L'invention a pour objet des compositions immunogènes utilisables, notamment, comme vaccins, chez les mammifères, contre des pathologies infectieuses.

Les pathologies visées conformément à l'invention sont du type cellule-dépendant c'est-à-dire que le processus infectieux se développe après la liaison, suivi ou non de la fusion, de l'agent pathogène à une cellule cible de mammifère.

On connaît le rôle majeur joué par certaines régions de ces agents pathogènes dans les infections qu'ils provoquent.

Ainsi, en ce qui concerne par exemple VIH, divers travaux ont montré que les régions impliquées dans les interactions avec les récepteurs des cellules cibles (récepteur CD4 et récepteurs de chimiokines, comme CCR5 et CXCR4) sont des régions conservées de l'enveloppe du virus.

La formation d'anticorps contre ces régions se heurte jusqu'à présent au problème de l'accès aux pitopes d'intért. Des interactions et changements structurels complexes interviennent durant la liaison du virus à la cellule cible, puis la fusion, qui empche en effet l'accès aux pitopes des régions fusionnées et rend difficilement accessibles ceux des régions voisines de celles directement impliquées dans l'interaction avec les cellules cibles, dont l'exposition de surcroît peut tre de courte durée.

Avec un système expérimental décrit dans Science, vol. 283,15 janvier 1999, LaCasse et al ont probablement obtenu chez la souris, la formation d'anticorps neutralisants vis-à-vis d'isolats infectieux de VIH, correspondant donc à un certain degré d'accessibilité desdits épitopes.

Le système proposé est obtenu par fusion de fibroblastes simiens, modifiés pour exprimer l'enveloppe fonctionnelle d'un isolat primaire de VIH-1 (P168), avec des neuroblastomes humains exprimant le récepteur CD4 et le co-récepteur CCRS, puis fixation du complexe formé, 4 à 5 h après le début de la fusion, avec du formaldéhyde. Dans des essais sur la souris, un tel complexe s'est montré capable de former des anticorps neutralisants vis-à-vis d'isolats infectieux de VIH provenant d'un très grand éventail de sous-types.

Toutefois, un tel système n'est pas utilisable chez l'homme compte tenu du danger potentiel des populations cellulaires formant le complexe immunogène.

De plus, les conditions mises en oeuvre pour élaborer le système ne garantissent pas la préservation de la conformation des pitopes et l'accès à une large région d'intért.

En contrôlant la progression de la fusion et les conditions de réalisation de la fixation, les inventeurs ont obtenu des complexes à un stade où les pitopes d'intért, y inclus des pitopes au voisinage de ceux mis en jeu dans la fusion, sont exposés de manière particulièrement satisfaisante et doivent tre préservés dans leur conformation naturelle. Les propriétés immunogènes mises en évidence chez de tels complexes en font alors des candidats de choix pour l'élaboration de vaccins, présentant l'avantage considérable d'tre utilisables chez l'homme lorsqu'on met en oeuvre, pour la préparation des complexes, des produits appropriés.

De manière avantageuse, de tels systèmes s'avèrent d'application générale pour tout type d'agent pathogène avec un processus infectieux impliquant une étape de liaison, suivie ou non de fusion avec les cellules cibles.

L'invention a donc pour but de fournir des compositions immunogènes et des compositions vaccinales,

utilisables chez les mammifères, contre les pathologies infectieuses, dépendantes d'une infection cellulaire.

Elle vise également les complexes immunogènes mis en oeuvre dans ces compositions, en tant que nouveaux produits, ainsi que les anticorps formés contre les pitopes des régions de l'agent pathogène dans le voisinage et mme à proximité immédiate de celles impliquées dans la fusion avec la cellule cible.

Les compositions immunogènes selon l'invention sont caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir de préparations obtenues par . incubation de premiers moyens, exprimant le et/ou les récepteurs cibles d'un agent pathogène infectieux tel que défini ci-dessus, avec des seconds moyens exprimant au moins les régions de l'agent pathogène reconnaissant lesdites cibles, dans des conditions permettant l'interaction des premiers et seconds moyens de manière à former un complexe, cette étape d'incubation étant réalisée selon des durées différentes, afin de conduire à des complexes correspondant à différents stades de fusion et présentant donc des expositions et conformations différentes d'pitopes nouvellement démasqués, et . mise en contact des complexes formés avec un agent fixateur, pendant des durées différentes, de manière à fixer des complexes avec différentes

expositions et conformations des pitopes contre lesquels on souhaite former des anticorps, lesdits premiers et seconds moyens étant choisis parmi des produits tolérés par les mammifères.

Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits premiers moyens sont des cellules autologues de mammifères. Il s'agit de cellules saines provenant du mammifère à vacciner, en particulier de l'homme par exemple des PBMC totaux, des lymphocytes ou des macrophages isolés.

Ces cellules sont stimulées si nécessaire de manière à exprimer, en quantité suffisante, le ou les récepteurs nécessaires pour l'interaction recherchée.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, lesdits premiers moyens sont des vecteurs exprimant le ou les récepteurs cibles à leur surface. De tels vecteurs comprennent par exemple des vecteurs viraux comme le baculovirus, le virus de la fort de Semliki (SFV), ou encore des levures comme Saccharomyces cerevisae.

Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, lesdits premiers moyens sont des liposomes portant à leur surface le ou les récepteurs cibles correctement présentés, mimant ainsi les cellules cibles.

Les récepteurs transmembranaires (à un ou plusieurs passages) cibles seront inclus dans les liposomes à partir de récepteurs exprimés en grandes quantités, grâce à des vecteurs d'expression, à la surface de cellules (10 à 10/cellule) soit d'insecte, de levure ou de mammifère. Le passage de récepteurs de cellules aux liposomes se fait après isolement de membranes cellulaires, leur traitement avec un détergent approprié selon des protocoles définis par J. L. Rigaud (voir référence ci-après) et finalement leur inclusion dans les membranes appropriées.

Conformément à l'invention, les seconds moyens mis en oeuvre sont ceux exprimant au moins les régions de l'agent pathogène infectieux capables de se lier aux cellules cibles et de fusionner avec ces cellules.

Des seconds moyens mis en oeuvre selon l'invention sont ainsi constitués par des cellules préalablement transformées avec un vecteur portant au moins une région de liaison à au moins un récepteur cible. Il s'agit avantageusement de vecteurs viraux tels qu'envisagés ci-dessus, à savoir le baculovirus, SFV, ou encore des levures comme Saccharomyces cerevisae.

En variante, les seconds moyens sont constitués par les vecteurs viraux eux-mmes.

Dans une autre variante, les seconds moyens sont des cellules infectées produisant les agents

pathogènes ou sont constitués par les agents pathogènes infectieux eux-mmes.

Les agents pathogènes évoqués ci-dessus peuvent tre des virus, et notamment des rétrovirus, des bactéries, des mycobactries, ou des parasites comme Plasmodium sp, Leishmania sp, Trypanosoma cruzi et Trypanosoma brucei.

L'invention présente un intért tout particulièrement dans le cas de VIH, ce terme étant utilisé dans la description et les revendications pour désigner aussi bien les isolats des différentes souches humaines ou animales, ainsi que le virus avec une enveloppe naturelle ou recombinante, le cas échéant mutée.

L'invention vise ainsi en particulier les compositions immunogènes dans lesquelles lesdites préparations sont obtenues par incubation de premiers moyens exprimant le récepteur CD4 et/ou des co-récepteurs du VIH, avec des seconds moyens exprimant au moins les régions conservées des protéines d'enveloppe gpl20 ou <BR> <BR> <BR> <BR> gpl60.<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> L'expression"protéine d'enveloppe"telle qu'utilisée dans la description et les revendications englobe aussi bien la protéine naturelle que les protéines recombinantes telles que connues de l'homme du métier, ou des protéines mutées. Ces dernières présentent

l'avantage de permettre l'identification des sites de l'enveloppe impliqués dans la reconnaissance par les anticorps, tels qu'ils sont produits après leur fusion avec les récepteurs cibles.

