MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se divulga una formulación inmunogénica útil para preparar una vacuna contra SARS-CoV-2, virus responsable de COVID-19, donde esta formulación comprende al menos una cepa atenuada de Mycobacterium bovis, Bacilo Calmette-Guérin (BCG), que expresa de manera recombinante una o más proteínas o fragmentos inmunogénicos de SARS-CoV-2, útiles para prevenir, tratar, o atenuar infecciones de SARS-CoV-2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

SARS-CoV-2, es un virus respiratorio descubierto en Diciembre del 2019 en Wuhan, provincia de Hubei, China. Produce un síndrome respiratorio agudo llamado COVID-19 (Coronavirus disease 2019), y se confirmó la evidencia de transmisión de persona a persona entre contactos cercanos. El análisis de secuencia mostró que este virus zoonótico SARS-CoV-2 posee una estructura genómica típica de coronavirus y pertenecía al grupo de -coronavirus.

Los síntomas y signos clínicos principales de este síndrome son: fiebre por sobre los 38 ⁹ C, disnea y tos seca, pudiendo llegar a gatillar una neumonía e incluso la muerte en casos más extremos. Si bien el virus tiene una tasa promedio baja de mortalidad, alrededor de un 2% en el primer cuatrimestre del 2020, dado su alto grado de infectividad se ha transformado en un gran problema de salud pública a nivel mundial, y la Organización Mundial de la Salud (OMS) lo declaró pandemia el 11 de marzo de 2020.

Si bien a la fecha COVID-19 en su calidad de pandemia declarada, se ha extendido a la mayoría de los países del mundo, el impacto no ha sido el mismo en todos los países. Si bien esta diferencia puede explicarse en parte por las políticas con que cada país ha hecho frente a la pandemia y el momento en que dichas políticas se tomaron, entre otros factores, muchos investigadores han correlacionado el menor impacto de SARS-CoV-2, tanto en la morbilidad como en la mortalidad de la enfermedad, con la política de vacunación infantil con Bacillus Calmette-Guérin (BCG). Se ha reportado que los países sin políticas de vacunación universal con BCG (Italia, Holanda, EE. UU. entre otros) se han visto más severamente afectadas en comparación a países con políticas de BCG universales y de larga data. Los datos indican que la vacuna BCG también reduce el número de los casos reportados de COVID-19 en un país (Covián, C., Retamal-Díaz, A., Bueno, S.M. and Kalergis, A.M., 2020. Could BCG vaccination induce protective trained immunity for SARS-CoV-2. Frontiers in Immunology, 11, p.970; Miller, Aaron, et al. Correlation between universal BCG vaccination policy and reduced morbidity and mortality for COVID-19: an epidemiological study. medRxiv, 2020.).

Como sabemos, se han desarrollado distintas vacunas basadas en distintas tecnologías para prevenir COVID-19, las que en su mayoría están aprobadas para su uso en adultos, donde algunas de ellas tienen aprobación de emergencia en población pediátrica, desde los 3 o 6 años en adelante.

Si bien el proceso de vacunación ha permitido desacelerar el avance de la pandemia, hasta la fecha no hay una vacuna aprobada para su aplicación en neonatos, o en población pediátrica de menos de 3 años. Adicionalmente, es posible que la pandemia nos acompañe por muchos años, debido a la aparición de nuevas variantes, debiendo vacunarnos una o más veces al año, dependiendo de las olas o brotes de contagio.

Ante este escenario los inventores han desarrollado nuevas vacunas para COVID-19, que emplean como vector la cepa atenuada de Mycobacterium bovis, Bacilo Calmette-Guérin (BCG), la que ha demostrado desde hace más de 100 años un uso seguro en neonatos y que se sabe actúa como adyuvante e induce respuestas que confieren inmunidad a largo plazo, transformándola para que exprese una proteína o fragmento inmunogénico de SARS-CoV-2, la que permite generar inmunidad contra este virus y controlar el desarrollo de COVID-19, protegiendo a la población desde el nacimiento.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. A. Identificación de clones recombinantes de BCG para los genes E-SARS-CoV-2 y M-SARS- CoV-2 mediante PCR, utilizando partidores específicos. La identificación de los genes de interés en el genoma de las cepas recombinantes de BCG se realizó utilizando los partidores específicos para cada uno de los genes de interés. Posteriormente, el amplicón fue analizado en un gel de agarosa al 1%, identificándose amplicones del tamaño esperado (228 pb para E-SARS-CoV-2 y 669 pb para M-SARS- CoV-2). "-CO2" significa que las bacterias fueron crecidas en ausencia de CO2 5%. "+CO2" significa que las bacterias fueron crecidas en presencia de CO2 5%. "SC-2" es la abreviación de SARS-CoV-2. "Beta" significa que corresponde a una cepa aislada en un ensayo anterior y que se mantuvo en crecimiento por 40 días, que resultó negativa para M-SARS-CoV-2.

B. Identificación de cepas recombinantes de BCG para los genes N-SARS-CoV-2 y S-SARS-CoV-2 mediante PCR utilizando partidores específicos. La identificación de los genes N y S desde el genoma de las cepas recombinantes de BCG se realizó utilizando los partidores específicos para cada uno de los genes de interés. Posteriormente, el amplicón fue analizado en un gel de agarosa al 1%, identificándose amplicones del tamaño esperado (1260 pb para N-SARS-CoV-2 y 3644 pb para S-SARS- CoV-2). "CO2" significa que las bacterias fueron crecidas en presencia de CO2 5%. "SC-2" es la abreviación de SARS-CoV-2.

Figura 2. Extracción de proteínas desde BCG recombinantes que presentan los genes de SARS-CoV-2. Se compara el proteoma de cada cepa con la proteína viral de interés, observándose que en cada caso hay una banda de tamaño similar a la proteína clonada.

Figura 3. A Expresión del gen N-SARS-CoV-2 en BCG recombinantes. La evaluación del número de copias del transcrito para el gen N, se realizó a partir de 100 ng de ARN total obtenido desde un cultivo saturado de rBCG-N-SARS-CoV-2.

B. Expresión del gen E-SARS-CoV2 desde BCG recombinantes. La evaluación del número de copias del transcrito para el gen E se realizó a partir de 100 ng de ARN total obtenido desde un cultivo saturado de rBCG-E-SARS-CoV-2.

C. Expresión del gen M-SARS-CoV-2 desde BCG recombinantes. La evaluación del número de copias del transcrito para el gen M se realizó a partir de 100 ng de ARN total obtenido desde un cultivo saturado de rBCG-M-SARS-CoV-2.

D. Expresión del gen Sl/2-SARS-CoV-2 desde BCG recombinantes. La evaluación del número de copias del transcrito para el gen Sl/2 se realizó a partir de 100 ng de ARN total obtenido desde un cultivo saturado de rBCG- Sl/2-SARS-CoV-2.

