deshalb als Impfstoffe gegen HIV nicht geeignet.

Protein-und Peptidimpfstoffe sowie Pseudovirionen enthalten nur Teile des Virus. Eine Immunantwort gegen HIV sollte jedoch mög- lichst breit angelegt sein und gegen möglichst viele Virusstruktur- komponenten gerichtet sein.

Da DNA-Impfstoffe keine Proteinstrukturen präsentieren, können durch solche Immunogene keine Antikörper gegen Konformationse- pitope, die durch die Tertiär-und Quartärstruktur von Proteinen ent- stehen, induziert werden. Insbesondere erzeugen sie keine neutrali- sierenden Antikörper gegen HIV. Gleichermaßen können durch be- kannte Peptidimpfstoffe keine Antikörper gegen Epitope gebildet werden, die erst durch die Konformation der natürlichen Proteine entstehen.

Da Impfstoffe wie Totimpfstoffe, Protein-und Peptidimpfstoffe, Pseudovirionen und DNA sich im Körper des Geimpften nicht ver- mehren, entspricht die eingesetzte Antigenmenge der maximalen Antigenmenge, der das Immunsystem eines Organismus ausgesetzt ist. Nicht replizierende Impfstoffe sind deswegen zwar prinzipiell si- cher, aber weit weniger immunogen als Impfstoffe, die sich im Ge- impften zunächst noch vermehren. Dies bedeutet, dass zur Erzeu- gung einer kräftigen und lang anhaltenden Immunantwort eine mehrmalige Applikation des Impfstoffs erforderlich ist. Je geringer die Anzahl der Impfungen, um so leichter lässt sich ein umfassender Immunschutz in einer Bevölkerung erzielen. Impfschemata, bei de- nen mehrmals immunisiert werden muss, sind wesentlich schwieriger in der Praxis umzusetzen. Dies trifft insbesondere auf solche Länder zu, in denen das Gesundheitssystem nur unzureichend entwickelt ist. Außerdem bedeuten Mehrfachimpfungen nicht nur aufwendigere Logistik und Kosten in der Anwendung sondern grundsätzlich höhere Produktionskosten.

Nachteile von Totimpfstoffen und Impfstoffen bestehend aus einzel- nen Viruskomponenten sowie DNA-Immunogenen ist, dass sie meist keine lokale Immunantwort auf Schleimhäuten induzieren, weil effi- ziente Transportsysteme, die sie zu den lokalen antigenprozessie- renden Zellen transportieren, fehlen (Keusch und Bart (1998),"Im- munization principles and vaccine use"in : Harrison's Principles of Internal Medicine, 14. Aufl., S. 758 ff., MacGraw-Hill-Verlag). Des- halb müssen bei der Anwendung solcher Impfstoffe zusätzliche im- munstimulatorische Maßnahmen ergriffen werden, um auch eine Immunreaktion auf Schleimhäuten zu erzielen, falls diese, wie bei der HIV-Infektion, erwünscht ist.

Ein Nachteil der Immunisierung mit Viralen Vektoren ist, dass sie nur einmal appliziert werden können, da bereits nach der erstmaligen Anwendung der Vektoren das Immunsystem massiv auf das Träger- virus reagiert und diese Immunreaktion bei einer Applikation die Im- munantwort gegen die transportierten HIV-Proteine überlagert.

Nachteil von Impfstoffen auf Basis von Bakteriellen Vektoren ist, dass sie lokal verabreicht nur eine Schleimhautimmunität, nicht je- doch eine systemische Immunantwort hervorrufen.

Hinsichtlich der Erzeugung einer Immunantwort durch"Targeting" von Dendritischen Zellen ist zu prüfen, ob eine Anwendung von VSV-G-pseudotypisierten Vektoren in vivo möglich ist, denn VSV-G- pseudotypisierte lentivirale Vektoren werden durch humanes Serum inaktiviert (DePolo et al. (2000), "VSV-G pseudotyped lentiviral vec- tor particles produced in human cells are inactivated by human se- rum"Mol Ther 2 (3) : 218-22). Außerdem haben die Dendritischen Zel- len ihre herausgehobene Rolle in der HIV-Pathogenese darin, dass sie einen besonderen Rezeptor (DC-SIGN) für das HIV-Glykoprotein gp120 besitzen, der es ermöglicht HI-Viren zu den lymphatischen Organen zu transportieren. Lentivirale Vektoren ohne HIV- Glykoprotein oder ein äquivalentes Molekül aus verwandten Immun- schwächeviren erfahren nicht den natürlichen Ausbreitungsweg im Organismus. Dies ist ein Nachteil in Hinsicht auf die Erzeugung einer Immunantwort über einen Weg, der der natürlichen Infektion ähnelt.

In Bezug auf die direkte Immunisierung eines Organismus ist die Verwendung von retroviralen Vektoren auf Basis von Oncoretroviren wie den Murinen Leukämieviren nachteilig, da dadurch eine Immun- antwort gegen Antigene der Oncoretroviren erzeugt wird und eine

mehrmalige Applikation der Vektoren deshalb nicht sinnvoll ist. Auch werden von solchen Vektoren die natürlichen Zielzellen einer HIV- Infektion nicht erreicht.

Der Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, eine Immunantwort gegen das Humane Immunschwächevirus (HIV) zu erzeugen, wobei das Immunogen strukturell von HIV abgeleitet und infektiös aber nicht vermehrungsfähig, zur Expression eines oder mehrerer HIV- Proteine geeignet und zur Erzeugung einer gegen Virusbestandteile gerichteten Immunantwort in vivo tauglich sein soll. Der Erfindung liegt weiterhin das technische Problem zugrunde, einen lentiviralen Vektor, der als Transgen ein oder mehrere HIV-Gene enthält, und zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Bestandteile des Huma- nen Immunschewächevirus (HIV) geeignet ist, zur Verfügung zu stel- len. Schließlich liegt der Erfindung das Problem zugrunde, ein Trä- gersystem auf Basis rekombinanter Poxviren zur Verfügung zu stel- len, mit dem der lentivirale Vektor besonders effizient appliziert wer- den kann.

Die Grundkonzeption der Erfindung besteht in der Verwendung von replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren zur Immunisierung, das heißt zur Erzeugung einer Immunantwort, gegen Bestandteile des HIV. Bei den replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren handelt es sich um infektiöse Partikel, die alle für die Infektion einer Zelle notwendigen Virusbestandteile enthalten. Die genetische In- formation der Vektoren stammt aus einem Lentivirus, bevorzugt aus HIV-1, HIV-2 oder SIV. Das Genom der replikationsinkompetenten viralen Vektoren ist jedoch unvollständig. Daher können erfindungs- gemäße replikationsinkompetente lentivirale Vektoren Zielzellen zwar infizieren, im Gegensatz zu den ursprünglichen Viren bilden

sich in infizierten Zellen jedoch nicht erneut infektiöse Viruspartikel.

Die Vektoren enthalten ein Transgen unter der transkriptionellen Kontrolle eines eukaryoten Promotors. Das Transgen eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Gen oder eine Kombi- nation von Proteingenen aus der Gruppe bestehend aus den HIV- Genen"gag, pol, env, nef, vif, vpr, vpu, vpx, tat, rev". Die Vektoren enthalten in ihrer Hülle Glykoproteine aus HIV-1, HIV-2 oder SIV.

Zur Immunisierung werden Vektoren in definierter Konzentration und Menge ohne oder unter Zusatz eines Adjuvans einmal oder mehr- mals verabreicht. In einer Modifikation wird die Immunisierung mit den Vektoren kombiniert mit Immunisierungen durch andere Verfah- ren, insbesondere mit rekombinanten Vektoren auf der Basis von Adeno-oder Pockenviren oder mit DNA-Plasmiden, Proteinen, Pep- tiden, Lipopeptiden oder bakteriellen Vektoren enthaltend Gene des HI-Virus.

In einer besonderen Ausführung der Erfindung wird das Genom der erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren in Viren aus der Familie der Poxviren verpackt. Dazu werden das Transgen und die cis- aktiven Elemente sowie die zur Transkomplementierung erforderli- chen genetischen Strukturen in das Genoms eines Poxvirus integ- riert. Cis-aktive Elemente sind solche Genstrukturen des Retrovirus, die für die Transkription, Verpackung und Integration eines retrovira- len Genoms essentiell sind. In trans werden diejenigen Elemente zur Verfügung gestellt, die zur Produktion eines reifen Vektorpartikels notwendig sind, insbesondere weitere reglulatorische Proteine sowie die Strukturproteine gag, pol und env. Damit die lentiviralen Vektor- gene sowie das Transgen mit seinen cis-aktiven Elementen transkri- biert werden, werden spezielle Promotoren zur Transkription der

Vektorgene im Zytoplasma eingeführt. Das Transgen selbst steht unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten Promotors, der im Zellkern aktiv ist.

Zur Immunisierung werden die rekombinanten Poxviruskonstrukte enthaltend die lentiviralen Vektoren verabreicht, indem eine be- stimmte Menge intracutan, subcutan, transcutan, intramuskulär, in- taperitoneal, intravenös oder auf Schleimhäute verabreicht wird. Die Verabreichung kann einmalig oder mehrfach, alleine oder in Kombi- nation mit anderen HIV-Impfstoffen, als einzelner Wirkstoff oder zu- sammen mit immunstimulatorischen Substanzen erfolgen.

Die Erfindung betrifft insbesondere die Herstellung von lentiviralen Vektoren zur Immunisierung. Lentivirale Vektoren für ein erfindungs- gemäßes Vefahren werden in Zellkultur durch Transfektion von Zel- len durch geeignete Plasmide hergestellt. Vektoren bilden sich dabei in den transfizierten Zellen und werden aus dem Zellkulturüberstand gewonnen.

Ein für ein erfindungsgemäßes Verfahren geeignetes Vektorplasmid enthält außer den für die Replikation und Genexpression in Bakteri- en notwendigen Genen und Antibiotika-Resistenzgenen eine Kasset- te, die die cis-aktiven Bereiche des lentiviralen Genoms und ein Transgen enthält. Zu den cis-aktiven Regionen zählen insbesondere, aber nicht ausschließlich, Teile der Long-Terminal-Repeat (LTR) - Regionen, die Primerbindungsstelle und das Verpackungssignal.