Dans de telles compositions, les premiers moyens mis en oeuvre sont constitués par des cellules autologues de mammifères comme indiqué plus haut. Ces cellules sont stimulées de manière à exprimer, en quantité suffisante pour l'interaction recherchée, le récepteur CD4 et/ou des co-récepteurs de CD4, comme CCR5, CXCR4, la protéine bande 3 ou d'autres protéines transmembranaires. La stimulation est réalisée par exemple avec PHA et/ou IL2.

En variante, lesdits premiers moyens sont des vecteurs viraux exprimant à leur surface CD4 et/ou des co-rcepteurs de VIH. Comme indiqué ci-dessus, de tels vecteurs comprennent le baculovirus, SFV, ou encore des levures comme Saccharomyces cerevisae.

Dans encore une autre variante, lesdits premiers moyens sont des liposomes exprimant à leur surface le récepteur CD4 et/ou des co-rcepteurs comme indiqué plus haut. Ces liposomes peuvent ainsi comporter le récepteur CD4 et/ou des co-récepteurs du VIH.

Dans de telles compositions comprenant avantageusement l'un des premiers moyens considérés ci- dessus, les seconds moyens mis en oeuvre expriment au

moins les régions conservées des protéines d'enveloppe gpl20 ou gpl60.

Ces seconds moyens sont constitués par des cellules préalablement transformées avec un vecteur d'enveloppe virale de VIH, ou tout au moins des régions conservées des protéines gpl20 ou gpl60. Il s'agit avantageusement de vecteurs viraux tels qu'envisagés ci- dessus.

En variante, les seconds moyens sont constitués par les vecteurs viraux eux-mmes.

Dans une autre variante, les seconds moyens sont des cellules infectées produisant VIH ou sont constitués par le virus VIH lui-mme. On met avantageusement en oeuvre un virus fusogène, provenant d'isolats primaires.

On rappelle que, conformément à l'invention, les protéines gpl20 ou gpl60, ou les protéines comportant au moins les régions conservées de protéines gpl20 ou gpl60 sont sous forme naturelle, ou sous forme recombinantes, ou sous forme mutée.

De manière avantageuse, lesdits seconds moyens sont constitués par de telles protéines et comprennent donc une gpl20 soluble monomère, le cas échéant sous forme recombinante ou un oligomère de gpl20 ou gpl60, également le cas échéant sous forme recombinante. Il peut

s'agir également des parties de ces protéines comportant au moins les régions conservées.

Dans un mode avantageux de réalisation de l'invention, les seconds moyens comprennent un anticorps monoclonal anti-co-récepteur. Il s'agit par exemple de l'anticorps monoclonal 17b, 48d ou CG10. Cette disposition permet d'accéder à des pitopes d'intért au voisinage du site de liaison au co-rcepteur sur la gpl20.

Des compositions préférées de ce type se présentent sous forme moléculaire et comprennent la gpl20 soluble monomère comme premier moyen, le CD4 soluble comme second moyen, et un anticorps monoclonal comme défini ci-dessus, ou un fragment Fab d'un tel anticorps.

L'incubation des premiers et seconds moyens est réalisée de manière à former un complexe dans lequel les premiers moyens sont engagés dans un processus de fusion avec les seconds moyens.

Il est avantageux de réaliser cette étape selon des durées différentes, ce qui permet de disposer de différents stades de fusion et de choisir, par test sur l'animal, le stade qui donnera les meilleurs résultats par rapport aux propriétés immunogènes recherchées.

On opère le plus généralement sur des durées variant de 15 min à 5 h.

Les conformations de ces différents stades sont fixées par addition d'un agent capable d'arrter la fusion sans dénaturer significativement les pitopes d'intért.

Un agent fixateur tout particulièrement préféré à cet égard est constitué par la 2,2'-dithiopyridine (aldidrithiol-2 ou, en abrégé, AT-2) D'autres agents peuvent tre utilisés notamment lorsqu'on vise des applications en recherche, comme par exemple le formol.

La fixation est réalisée sur des durées différentes ce qui permet d'étudier les effets de la cinétique de fixation sur l'immobilisation des épitopes présentés.

Les préparations obtenues sont récupérées, lavées et mise en suspension dans un tampon approprié.

On évalue ensuite sur l'animal les meilleurs temps de fusion et de fixation pour induire la meilleure réponse immune et générer les anticorps qui empchent l'infection.