Los números presentes en las gráficas representan distintas muestras de ARN desde cepas que fueron confirmadas como positivas por PCR convencional. (1) Muestra de ARN desde el clon 1 de la cepa rBCG- N-SARS-CoV-2 en el pasaje de cultivo 2. (2) Muestra de ARN desde el clon 2 de la cepa rBCG-N-SARS- CoV-2 en el pasaje de cultivo 1. (3) Muestra de ARN desde el clon 1 de la cepa rBCG-N-SARS-CoV-2 en el pasaje de cultivo 1. "Neg" corresponde al control negativo que corresponde a la reacción sin ARN. El número de copias se calculó extrapolando el CT obtenido para cada una de las muestras con una curva estándar previamente estandarizada con el plásmido pUC57-N-SARS-CoV-2. El símbolo (#) corresponde al pasaje del cultivo.

Figura 4. Esquema de inmunización para evaluar la inducción de respuestas inmunes anti SARS-CoV-2 por la vacunación con BCG recombinantes. Los días 0 y 14 corresponden a los días de vacunación de los animales con una dosis de lxlO ⁸ UFC (Unidad formadora de colonia). Los tubos bajo los días corresponden a los puntos dentro del experimento en los cuales se tomaron muestras de sangre para obtención de sueros. El día 21 corresponde al punto final del experimento.

Figura 5. Esquema de inmunización para evaluar la inducción de respuestas inmunes anti SARS-CoV-2 por la vacunación con BCG recombinantes. El día 0 corresponde al día de vacunación de los animales con una dosis de lxlO ⁵ UFC. Los tubos bajo los días corresponden a los puntos dentro del experimento en los cuales se tomaron muestras de sangre para obtención de sueros. El día 21 corresponde al punto final del experimento.

Figura 6. Determinación de citoquinas producto de la vacunación con rBCG-N-SARS-CoV-2. Se evaluaron las citoquinas secretadas en el co-cultivo consistente de células dendriticas y los linfocitos T totales obtenidos desde los bazos y nodulos linfáticos de animales sometidos al esquema de inmunización N ⁹ 2. Se evaluó mediante ELISA la citoquina IFN-y utilizando una dilución de los sobrenadantes de los co-cultvos de 1/10. La reacción colorimétrica fue evaluada en un lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Con A es un estimulo que potencia la respuesta inmune, y corresponde a un control positivo.

Figura 7. Evaluación de marcadores de activación en la superficie de los linfocitos T CD4 ⁺ y CD8 ⁺ 72 horas post-co-cultivo con células dendriticas cargadas con distintos tratamientos. Para evaluar si la vacunación con rBCG-N-SARS-CoV-2 induce una respuesta inmune celular, luego de poner punto final al experimento, se purificaron linfocitos T totales desde los bazos de los animales. Estos fueron luego co-cultivados con células dendriticas cargadas con distintos péptidos y tratamientos durante 72 horas. Luego de este tiempo, los marcadores de activación CD69 ⁺ , CD71 ⁺ y CD25 ⁺ fueron evaluados en la superficie de linfocitos T CD4 ⁺ y T CD8 ⁺ mediante citometría de flujo. Panel superior, corresponde a los linfocitos T CD4 ⁺ para los marcadores CD25 ⁺ , CD69 ⁺ y CD71 ⁺ . El panel inferior corresponde a los linfocitos T CD8 ⁺ para los marcadores CD25 ⁺ , CD69 ⁺ y CD71 ⁺ . La barra señalada con * corresponde a la respuesta frente a proteína N de SARS-CoV-2, y la barra señalada con + corresponde al control Con A el cual es un control positivo de activación del experimento.

Figura 8. Determinación de anticuerpos anti-N de SARS-CoV-2 inducidos por una vacunación con rBCG- N-SARS-CoV-2. Se evaluaron los anticuerpos secretados desde los sueros obtenidos desde los animales inmunizados con dos dosis de lxlO ⁸ UFC. Se evaluó mediante ELISA los anticuerpos específicos contra la proteína N del virus utilizando sueros diluidos 1/600. La reacción colorimétrica fue evaluada en un lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm.

Figura 9. Esquema de inmunización para evaluar la inducción de respuesta inmune anti-SARS-CoV-2 por la vacunación con un pool (mezcla) de las cepas recombinantes de BCG de la invención. El día 0 corresponde al día de vacunación de los animales con una dosis de 4xl0 ⁵ UFC. El día 14 corresponde al refuerzo administrado con las proteínas purificadas e hidróxido de alumninio (Alum) o sus controles respectivamente. Los símbolos bajo los días corresponden a los puntos dentro del experimento en donde se tomaron muestras de sangre para obtención de sueros. El día 24 corresponde al punto final del experimento.

Figura 10. Determinación de la curva de peso en animales vacunados. Se realizó el monitoreo de la ganancia o pérdida de peso de los animales inmunizados con una dosis de 4xl0 ⁵ UFC de un pool (mezcla) de las cepas recombinantes de rBGC-N-SARS-CoV-2, rBGC-E-SARS-CoV-2, rBGC-M-SARS-CoV- 2, rBGC-S-SARS-CoV-2, y sus grupos controles durante 24 días para determinar si la vacuna era segura para los animales.

Figura 11. Determinación de anticuerpos anti-N de SARS-CoV-2 inducidos por una vacunación con un pool (mezcla) de las cepas recombinantes de BCG en una dosis de 4xl0 ⁵ UFC. Se evaluó mediante ELISA los anticuerpos específicos contra la proteína N del virus utilizando sueros diluidos 1/5, para todas las condiciones indicadas en la Tabla 1. La reacción colorimétrica fue evaluada en un lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Figura 12. Determinación de anticuerpos anti-S de SARS-CoV-2 inducidos por una vacunación con un pool (mezcla) de las cepas recombinantes de BCG en una dosis de 4xl0 ⁵ UFC. Se evaluó mediante ELISA el titulo de los anticuerpos específicos contra la proteína S del virus utilizando sueros diluidos desde 1/10 hasta 1/2560, para todas las condiciones indicadas en la Tabla 1. La reacción colorimétrica fue evaluada en un lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm

Figura 13. Evaluación de marcadores de activación en la superficie de linfocitos T CD8 ⁺ a 72 horas posteo-cultivo con células dendríticas tratadas con distintos estímulos de proteínas N, M, S, o la mezcla de N, M y S, todas de SARS-CoV-2. Luego de poner punto final al experimento, de acuerdo con el esquema de la Tabla 2, se purificaron linfocitos T totales desde los bazos. Estos fueron luego co-cultivados con células dendríticas cargadas con los distintos péptidos durante 72 horas. Luego de este tiempo, los marcadores de activación CD69 ⁺ , CD71 ⁺ y CD25 ⁺ fueron evaluados en la superficie de linfocitos T CD8 ⁺ mediante citometría de flujo.

Figura 14. Evaluación de marcadores de activación en la superficie de los linfocitos T CD8 ⁺ 72 horas post-co-cultivo con células dendríticas tratadas con distintos estímulos, proteínas N o S, o derivado proteico purificado (PPD, por sus siglas en inglés). Luego de poner punto final al experimento, y de acuerdo con el esquema de la Tabla 3, se purificaron linfocitos T totales desde los bazos. Estos fueron co-cultivados con células dendríticas cargadas con distintos estímulos durante 72 horas. Luego de este tiempo, los marcadores de activación CD69 ⁺ , CD71 ⁺ y CD25 ⁺ fueron evaluados en la superficie de linfocitos T CD8 ⁺ mediante citometría de flujo.