Das Transgen steht unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryo- ten, nukleär aktiven Promotors. Die Genkassette steht unter der Kontrolle eines eigenen Promotors, wie beispielhaft dem CMV- Promotor. Innerhalb der Genkassette liegen optional weitere Gene

des Lentivirus. So ist es in einer besonderen Ausführungsform vor- teilhaft, dass sich gag, pol und rev sowie das rev-responsive Element (RRE) zusammen mit der Kassette auf dem Plasmid befindet. In kei- nem Fall jedoch enthält das Plasmid das vollständige Genom eine Lentivirus. Auf einem zweiten und gegebenenfalls einem dritten oder auf weiteren Plasmiden befinden sich die lentiviralen Gene, die als trans-aktive Gene für die Produktion eines Virusvektors notwendig sind. Dazu gehören die Gene env, gag, pol, rev sowie optional die Gene vif, vpr, vpu, nef, tat. In diesen Verpackungsplasmiden stehen die HIV-Gene unter der transkriptionellen Kontrolle eines eukaryoten Promotors. Die Verpackungssequenz Psi sowie alle weiteren cis- aktiven Regionen befinden sich immer auf dem Plasmid mit dem Transgen.

In einer besonderen Ausführungsform werden für die Herstellung des Vektorplasmids ausgehend von einem proviralen HIV-Konstrukt mehrere für die HIV-Replikation notwendige Genabschnitte deletiert, insbesondere das Glykoprotein-Gen und ein Abschnitt im 3'U3- Bereich, der die virale TATA-Box enthält. In dieses Konstukt wird die genetische Information für ein Transgen unter Kontrolle eines hete- rologen, eukaryoten Promotors integriert. In diesem Plasmid werden zusätzlich zu env-Gen und 3'U3 weitere Gene deletiert, unter ande- rem die Gene vif, vpu, vpr, tat und nef. Außerdem wird der HIV- Promotor durch den CMV-Promotor ersetzt. Dadurch enthält das Plasmid zusätzlich zur Transgenkassette die HIV-Gene gag, pol und rev sowie das RRE.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform werden anstelle der HIV-1 gag-, pol-, env-und rev-Gene die entsprechenden Gense- quenzen von HIV-2 oder SIV verwendet. In einer weiteren Ausfüh-

rungsform werden anstelle eines oder mehrerer natürlicher Gene aus der Gruppe"gag, pol, env, rev"synonyme, Kodon-optimerte Gensequenzen verwendet, das sind Gene, die andere, synonyme Kodons für die Kodierung der gleichen Peptidsequenz besitzen. Es ist auch möglich, modifizierte gag-pol-Gene, deren Kernretentions- signale entfernt wurden, zu verwenden um den Export der gag-pol mRNAs aus dem Zellkern zu gewährleisten.

Die genetische Information des Glykoprotein-Gens wird durch Restriktionsverdau oder ähnliche Verfahren aus einem Virus- Laborstamm gewonnen und in ein Expressionsplasmid inseriert. E- benso ist es möglich, nach Reverser Transkription der Virus-RNA durch Amplifikation der viralen Nukleinsäure, insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion, das Glykoprotein-Gen aus einem Labor- stamm oder aus Probandenmaterial zu gewinnen und in ein Expres- sionsplasmid zu inserieren. Es ist gleichermaßen möglich, das env- Gen synthetisch herzustellen.

Das Transgen für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist ein HIV- Genbereich oder eine Kombination mehrerer Genabschnitte aus der Gruppe"gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, nef". Die genetischen Strukturen, insbesondere die Glykoproteingene, entstammen aus Viren der Gruppe"HIV-1, HIV-2, SIV"oder sind diesen analog. Opti- onal enthält das Transgens synthetisch modifizierte Genomsequen- zen. So ist es vorteilhaft, synonyme Gensequenzen zu verwenden.

Die synonyme Sequenz hat den Vorteil, dass die Expression des Gens dadurch verbessert wird und die Gefahr einer homologen Re- kombination und die Bildung pathogener Viren verringert wird.

Das Transgen enthält Sequenzen aus HIV-1, HIV-2 oder SIV. Optio- nal besitzt es jedoch zusätzlich weitere Gene, deren Expressions- produkte zur verstärkten Immunisierung beitragen, wie z. B. Zytoki- ne, Chemokine, Antikörper, Hormone, Tetanus-, Diphtherie oder ein anderes Toxoid. Dabei stehen diese Gene unter der transkriptionel- len Kontrolle eines eigenen Promotors oder sind mit dem HIV- Transgen über eine Interne Ribosomen-Eintrittsstelle verknüpft.

Die Plasmide werden in Bakterien, vorzugsweise in E. coli, vermehrt und anschließend aufgereinigt. Mit den Plasmiden werden durch dem Fachmann bekannte Standardverfahren eukaryote Zellen, vor- zugsweise Zellen ohne HIV-Rezeptoren, wie die humane embryona- le Nierenfibroblasten-Zelilinie HEK 293T, transfiziert. Die Transfekti- on der Plasmide in HEK 293T-Zellen führt dort zur Bildung von Vek- torpartikeln, deren Genom die Regionen enthält, die auf dem Plas- mid, das die cis-aktiven Regionen und das Transgen enthält, kodiert sind. Nach einigen Tagen, vorzugsweise nach 48-72 Stunden, wer- den die Vektoren aus dem Zellkulturmedium gewonnen, optional au- ßerdem noch konzentriert durch Zentrifugation oder Filtrierung und die Konzentration infektiöser Vektoren bestimmt. Die Vektoren kön- nen eingefroren gelagert werden. Die Vektorpartikel gleichen in Form und Struktur natürlichen, infektiösen Lentiviren. Werden mit den len- tiviralen Vektoren eukaryote Zellen infiziert, wird das Transgen exprimiert. Die Einführung der Fremd-Nukleinsäure in die Zellen wird als Transduktion bezeichnet. Eine Bildung von infektiösen Partikeln findet nicht statt.

Ein lentiviraler Vektor für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist bei- spielsweise dadurch erhältlich, daß a) in ein Ausgangskonstrukt, ins- besondere ein Plasmid oder Cosmid, ein virales Genom inseriert

wird, b) in dem Zielvirusgenom enthaltenden Konstrukt aus Stufe a) zumindest env und eine für die Genexpression des Virus notwendige Sequenz, insbesondere im 3'U3-Bereich modifiziert oder daraus de- letiert werden, c) in das Produkt aus Stufe b) die genetische Informa- tion zur Expression der Markersubstanz inseriert wird, d) das Vektor- konstrukt aus Stufe c) zusammen mit einem Vektorkonstrukt enthal- tend die genetische Information für ein HIV-oder SIV-env-Gen in ein Vektorproduktionssystem eingebracht und darin exprimiert wird, e) optional ein in Stufe b) deletiertes Protein in trans über ein Konstrukt, insbesondere ein Plasmid, oder eine Verpackungszelllinie in Stufe d) eingeführt wird und f) der in Stufe d) bzw. e) erzeugte virale Vektor nach seiner Produktion mittels des Vektorproduktionssystems, ggf. nach Zell-Kultivierung, isoliert wird.

Das Vektorproduktionssystem kann eine Verpackungszelilinie sein.

Eine Verpackungszelllinie produziert bereits konstitutiv eines oder mehrere für die Bildung der Viruspartikel notwendigen Virusbestand- teile, insbesondere das env-Gen. Die Isolierung kann darin beste- hen, Zellkulturüberstand abzunehmen. Erfindungsgemäße lentivirale Vektoren können auch dadurch erzeugt werden, dass die Gene des Vektors stabil in eine Zellinie integriert werden. Dazu werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren eukaryote Zellen mit Plasmiden "stabil"transfiziert, Vektor-exprimierende Zellen identifiziert, und se- lektiert. Lentivirale Vektoren werden dabei aus dem Zellkulturüber- stand der Produktionszelilinie isoliert.

Die Erfindung betrifft insbesondere auch die Herstellung von rekom- binanten Poxviren enthaltend das Genom zur Bildung lentiviraler Vektoren zur Immunisierung. In einer besonders vorteilhaften Aus- führungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die gene-

tischen Strukturen, die für die Bildung von erfindungsgemäßen infek- tiösen, replikationsinkompetenten lentiviralen Vektoren notwendig sind, in das Genom eines Virus aus der Familie der Poxviren integ- riert. Dazu werden cis-aktive Regionen zusammen mit dem Trans- gen und die anderen für die Vektorbildung notwendigen Genstruktu- ren an einer, zwei oder mehreren Genorten des Poxvirus eingefügt.

Cis-aktive Bereiche zusammen mit dem Transgen sowie alle ande- ren Gene stehen unter transkriptioneller Kontrolle zytoplasmatisch aktiver Promotoren. Vorteilhaft sind dazu Poxviruspromotoren, ins- besondere Frühe Promotoren wie der p7,5-Promotor. Zur Expression in Poxviren werden in den zu integrierenden lentiviralen Vektor- Genen alle kryptischen Transkriptions-Stopp-Sequenzen entfernt.

Bei Verwendung Früher Poxvirus-Promotoren werden Abschnitte mit der Nukleotidsequenz TTTTTNT eliminiert. Unterhalb der zu transk- ribierenden Gensequenzen werden Stopp-Signale eingeführt. Bei Verwendung Früher Poxvirus-Promotoren wird die Sequenz TTTTTNT hinter die zu transkribierende Sequenz eingeführt. Es ist für ein erfindungsgemäßes Verfahren auch möglich, andere Poxvi- ruspromotoren einschießlich Später oder Früh/Später Promotoren zu verwenden.

Falls das verwendete Poxvirus ein Vakziniavirus ist, ist es vorteilhaft die Gene der lentiviralen Vektoren in den Bereich der Notl- Schnittstelle des Vakziniavirusgenoms sowie in das Thymidinkinase- Gen zu integrieren. Rekombinierte Poxviren werden durch dem Fachmann bekannte Verfahren selektiert, in eukaryoten Zellen an- gezüchtet und optional durch Zentrifugation konzentriert.

In einer besonderen Ausführungsform werden mehrere Expressions- kassetten für einzelne HIV-Proteine gleichzeitig in das Poxvirusge-

nom eingefügt, wobei die Gensequenzen der zugrundeliegenden Lentiviren unterschiedlichen HIV-Stämmen oder unterschiedlichen Viren aus der Gruppe"HIV-1, HIV-2, SIV"entsprechen und entweder mit natürlichen Genen übereinstimmen oder modifizierte, optional synthetische, synonyme Nukleotidsequenzen besitzen.

Bevorzugt werden aus der Familie der Poxviren die Orthopoxviren, insbesondere das Vakziniavirus sowie Poxviren, die in ihrer Vermeh- rung im menschlichen Organismus eingeschränkt sind, wie das Mo- difizierte Vakziniavirus vom Typ Ankara (MVA) und Avipoxviren.

Zur Immunisierung werden erfindungsgemäße infektiöse, replikati- onsinkompetente lentivirale Vektoren in definierter Konzentration und Menge ohne oder zusammen mit Adjuvans auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intrape- ritoneal, intravenös oder auf anderem Weg einmal oder mehr als einmal appliziert. In einer besonderen Ausführungsform wird die Im- munisierung mit den lentiviralen Vektoren kombiniert mit Immunisie- rungen durch ein anderes Verfahren, insbesondere zusammen mit rekombinanten Vektoren auf der Basis von Adeno-oder Pockenviren oder mit geeigneten DNA-Plasmiden, Protein-, Peptid-, Lipopeptid- Vakzinen oder bakteriellen Vektoren enthaltend Gene des HI-Virus.