L'invention vise en tant que nouveaux produits les complexes antigéniques résultant des étapes de fusion et fixation.

Ces complexes, plus spécialement sous forme cristallisée, permettent de manière avantageuse d'étudier et de mettre en évidence les sites d'interaction de la gpl20 et/ou de la gp41 de l'enveloppe, mais aussi les régions à proximité immédiate de ces sites.

Le procédé de préparation des compositions immunogènes définies ci-dessus entre également dans le champ de l'invention. Ce procédé comprend la mise en oeuvre desdits premiers et seconds moyens, leur fusion et leur fixation, comme défini ci-dessus.

L'étude des propriétés immunologiques des compositions de l'invention a permis de mettre en évidence leur fort pouvoir immunogène.

Ainsi, les sérums recueillis après administration de ces compositions à des souris transgniques CD4+, CXCR5+, ou à des lapins a montré des taux élevés en anticorps.

Ces sérums, ainsi que les anticorps obtenus à partir de ces sérums, puis purifiés selon les techniques classiques, font partie de l'invention.

Ces anticorps sont ainsi caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître, selon une réaction de type antigène-anticorps, un agent pathogène infectieux et d'inhiber ainsi son pouvoir infectieux.

Comme le montrent les expériences réalisées in vivo sur les mammifères, les sérums et anticorps

purifiés sont capables d'inhiber l'infectivité d'un large spectre d'isolais primaires de VIH.

L'invention vise donc des compositions vaccinales caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace de compositions immunogènes telles que définies ci-dessus avec un véhicule, inerte, acceptable pour l'administration à un mammifère, en association le cas échéant avec un adjuvant.

Comme adjuvant capable d'augmenter les réactions immunitaires de l'organisme du mammifère à vacciner, on citera les adjuvants minéraux comme le phosphate d'aluminium, les adjuvants huileux comme l'adjuvant incomplet de Freund, les adjuvants d'origine bactérienne comme l'adjuvant complet de Freund. Un adjuvant particulièrement préféré est constitué par l'adjuvant Ribi.

La composition vaccinale est administrée par voie injectable, ou encore par voie orale, avec un rappel 3 mois après l'injection.

Les compositions vaccinales sont administrées en une quantité et selon un protocole permettant de conférer à l'hôte une immunité à l'égard des antigènes de l'agent pathogène infectieux.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dansées exemples qui suivent :

Préparation d'une composition immunogène cellulaire.

On utilise d'une part des cellules humaines autologues prélevées sur le patient à vacciner et exprimant CD4/CCRS et CXCR4 après stimulation pendant 3 à 6 jours avec PHA/IL2 en opérant selon la méthode de Riley et al, JVI 1998,71 : 8273-8280, d'autre part un isolat primaire de VIH-1 ou des cellules infectées par un tel isolat.

On répartit ces 2 populations dans différentes boites de pétri pour une incubation à 37° C pendant des durées différentes respectivement de 15,30,45,60,120, 180,240 et 300 min. Pour chaque expérience, on utilise 3 x 106 à 108 cellules autologues et par exemple l'isolat primaire 92 HT 593 ou ACH168.10 provenant de Aids Research and Reference Reagent Programm, NIH (EUA), lesquels utilisent les deux co-récepteurs CXCR4 et CCRS de VIH.

Au terme de la durée prévue, on ajoute l'AT-2 à raison de 600 à 1000 Sm, en solution dans PBS. La fixation est réalisée à 4°C pendant un temps comme recommandé par Rossio et al, JVI, 1998,72,7992, ou 1 à 12 h. Les complexes cellulaires formés sont lavés avec PBS, récupéré et remis en suspension à raison de 10 à 10 complexe cellulaire/0, 1 ml dans PBS/(DM50 10W) afin de les conserver à-80°C.

L'immunogène congelé est décongelé et lavé plusieurs fois, puis mis en présence de la mme quantité d'un adjuvant, par exemple Ribi (R-700 ou R-730).

Préparation d'une composition immunogène avec des vecteurs viraux.