Figura 15. Determinación de anticuerpos anti-N de SARS-CoV-2 inducidos por una vacunación con una cepa rBCG-N-SARS-CoV-2 en una dosis de lxlO ⁵ UFC y un refuerzo con proteína N recombinante + Alum, y por vacuna de virus inactivado. Se evaluó mediante la técnica de ELISA los anticuerpos específicos contra la proteína N del virus utilizando sueros sin diluir. La reacción colorimétrica fue evaluada en un lector de ELISA a una longitud de onda de 450nm. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención corresponde a formulación inmunogénica que comprende al menos una cepa viva atenuada basada en Mycobacterium bovis, preferentemente de la cepa Bacilo Calmette-Guérin (BCG) que comprenda la expresión recombinante de un antígeno viral heterólogo de SARS-CoV-2.

Los coronavirus (CoV), incluyendo SARS-CoV-2 comprenden un ARN de simple hebra, de sentido positivo, con un tamaño que varía de 26,000 a 37,000 bases. Este es el mayor genoma conocido entre los virus de ARN. La estructura genómica de los CoV es la siguiente: cola 5'-líder-UTR-replicasa-S (Spike) -E (Envelope) -M (Membrane) -N (Nucleocapsid) -3'UTRpoly (A). Las proteínas M y E juegan un papel importante en el ensamblaje viral, y la proteína N es necesaria para la síntesis de ARN. La proteína S (Spike) es responsable de la unión del receptor y la posterior entrada viral en las células huésped, Spike es una proteína de fusión de clase I trimérica altamente glicosilada y contiene dos subunidades, SI y S2. En este documento nos referiremos indistintamente a ella como S o S1/S2.

De forma más particular, podemos indicar que la invención corresponde a una formulación que comprende al menos una cepa de Bacilo Calmette-Guérin (BCG), que expresa de forma recombinante (rBCG) antígenos de N, E, M y/o S del virus de SARS-CoV-2. La cepa de la vacuna BCG ha demostrado una estabilidad genética sorprendente a lo largo de los años que ha estado en uso.

Los genes de interés de SARS-CoV-2 se clonaron, mediante técnicas estándar de ingeniería genética, en el vector pMV361 de recombinación y expresión en Mycobacterium, con el vector resultante se transformaron las cepas BCGs mediante electroporación. Una vez transformadas se evaluó el nivel de la expresión del antígeno viral a nivel de proteína por Western blot y a nivel de ARN mensajero a través de RT-qPCR. Además, se purificó el ADN genómico de las cepas transformadas, para determinar la integración de los genes de interés en el genoma de BCG.

Para el experto en la técnica será evidente que podría usarse un vector diferente y una técnica de transformación distinta al seleccionado por los inventores, sin que esta modificación signifique un deterioro de los resultados observados, por lo que dichas modificaciones se consideran dentro del alcance de la presente invención.

Específicamente la invención apunta a una formulación inmunogénica que confiere protección contra

COVID-19, que comprende al menos una cepa recombinante atenuada de Mycobacterium bovis Bacilo Calmette-Guerin (BCG), en una cantidad entre 10 ⁴ -10 ⁹ unidades formadoras de colonia (UFC) por dosis, la que expresa al menos una proteína o fragmento inmunogénico del virus SARS-CoV-2, en una solución tampón salina farmacéuticamente aceptable. De manera preferente, la proteína o fragmento inmunogénico del SARS-CoV-2 corresponde a las proteínas N, E, M o S de SARS-CoV-2 o sus fragmentos inmunogénicos, donde las proteínas tienen una secuencia de aminoácidos al menos un 75% idéntica a la secuencia de aminoácidos de los productos de los genes de las SEO. ID NO:1, SEO. ID NO:2, SEO. ID NO:3 o SEO. ID NO:4. Y preferentemente las proteínas tienen una secuencia de aminoácidos al menos un 95% idéntica a las SEO. ID NO: 1, SEO. ID NO:2, SEO. ID NO:3 o SEO. ID NO:4.

La SEO. ID NO: 1 corresponde al gen que codifica para la proteína N, empleando los sitios de restricción de las enzimas BstBI and Clal. La SEQ ID NO: 2 corresponde al gen que codifica para la proteína E, empleando los sitios de restricción de las enzimas BstBI and Clal. La SEQ ID NO: 3 corresponde al gen que codifica para la proteína M, empleando los sitios de restricción de las enzimas BstBI and Clal. La SEQ ID NO: 4 corresponde al gen que codifica para la proteína S, empleando los sitios de restricción de las enzimas Mfel and Aflll.

En la formulación inmunogénica de la invención, los genes que codifican para la proteína N, E, M o S de SARS-CoV-2 o sus fragmentos inmunogénicos se encuentran insertos en el genoma de Mycobacterium BCG o en plásmidos extracromosomales, en una o varias copias, y están regulados o comandados por promotores endógenos o exógenos de Mycobacterium BCG, constitutivos o inducibles. Donde los genes que codifican para la proteína N, E, M o S de SARS-CoV-2 o sus fragmentos inmunogénicos corresponden a una secuencia nucleotídica al menos un 75% idéntica a la las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4., y preferentemente al menos un 95% idéntica a las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, considerando todas las opciones intermedias. Como resultado, las proteínas N, E, M o S de SARS-CoV-2 o sus fragmentos inmunogénicos pueden ser expresados por BCG de forma soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o como proteínas unidas a membrana celular. La cepa de BCG empleada se escoge preferentemente entre BCG Danish o BCG Pasteur.

En una realización de la invención, la proteína o fragmento inmunogénico del virus SARS-CoV-2 corresponde a secuencias de aminoácidos con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia de la proteína las proteínas N, E, M o S de SARS-CoV-2, definidas como el producto de los genes de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, en donde la diferencia incluye substituciones, supresiones, adiciones o inserciones. Asimismo, para el experto en la técnica será evidente que para obtener esta expresión proteica se debe transformar la bacteria con un vector que contenga una secuencia nucleotídica que codifique para dicha proteína, donde la invención incluye una secuencia nucleotídica que contenga al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia nucleotídica, definida de acuerdo a las SEO. ID NO:1, SEO. ID NO:2, SEO. ID NO:3 o SEQ. ID NO:4 y sus equivalentes producto de la degeneración del código genético.

Para el experto en la técnica será evidente, que en el caso de las variantes del virus SARS-CoV- 2, podrían formularse vacunas específicas, acorde con las secuencias peptídicas de las proteínas virales de dichas variantes. Donde, si dichas proteínas virales de las variantes de SARS-CoV-2 tienen al menos 75% de identidad con la secuencias de las proteínas N, E, M o S de SARS-CoV-2, definidas como el producto de los genes de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, esas vacunas se consideran dentro del alcance de la presente invención.