Als Adjuvans sind alle Substanzen geeignet, die zur Immunstimulati- on und-modulation beitragen ohne selbst ein HIV-Antigen darzustel- len. Insbesondere, aber nicht ausschließlich, können dies Freund'sches Adjuvans, CpG-ODN, Derivate von Saponin und ande- ren Detergenzien, Zytokine, Chemokine, Toxoide wie Tetanus-, Diphtherie und Choleratoxin, Antikörper und Hormone sein.

Die rekombinanten Poxviruskonstrukte enthaltend die lentiviralen Vektoren werden verabreicht, indem eine bestimmte Konzentration und Menge ohne oder zusammen mit Adjuvans auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intrape- ritoneal, intravenös oder auf anderem Weg appliziert wird. Die Ver- abreichung kann einmalig oder mehrfach, alleine oder in Kombinati- on mit anderen HIV-Impfstoffen, als einzelner Wirkstoff oder zu- sammen mit immunstimulatorischen Substanzen erfolgen.

Ein erfindungsgemäßer lentiviraler Vektor für ein erfindungsgemäßes Verfahren ist abgeleitet vom Genom eines einzigen HIV-1-Stamms.

Sequenzen aus mehreren unterschiedlichen HIV-1-Sequenzen kön- nen als Ausgangsbasis für die Konstruktion von erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren und Verfahren verwendet werden. Chimäre Lentiviren enthaltend Elemente aus HIV und SIV können hergestellt werden. Es ist insbesondere vorgesehen, dass an Stelle oder zu- sätzlich zu Sequenzen aus HIV-1 auch Sequenzen aus HIV-2 oder dem Affenimmunschwächevirus SIV im Vektor enthalten sind, bevor- zugt wenn dadurch ein funktionsfähiger lentiviraler Vektor gebildet wird. Dabei können die Virussequenzen sowohl von Laborstämmen als auch von Virus-Primärisolaten stammen. Es ist dabei möglich Gene, die für HIV-Proteine kodieren, zu modifizieren, zu kürzen oder durch synthetische, synonyme Gensequenzen zu ersetzen.

Vorteilhaft ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dazu ge- eigneten Vakzinierungskonstrukten die Verwendung von HIV-1- Glykoprotein-Genen. Es ist jedoch auch möglich, zusätzlich oder an- stelle der HIV-1-Gene die Glykoprotein-Gene der mit HIV-1 verwand- ten Viren HIV-2 und SIV zu verwenden.

Um den Vektor biologisch sicher zu machen ist es nützlich, bestimm- te regulatorische Genabschnitte zu entfernen. Insbesondere ist es vorteilhaft, durch Entfernung einer Region im 3'U3 des 3'-LTR- Bereichs einen"selbst-inaktivierenden"Vektor herzustellen. Außer- dem kann durch Ersatz natürlicher Gensequenzen durch synonyme Kodon-veränderte Gene das Risiko einer homologen Rekombination reduziert werden.

Weiter ist vorgesehen, dass in lentiviralen Vektoren für erfindungs- gemäße Verfahren und den davon abgeleiteten rekombinanten Pox- viren mehrere HIV-Gene als Transgen enthalten sind. Neben der Integration eine Genomabschnitts aus dem Bereich des gag-Gens werden bevorzugt weitere oder andere HIV-Genomabschnitte aus der Gruppe"gag, pol, env, rev, tat, vif, vpr, vpu, nef'als Transgen in den gegebenenfalls in Poxviren verpackten lentiviralen Vektor inkor- poriert. Neben der Verwendung von HIV-Gensequenzen als Trans- gen, die natürlichen HIV-Sequenzen entsprechen, ist es vorteilhaft, synthetische Gensequenzen mit veränderten Kodonsequenzen, die für die gleichen Proteine kodieren, einzusetzen.

Weiter ist vorgesehen, innerhalb des Genoms des lentiviralen Vek- tors zusätzlich zum Transgen Gene zur Expression immunregulatori- scher Proteine wie Zytokine, Chemokine, Antikörper, Hormone, Te- tanus-, Diphtherie-, Cholera-oder ein anderes Toxoid zu integrieren.

Es ist vorgesehen, die erfindungsgemäßen Vektoren einmal zu ve- rabreichen. Vorteilhaft ist jedoch die mehrmalige Applikation, da da- durch eine Verstärkung der Immunantwort, insbesondere gegen die Glykoproteine, erzielt werden kann. Es ist weiter vorgesehen, die Vektoren in Kombination mit anderen HIV-Impfstoffen zu verabrei-

chen. Es ist auch vorgesehen, unterschiedliche erfindungsgemäße Vektoren, die genetisch von verschiedenen Immunschwächeviren abgeleitet wurden, zu kombinieren und entweder gemeinsam oder nacheinander zu verabreichen. Es ist auch vorgesehen, Vektoren bei der Anwendung mit anderen bekannten und neu zu entwickelnden Adjuvanzien zu kombinieren.

Besonders zweckmäßig zur Vermehrung und Verabreichung des erfindungsgemäßen lentiviralen Vektors ist die Verpackung seines Genoms in Viren aus der Familie der Poxviren. Darunter sind beson- ders Vakziniavirus aus der Subfamilie der Orthopoxviren sowie Avi- poxviren einschließlich Geflügelpocken-und Kanarienpockenviren und andere Poxviren, deren Replikationsfähigkeit im menschlichen Organismus eingeschränkt ist, wie der Vakziniavirus-Stamm Modifi- ziertes Vakzinia-Virus Typ Ankara, MVA. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, in Poxviruskonstrukten die Gene, die für die Herstellung von lentiviralen Vektoren in der Zelle notwendig sind, an ein, zwei oder mehr unterschiedlichen Orten zu integrieren. Es ist insbesonde- re vorgesehen und vorteilhaft, cis-aktive Sequenzen zusammen mit dem Transgen von den Genen, die zur Komplementation in trans notwendig sind, zu trennen.

Weiter ist dabei vorgesehen, gleichzeitig auch mehrere genetisch unterschiedliche, jedoch analoge lentivirale Gene an einem oder mehreren Orten des Poxvirusgenoms zu integrieren, so dass die in Poxvirus-infizierten Zellen entstehenden Vektorpartikel Proteinkom- ponenten von verschiedenen Lentiviren der Gruppe"HIV-1, HIV-2, SIV"enthalten. Insbesondere ist vorgesehen und vorteilhaft, zur Herstellung erfindungsgemäßer rekombinanter Poxviren mehrere HIV-Glykoproteingene in das Poxvirus zu integrieren. Zwei oder

mehr Glykoproteingene können dabei entweder an einem einzigen Genlocus, insbesondere im Bereich des tk-Gens, oder an zwei oder mehr unterschiedlichen Genloci integriert werden. Dadurch werden in infizierten Zellen rekombinante lentivirale Vektoren gebildet, die die Glykoproteine von unterschiedlichen HIV-Stämmen tragen.

Es ist gleichermaßen vorgesehen, zwei oder mehr Kassetten für an- dere HIV-Struktur-und Regulatorgene sowie zwei oder mehr Kasset- ten enthaltend die cis-aktiven Elemente und unterschiedliche Trans- gene in das Poxvirusgenom zu integrieren. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten der Anzahl und Anordnung von Komponenten zur Produktion von lentivi- ralen Vektoren enthaltend HIV-Transgene und Glykoproteingene aus Immunschwächviren erzeugt werden. Das Einfügen von zusätzlichen genetisch andersartigen HIV-Genen hat den Vorteil, dass dem Im- munsystem gleichzeitig Proteine von mehreren unterschiedlichen Hi- Virusstämmen präsentiert werden und eine breite, kreuzreaktive Im- munantwort erzielt werden kann. Es ist besonders bevorzugt, dass dabei auch gleichzeitig Genkomponenten von HIV-2 und SIV mit zu integrieren.

Es ist auch vorgesehen, dass Gene für immunregulatorische Protei- ne wie Zytokine, Chemokine, Antikörper, Hormone, Tetanus-, Diph- therie-, Cholera-oder ein anderes Toxoid in das Poxvirusgenom au- ßerhalb oder innerhalb der Expressionskassetten für die Gene der lentiviralen Vektoren einzuführen, um damit bei der Vakzinierung eine Immunmodulation zu erzielen.

Poxviruskonstrukte werden bevorzugt einmalig aber auch mehrfach hintereinander verabreicht, wobei es bei einem bevorzugten Verfah-

ren zunächst unerheblich ist, ob die Verabreichung im Abstand von Tagen oder Wochen oder erst von mehreren Jahren erfolgt. Es ist auch vorgesehen, mehrere Poxviruskonstrukte, die jeweils die Ge- nome von lentiviralen Vektoren auf Basis von genetisch unterschied- lichen HIV-Stämmen besitzen, gleichzeitig oder in Folge zu verabrei- chen. Außerdem ist bevorzugt, rekombinante Poxviruskonstrukte in bestimmter zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation zusammen mit anderen Vakzinen gegen HIV auf der Basis von Substanzen aus der Gruppe"Protein-, Peptid-, Lipopeptid-, DNA-Vakzine, Pseudovirion, bakterieller und viraler Vektor"oder anderen, bisher noch unbekann- ten Impfstoff zu verabreichen. Poxviruskonstrukte werden bevorzugt auch mit immunregulatorischen Substanzen in bestimmter zeitlicher Reihenfolge oder Lokalisation zusammen verabreicht. Es ist auch bevorzugt, zwei oder mehrere Poxviruskonstrukte, die jeweils zumin- dest teilweise unterschiedliche lentivirale Genomsequenzen enthal- ten, gemeinsam oder nacheinander zu applizieren, um eine breite immunisierende Wirkung gegenüber einer Vielzahl von antigenen HIV-Varianten zu induzieren.

Die in Poxviren verpackten lentiviralen Vektoren enthaltend HIV- Transgene werden bevorzugt für ein Verfahren der Erzeugung einer Immunantwort über verschiedene Wege appliziert. So ist es möglich, die Poxviruskonstrukte intracutan, subcutan, transdermal, intramus- kulär, intravenös, intraperitoneal oder auf Schleimhäute der Atem- wege, der Verdauungsorgane einschließlich dem Darm oder der Ge- schlechtsorgane zu verabreichen.