On opère comme indiqué dans l'exemple 1, mais on utilise d'une part un système baculovirus portant les récepteurs CD4 et CCRS et/ou CXCR4 à sa surface, d'autre part le virus Vaccina ou le virus de la fort de Semliki portant la gpl20 monomère ou l'oligomère de gpl20 et gp41. Dans d'autres expériences, on utilise un système baculovirus permettant l'expression de protéines dans sa propre membrane (Boublick et al, Biotechnology, 1995, 13 : 1079-84).

Préparation d'une composition immunogène à base de lisposomes.

On opère comme indiqué dans l'exemple 1, mais on utilise des liposomes portant à leur surface CD4 et CCRS et/ou CXCR4. Pour préparer ces liposomes, on a recours aux enseignements de Rigaud et al dans Biochim.

Acta Phys. 1995,1231 : 223-246 ou de Pitard et al dans Eur. J. Biochem. 1996,235,3769-3778, qui décrivent des liposomes portant des protéines membranaires ou transmembranaires fonctionnelles. On les met à incuber avec les enveloppes de VIH-1 ou de VIH-2 aux fins de fusion. Il s'agit soit de virus VIH avec différentes

enveloppes recombinantes (utilisation de virus complments pseudotypés), soit de vecteurs viraux portant les enveloppes recombinantes de VIH. Pour le passage de récepteurs transmembranaires de membranes cellulaires aux liposomes, on a recours à des vecteurs à forte expression comme le virus Vaccin-Là, le baculovirus, ou Saccharomyces cerevisae permettant l'obtention de 10° à 107 copies de récepteur par cellule.

Préparation vaccinale administrée à un mammifère, contre une infection par VIH-1 On utilise une composition immunogène selon l'exemple 3, préalablement testée sur l'animal pour évaluer sa capacité à produire une réponse d'anticorps.

Cette composition est lavée à plusieurs reprises dans PBS, mise en suspension dans du sérum physiologique, puis additionnée à cette composition, à titre d'adjuvant, de Ribi.

La préparation est injectée à raison de 0,05 ml à 1 ml à des animaux expérimentaux (souris, singe, homme, selon le cas). On procède à un rappel 4 à 6 mois plus tard.

Clonage et expresion du co-récepteur CCR5 et/ou du récepteur CD4 à la surface de cellules d'insectes.

Clonage du CCR5/6Histidine et expression de baculovirus 1. Le pcDNA3 CCR5 contient la séquence complète du CCR5 humain (n° d'accession à Genbank : NM 000579). On amplifie par PCR la région C-terminale entre le site Eco-Rl et TGA. A partir de 1'ATG (+10) le site EcoRI est en position 793 et le codon Stop est en position 1066.

2. Ce fragment est clone dans un plasmide pUC 18, pour sequençage, puis le fragment est re- inséré dans pcDNA3 CCR5 en EcoRI-XbaI.

3. Ainsi le plasmide pcDNA3 CCR5 est modifié et devient pcDNA3 CCR5-6HIS.

4. Le gène CCR5 plus son tag 6HIS en C-terminal est extrait du pcDNA3 par coupure BamHI-BamHI.

5. Le gène CCR5-6HIS est alors introduit par BgI II-bgl I en aval du promoteur plO du vecteur de transfert (baculo) pi 19.

6. Une fois que le vecteur de transfert pi 19 a té additionné du gène CCR5-6HIS, il est co- transfert avec de 1'ADN du virus AcSLP10 dans les cellules Sf9 d'insecte (Autographa californica).

7. L'expression de CCR5-6HIS est obtenue à la surface de ces cellules. La densité de ces CCR5-6HIS est évaluée par scatchard (REF).

8. La caractérisation fonctionnelle de ce récepteur est évaluée par la capacité de virus VIH ou des gpl20 de VIH à se fixer à ces cellules.

Clonage du CD4. On procède selon un protocole de mme type : 1. Le plasmide pGEM-T contenant le gène CD4 est additionné du tag 6 Histidine. A partir de 1'ATG (+1) le site Bsu361 est en position 1087 et le codon Stop en position 1375.

2. Le gène CD4 additionné de 6 histidines en C-terminal est introduit an aval du promoteur de la polyédrine dans le vecteur de transfert pGEMAc116T par BgI II-bgI I.