En una realización de la invención, la formulación inmunogénica de la invención es estabilizada por congelamiento, I iof ilización o en solución salina tampón y excipientes para preparaciones inyectables, para su conservación previa a su uso. Entre los excipientes apropiados se encuentran: glutamato de sodio, sulfato de magnesio heptahidrato, hidrogenofosfato de potasio, ácido cítrico monohidrato, L- asparagina monohidrato, citrato de hierro y amonio, glicerol, y agua para preparaciones inyectables y cualquier otro disponible en la técnica, al momento de ejecutar la invención.

En otra realización de la invención se protege el uso de la formulación inmunogénica descrita para preparar una vacuna para prevenir, tratar o atenuar infecciones por SARS-CoV-2, donde dicha formulación contiene entre 1X10 ⁴ -1X10 ⁹ UFC de la cepa atenuada recombinante de Mycobacterium bovis, BCG, estabilizada con una solución salina. Esta vacuna puede ser administrada de forma subcutánea, percutánea o subdérmica en solución salina fisiológicamente aceptable.

Como sabemos, en muchos casos, las vacunas contra COVID-19 requieren un refuerzo después de la primera inoculación. En el caso de la invención se propone que dicho refuerzo, dentro de uno a seis meses de la primera inoculación, se realice con una vacuna de virus atenuado, o de subunidades virales purificadas, o con fragmentos inmunogénicos peptídicos, o con vacuna de ADN o incluso con vacuna de RNA.

El refuerzo con la vacuna de la invención puede aplicarse algunos años después de la primera inoculación con la vacuna BCG, la que se realizaría, por ejemplo al momento del nacimiento de los infantes. Para generar la formulación que se protege en esta invención, se utiliza la cepa Danish o Pasteur de BCG, y la transformamos a nivel de genoma, expresando las proteínas N, E, M o S de SARS-CoV-2 de manera constitutiva durante su ciclo replicativo. La síntesis de esta proteína no genera alteraciones ni impedimentos en la capacidad replicativa de la bacteria, por lo cual no ejercería un efecto de toxicidad a la cepa vector.

Dos características para destacar de esta invención, corresponden a su perfil de seguridad e inmunogenicidad, los cuales hemos evaluado en un modelo preclínico murino. Nuestros resultados de curvas de crecimiento y de manifestaciones clínicas en ratones inmunizados indican que la administración de esta vacuna no genera reacciones adversas significativas, teniendo un efecto similar al de BCG sin transformar o WT (por sus siglas en inglés, wild type). Con respecto a la inmunogenicidad de esta vacuna, hemos observado que genera una proliferación y activación de células T CD4 ⁺ y CD8 ⁺ específica contra el antígeno purificado N, E, M o S de SARS-CoV-2, estímulos esenciales para producir una respuesta inmune y generar memoria inmunológica.

El perfil de seguridad e inmunogenicidad observado para la vacuna de la presente invención la convierten en una herramienta segura de inmunización.

Actualmente no existe vacuna o tratamiento efectivos aprobados para la prevención o el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2 específicos para la población de lactantes y que pueda ser aplicado desde el momento del nacimiento. La vacuna BCG recombinante que expresa la proteína N, E, M y/o S de SARS-CoV-2 de acuerdo a la presente invención puede ser utilizada en individuos de todas las edades, incluso neonatos. La invención consiste en una vacuna desarrollada con el fin de prevenir COVID-19. BCG es un buen vehículo para el desarrollo de vacunas, ya que ha demostrado ser segura en neonatos, niños y adultos. Se puede producir fácilmente a gran escala con bajos costos y es estable a los cambios de temperatura. Sumado a esto, la BCG actúa como adyuvante e induce respuestas Thl (linfocito T helper), las que son necesarias para la eliminación del virus. A diferencia de otras formulaciones, el vector BCG, en donde se expresa la proteína viral ha sido ampliamente utilizado durante casi 100 años en humanos.

En una realización la vacuna comprende entre 1X10 ⁴ -1X10 ⁹ UFC de una cepa rBCG que expresa la proteína N, E, M y/o S de SARS-CoV-2, con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia peptídicas de los productos de los genes de las SEO. ID NO:1, SEO. ID NO:2, SEO. ID NO:3 o SEO. ID NO:4. En una segunda realización la vacuna comprende entre 1X10 ⁴ -1X10 ⁹ UFC de una combinación de dos cepas rBCG de acuerdo con la invención donde cada cepa rBCG expresa la proteína N, E, M o S de SARS- CoV-2, con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia peptídicas de los productos de los genes de las SEO. ID NO:1, SEO. ID NO:2, SEO. ID NO:3 o SEQ ID NO:4., respectivamente. Donde la combinación se escoge entre todas las alternativas posibles, es decir cepas transformadas con cualquiera de los pares posibles: N y E; N y M; N y S; E y M; E y S; M y S.

En una tercera realización la vacuna comprende entre 1X10 ⁴ -1X10 ⁹ UFC de una combinación de tres cepas rBCG de acuerdo con la invención donde cada cepa rBCG expresa la proteína N, E, M o S de SARS- CoV-2, con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia peptídicas de los productos de los genes de las SEQ. ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, respectivamente. Donde la combinación se escoge entre todas las alternativas posibles, es decir cepas transformadas con cualquiera de los trios posibles: N, E y M; N, E y S; M, E y S; N, M y S.

En una cuarta realización la vacuna comprende entre 1X10 ⁴ -1X10 ⁹ UFC de una combinación de las cuatro cepas rBCG de acuerdo con la invención donde cada cepa rBCG expresa la proteína N, E, M o S de SARS-CoV-2, con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más de identidad con respecto a la secuencia peptídicas de los productos de los genes de las SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4. Es decir la combinación de cepas transformadas con N, E, M y S.

Las vacunas de la invención contienen cepas vivas recombinantes atenuadas de Mycobacterium bovis, preferentemente Bacilo Calmette-Guérin (BCG), por ejemplo las cepas BCG Danish o Pasteur que expresan de manera recombinante o heteróloga una o más proteínas o fragmentos inmunogénicos de SARS-CoV-2, en especial la proteína N o sus fragmentos inmunogénicos. Las vacunas de la invención comprenden entre 1X10 ⁴ -1X10 ⁹ UFC (unidades formadores de colonia) de las cepas descritas por dosis, y pueden mantenerse conservadas, previo a su administración, de forma liofilizada o en una solución salina y excipientes estabilizador en frío.

Ejemplos de soluciones estabilizadoras apropiadas para las formulaciones inmunogénicas o vacunas de la invención son:

Solución diluida Sauton SSI (125 pg MgSO4, 125 pg K2HPO4, 1 mg L-asparragina, 12,5 pg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico, en 1 ml de H2O) a 4°C;

PBS (137 mM NaCI; 2,7 mM KCI; 4,3 mM Na ₂ HPO4; 1,47 mM KH2PO4, pH 7,4) suplementado con Tween 80 0,02% y Glicerol 20% a -80°C; o Solución volumen: volumen de lactosa 25% y Medio Proskauer y Beck suplementado con glucosa y Tween 80 (PBGT: 0,5 g asparragina; 5,0 g fosfato monopotasio; 1,5 g citrato de magnesio; 0,5 g sulfato de potasio; 0,5 ml Tween 80 y 10,0 g glucosa por litro de agua destilada) liofilizada y conservada en el rango de temperaturas entre 4°C y 25°C.