Retrovirale Vektoren gelten als nur schwach immunogen (McCor- mack et al. (1997), "Anti-vector immunoglobulin induced by retroviral vectors"Hum Gene Ther 8 (10) : 1263-73). Es ist deshalb überra-

schend, dass im Mausmodell durch replikationsinkompetente lentivi- rale Vektoren enthaltend Syngag eine beachtliche humorale und zel- luläre Immunantwort gegen das HIV-Gag-Protein, deren Ausmaß der anderer Immunisierungsverfahren entspricht oder sie sogar übertrifft sowie gleichzeitig eine neutralisierende Antikörperantwort gegen das Glykoprotein erzielt werden kann.

Darüber hinaus zeigt die Erfindung einen Weg auf, mit dem gleich- zeitig mehrere elementare Schwierigkeiten bei der Erzeugung einer HlV-spezifischen Immunantwort gelöst werden. Dazu zählen die Möglichkeit einer Vakzinierung durch einen Impfstoff, der wie ein Lebendimpfstoff die Zellen, die natürliche Zielzellen der HIV-Infektion sind, infiziert, gleichzeitig jedoch eine hohe biologische Sicherheit besitzt. Die natürliche Expression der HIV-Glykoproteine an der Vi- rusoberfläche ermöglicht die Induktion einer neutralisierenden Anti- körperantwort, gleichzeitig werden durch die Expression und intrazel- luläre Prozessierung von Virusproteinen in infizierten Zellen zytotoxi- sche T-Lymphoyzten, denen eine entscheidende Bedeutung bei der HIV-Abwehr beigemessen wird, aktiviert. Die Integration des Trans- gens ermöglicht eine Weitergabe des Transgens bei der Zellteilung und damit eine Vermehrung des Antigens in vivo. Durch die Wahl geeigneter Promotoren ist kann die Expression von HIV-Protein aus transduzierten Zellen längere Zeit anhalten oder nach einer Latenz- zeit zu einem erneuten Antigenkontakt"von innen"führen. Dadurch ist eine länger anhaltende HIV-spezifische Immunaktivierung im einmal immunisierten Organismus möglich.

Mit der Erfindung werden folgende weitere Vorteile gegenüber der Immunisierung mit anderen Verfahren erhalten. Durch die Immuni- sierung mit Vektoren werden Partikel verabreicht, die in ihrer Größe

und Form sowie der Proteinzusammensetzung und Glykoprotei- nexpression dem pathogenen Ausgangsvirus ähneln, wobei die na- türliche Infektion in optimaler Weise nachgeahmt wird. Ein Vorteil von lentiviralen Vektoren, die die Glykoproteine von HIV oder SIV tragen ist, dass Dendritische Zellen diese Vektoren zu den Organen des Immunsystems transportieren können. Bei der natürlichen Infek- tion ist die Bindung von HIV über sein Glykoprotein gp120 an Dendri- tische Zellen und der Transport durch diese Zellen zu den lymphati- schen Organen, wo das Virus auf die eigentlichen Zielzellen, die Makrophagen und die CD4+ T-Lymphozyten, trifft und diese infiziert, ein wichtiges pathogenetisches Element der HIV-Infektion. Dieser pathogenetische Prozess kann durch erfindungsgemäße Vektoren nachvollzogen werden.

Die Infektion über das CD4-Molekül ermöglicht auch die Infektion von solchen Zellen, die weil sie viele Jahre leben als Reservoir einer HIV-Infektion betrachtet werden (Finzi et al. (1997),"Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral ther- apy"Science 278 (5341) : 1295-300). Dadurch kann möglicherweise eine langanhaltende Immunaktivierung erzielt werden.

Anders als bei der Immunisierung mit Totimpfstoff enthalten die Vek- tor-Partikel für ein erfindungsgemäßes Verfahren HIV-oder SIV- Glykoproteine in ihrer natürlichen Konfiguration. Dies begünstigt die Bildung neutralisierender Antikörper.

Ein besonderer Vorteil durch die Verwendung von erfindungsgemä- ßen lentiviralen Vektoren gegenüber Vektoren auf Basis von Onco- retroviren ist, dass damit eine Immunantwort gegen Nicht- Immunschwächeviren, die eine Auffrischimpfung blockieren würde,

nicht erzeugt wird. Im Gegensatz zu anderen viralen Vektoren ein- schließlich oncoretroviraler Vektoren, die HIV-Gene enthalten, ist eine mehrfache Verabreichung der erfindungsgemäßen lentiviralen Vektoren sinnvoll, denn sie verstärkt die Immunantwort gegen die Virus-Glykoproteine.

Bei dem Verfahren zur Immunisierung unter Verwendung von re- kombinanten Poxviren enthaltend Gene lentiviraler Vektoren kommt es zu einer Reihe weiterer wesentlicher Vorteile : Poxviruskonstrukte sind physikalisch-chemisch wesentlich stabiler als die Immunschwä- cheviren und lentivirale Vektoren. Sie lassen sich deshalb zu höhe- ren Titern konzentrieren und widerstehen Einfrier-und Auftauvor- gänge wesentlich besser. Sie sind deshalb weniger empfindlich ge- genüber Unterbrechungen der Kühlkette, einem kritischen Punkt bei der Anwendung von Impfstoffen, insbesondere in heißen und ärme- ren Ländern.

Die Verabreichung von rekombinanten Poxviren führt im Körper zu- nächst zu einer umfangreichen Vermehrung der Poxviruskonstrukte über mehrere Tage. Da das lentivirale Genom stabil in den Pocken- viren verpackt ist, kommt es gleichzeitig zu einer massiven Produkti- on von Vektorpartikeln, die ihrerseits CD4+ Zellen infizieren und transduzieren, wobei das Transgen exprimiert wird. Dadurch wird durch die Verabreichung rekombinanter Poxviruskonstrukte eine drastische Steigerung der Vektorzahl und eine Potenzierung der An- tigenmenge in vivo erzielt. Bei diesem Verfahren wird mit nur einer einzigen Immunisierung dem Immunsystem auf dreierlei Weise HIV- Antigen dargeboten : 1. Zunächst präsentieren die rekombinanten Poxviren lentivirale Glykoproteine, so dass die Poxviruspartikel selbst bereits eine neutralisierende Antikörperantwort hervorrufen. 2. Es

werden in infizierten Zellen HIV-Vektorpartikel produziert, zur erwei- terten Aktivierung einer Immunantwort gegen Vektor- Strukturbestandteile. 3. In infizierten Zellen wird das Transgen exprimiert, prozessiert und ermöglicht so insbesondere die Aktivie- rung zytotoxischer T-Lymphozyten.

Es ist weiterhin besonders vorteilhaft, dass durch und in rekombinan- ten Poxviren Antigene von mehreren genetisch unterschiedlichen HIV-Stämmen gleichzeitig verabreicht werden können. Dadurch ist das Verfahren geeignet, mit einem einzigen Impfstoff und einer ein- zigen Verabreichungsdosis eine kräftige, breit angelegte, kreureakti- ve Immunantwort zu erzeugen. Es ist damit besonders geeignet, die Anzahl der notwendigen Immunisierungen und die benötigte Impf- stoffmenge zu reduzieren.

Bevorzugt ist ein Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort ge- gen Proteine des Humanen Immunschwächevirus (HIV), dadurch gekennzeichnet, dass ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Vi- rusvektor appliziert wird, der ein oder mehrere HIV-Gene als Trans- gen enthält, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthält. Bevorzugt ent- hält der Virusvektor Glykoproteine eines Lentivirus aus der Gruppe "HIV-1, HIV-2, SIV". Bevorzugt enthält der Virusvektor weitere Gene zur Expression von immunregulatorischen Substanzen.

Bevorzugt wird ein Poxvirus enthaltend die Genombestandteile eines replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors, der ein oder mehrere HIV-Gene als Transgen enthält, verabreicht, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen enthält. Bevorzugt enthält das Poxvirusgenom zusätz-

lich zu allen für die Erzeugung eines lentiviralen Vektors notwendi- gen Genen eine oder mehrere weitere Kopien von Genen aus der Gruppe"gag, pol, env, tat, rev, vif, vpu, vpr, nef'aus genetisch un- terschiedlichen Virusstämmen der Gruppe"HIV-1, HIV-2, SIV"unter transkriptioneller Kontrolle eines im Zytoplasma aktiven Promotors enthält.

Bevorzugt wird ein Orthopoxvirus, besonders bevorzugt ein Vakzini- avirus, enthaltend Genombestandteile replikationsinkompetenter len- tiviraler Virusvektoren appliziert. Weiter bevorzugt wird ein in huma- nen Zellen replikationsinkompetentes Poxvirus enthaltend Genom- bestandteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren ap- pliziert. Weiter bevorzugt wird ein Avipoxvirus enthaltend Genombe- standteile replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren appli- ziert.

Bevorzugt sind zusätzlich Gensequenzen für immunregulatorische Proteine im lentiviralen Vektor enthalten. Auch bevorzugt sind zu- sätzlich Gensequenzen für immunregulatorische Proteine im Poxvi- rus-Vektor enthalten. Bevorzugt werden zusätzlich zum rekombinan- ten Poxvirusvektor immunregulatorische Substanzen appliziert. Be- vorzugt wird der rekombinante Poxvirusvektor einem Individuum mehrmals verabreicht wird. Bevorzugt wird der rekombinante Pox- vektor in Zusammenhang hinsichtlich zeitlicher Reihenfolge oder Lo- kalisation mit der Applikation eines weiteren Immunogens aus der Gruppe"Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid-Impfstoff, Viraler und Bakterieller rekombinanter Vektor-Impfstoff, Pseudovirion"oder einem anderen zukünftig noch zu entwickelnden Impfstoffprinzip kombiniert verabreicht.

Weiter bevorzugt werden zwei oder mehr verschiedene rekombinan- te Poxviren, die Vektoren enthalten, welche auf genetischer Basis von unterschiedlichen HIV-Stämmen hergestellt wurden, verabreicht.

Bevorzugt ist auch ein lentiviraler, replikationsinkompetenter Virus- vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Vektor von einem Virus der Gruppe"HIV-1, HIV-2, SIV"abgeleitet ist. Bevorzugt enthält er ein oder mehrere HIV-Gene als Transgen, wobei optional das Transgen Komponenten von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV- Stämmen enthält. Besonders bevorzugt enthält er Glykoproteine ei- nes Lentivirus aus der Gruppe"HIV-1, HIV-2, SIV". Bevorzugt ruft der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvektor eine Immunant- wort gegen HIV-Strukturbestandteile hervor. Bevorzugt ist der lentivi- rale, replikationsinkompetente Virusvektor dadurch gekennzeichnet, dass das Transgen eine kodonoptimierte Nukleinsäuresequenz be- sitzt. Bevorzugt ist der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvek- tor dadurch gekennzeichnet, dass er ein selbst-inaktivierender Vek- tor ist. Bevorzugt ist er auch dadurch gekennzeichnet, dass er weite- re Gene zur Immunstimulation einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zytokine, Hormone, Antikörper, Bakterientoxin unter transkripti- oneller Kontrolle eines eukaryoten Promotors enthält.