3. Le vecteur de transfert pGEMAcl 16T CD4-6 HIS sera co-transfecté avec 1'ADN du virus AcSLPIO dans les cellules Sf9 d'insecte (Autographa californica) 4. L'expression du CD4-6HIS est obtenue à la surface de ces cellules. La densité de ces CCR5-6HIS est évaluée par scatchard (Cahoreau et al, 1992, Biochimie, 74,1053-1065).

5. La caractérisation fonctionnelle de ce récepteur est évaluée par la capacité de virus ou des gpl20 de VIH à se fixer à ces cellules.

Expression du double recombinant CD4 et du CCR5 : 1. Les gènes CCR5-6 HIS et CD4-6 HIS sont respectivement clones dans les vecteurs pi 19 et pGEMAc116T.

2. L'expression du CCR5-6HIS sous contrôle du promoteur plO et du CD4-6 HIS est effectuée sous contrôle du promoteur de la polyédrine 3. Les 2 vecteurs de transfert seront co-transfectés avec 1'ADN du virus AcSLP10 dans les cellules Sf9d'insecte (Autographa californica).

4. On obtient ainsi des cellules Sf9 exprimant à leur surface un double recombinant CCR5- 6HIS et CD4-6HIS dans des proportions égales.

Purification des membranes cellulaires enrichies en CCR5 ou CD4 et préparation des protéoliposomes correspondants.

A partir de membranes cellulaires Sf9, il est ainsi possible de reconstituer les récepteurs dans des liposomes contenant : 1. seulement du CCR5, 2. seulement du CD4 3. du CCR5 et du CD4 dans les proportions choisises à partir des cellules exprimant séparément CCR5 et CD4.

4. du CCR5 et CD4 dans de proportions choisies à partir des cellules exprimant en mme temps et dans des quantités identiques CCR5 et CD4.

Il s'agit d'obtenir des enveloppes de VIH fusionnant avec le co-récepteur de VIH, puis d'arrter ces fusions au moyen d'un fixateur comme le paraformaldehyde ou le glutaraldéhyde et d'injecter ce couple immunisant aux souris transgéniques huCD4/huCCR5 ou à des modèles macaques ou d'autres simiens. En fonction des résultats, les préparations peuvent alors tre injectées chez l'homme.

Le mme système est mis en place pour CXCR4.

Stratégies pour la reconstitution de protéines transmembranaires dans des protéouposomes<BR> <BR> Les cellules SF9 dÁutographa californica, qui surrexpriment les récepteurs CCR5 (ou CXCR4) et/ou CD4 seront digérées par détergents appropriés dans le but d'obtenir des protéoliposomes selon une méthode dérivée de Rigaud et al, 1988, Biochemistry, 27,2677- 2688 ; Paternostre et al, Biochemistry 1988,27,2668-2677 ; Gaymard et al, J. Biol. Chem.

1996,271,22863-22870.

Evaluation des capacitisfoncdonnelles du CCRS oulet du CD4 1. exprimés à la surface de cellules Sf9 a) Présence de récepteurs à la surface cellulaires analysé par FACS et microscopie confocale : I. Avec des anticorps spécifiques anti-CD4 ou anti-CCR5 II. Avec des gpl20 marqués avec des anticorps spécifiques III. Avec du VIH-1 portant les enveloppes mutées ou non IV. Dans un premier temps on caractérise la fonctionnalité des récepteurs à la surface de cellules Sf9 et on quantifie par scatchard (Cahoreau et al ci-dessus) le nombre de molécules par cellule dont nous connaissons 1'environnement lipidique des membranes cellulaires. b) Analyse confocale de fluorescence spécifique de la fusion par des méthodes dérivées de Robert Blumenthal (NIH, communication personnelle, 2000) et par celle de Vidal et al, 1996, J. Biol. Chem. 270,17823-17829.

I. Après contact avec des cellules exprimant 1'enveloppe de VIH-1 (mutée ou non) II. Après contact avec des VIH-1 (ou des pseudotypes viraux portant les enveloppes mutées ou non) III. Avec des pseudo-particules virales.

2 Dans les protéoliposomes correspondants

a. Analyse confocale de fluorescence spécifique par les méthodes ci-dessus b. D'autres méthodes de transfert d'énergie (FRET : fluorescence resonance energy transfer, (Mattjus et al, 1999, Anal. Biochem. 268,297-304).