Para obtener las cepas recombinantes de la invención, los genes que codifican para la proteína N, E, M o S de SARS-CoV-2 o sus fragmentos inmunogénicos, se insertan en un plásmido, el que se incorpora a la bacteria por cualquier técnica disponible. En una realización se utiliza el plásmido pMV361, se incorpora a la bacteria mediante electroporación, y se integra en el genoma bacteriano por acción de integrasas de mycobacteriófagos. También estos genes se pueden insertar en plásmidos extracromosomales, como por ejemplo pMV261, que se incorpora al Mycobacterium por electrotransformación, y se mantiene de forma extracromosomal en la bacteria. Estos genes pueden estar en una o varias copias, y su expresión está comandada por promotores endógenos de BCG, constitutivos o inducibles, por ejemplo el promotor del gen hsp60 y el promotor del gen acr respectivamente. Estas proteínas, o fragmentos inmunogénicos de SARS-CoV-2, pueden ser expresados por BCG u otras cepas atenuadas de Mycobacterium, de forma soluble-citoplasmática, secretada extracelularmente o como proteínas unidas a la membrana.

Las formulaciones de la invención pueden usarse para preparar una vacuna para prevenir, tratar, o atenuar infecciones de SARS-CoV-2 y/o el desarrollo de la enfermedad COVID-19, donde dicha formulación contiene entre 1X10 ⁴ -1X10 ⁹ unidades formadoras de colonia de la cepa atenuada recombinante de Mycobacterium bovis BCG estabilizada con una solución salina fisiológicamente aceptable. Donde dicha vacuna puede ser administrada de forma subcutánea, percutánea o subdérmica en solución salina fisiológicamente aceptable.

Como se sabe de las vacunas actualmente disponibles en el mercado, muchas veces las vacunas contra SARS-CoV-2 requieren una segunda dosis al mes de la primera inoculación y probablemente se sigan requiriendo dosis de refuerzo con inoculaciones semestrales o anuales cada invierno, tal como se requiere para otras enfermedades persistentes o estacionales, tales como la influenza. En el caso de las vacunas de la invención, se debe considerar que el refuerzo actual con BCG se ha realizado a los 5 años de vida, y dada la bivalencia de la vacuna, ya que sigue previniendo la tuberculosis, además de COVID-19, es posible que en un esquema de vacunación para recién nacidos o niños pequeños, lo más conveniente sea que el primer refuerzo para COVID-19, entre uno a seis meses desde la incoulación con las vacunas de la invención, se realice con alguna otra vacuna existente en el mercado.

No obstante, para refuerzos anuales, o más espaciados en el tiempo, por supuesto que sería conveniente la aplicación de las formulaciones de la invención como refuerzo.

Dentro de las vacunas que podrían aplicarse como primer refuerzo entre el mes 1 a los 6 meses desde la primera aplicación, se encuentran vacunas basadas en virus SARS-CoV-2 inactivado, o de subunidades virales de SARS-CoV-2 purificadas, o con fragmentos inmunogénicos peptídicos de SARS- CoV-2, o con vacuna de ADN SARS-CoV-2 o con vacuna de RNA para SARS-CoV-2.

EJEMPLOS

Estos ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden limitar el rango de producción o aplicación de la invención. Aunque en las siguientes descripciones se utilicen términos específicos, su uso es sólo descriptivo y no limitante.

Ejemplo I Cepas BCG Danish recombinante para el gen N, E, M o S de SARS-CoV-2.

Se construyeron cuatro vectores de expresión para BCG que contienen los genes para las proteínas de SARS-CoV-2 N, E, S y M. Para esto se empleó el plásmido pMV361, que se integra una sola vez en el genoma de la bacteria.

Para insertar cada gen en el plásmido se utilizó la combinación de enzimas BstBI (TTCGAA) en el extremo 5' de cada gen y Clal en el extremo 3' (ATCGAT), para los genes N, E y M. La secuencia que se inserta en el plásmido para expresar proteína N, se describe en la SEO. ID NO: 1. La que se inserta en el plásmido para expresar proteína E, se describe en la SEO. ID NO: 2, y la que se inserta en el plásmido para expresar proteína M, se describe en la SEQ ID NO: 3. Para insertar el gen de Spike, S, se utilizó la combinación de enzimas Mfel (CAATTG) en el extremo 5' y Aflll en el extremo 3' del gen (CTTAAG), el cual fue clonado en el vector pMV361 mediante la técnica de Gibson Assembly. Se describe la expression en la SEQ. ID NO. 4:

Los plásmidos obtenidos se denominan pMV361/N SARS-CoV-2, pMV361/E SARS-CoV-2, pMV361/M SARS-CoV-2 y pMV361/S SARS-CoV-2 respectivamente, y las secuencias insertadas se expresan bajo el control de un promotor endógeno y constitutivo del gen hsp60 de BCG. Adicionalmente el plásmido tiene un gen de resistencia a Kanamicina de forma de poder seleccionar las bacterias transformadas.

De modo de comprobar que los plásmidos contienen el segmento insertado, se escindieron de los plásmidos cada uno de los insertos, y se comprobó por electroforesís que los fragmentos obtenidos tienen los tamaños esperados en cada caso, esto es un tamaño de 226 pb para el gen E, un tamaño de 669 pb para el gen M, un tamaño de 1.260 pb para el gen N, , un tamaño de 4122 pb para el gen S1/S2.

Una vez obtenidos los plásmidos para cada proteína de SARS-CoV-2, BCG electrocompetentes se transformaron con plásmidos integrativos de expresión que expresan las proteínas N, E, M y S de SARS- CoV-2.

Con los plásmidos obtenidos se procedió a transformar independientemente cultivos de una cepa BCG electrocompetentes Danish mediante electroporación con cada uno los plásmidos pMV361/N SARS- CoV-2, pMV361/E SARS-CoV-2, pMV361/M SARS-CoV-2 y pMV361/S SARS-CoV-2.

Las colonias recombinantes resultantes de la transformación se crecieron independientemente durante 21 días a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado con Kanamicina 25ug/mL como antibiótico de selección.

Los cultivos se crecieron hasta OD6oonm=l y las BCG transformadas con los plásmidos pMV361/N SARS- CoV-2, pMV361/E SARS-CoV-2, o pMV361/M SARS-CoV-2 y pMV361/S SARS-CoV-2 fueron centrifugadas a 11.000 rpm por 20 min (rotor Eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en solución PBS (137 mM NaCI; 2,7 mM KCI; 4,3 mM Na ₂ HPO ₄ ; 1,47 mM KH ₂ PO ₄ , pH 7,4).

Ejemplo II Demostración de identidad de las cepas BCG recombinantes para el gen N, E, M o S de SARS-CoV-2.