Bevorzugt ist der lentivirale, replikationsinkompetente Virusvektor dadurch gekennzeichnet, dass die Genom-Bestandteile des Vektors in einem Poxvirus verpackt sind. Bevorzugt ist auch ein Poxvirus, worin Genombestandteile von zwei oder mehr replikationsinkompe- tenten lentiviralen Virusvektoren enthalten sind, wobei die Genomtei- le der lentiviralen Vektoren von zwei oder mehr unterschiedlichen HIV-Stämmen abgeleitet ist. Bevorzugt sind im Poxvirusgenom Ge- nombestandteile von einem replikationsinkompetenten lentiviralen

Virusvektor und zusätzlich Gene von einem, zwei oder mehr unter- schiedlichen HIV-Stämmen enthalten. Bevorzugt sind Bestandteile des Vektors in einem Orthopoxvirus, insbesondere in einem Vakzini- avirus, verpackt. Bevorzugt sind Bestandteile des Vektors in einem in humanen Zellen replikationsinkompetenten Poxvirus verpackt. Be- vorzugt sind Bestandteile des Vektors in einem Avipoxvirus verpackt.

Bevorzugt sind cis-aktive Regionen zusammen mit dem Transgen sowie die trans-aktiven Strukturgene am gleichen Ort des Poxvirus- genoms integriert. Auch bevorzugt sind cis-aktive Regionen zusam- men mit dem Transgen und die trans-aktiven Strukturgene an ge- trennten Orten des Poxvirusgenoms integriert.

Bevorzugt sind Bestandteile mehrerer Vektorgenome auf Basis un- terschiedlicher HIV-Stämme gleichzeitig im Poxvirusgenom verpackt.

Bevorzugt sind zwei oder mehr Glykoproteingene von genetisch ver- schiedenen HIV-Stämmen gleichzeitig im Poxvirusgenom verpackt.

Bevorzugt wird der Virusvektor intracutan, subcutan, intramuskulär, transdermal, intravenös, intraperitoneal, oder auf Schleimhäute ap- pliziert. Bevorzugt wird der Virusvektor nur einmal appliziert. Auch bevorzugt wird der Virusvektor mehr als einmal appliziert. Bevorzugt wird der Virusvektor in Zusammenhang hinsichtlich zeitlicher Reihen- folge oder Lokalisation mit der Applikation eines weiteren Immuno- gens aus der Gruppe"Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid- Impfstoff, Viraler und Bakterieller rekombinanter Vektor-Impfstoff, Pseudovirion"oder einem anderen zukünftig noch zu entwickelnden Impfstoffprinzip kombiniert verabreicht. Bevorzugt werden zwei oder mehr verschiedene rekombinante Poxviren, die Vektoren enthalten, welche zumindest teilweise auf genetischer Basis von unterschiedli- chen HIV-Stämmen hergestellt wurden, verabreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein replikationsinkompe- tenter lentiviraler Virusvektor, der zur Erzeugung einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) geeignet ist. Erfindungsgemäß ist der replikationsinkompetente lentivirale Vi- rusvektor abgeleitet von mindestens einem Stamm, das heißt "strain", der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1, HIV-2 und SIV.

Der erfindungsgemäße replikationsinkompetente lentivirale Virusvek- tor enthält im Genom, insbesondere als mindestens ein Transgen, ein erstes Lentivirusgen einer Gengruppe, welches aus einem ersten Stamm, das heißt"strain", der Gruppe der Viren bestehend aus HIV- 1, HIV-2 und SIV abgeleitet ist, und ein zweites oder weiteres Lentivi- rusgen, insbesondere der gleichen Gengruppe, welches aus einem zweiten oder weiteren Stamm, das heißt"strain", der Gruppe der Vi- ren bestehend aus HIV-1, HIV-2 und SIV, der von dem ersten Stamm genetisch verschiedenen ist, das heißt insbesondere ein an- derer Stamm ist, abgeleitet ist In einer bevorzugten Ausführungsform des Virusvektors kodiert das Lentivirusgen, insbesondere das mindestens eine Transgen, ein Glykoprotein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Virusvektors ist das Lentivirusgen, insbesondere das mindestens eine Transgen, ein Gen der Gruppe der Gene bestehend aus gag, pol und nef. Besonders bevorzugt sind erstes und zweites und weite- res Lentivirusgen Gene der gleichen Gengruppe, vorzugsweise der Gengruppe bestehend aus gag, pol und nef.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der lentivirale Vektor ein selbst-inaktivierender Vektor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Virusvektors steht das Transgen unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryo- ten nukleär aktiven Promotors. In einer besonders bevorzugten Aus- führungsform ist der Promotor der SFFV-Promotor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Virusvektors enthält das Genom, insbesondere das Transgen, mindestens ein weiteres Gen zur Expression mindestens einer immunregulatori- schen Substanz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kodiert das mindestens eine weitere Gen ein Zytokin, Hormon, Anti- körper oder Bakterientoxin unter transkriptioneller Kontrolle eines eukaryoten nukleär aktiven Promotors.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Virusvek- tor, insbesondere abgeleitet von einem Lentivirusstamm aus der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1, HIV-2 und SIV, der im Ge- nom mindestens eine Kopie einer kodonoptimierten Nukleinsäurese- quenz, insbesondere dargestellt in SEQ ID NO. 1, nämlich die syn- gag-Sequenz, enthält.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombi- nanter Poxvirusvektor, der insbesondere zur Erzeugung einer Im- munantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV), bevorzugt zur Immunisierung und/oder Immuntherapie, geeig- net ist. Der erfindungsgemäße rekombinante Poxvirusvektor ist ab- geleitet aus einem Poxvirus. Der erfindungsgemäße rekombinante Poxvirusvektor enthält im Genom (a) erste Genombestandteile eines lentiviralen Virusvektors zur Expression lentiviraler Virusvektoren, enthaltend (i) mindestens eine erste lentivirale Expressionskassette, (ii) mindestens ein erstes env-Gen und (iii) mindestens ein erstes

gag-Gen, insbesondere in Verbindung mit einem pol-Gen, bevorzugt gag-und pol-Gene, wobei die ersten Genombestandteile jeweils ab- geleitet sind von einem ersten Stamm ("strain") der Gruppe der Viren HIV-1, HIV-2 oder SIV, und ; (b) mindestens einen weiteren, insbe- sondere von den ersten Genombestandteilen genetisch verschiede- nen, Genombestandteil, der aus einem zweiten Stamm ("strain") der Gruppe der Viren HIV-1, HIV-2 oder SIV abgeleitet ist und mindes- tens ersten Genombestandteilen (i) bis (iii) entspricht oder darin ent- halten ist, mit der Maßgabe, dass der zweite oder weitere Stamm der Gruppe der Viren HIV-1, HIV-2 oder SIV vom ersten Stamm der Gruppe der Viren HIV-1, HIV-2 oder SIV genetisch verschieden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der mindestens eine weite- re Genombestandteil ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einer zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette, welche aus dem zweiten Stamm der Viren HIV-1, HIV-2 oder SIV abgeleitet ist, (b) einem Transgen mit einem ersten Lentivirusgen einer Gengruppe abgeleitet aus dem ersten Stamm und einem zweiten oder weiteren davon genetisch verschiedenen Lentivirusgen der gleichen Gengruppe, also bevorzugt ein entsprechendes ein Gly- koprotein kodierendes Gen, gag-Gen, pol-Gen oder nef-Gen, das aus dem zweiten Stamm abgeleitet ist, (c) einem zweiten oder weite- ren env-Gen aus dem zweiten Stamm, (d) einem zweiten oder weite- ren gag-Gen aus dem zweiten Stamm, insbesondere in Verbindung mit dem ersten pol-Gen oder einem weiteren pol-Gen aus dem zwei- ten Stamm.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Transgen als der min- destens eine weitere Genombestandteil in der ersten lentiviralen Ex- pressionskassette lokalisiert. In einer weiteren bevorzugten Ausfüh-

rungsform ist das Transgen als der mindestens eine weitere Ge- nombestandteil in der zweiten oder weiteren lentiviralen Expressi- onskassette lokalisiert.

Erfindungsgemäß enthält der Poxvirusvektor also Genombestandtei- le aus mindestens einem lentiviralen Virusvektor, die die Expression von infektiösen Partikeln wie lentivirale Virusvektoren erlauben, wo- bei mindestens ein Genombestandteil, insbesondere Gen, bevorzugt gag-und env-Gen beziehungsweise ein Gen kodierend ein oder mehrere Glykoproteine, mindestens zweifach enthalten ist, wobei die erste Kopie des Gens von einem ersten Stamm der Gruppe der Vi- ren HIV-1, HIV-2 oder SIV abgeleitet ist und die zweite und/oderwei- tere Kopie von einem zweiten oder weiteren Stamm der Gruppe der Viren HIV-1, HIV-2 oder SIV abgeleitet ist, wobei der zweite oder weitere Stamm vom ersten Stamm genetisch verschiedenen ist.

Bevorzugt sind zwei oder mehr gag-pol-Gene von genetisch ver- schiedenen HIV-Stämmen gleichzeitig im Poxvirusgenom verpackt.

Bevorzugt ist für die Erzeugung eines lentiviralen Vektors enthaltend ein exprimierbares Transgen sind in dem rekombinanten Poxvirus- vektor verpackt : Mindestens eine lentivirale Expressionskassette (A) enthaltend mindestens eine 5'-LTR, mindestens eine Verpackungs- sequenz, mindestens einen nukleär aktiven eukaryoten Promotor, das Transgen oder mehrere dieser Transgene, mindestens eine 3'- LTR, wobei die LTR-Regionen bevorzugt zumindest Integrationsstel- len zur Integration ins Wirtszellgenom, mindestens ein Transkripti- onsstartsignal, vorzugsweise TATA-Box, und mindestens eine Pri- mer-Bindungsstelle (zum Start der Reversen Transkription) enthal- ten. Diese Kassette steht unter Kontrolle mindestens eines zy- toplasmatisch aktiven Promotors, beispielsweise eines Poxviruspro-

motors, insbesondere eines frühen Poxviruspromotors ; und (B) Gene für die Strukturproteine gag und env und mindestens ein pol-Gen, das die für die Replikation notwendigen Enzyme kodiert, wobei diese Gene bevorzugt unter Kontrolle zytoplasmatisch aktiver Promotoren stehen. Vorzugsweise liegen diese Gene in Form von gag-pol- Genkassetten und env-Genkassetten, insbesondere besitzen die gag-pol-Genkassette und die env-Genkassette jeweils einen eigenen zytoplasmatisch aktiven Promotor. Gag-pol kann mit einem gemein- samen Promotor oder getrennt als gag und pol-Gene mit eigenen Promotoren versehen sein. Besonders bevorzugt liegt das gag-pol- Leseraster zusammen mit der lentiviralen Expressionskassette (A) zwischen den 5'-LTR und 3'-LTR und verwendet bevorzugt den glei- chen Promotor (Figur 6). Es kann jedoch auch an einer anderen Stelle in das Poxvirusgenom integriert sein (Figur 7). Weiterhin be- vorzugt liegt das env-Gen zusammen mit seinem zytoplasmatisch aktiven Promotor außerhalb der lentiviralen Expressionskassette (A).