CCR-5, Introduction de 6 résidus Histidine en C-terminal 1-Amplification par PCR de la région C-terminale entre le site EcoRI et le TGA pour CCR5 ; 5'3' CCT TCC AGG AAT TCT TTG GCC Bac-CCR5 : introduction dans cet oligonucléotide d'un site Stul (créé grâce à la dégénérescence du code génétique) et d'un site XbaI pour le réintégration du fragment muté dans le plasmide d'origine. val gly leu opa GTG GGC TTG TGA- GTC GGA TTA GTA GGT CTA GTT GGG CTG CTC CTT StuI XbaI 5'3' G GAA ATA TCT GTA GGC CTG TGA CAT CTA GAG GTG C CTT TAT AGA C AT CCG GAC ACT GTA GAT CTC CAC 3'5' --------------------------------++++++++++++++ appariées non appariées Le fragment EcoRI-XbaI amplifié est clone dans un vecteur pUC en EcoRI-XbaI, puis séquence. Le fragment muté est ensuite réinséré dans le plasmide d'origine en EcoRI-XbaI.

2-Introduction des 6 codons histidine en aval du C-termina : du CCR5.

Le plasmide ainsi modifié est coupé par StuI et Xba puis ligué avec le fragment d'ADN StuI- XbaI décrit ci-dessous. Ce fragment apporte 6 codons Histidine et un codon Stop TAA. <BR> <BR> <P> Y2EcoRI stui BamHi l/2 Xbal<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> AA TTC-A GGC CTG CAC-CAT-CAC-CAT-CAT-CAC TAA GGATCC T G T CCG GAC GTG-GTA-GTG-GTA-GTA-GTG ATT CCTAGG AGATC Un site Eco RI est ajouté en amont pour cloner les oligonucléotides appariés dans un vecteur pUC intermédiaire et pouvoir ainsi vérifier la séquence.

Modification et clonage du CD4 1-Séquençage de la région C-terminale du plasmide pGEM-T contenant le gène CD4 : La région C-terminale du plasmide est vérifiée par séquençage, après une étape de PCR*.

2-Addition de 6 résidus histidine en C-terminal du CD4 : 1-Amplification par PCR de la region Bsu361-Banim (dans le polylinker) Oligonucléotide de PCR : FOR-CD4 : <BR> <BR> <BR> 5'3'<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> CCT AAGCTG ATG CTG AGC TTG BAC-CD4 : BamHi Pstl 5'3' CAGT GGATCC AAT GGG GCT GCA GGT CTT CTG 2-Addition de 6 codons His <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> /2Ptl l/2BanHl<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> GC CCC ATT CAC CAT CAT CAC CAC CAT TTA G<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> ACGTCG GGG TAA GTG GTA GTA GTG GTG GTA ATT CCTAG<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Oligonucléotide de la PCR*<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> CD4-HIS5 5'3' <BR> <BR> <BR> GCCCCATTCACCATCATCACCACCATTTAG<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> CD4-HIS3 3'5' ACGTCGGGGTAAGTGGTAGTAGTGGTGGTAATTCCTAG 5'3' GATCCTTAATGGTGGTGATGATGGTGAATGGGGCTGCA <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> FOR-CD4 CCTAAGCTGATGCTGAGCTTG 40<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> BAC-CD4 CAGTGGATCCAATGGGGCTGCAGGTCTTCTG 40 CD4-HIS5 GCCCCATTCACCATCATCACCACCATTTAG 40 CD4-HIS3 GATCCTTAATGGTGGTGATGATGGTGAATGGGGCTGCA 40

Marquage avec la calcine de cellules exprimant 1'enveloppe de HIV-1 Réactifs : -culture cellulaire -calcine AM (Molecular Probe, INC) 1 pg/ml (-2,5 mM) (50pg de calcéine/20 ul de DMSO, stocké à-20°C) -DMSO (diméthyl sulfoxyde) -RPMI ou DMEM -PBS pH 7,4 (Dulb PBS de Gibco BRL) -centrifugation avec IEC Central M04R Méthode : 1. Comptage des cellules dans le flacon.