Se realizaron distintas pruebas para asegurar la identidad de cada una de las transformantes obtenidas en el ejemplo I. En primer lugar se obtuvieron colonias aisladas para cada transformante en placas con medio de cultivo 7H10 suplementadas con Kanamicina. Inicialmente se buscó comprobar que los microorganismos son efectivamente BCG, para lo cual se evaluó mediante PCR la presencia de un fragmento del 16S de BCG y un fragmento de la secuencia de inserción IS6610 en el cultivo, las cuales solo están presentes en este tipo de bacterias y no en hongos u otro tipo de microorganismo que podrían contaminar el cultivo. Mediante la amplificación de estos genes conservados en el genoma de BCG por PCR, y posterior visualiza on en un gel de agarosa 3% se confirmó con éxito que un set de colonias obtenidas tras la transformación con los plásmidos recombinantes pMV361/N SARS-CoV-2, pMV361/E SARS-CoV-2, o pMV361/M SARS-CoV-2 y pMV361/S SARS-CoV-2. corresponde a BCG.

En segundo lugar se evaluó la presencia del gen que codifca para cada proteína de SARS-CoV-2 de interés en las cepas tranformadas. Esto se realizó a través de un PCR con partidores específicos para cada gen viral N, E, M y/o S, para la cepa correspondiente. Los resultados se muestran en la Figura 1, donde se observa que en los carriles "1" se obtiene una banda similar al control positivo

Una fracción de BCGs recombinantes obtenidas fue sometida a un protocolo de extracción de proteínas, para evaluar la presencia y expresión de los antígenos N, E, M y/o S recombinante en cada una. Para ello, estas BCGs fueron resuspendidas en un buffer de lisis (Tris 50mM, EDTA 5mM, SDS 0.6%, coctel de inhibidor de proteasas IX ), sometidas a 6 pulsos de sonication de 30 seg en hielo con pulso de descanso de 30 segundos.

La fracción proteica de cada cepa transformada se analizó por electroforesis, comparando el proteoma de cada cepa con la proteína aislada del virus correspondiente, la fotografía del gel se muestra en la Figura 2. Puede observarse que en cada caso existen proteínas del peso molecular esperado a la proteína viral con la que la BCG fue transformada.

Para determinar si se trata efectivamente de las proteínas virales, se realizaron pruebas inmunológicas, con anticuerpos monoclonales murinos que reconocen específicamente las proteínas E, M, N o S de SARS-CoV-2. Posteriormente se emplearon anticuerpos de cabra anti-ratón (Goat anti-mouse IgG- HRP), marcados con HRP, la que permite una reacción colorimétrica. Se realizaron pruebas por Western blot y Dot Blot, y en ambos casos los resultados fueron positivos para la proteína viral correspondiente para cada BCG transformadas pMV361/N SARS-CoV-2, pMV361/E SARS-CoV-2, pMV361/M SARS-CoV-2 o pMV361/S SARS-CoV-2.

Ejemplo III Evaluación de expresión de las proteínas virales N, E, M y/o S de SARS-CoV-2 en las cepas BCG recombinantes. Para finalizar la caracterización de las cepas recombinantes de BCG, además de la identificación del gen mediante PCR, y de confirmación de la expresión de la proteína insertada por Western blot y Dot blot, se realizó la cuantificación del transcrito o mRNA que generan las proteínas virales de SARS-CoV- 2 en la cepa vacuna de la invención, mediante la técnica de qPCR (cuantitativo).

Utilizando esta metodología fue posible encontrar que todos los clones de rBCG-N-SARS-CoV-2, E- SARS-CoV-2, M-SARS-CoV-2 y S-SARS-CoV-2 expresan el gen de interés, lo que se puede observar en la Figura 3. Con este análisis, se pretende estimar la cantidad de proteína que la cepa vacuna podría estar expresando. Con esta información se puede estimar las dosis de prueba para los futuros ensayos de inmunización en animales.

Se evaluó el número de transcritos para el gen N-SARS-CoV-2 en 2 clones de rBCG-N-SARS-CoV-2, los resultados se muestran en la Figura 3 A. Durante el primer pasaje de cultivo, el clon 2 presentó mayor número de copias del transcrito. Sin embargo, cuando se evaluó esto mismo con una muestra de RNA obtenida desde el clon 1 pasaje de cultivo 2, se observó un incremento en un orden de magnitud en la cantidad de transcrito respecto a la obtenida en el primer pasaje-

El mismo ensayo se realizó para evaluar el número de transcritos para el gen E-SARS-CoV-2 observándose la presencia del número de copias para el gen evaluado para los dos pasajes del cultivo evaluados (Figura 3 B). Sin embargo, se determinó que la cantidad de transcrito obtenido en el segundo pasaje de cultivo de la cepa rBCG-E-SARS-CoV-2 fue mayor en tres ordenes de magnitud con respecto a la cantidad obtenida durante el primer pasaje del cultivo.

La expresión del gen M-SARS-CoV-2 fue también evaluado con la misma metodología mencionada para los otros genes. De este ensayo se observó que la presencia del número de copias para el gen M-SARS- CoV-2 evaluado para los dos pasajes del cultivo fue similar (Figura 3 C).

Por último, se estandarizaron las condiciones para poder detectar la expresión de la proteína S (Spike) en la cepa recombinante de BCG. Cuando se evaluó el primer pasaje de cultivo de esta cepa vacuna se obtuvo que la expresión se encontraba presente, sin embargo, el número de copias no era muy elevado (Figura 3 D).

Ejemplo IV: Formulación inmunogénica.

Las colonias recombinantes resultantes en el ejemplo anterior transformadas con pMV361/N SARS- CoV-2, pMV361/E SARS-CoV-2, pMV361/S SARS-CoV-2 o pMV361/M SARS-CoV-2, se crecieron a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado, con Kanamicina 25 ug/mL como antibiótico de selección hasta OD600nm=l, fueron centrifugadas a 11.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en solución PBS (137 mM NaCI; 2,7 mM KCI; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 M KH2PO4, pH 7,4).

Para generar dosis de vacuna de concentración específica, por ejemplo 10 ⁵ ó 10 ⁸ UFC por 100 pl se realizaron diluciones seriadas en placas con medio 7H9, realizando conteo de colonias, desde los viales de dosis. Se descartó la presencia de agentes contaminantes sembrando algunas de las dosis en placas de LB y 7H9 sin antibióticos. Finalmente, una vez confirmado que las dosis fuesen precisas respecto al número de UFCs, estas se conservaron a -80°C hasta su uso como vacuna en animales.

Se generaron dosis de BCG recombinante para proteína N, E, M y/o S de SARS-CoV-2, donde las cepas BCG fueron transformadas con plásmidos que contienen las secuencias indicadas en las SEO. ID NO:1 para N, SEO. ID NO:2 para E, SEQ. ID NO:3 para M o SEQ ID NO:4 para S1/S2 y que se identifican como rBCG-N-SARS-CoV-2, rBCG-E-SARS-CoV-2, rBCG-M-SARS-CoV-2 y rBCG-S-SARS-CoV-2.

