TEST IMMUNOLOGIQUE POUR DETECTION D’INFECTIONS VIRALES

DOMAINE TECHNIQUE

La présente demande concerne un procédé de diagnostic d’une infection virale touchant les êtres humains. Ce procédé est réalisé sur un échantillon biologique d’un individu susceptible d’être infecté par ledit virus, en particulier par un coronavirus, et plus spécifiquement par le coronavirus SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2).

TECHNIQUE ANTERIEURE

Un virus est un agent infectieux capable de s’intégrer dans les cellules d’un organisme, dites « cellules hôtes », et de s’y reproduire en utilisant la machinerie cellulaire desdites cellules hôtes. De nombreux virus sont pathogènes, c’est-à-dire qu’ils causent une maladie chez leur hôte dite « infection virale ».

Les infections virales chez l’être humain sont caractérisées par des signes cliniques et symptômes tels que fièvre, frissons, maux de tête, courbatures, toux et fatigue. Ces signes cliniques sont communs à des infections virales générées par des virus distincts, et ne permettre de distinguer le virus à l’origine de la pathologie.

Or, il est indispensable pour les personnels de santé de connaître l’origine virale des infections qu’ils doivent traiter, d’une part pour choisir la thérapie adaptée, et d’autre part pour anticiper la contagion et le risque de dissémination du virus au sein de la population.

L’importance de l’identification du virus pathogène est essentielle en cas de virus très contagieux, afin de pouvoir isoler les personnes infectées et prévenir les personnes ayant été en contact avec une personne infectée.

Parmi les virus particulièrement contagieux, l’année 2020 a été marquée par l’apparition d’une pandémie liée au SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) générant la forme de pneumonie dénommée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Cette épidémie a été déclarée « urgence de santé publique de portée internationale » par l'Organisation mondiale de la santé (OMS) le 30 janvier 2020.

Le virus SARS-CoV-2 est un virus enveloppé à ARN positif qui appartient à la famille des Coronaviridae, à la sous-famille des Coronavirinae, au genre Betacoronavirus et au sous- genre Sarbecovirus. Comme le SARS-CoV, le SARS-CoV-2 est un virus de chauve-souris qui s’est adapté à l’homme selon des modalités qui restent encore à élucider. L’ARN viral, d’une longueur d’environ 30 000 bases, a été séquencé pour la première fois le 5 janvier 2020 par une équipe de l'université Fudan de Shanghai (Chine). Cet ARN simple brin code notamment une volumineuse ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp pour RNA-dependent RNA polymerase) et plusieurs protéines structurales dont une glycoprotéine de surface (S pour « Spike protein ») responsable de l’aspect en couronne du virus en microscopie électronique.

A la fin de l’année 2020, sont apparus de nouveaux variants viraux du SARS-CoV-2 dont l’efficacité de la transmission interhumaine est accrue, suite à l’apparition de nouvelles mutations du génome.

De nombreuses techniques de diagnostic in vitro de la présence d’un virus spécifique chez un être humain hôte (infecté) sont connues de la personne de l’art. Sont présentées ci- dessous les techniques les plus utilisées de diagnostic direct, c’est-à-dire indiquant la présence ou l’absence du virus dans un échantillon biologique issu d’un individu, avec ou sans quantification de la charge virale.

Ces techniques de détection sont de deux types : celles basées sur la détection de l’acide nucléique du virus, et celles basées sur la détection d'antigènes (protéines ou sucres) du virus, au sein de l’échantillon biologique.

En ce qui concerne la détection du SARS-CoV-2, ces deux types de techniques ont été développées au cours de l’année 2020.

Techniques de détection de l’acide nucléique viral basées sur l’amplification des acides nucléiques

Ces techniques sont basées sur l’amplification du matériel génétique de l’agent infectieux, ADN ou ARN en fonction de la nature du virus. Il existe trois types de technologies qui sont présentées ci-dessous.