Die verpackte mindestens eine lentivirale Expressionskassette (A) enthält, bevorzugt als mindestens ein Transgen, ein oder mehrere lentivirale Gene, insbesondere HIV-Gene. Besonders bevorzugt ist ein Transgen ein Teil mindestens eines gag-Gens, bei dem bevor- zugt zusätzlich der Codon-Gebrauch geändert wurde. In einer weite- ren bevorzugten Variante ist ein Transgen von einem gag-pol-Gen, einem gag-pol-nef-Gen, einem env-Gen und/oder eine andere Kom- bination von lentiviralen Genen, insbesondere HIV-Genen abgeleitet, gegen die bevorzugt eine Immunantwort erzeugt werden soll.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind in das Genom des Poxvirusvektors alle Genkassetten mehrfach eingebaut. So sind vorzugsweise zwei oder mehr lentivirale Expressionskassetten, zwei oder mehr env-Gene, und/oder zwei oder mehr gag-pol-

Genkassetten eingebaut. Durch die Verwendung mehrerer Gen- Kassetten (einer Art), wobei jeweils die zwei oder mehr Transgene, die zwei oder mehr gag-pol-Gene und die zwei oder mehr env-Gene aus unterschiedlichen Virusstämmen stammen, werden in den Pox- virus-infizierten Zellen eine Vielzahl unterschiedlicher lentiviraler, in- fektiöser vermehrungsunfähiger Vektoren gebildet. Besonders be- vorzugt ist, dass mehrere Genkassetten für das env-Gen, das auch in der Natur besonders variabel ist, eingebaut sind. Der so erfin- dungsgemäß bereitgestellte"Schwarm"ähnlicher Vektoren enthält besonders vorteilhaft sehr viel mehr immunogene Epitope als ein Vektor gebildet aus einem einzelnen Virusstamm und erzeugt da- durch eine breiter angelegte Immunantwort.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Poxvirusvektor Genombestandteile von mindestens zwei genetisch verschiedenen lentiviralen Virusvektoren, abgeleitet von jeweils einem anderen ge- netisch verschiedenen Virusstamm von HIV-1, HIV-2 oder SIV.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erste und/oder zweite oder weitere lentivirale Expressionskassette die gag-und pol- Gene als gag-pol-Leseraster.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt das erste env- Gen, insbesondere zusammen mit einem zytoplasmatisch aktiven Promotor, dass außerhalb der ersten und/oder zweiten oder weiteren lentiviralen Expressionskassette vor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stehen die im Ge- nom des Poxvirusvektors enthaltenen Genombestandteile des lenti- viralen Virusvektors unter transkriptioneller Kontrolle eines im Zytop- lasma aktiven Promotors.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind im Genom des Poxvirusvektors in der ersten und/oder zweiten oder weiteren lentivi- ralen Expressionskassette mindestens ein cis-aktiver Bereich eines lentiviralen Virusvektors zusammen mit mindestens einem Transgen des lentiviralen Virusvektors und mindestens einem trans-aktiven gag-und/oder env-Gen am gleichen Ort im Genom des Poxvirus in- tegriert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind im Ge- nom des Poxvirusvektors in der ersten und/oder zweiten oder weite- ren lentiviralen Expressionskassette mindestens ein cis-aktiver Be- reich eines lentiviralen Virusvektors zusammen mit mindestens ei- nem Transgen des lentiviralen Virusvektors und mindestens einem trans-aktiven gag-und/oder env-Gen an getrennten Orten im Genom des Poxvirus integriert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Poxvirusvektors ist das Poxvirus, von dem der Poxvirusvektor abgeleitetet ist, ausge- wählt aus der Gruppe der Poxviren bestehend aus Orthopoxviren, insbesondere Vakziniaviren, und Avipoxviren.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist im Genom des Poxvirusvektors mindestens ein Gen kodierend für ein immunregula- torisches Protein enthalten. Das immunregulatorische Gen liegt be- vorzugt als Transgen vor und/oder separat im Poxvirusgenom. Als Transgen ist es vorzugsweise entweder innerhalb einer einzelnen lentiviralen Expressionskassette zusammen mit dem Transgen, das für ein oder mehrere lentivirale Gene, insbesondere HIV-Gene, ko- diert, integriert, wobei das immunregulatorische Gen einen eigenen nukleär aktiven Promotor besitzt, oder es liegt als Transgen in einer eigenen lentiviralen Expressionskassette vor, wenn zumindest eine weitere lentivirale Expresssionskassette enthaltend ein oder mehrere

HIV-Gene im Poxvirusgenom integriert ist. Liegt das immunregulato- rische Gen nicht als Transgen sondern im Poxvirusgenom separat integriert vor, so erhält es bevorzugt einen eigenen zytoplasmatisch aktiven Promotor.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Poxvirusvektors ist dieser dadurch gekennzeichnet, dass in dem Genombestandteil aus dem lentiviralen Virusvektor mindestens ein Gen kodierend min- destens ein immunregulatorisches Protein enthalten ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektors zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) sowie zur Herstellung eines Arzneimit- telkits zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).

In diesem Zusammenhang wird unter Immuntherapie ein therapeuti- sches Verfahren verstanden, bei der ein Krankheitszustand durch ein immunologisches Verfahren behandelt wird. In diesem Zusam- menhang wird unter Immunisierung ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Verfahren, insbesondere Impfung, verstanden, bei der im tierischen oder menschlichen Organismus, insbesondere dem Körper (in vivo), aber auch in Gewebe und Zellkulturen (in vitro), eine Immunantwort hervorgerufen wird, damit es bei einem späteren Kon- takt mit dem Krankheitserreger nicht zu einer Erkrankung kommt.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Konstrukte sind bevorzugt für beides geeignet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines Poxvirusvektors, enthaltend im Genom mindes-

tens zwei genetisch verschiedene Lentivirusgene aus jeweils einem anderen Virusstamm aus HIV-1, HIV-2 oder SIV zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevi- rus (HIV) sowie zur Herstellung eines Arzneimittelkits zur Immune- rapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwä- chevirus (HIV).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines Poxvirusvektors, enthaltend im Genom geneti- sche Strukturen zur Bildung infektiöser replikationsinkompetenter lentiviraler Virusvektoren, welche in mindestens einem Transgen mindestens ein Lentivirusgen aus Stämmen ausgewählt aus der Gruppe der Viren bestehend aus HIV-1, HIV-2 oder SIV aufweisen, zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) sowie zur Herstellung eines Arzneimit- telkits zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines Poxvirusvektors zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevirus (HIV) so- wie zur Herstellung eines Arzneimittelkits zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung gegen das humane Immunschwächevi- rus (HIV) Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung enthaltend mindes- tens einen replikationsinkompetenten lentiviralen Virusvektor.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit zur Immuntherapie und/oder zur Immunisierung enthaltend mindes-

tens einen Poxvirusvektor. In einer bevorzugten Variante enthält das Kit zusätzlich immunregulatorische Substanzen. In einer weiteren bevorzugten Variante enthält das Kit mindestens ein weiteres Immu- nogen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein-, Peptid-, Lipopetid-, DNA-Plasmid-Impfstoffen, Impfstoffen viraler und bakteri- eller rekombinanter Vektoren und Pseudovirionen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) im tierischen oder menschli- chen Organismus, das die Schritte des Bereitstellens des replikati- onsinkompetenten lentiviralen Virusvektors (Schritt a), der Applikati- on, das heißt Verabreichen, insbesondere Impfen, des replikation- sinkompetenten lentiviralen Virusvektors in den tierischen oder menschlichen Organismus, insbesondere den Körper (in vivo), aber auch in Gewebe und Zellkulturen (in vitro) (Schritt b), und der Induk- tion, das heißt Erzeugen, einer Immunantwort, insbesondere Immu- nisierung, gegen Proteine des HIV im tierischen oder menschlichen Organismus (Schritt c) enthält, insbesondere daraus besteht.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Induktion einer Immunantwort gegen Proteine des humanen Immunschwächevirus (HIV) im tierischen oder menschli- chen Organismus, das die Schritte des Bereitstellens des rekombi- nanten Poxvirusvektors (Schritt a), der Applikation, das heißt Vera- breichen, insbesondere Impfen, des Poxvirusvektors in den tieri- schen oder menschlichen Organismus, insbesondere den Körper (in vivo), aber auch in Gewebe und Zellkulturen (in vitro) (Schritt b) und der Induktion einer Immunantwort, insbesondere Immunisierung,

gegen Proteine des HIV im tierischen oder menschlichen Organis- mus (Schritt c) enthält, insbesondere daraus besteht.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens wird die Applikation des Virusvektors in den tierischen oder menschlichen Organismus (Schritt b) einmal durchgeführt. In einer weiteren bevorzugten Vari- ante wird der Virusvektor in den tierischen oder menschlichen Orga- nismus (Schritt b) mehrfach wiederholt appliziert, das heißt verab- reicht, insbesondere geimpft.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden in Schritt b) zusätzlich mindestens eine immunregulatorische Substanz appliziert, das heißt verabreicht, insbesondere geimpft.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens wird in Schritt b) zusammen mit dem Virusvektor am gleichen Ort, insbesondere am gleichen Applikationsort, insbesondere gleichzeitig oder zu einem späteren Zeitpunkt, und/oder gleichzeitig und bevorzugt an einem anderen Applikationsort, mindestens ein weiteres Immunogen aus- gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Protein Impfstoffen, Peptid- <BR> <BR> <BR> <BR> Impfstoffen, Lidopeptid-Impfstoffen, DNA-Plasmid-Impfstoffen, Impf- stoffen virale rekombinante Vektor-Impfstoffen, bakterieller rekombi- nanter Vektor-Impfstoffen und Pseudovirionen, appliziert, das heißt verabreicht, insbesondere geimpft.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens erfolgt die Applikation in Schritt b) auf die Schleimhaut, intracutan, subcutan, transdermal, intranasal, intramusculär, intraperitoneal und/oder intra- venös, ohne oder zusammen mit Adjuvans.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden in Schritt a) mindestens zwei genetisch verschiedene rekombinante Poxviren nach einem der Ansprüche 9 bis 17 bereitgestellt werden, wobei die verschiedenen Poxviren jeweils Genombestandteile von mindestens zwei verschiedenen lentiviralen Virusvektoren, abgeleitet von jeweils einem anderen Lentivirusstamm aus der Gruppe beste- hend aus HIV-1, HIV-2 und SIV, enthalten, und in Schritt b) die min- destens zwei genetisch verschiedenen Poxviren appliziert.

Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind auch die Ver- fahren zur Herstellung der Virusvektoren, insbesondere des replia- tionsinkompetenten lentiviralen Virusvektors und des rekombinanten Poxvirusvektors.

Schließlich sind Gegenstände der vorliegenden Erfindung auch Anti- körper, monoklonale sowie polykonale, gerichtet gegen den replikati- onsinkompetenten lentiviralen Virusvektor und/oder den rekombinan- ten Poxvirusvektors, insbesondere spezifisch bindend an Epitope der Proteine oder Strukturen der Vektoren und/oder von den Vektoren und/oder den damit infizierten Wirtszellen gebildeten Proteine oder Strukturen.

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht beschränkenden Ausführungsbeispielen und Figuren näher erläutert.

Es zeigen Figur 1 : Plasmid pGJ2syngag zur Herstellung eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren

Figur 2 : Plasmid pSFsyngag als HIV-gag-Expressionsplasmid zur Impfung in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Vektorkonstrukt Figur 3 : Zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) -Antwort in Balb/c- Mäusen nach Impfung mit einer Kombinationsimpfung aus DNA-Vakzine pSFsyngag und lentiviralem Vektor pGJ2syngag enthaltend das Syngag-Protein.

Figur 4 : HIV-Gag/p55-spezifische humorale Immunantwort in Balb/c-Mäusen nach Impfung mit einer Kombinationsimp- fung aus DNA-Vakzine pSFsyngag und lentiviralem Vektor pGJ2syngag enthaltend das Syngag-Protein.

Figur 5 : Plasmid pEnv (Lig) zur Herstellung eines Vektors für ein erfindungsgemäßes Verfahren enthaltend die Glykopro- teine von HIV-1.

Figur 6 : Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus (Stamm Copenhagen) enthaltend die Gensequenzen eines lentivi- ralen, replikationsinkompetenten Vektors auf Basis von pGJ2syngag und der HIV-1-Glykoproteine.

Figur 7 : Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus enthal- tend die cis-aktiven Elemente sowie das Transgen eines lentiviralen Vektors auf Basis von pVeksyngag sowie die HIV-Gene gag-pol und env unter transkriptioneller Kontrol- le von Vakziniavirus-Promotoren eingefügt in unterschied- liche Genorte des Vakzinia-Virusgenoms.

Das Sequenzprotokoll enthält : SEQ ID NO. 1 Die Nukleotidsequenz von"syngag", einem syn- thetisch hergestellten Gen, dessen Gensequenz für die HIV-Gag-Proteine p17 und p24 kodiert ; SEQ ID NO. 2 Die Nukleotidsequenz des immunstimulatori- schen CpG-Oligodinukleotids (CpG-ODN).

Beispiel 1 : Immunisierung mit einem HIV-1-Vektor enthaltend hu- manisiertes, synonymes gag/p39 (syngag) A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997 ; 71 : 7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel ent- fernt. Das HIV-1-Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssH !) und Aflll sowie mit Afilll und Xbal verdaut. Der 3'- Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV- LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/Afllil und Afllll/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekon- struierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssH ! ! und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wur- den miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulä- ren Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 11021 und Asp718 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dadurch wurde das Konstrukt pGJ2 erhalten. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV)-Promotor in den Bereich der Esp31-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Syngag,

dargestellt in SEQ ID No. 1, ist ein synthetisch hergestelltes Gen, dessen Gensequenz für die HIV-Gag-Proteine p17 und p24 kodiert.

Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf Figur 1 hingewiesen wird.

A) pczVSV-G wurde hergestellt gemäß der Literaturstelle (Pietschmann et al (2000),"Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export"J. Virol. 73 : 2613-2621).

B) Die Plasmide pGJ2syngag und pczVSV-G wurden durch die CaC12-Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23.

No. 4.628-633) in 293T-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h in- kubiert. Anschließend wurde mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Me- dium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium in- kubiert. Dazu wurde zu diesem Zeitpunkt Medium verwendet, das frei von fötalem Rinderserum (FCS) ist. Dabei entstehen replikation- sinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand iso- liert und durch Ultrazentrifugation (45 000 g, 150 min., 4° C) konzent- riert wurden.

C) Die Expression des Transgens wurde getestet indem zu HEK 293-Zellen Zellkulturüberstand enthaltend die replikationsinkompe- tenten Virusvektoren gegeben und die Zellen für 48-72 Stunden bei 37° C inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen lysiert und das Lysat durch Western-Blot-Test analysiert. Dabei wurde ein HIV-Gag/p24-spezifischer monoklonaler Antikörper zum Protein- Nachweis eingesetzt. Die Untersuchung zeigt die Expression eines

Gag-Proteins in transduzierten Zellen mit einem Molekulargewicht von etwa 39 kD.

D) Die Vektoren wurden direkt vor der Applikation mit 10 mg im- munstimulatorischen CpG-Oligodinukleotiden (CpG-ODN) mit der Nukleinsäuresequenz 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3', dar- gestellt in SEQ ID NO. 2, gemischt. Für die Austestung der Immuno- genität wurde Mäusen (Mus musculus) des Inzuchtstamms Balb/c 5 x 106 infektiöse Einheiten der Vektoren enthaltend die CpG-ODN (SEQ ID NO. 2) intraperitoneal injiziert. Die Immunisierung wurde nach 2 Wochen wiederholt. Weitere 12 Tage später wurden die Mäuse getötet, Blut entnommen und die humorale Immunantwort gegen Vektorbestandteile untersucht. Es wurden fünf Tiere immuni- siert.

E) Die Gag-spezifische Antikörperantwort wurde durch Enzyme- linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Dabei wurde eine Mikrotiterplatte mit in E. coli hergestelltem HIV-1 Gag/p55-Protein (2,5 mg/ml) beschichtet. Anschließend wurde Serum aus immunisier- ten Mäusen gewonnen und in einer Verdünnungsreihe auf die Platte pipettiert. Daraufhin wurde ein Detektionsantiserum (Kaninchen-anti- Maus-IgG), das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, zugege- ben sowie anschließend Substrat. Die Extinktion bei 450 nm wurde photometrisch bestimmt und der Titer an Gag/p55-spezifischen Anti- körpern wurde ermittelt als das Reziprok der Serumverdünnung, de- ren Extinktion größer war als die Extinktion von Kontrollserum nicht immunisierter Tiere. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Gag-spezifischen Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit dem Vektor pGJ2-syngag geimpft wurden, wozu auf Tabelle 1 hin- gewiesen wird. Tabelle 1 : Titer anti-Gag/p55-spezifischer Antikörper in Mäusen nach zweimaliger Impfung mit pGJ2syngag Anti-Gag/p55-Antikörpertiter lmmunisierung Maus 1 Maus 2 Maus 3 Maus 4 Maus 5 2 x pGJ2syngag 12800 12800 12800 12800 12800

F) Die Konzentration an neutralisierenden Antikörpern wurde durch den Neutralisationstest bestimmt. Dabei wurde Serum in Form einer Verdünnungsreihe zu 100 TCID50 von mit VSV-G pseudotypi- sierten pGJ2-GFP-Vektoren, das sind pGJ2syngag-ähnliche Vekto- ren, die als Transgen anstelle von syngag das Grün-fluoreszierende Protein GFP tragen, gegeben und mikroskopisch untersucht, bis zu welcher Serumverdünnung die Markergenexpression unterdrückt werden kann. Der Neutralisationstiter entspricht dem Reziprokwert der höchsten Verdünnung, bei der noch eine vollständige Hemmung der GFP-Expression beobachtet wurde. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Vektor-neutralisierenden Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit dem Vektor pGJ2syngag geimpft wurden, wozu auf Tabelle 2 hingewiesen wird.

Tabelle 2 : Titer neutralisierender, anti-VSV-G-Glykoprotein- spezifischer Antikörper in Mäusen nach zweimaliger Impfung mit pGJ2syngag Titer neutralisierender Antikörper Immunisierung Maus 1 Maus 2 Maus 3 Maus 4 Maus 5 2 x pGJ2syngag 32768 65536 32768 32768 16384

Beispiel 2 : Immunisierung mit einem HIV-1-Vektor enthaltend hu- manisiertes, synonymes gag/p39 (syngag) in Kombina- tion mit einem DNA-Plasmid A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997 ; 71 : 7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel ent- fernt. Das HIV-1-Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssHll und Aflll sowie mit Aflill und Xbal verdaut. Der 3'- Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV- LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/Afllll und Afllll/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekon- struierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssH)) und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wur- den miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulä- ren Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 11021 und Asp718 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dieses Konstrukt ist pGJ2. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV) -Promotor in den Bereich der Esp31-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf Figur 1 hingewiesen wird.

B) pczVSV-G wurde hergestellt gemäß der Literaturstelle (Pietschmann et al (2000),"Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export"J. Virol. 73 : 2613-2621).

C) Die beiden rekombinanten Plasmid-DNAs wurden durch die CaCl2-Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23.

No. 4.628-633) in 293T-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h in- kubiert. Anschließend wurde mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Me- dium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium in- kubiert. Dazu wurde Medium verwendet, das frei von fötalem Rinder- serum ist. Dabei entstehen replikationsinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand gewonnen und durch Ultrazentrifu- gation (45 000 g, 150 min., 4° C) konzentriert wurden.

D) Ein syngag-enthaltendes Expressionsplasmid wurde herge- stellt, indem das syngag-Gen (SEQ ID NO. 1) zusammen mit dem Promotor des Spleen Focus-Forming Virus in den Vektor pcDNA3. 1zeo (Invitrogen) kloniert wurde. Dadurch wurde das Plas- mid pSFsyngag erhalten, wozu auf Figur 2 hingewiesen wird.

E) 100 mg pSFsyngag Plasmid-DNA wurden mit 10 mg CpG- ODN (SEQ ID NO. 2) gemischt und zur Austestung der Immunogeni- tät Mäusen (Mus musculus) des Inzuchtstamms Balb/c je 50 mg DNA/5 mg CpG-ODN in die Mm. quadriceps beider Hinterbeine inji- ziert. Drei Wochen später wurden aus pGJ2syngag und pczVSV-G hergestellte Vektoren mit 10 mg immunstimulatorischen CpG- Oligodinukleotiden (CpG-ODN) (Nukleinsäuresequenz 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3') gemischt. 5 x 106 infektiöse Einheiten der Vektoren enthaltend die CpG-ODN wurden intraperitoneal inji- ziert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse getötet, die Milz und Blut entnommen und die zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antwort sowie die humorale Immunantwort gegen das HIV-Gag-Protein ge- messen. Als Kontrollen wurden Balb/c-Mäuse zweimal mit Plasmid- DNA immunisiert. Es wurden je fünf Tiere immunisiert.