Las dosis pueden contener sólo una de las bacterias transformadas, o una combinación de 2 de ellas, o una combinación de 3 de ellas o las 4, donde en cada combinación de más de una bacteria transformada cada una puede estar presente en cualquier proporción. Es decir una dosis puede contener entre 0 a 100% rBCG-E-SARS-CoV-2, entre 0 a 100% rBCG-M-SARS-CoV-2, entre 0 a 100% rBCG-N-SARS-CoV-2 y entre 0 a 100% rBCG-S-SARS-CoV-2.

Las dosis así preparadas se pueden emplear para vacunar animales por medio de una inyección subcutánea o percutánea o subdérmica.

Ejemplo V: Inmunización de animales con una cepa rBCG

Se realizaron 2 conjuntos de pruebas de inmunización en modelo animal (ratón), con las composiciones obtenidas en el ejemplo IV. El diseño experimental fue desarrollado para evaluar la inmunidad celular y humoral inducidos por una vacunación con una cepa recombinante de BCG que expresa ya sea la proteína E, N, M y/o S de SARS-CoV-2.

El primer conjunto de análisis se realizó de acuerdo a lo indicado en el esquema de la Figura 4, con 2 vacunaciones de los animales en los días 0 y 14 con una dosis de lxlO ⁸ UFC. Se tomaron muestras de sangre a los 7, 14 y 21 días, donde el día 21 se puso término al experimento con la eustanasia de los animales. El segundo conjunto de análisis se realizó de acuerdo a lo indicado en el esquema de la Figura 5, con 1 vacunación de los animales el día 0 con una dosis de lxlO ⁵ UFC. Se tomaron muestras de sangre a los 7, 14 y 21 días, donde el día 21 se puso término al experimento con la eustanasia de los animales.

En cada caso las dosis de UFC corresponden a las BCG transformadas de la invención, las que corresponden a BCG transformadas pMV361/N SARS-CoV-2, pMV361/E SARS-CoV-2, pMV361/M SARS-CoV-2 o pMV361/S SARS-CoV-2.

Ejemplo VI: Efecto de la vacuna con una cepa rBCG en animales

Para evaluar el efecto de la vacunación con la cepa rBCG-N-SARS-CoV-2 en ambos esquemas de inmunización desarrollados en el ejemplo anterior, se procedió a generar un co-cultivo entre células dendríticas (DCs) cargadas con distintos péptidos y tratamientos, y linfocitos T purificados desde órganos linfoides secundarios de los animales vacunados (bazo y nodulos linfáticos), durante 72 horas. Posterior a este tiempo las células fueron teñidas con distintos anticuerpos para evaluar la activación de estos linfocitos T. Adicionalmente, los marcadores de activación CD69 ⁺ , CD71 ⁺ y CD25 ⁺ fueron evaluados en la superficie de linfocitos T CD4 ⁺ y T CD8 ⁺ mediante citometría de flujo. Además, las citoquinas fueron evaluadas mediante ELISA desde los sobrenadantes de los co-cultivos.

A partir del co-cultivo proveniente del segundo esquema de inmunización, se realizó la evaluación de citoquinas en los sobrenadantes de los distintos tratamientos. En un comienzo se evaluaron las citoquinas IL-2 e IFN-gamma. IL-2 se evaluó para correlacionar un aumento en la proliferación de los linfocitos T, mientras que IFN-gamma se evaluó para correlacionar la respuesta inmune que promueve la vacuna.

Cuando se evaluó IFN-gamma se determinó que los animales vacunados con la cepa rBCG-N-SARS-CoV- 2 promueven una mejor secreción de esta citoquina que polariza la respuesta inmune a un perfil antiviral, ver figura 6.

Para evaluar si la vacunación con la cepa rBCG-N-SARS-CoV-2 induce una respuesta inmune celular, luego de poner punto final al experimento, del segundo esquema de inmunización se purificaron linfocitos T totales desde los bazos. Estos fueron luego co-cultivados con células dendríticas cargadas con distintos péptidos y tratamientos durante 72 horas. Luego de este tiempo, los marcadores de activación CD69 ⁺ , CD71 ⁺ y CD25 ⁺ fueron evaluados en la superficie de linfocitos T CD4 ⁺ y T CD8 ⁺ mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la Figura 7, donde se puede apreciar que los linfocitos T se activan específicamente en respuesta a la proteína N de SARS-CoV-2 (20 pg). El resultado es muy notorio para todos los linfocitos T CD4 ⁺ y T CD8 ⁺ evaluados, la respuesta frente al antígeno viral específico es similar a la respuesta frente al control positivo Concanavalina A (Con A).

Estos resultados son muy importantes, ya que implica que la vacuna tiene un efecto positivo en promover linfocitos T CD4 ⁺ , los que puedan ayudar a activar la respuesta inmune contra el virus, y al mismo tiempo en promover linfocitos T CD8 ⁺ que tiene un efecto antiviral.

Sumado a estos resultados, se complementó la respuesta celular observada con la medición de anticuerpos inducidos para ambos esquemas de inmunización. A partir del esquema de inmunización con dos dosis de lxlO ⁸ UFC mostró una eficiente inducción de anticuerpos anti-N-SARS-CoV-2 mediante ELISA, luego de 24 días posterior a la inmunización. De los datos obtenidos fue posible identificar que la cepa vacuna rBCG-N-SARS-CoV-2 es capaz de promover una leve respuesta de anticuerpo previo del estímulo, observándose un pequeño incremento al día 14 para la barra señalada con *. Sin embargo, este incremento es mucho más notorio luego del estímulo al día 24 en donde se observa que existe una alta respuesta frente al estímulo desde los sueros de animales vacunados con la cepa recombinante rBCG-N-SARS-CoV-2 (Figura 8).

Ejemplo Vil: Inmunización de animales con mezclas de cepas rBCG

Se realizó un conjunto de pruebas de inmunización en modelo animal (ratón), con las composiciones obtenidas en el ejemplo IV, comprendiendo una mezcla de las cuatro cepas transformadas (25% rBCG- E-SARS-CoV-2, 25% rBCG-M-SARS-CoV-2, 25% rBCG-N-SARS-CoV-2 y 25% rBCG-S-SARS-CoV-2). El diseño experimental fue desarrollado para evaluar la inmunidad celular y humoral inducidos por la vacunación con una formulación de la invención.

Para llevar a cabo esto, se realizó una inmunización con una dosis de 4 x 10 ⁵ UFC totales (1 x 10 ⁵ UFC de cada una de las cepas recombinantes de la invención), luego de 14 días los animales fueron sometidos a una segunda inmunización que correspondió a un refuerzo utilizando las proteínas purificadas E, M, N y S, 40 pg en total, (10 pg de cada una) administradas en compañía del adyuvante hidróxido de aluminio, el esquema del experimento está en la Figura 9. Se tomaron muestras de sangre a los 0, 14 y 24 días posteriores a la inmunización, donde el día 24 se puso término al experimento con la eutanasia de los animales. Adicionalmente se incluyeron diferentes controles, cada uno en un grupo de 3 animales, como se indican en la Tabla 1.

Tabla 1.