2. Centrifugation à 1000rpm, pendant 5 min. 6 3. Remise en suspension des cellules dans 5 ml de milieu (0,5 x 106 cellules/ml, par exemple).

4. Addition de lui de calcéine/5 ml de cellules (-2,5 mmoles de calcine).

5. Vortex, afin d'obtenir un bon mélange.

6. Incubation pendant 45 min à 37°C, 5-7% de C02, à l'abri de la lumière.

7. Centrifugation à 1000 rpm pendant 5 min.

8. Lavage à 2 reprises avec 10 ml de milieu (ou PBS).

9. Remise en suspension des cellules dans 5 ml de milieu (ou PBS) ou à une concentration de 0,5 x 106 cellules/ml.

10. Incubation 30 min à 37°C, 5-7% de C02, à l'abri de la lumière.

11. Lavage à 2 reprises avec 10 ml de milieu (ou PBS).

12. Remise en suspension des cellules dans 5 ml de milieu (ou PBS) ou à une concentration de 0,5-1 x 106 cellules/ml Vortex.

Marquage des cellules cibles avec CMTMR Le CMTMR est un dérivé fluorescent de chlorométhyle qui diffuse librement à travers les membranes des cellules vivantes. Une fois à l'intérieur de la cellule, la sonde légèrement thiol-réactive subit ce qui doit tre une réaction médiée par la glutathione-S-transférase pour produire des produits d'addition colorants fluorescents imperméables à la membrane.

La coloration des cellules avec CMTMR donne une vive fluorescence qui résulte de la réaction avec les protéines dans les régions périnucléaires, ER et Golgi, qui sont immobiles, ainsi qu'à une plus faible fluorescence due au produit d'addition du glutathion fluorescent (PM ~ 600 Da) dans le cytosol qui est capable de diffuser à travers les petits pores de fusion.

1. On solubilise la sonde fluorescente cytoplasmique CMTMR (5-(et-6-)-(((4-chlorométhyl) benzoyl) amino) tetraméthylrhodamine) (Moleculer Probes cat # C-2927, ex/em 541/565 nm) à une concentration de 10 mM dans DMSO.

On prélève des quantités aliquotes de 10 ou 20 ni, qu'on stocke à-20°C. On prépare une dilution de CMTMR (1 : 500) dans du DMEM supplémenté avec 10% de S VF inactivé par la chaleur 100 u/ml de pénicilline, 100 pg/ml de streptomycine (D10).

2. On élimine le milieu des cellules cibles (sur les micropuits) et on étale 1 ml d'une solution diluée de CMTMR. On met à incuber les échantillons à 37°C pendant 45-60 min. On

remplace la solution colorante par lml de D10 et on continue l'incubation pendant 15 à 30 min de plus.

Conduite de la fusion 1. On ajoute des cellules effectrices marquées par la calcine (2 ml) à des cellules cibles marquées par CMTMR. On fait incuber les deux populations cellulaires, 3 à 5 h à 37°C.

2. A la fin des incubations, on remplace le milieu par 1 ml de D-PBS et on prend les images de phase et de fluorescence avec des lentilles d'immersion dans l'huile 40 x.

Pour observer les cellules colorées avec la calcine, on utilise le FITC (excitateur : BP 470- 490 ; prisme DM 505 ; émetteur : BA 515-550) et pour CMTMR, on utilise de la rhodamine (excitateur : BP 530-550, prisme DM 570, émetteur BA 590). On évite ainsi le débordement qui se produit lorsqu'on observe la fluorescence des colorants. On réunit les images avec 6- 10 filtres différents choisis au hasard pour chaque échantillon.

3. On analyse les données en utilisant le logiciel Metamorph (Universal Imaging Inc.), en superposant et en comptant les images. On compte le nombre total de cellules positives pour CMTMR et celles positives pour les 2 sondes fluorescentes. On utilise des images en champ brillant pour distinguer les taux positifs où les cellules marquées se recouvrent les uns les autres, mais n'ont pas fusionné. On calcule le pourcentage de fusion comme suit : % fusion = 100 x [nombre de cellules positives pour les 2 colorants] [nombre total de cellules cibles]