F) Die HIV-Gag-spezifische CTL-Antwort wurde wie folgt analy- siert : Die entnommene Milz wurde zerkleinert, die Erythrozyten in Ammoniumchlorid-haltiger hypotoner Lösung lysiert und die mono- nukleären Zellen isoliert. Die CTL-Reaktion wurde durch den ELIS- pot-Test untersucht. Dafür wurden die mononukleären Zellen in eine mit einer Membran versehene Mikrotiterplatte, die mit Antikörpern gegen Maus-Interferon-g (IFN-g) beschichtet war, ausgesät. Zusätz- lich wurde als Antigen ein Peptid aus dem Bereich des HIV-Gag/p24- Proteins mit der Aminosäuresequenz"AMQMLKETI"in einer Kon- zentration von 10 mg/ml zugegeben. Die Zellen wurden mit dem An- tigen für 40 h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Anschließend wur- den die Zellen abgewaschen und die IFN-g-Produktion mit einem immunologischen Detektionssystem nachgewiesen. In diesem De- tektionssystem wurde ein mit Streptavidin konjugierter Anti-IFN-g- Antikörper als Nachweisantikörper zugegeben. Durch Zugabe von an Biotin gekoppelter Alkalischer Peroxidase und Substrat läuft eine Farbreaktion dort ab, wo durch antigenspezifische Lymphozyten IFN- g produziert und an die Membran der Mikrotiterplatte gebunden wur- de. Die in diesem Test sichtbar werdenden Spots entsprechen durch das Gag-Peptid AMQMLKETI aktivierten zytotoxischen T- Lymphozyten. Die Spots wurden mithilfe eines Sektionsmikroskops ausgezählt und die Anzahl der Spots bezogen auf 106 mononukleä- re Milzzellen ermittelt, wozu auf Figur 3 hingewiesen wird.

G) Die Gag-spezifische Antikörperantwort wurde durch Enzyme- linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Dabei wurde eine Mikrotiterplatte mit in E. coli hergestelltem HIV-1 Gag/p55-Protein (2,5 mg/ml) beschichtet. Anschließend wurde Serum aus immunisier- ten Mäusen gewonnen und in einer Verdünnungsreihe auf die Platte pipettiert. Daraufhin wurde ein Detektionsantiserum (Kaninchen ge-

gen Maus-IgG), das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, zuge- geben sowie anschließend Substrat. Die Extinktion bei 450 nm wur- de photometrisch bestimmt und der Titer an Gag/p55-spezifischen Antikörpern wurde ermittelt als das Reziprok der Serumverdünnung, deren Extinktion größer war als die Extinktion von Kontrollserum nicht immunisierter Tiere. Diese Untersuchung zeigt die Induktion einer Gag-spezifischen Antikörperantwort im Blut von Mäusen, die mit pSFsyngag und dem Vektor pGJ2-syngag geimpft wurden, wozu auf Figur 4 hingewiesen wird.

Beispiel 3 : Konstruktion eines Vektors, der das Glykoprotein von HIV-1 enthält.

A) Aus dem Plasmid pczHSRV2 (Moebes et al., J. Virol. 1997 ; 71 : 7305-7311) wurde das Foamyvirus-Genom und der 3'-Teil des CMV-Promotors durch Restriktionsverdau mit Pmel und Ndel ent- fernt. Das HIV-1-Plasmid pHXB2D (Gen-Bank Nr. K03455 M38432) wurde mit BssH !) und Aflll sowie mit Afllll und Xbal verdaut. Der 3'- Teil des CMV-Promotors und der 5'-Teil der R-Region aus dem HIV- LTR wurden mit Hilfe der rekombinanten PCR rekonstruiert. Die BssHII/Afllll und Afllll/Xbal-Fragmente aus pHXB2D, das rekon- struierte CMV-Promotor/HIV-R-Konstrukt, verdaut mit BssHll und Ndel, und das Ndel/Pmel-Fragment des Plasmids pczHSRV2 wur- den miteinander ligiert. Durch rekombinante PCR wurden die zellulä- ren Restsequenzen aus pHXB2D entfernt. Durch Verdau mit Pvull und EcoRV wurde eine Deletion in der 3'-U-Region vorgenommen, wodurch die TATA-Box entfernt wurde. Durch Verdau mit Bpu 11021 und Asp718 wurde das nef-Gen teilweise entfernt. Dieses Konstrukt ist pGJ2. Anschließend wurde das syngag-Gen zusammen mit dem Spleen Focus-Forming Virus (SFFV) -Promotor in den Bereich der

Esp31-Schnittstelle in pGJ2 hineinligiert. Dadurch wurde das Plasmid pGJ2syngag erhalten, wozu auf Figur 1 hingewiesen wird.

B) Das Plasmid pHXB2 wurde mit den Restriktionsenzymen Sall und Xhol geschnitten. Dabei entsteht ein 3,1 kb großes Fragment, welches unter anderem das gesamte Leseraster des env-Gens ent- hält. Dieses Fragment wurde über eine Xhol-Schnittstelle in den pC- DNA (-) Vektor (Invitrogen) kloniert. Dieses Plasmid wurde mit Bpil und Xhol geschnitten und das so erhaltene Bpil/Xhol-Fragment ent- hält das komplette Leseraster des env-Gens. Die 5'-Überhänge der Schnittstellen wurden durch die Behandlung mit der Klenow- Polymerase aufgefüllt. Das eukaryotische Expressionsplasmid pCI (Promega), welches ein Intron und einen CMV-Promotor enthält, wurde mit Smal geschnitten und das Bpil/Xhol Fragment hinein klo- niert. Dadurch wurde das Plasmid pEnv (Lig), bei dem das HIV-1- env-Gen unter Kontrolle des CMV-Promotors steht, erhalten, wozu auf die Figur 5 hingewiesen wird.

C) Die beiden rekombinanten Plasmid-DNAs werden durch die CaCl2 Methode (Soneoka et al. Nucl. Acids Research 1995. Vol. 23.

No. 4.628-633) in 293T-Zellen transfiziert. Die Zellen werden für 8 h bei 37°C inkubiert, das Medium gewechselt und für weitere 16 h in- kubiert. Anschließend wird mit Natrium-Butyrat die Transkription der Vektor-DNA induziert, nach 8h das Natrium-Butyrat-haltige Medium entfernt und die Zellen für weitere 16 h in frischem Medium inkubiert.

Dabei entstehen replikationsinkompetente Virus-Vektoren, die aus dem Zellkulturüberstand isoliert werden.

Beispiel 4 : Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus zur Expression des Vektors pGJ2syngag Durch PCR wird das 5'-Ende der Expressionskassette von pGJ2syngag unterhalb des CMV-Promotors amplifiziert, wobei gleichzeitig am 5'Ende der Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vak- ziniavirus sowie Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Eagl und Xhol angefügt werden. Durch PCR wird auch das 3'-Ende der Ex- pressionskassette von pGJ2syngag amplifiziert, wobei gleichzeitig das Vakziniavirus-Immediate Early Gen Stop-Signal TTTTTGT hinter der 3'R-Region eingefügt wird. Die Fragmente werden zusammen mit dem mittleren Teil der Expressionskassette aus pGJ2syngag in das Plasmid pBK-CMV ligiert. Anschließend wird das modifizierte pGJ2syngag-Vektorgenom durch das Restriktionsenzym Eagl he- rausgeschnitten und in die Notl-Schnittstelle eines Vakziniavirus (Stamm Copenhagen) hineinkloniert. 143B Tk-Zellen werden mit der ligierten Vakziniavirus-DNA transfiziert und nach Inkubation für 24-72 h rekombinante Vakziniaviren aus dem Zelllysat gewonnen.

Vakziniaviren werden kloniert und rekombinante Vakzinaviren, die pGJ2-syngag-Vektorkomponenten exprimieren, selektiert. Eine Ex- pressionskassette enthaltend das HIV-1-env-Gen, aus dem die Transskriptionsstopps entfernt wurden, unter transkriptioneller Kon- trolle des Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vakziniavirus wird durch homologe Rekombination in den Thymidinkinasegen (tk)- Locus des Vakziniavirus enthaltend pGJ2syngag hineinkloniert, wozu auf Figur 6 hingewiesen wird.

Beispiel 5 : Konstruktion eines rekombinanten Vakzinia-Virus zur Expression des Vektors pVeksyngag Durch PCR wird das 5'-Ende der Expressionskassette von pGJ2syngag unterhalb des CMV-Promotors amplifiziert, wobei gleichzeitig am 5'-Ende der Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vak- ziniavirus sowie Schnittstellen für die Restriktionsenzyme Eagl und Xhol angefügt werden. Durch PCR wird auch das 3'-Ende der Ex- pressionskassette von pGJ2syngag amplifiziert, wobei gleichzeitig das Vakziniavirus-Immediate Early Gen Stop-Signal TTTTTGT hinter der 3'R-Region eingefügt wird. Die Fragmente werden zusammen mit dem mittleren Teil der Expressionskassette aus pGJ2syngag in das Plasmid pBK-CMV ligiert. Anschließend werden die Genbereiche für den 3'-Bereich von gag, pol, vif, vpr, rev, tat und env durch Restriktionsverdau mit Bael und Bsml entfernt. Dadurch wird eine Genkassette erhalten, die am 5'-Ende den Promotor p7.5, die HIV- LTR-Strukturen R und U5, das 5'-Teil des gag-Leserasters, den Promotor pSFFV und das Transgen syngag sowie die partiell dele- tierte und verkürzte 3'-HIV-LTR-Region enthält (pVeksyngag). Das pVeksyngag-Vektorgenom wird durch das Restriktionsenzym Eagl herausgeschnitten und in die Notl-Schnittstelle eines Vakziniavirus (Stamm Copenhagen) in Gegenwart des Restriktionsenzyms Notl hineinkloniert. 143B Tk--Zellen werden mit der ligierten Vakziniavi- rus-DNA transfiziert, mit Geflügelpockenvirus infiziert, und nach In- kubation für 3-5 Tage werden rekombinante Vakziniaviren aus dem Zelllysat gewonnen. Vakziniaviren werden in Zellkultur kloniert und Viren, die pVeksyngag-RNA exprimieren, selektiert. Eine Expressi- onskassette enthaltend das HIV-1-env-Gen ohne kryptische Transkriptionsstoppsequenzen unter transkriptioneller Kontrolle des Immediate Early-Promotor p7.5 aus Vakziniavirus sowie das HIV-1- gag/pol-Gen unter Kontrolle des Vakziniavirus-H6-Promotors wird durch homologe Rekombination in den Thymidinkinasegen (tk)- Locus des rekombinanten Vakziniavirus enthaltend pVeksyngag hi- neinkloniert, wozu auf Figur 7 hingewiesen wird.