Ejemplo VIII: Efecto de la vacuna con mezclas de cepas rBCG en los animales

En primer lugar se realizó la evaluación de pérdida de peso de los animales sometidos al esquema de vacunación de la invención y sus controles, donde la vacuna de la invención corresponde a un pool o mezcla de las 4 cepas recombinantes de BCG en conjunto. Los resultados se muestran en la figura 10. El esquema de vacunación de la invención demostró ser segura, ya que los animales no disminuyeron su peso en el tiempo.

A partir de las muestras de sangre obtenidas en los días 0, 14 y 24 se realizó la determinación de anticuerpos contra la proteína N del virus SARS-CoV-2, observándose que la vacunación con el pool de BCGs promueve un incremento de los anticuerpos anti-N-SARS-CoV-2 en los animales, mayor al obtenido en todos los grupos control. Se observó que este efecto fue ostensiblemente mayor al final del ensayo (día 24) en el grupo que corresponde a la invención, inmunizado con el pool de cepas recombinantes y con el refuerzo constituido por una mezcla de proteínas recombinantes (N, M y S) y Alum. Los anticuerpos presentes en los sueros obtenidos de los animales del ensayo se evaluaron mediante la técnica de ELISA, empleando proteína recombinante N (rN)de SARS-CoV-2 como blanco y anticuerpos anti-ratón unidos a la enzima HRP, que da la reacción colorimétrica. Se emplearon los sueros de los animales del estudio diluidos 1/5. La reacción colorimétrica fue evaluada en un lector de ELISA a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados se muestran en la figura 11, donde se aprecia que la mejor producción de anticuerpos anti-N se obtiene con el esquema de vacunación de la invención, al día 24 del experimento.

Adicionalmente, se realizó una titulación para determinar si los esquemas de inmunización de la invención habían permitido desarrollar a los animales anticuerpos contra la proteína S del virus SARS- CoV-2. Para esto, se utilizaron los sueros obtenidos al día 24 del ensayo, donde se realizó una medición por cada grupo de animales, empleando una mezcla en proporciones ¡guales de los sueros provenientes de los 3 animales que conforman cada grupo experimental. De este ensayo, fue posible determinar que la vacunación realizada utilizando el esquema de vacunación de la invención promueve una fuerte respuesta de anticuerpos contra la proteína S de SARS-CoV-2. Donde la producción de anticuerpos es notoriamente superior en el esquema de la invención, respecto a lo observado para el resto de los grupos experimentales, como se aprecia en la figura 12. En especial, los resultados muestran que la combinación del pool de cepas de la invención con un refuerzo de un pool de proteínas recombinantes virales (N, M y S) generan significativamente más anticuerpos que el uso sólo de las cepas de la invención (pool) y que el uso sólo de las proteínas recombinantes.

Dado que se demostró que el esquema de la invención promueve la generación de anticuerpos contra el virus SARS-CoV-2, se evaluó además la respuesta inmune celular, evaluando la activación de linfocitos T CD8 ⁺ , de efecto antiviral. Para esto, luego de poner punto final al experimento, el día 24, se purificaron linfocitos T totales desde los bazos de los animales. Las condiciones evaluadas se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2

Los linfocitos T purificados fueron luego co-cultivados con células dendríticas cargadas con distintos péptidos de SARS-CoV-2 durante 72 horas, los péptidos empleados corresponden a las proteínas N, M y S, o la mezcla de N, M y S. Al finalizar la incubación se evaluaron, los marcadores de activación CD69 ⁺ , CD71 ⁺ y CD25 ⁺ en la superficie de linfocitos T CD8 ⁺ mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la figura 13.

Los resultados muestran que los distintos estímulos evaluados (N, M y S, o su mezcla) efectivamente estimulan a los linfocitos T CD8 ⁺ , aumentando la expresión de los marcadores CD69 ⁺ , CD71 ⁺ y CD25 ⁺ . Específicamente, se encontró una mayor expresión del marcador CD69 ⁺ en el grupo con el esquema de vacunación de la invención, "rBCGs pool / rProts+Alum", frente a los estímulos de las proteínas M, N y para la mezcla de proteínas en el co-cultivo (figura 13 B). Por otra parte, el segundo marcador de activación más expresado en el grupo de interés fue CD71 ⁺ , principalmente como respuesta a los estímulos de la proteína S y del mix de proteínas (figura 13C). Finalmente, se observó una respuesta similar a la observada para CD71 ⁺ en la expresión del marcador CD25 ⁺ (figura 13A).

Los datos obtenidos en este estudio demuestran que el uso de un pool de las cepas recombinantes de BCG, que expresan las distintas proteínas de SARS-CoV-2, promueven una respuesta inmune humoral y celular que seria eficaz frente a una infección por SARS-CoV-2 en un modelo sin infección.

Ejemplo IX: Ejemplo comparativo: esquema de vacunación de la invención v/s vacuna de virus inactivado.

De modo de establecer comparativamente la inmunidad otorgada por el esquema de vacunación de la invención, se realizó un experimento donde se inmunizaron animales según la invención y simultáneamente con vacunas de virus inactivados. El esquema de vacunación se resume en la Tabla 3:

Tabla 3. A partir del esquema de inmunización de la Tabla 3, se procedió a evaluar la respuesta inmune inducida por la vacunación con nuestra cepa vacuna rBCG-N-SARS-CoV-2 en comparación con la respuesta generada por la vacunación con virus inactivado.

Luego de finalizar el experimento, los bazos y nodulos linfáticos de los animales fueron recolectados y a partir de estos se realizó la purificación de linfocitos T totales. Estos linfocitos fueron luego cocultivados con células dendríticas previamente cargadas con los distintos estímulos por 72 horas. Los tratamientos evaluados fueron control negativo o sin tratamiento (UT), con proteína N de SARS-CoV- 2, y con derivado proteico purificado (PPD, por sus siglas en inglés), el cual es utilizado como marcador de infección positivo o control positivo de estimulación por BCG, y al grupo inmunizado con virus inactivado también con proteína S de SARS-CoV-2. Los resultados se muestran en la Figura 14, donde se aprecia que después de los esquemas de vacunación de la invención y con virus inactivado se obtiene una activación similar de linfocitos T CD8 ⁺ , aumentando la expresión de los marcadores CD69 ⁺ , CD71 ⁺ y CD25 ⁺ .

Finalmente, se evaluó la capacidad que tenían ambas vacunas para promover la secreción de anticuerpos anti-N en el suero de los animales. Para determinar esto, se realizó mediante la técnica de ELISA indirecto la determinación de anticuerpos totales anti-N-SARS-CoV-2 presente en los sueros obtenidos desde los animales a distintos tiempos dentro del experimento. Los resultados muestran que una vez terminado el esquema de vacunación, ambos grupos, (invención y el grupo vacunado con virus inactivado), estimularon la secreción de anticuerpos contra proteína N de SARS-CoV-2 a niveles similares (Figura 15).

Estos resultados demuestran que las cepas BCG transformadas expresan constitutivamente proteínas de SARS-CoV-2, por lo que al emplearse en una formulación inmunogénica permitirían al individuo (animal o persona) que recibe esta composición, desarrollar inmunidad contra la SARS-CoV-2, lo que otorgaría una protección contra COVID-19.