1. Technique basée sur l’amplification par polymérisation en chaîne (PCR), en particulier la RT -PCR en temps réel.

La RT-PCR en temps réel comporte 3 étapes : (i) l’extraction des acides nucléiques de l’échantillon, (ii) la transcription inverse des ARN de l’échantillon en ADN complémentaires grâce à l’utilisation d’une réverse transcriptase (RT) et (iii) l’amplification du génome viral grâce à des amorces spécifiques de certains gènes de ce virus par technique de PCR en temps réel.

Cette amplification « en temps réel », abrégée rt-PCR ou qPCR (pour real-time PCR ou quantitative PCR), permet d’avoir une estimation de la charge virale de l’échantillon exprimée en valeur de Ct, le terme Ct ou cycle threshold correspondant au nombre de cycles de PCR à partir duquel un signal fluorescent est détecté en PCR : plus la valeur de Ct est faible, plus le signal apparaît précocement au cours du processus d’amplification et plus la charge virale estimée est élevée. En termes pratiques, la réaction de RT-PCR quantitative comprenant les 3 étapes mentionnées ci-dessus nécessite 3 à 4 heures à partir de l’arrivée de l’échantillon au laboratoire, ce qui constitue pour le moment un délai de réponse incompressible de la technique.

Certains tests moléculaires basées sur la PCR permettent d’obtenir un résultat en environ une heure. Il s’agit de tests commerciaux comme BioFire® (BioMérieux), Cobas LIAT® (Roche Diagnostics), QIAstat Respiratory Panel-A (Q.IAGEN) ou Xpert® Xpress SARS-CoV-2 (Cepheid). Hormis leur coût, leur principale limite reste la difficulté à les utiliser dans le cadre de grandes séries, ce qui les réserve plutôt à l’investigation de situations d’urgence et des cas graves.

La PCR digitale (dPCR) est une variante technologique de test PCR qui permet de réaliser simultanément plusieurs dizaines de milliers de réactions PCR au sein d’une puce microfluidique ou d’un aérosol de gouttelettes micronisées dans une émulsion d’huile. Comme la RT-PCR classique, la RT-PCR digitale en temps réel permet d’obtenir une semi- quantification de la charge virale des signaux PCR.

2. Techniques moléculaires basées sur l’amplification isotherme

Lors de ces tests, l’amplification du matériel génétique se fait à température constante, ce qui ne nécessite pas, contrairement aux techniques basées sur la PCR, l’utilisation d’un thermocycleur. On parle alors de techniques d’amplification isotherme.

L’une des méthodes les plus utilisées est la Transcription-mediated amplification (TMA). Cette technique ne permet pas de semi-quantification car le signal positif est généré en fin de réaction. Sa sensibilité est équivalente à celle de la RT-PCR.

Une autre technique, la RT-LAMP pour Loop-mediated isothermal amplification, combine une transcriptase inverse, une ADN polymérase possédant une forte activité de déplacement de brin et 4 à 6 amorces ciblant différentes régions du génome à détecter ; la lecture se fait par détection colorimétrique ou de fluorescence. Du fait de leur coût modeste, les tests commerciaux basés sur ce principe connaissent actuellement un grand essor pour la détection de l’ARN du SARS-CoV-2. Ces tests sont faciles à mettre en oeuvre et fournissent un résultat en moins d’une heure. Néanmoins, outre la possibilité de faux-positifs, la principale limite des tests LAMP reste la difficulté à les utiliser à grande échelle, ce qui conduit à les réserver plutôt à des situations d’urgence.

Enfin, la technique NEAR pour Nicking and extension amplification reaction utilise une ADN polymérase, deux amorces spécifiques de la cible à détecter et une enzyme de restriction capable de ne couper qu’un seul brin d’ADN (nicking enzyme). Cette technique, commercialisée par Abbott Diagnostics pour le diagnostic rapide de l’infection à SARS-CoV- 2 (test ID NOW COVID-19), est très simple à mettre en oeuvre et donne un résultat en moins de 15 minutes. Il s’agit, comme la précédente, d’une technique destinée à des déterminations individuelles en situation d’urgence. Son manque de sensibilité a été pointé dans certaines études.

3. Techniques moléculaires basées sur le séquençage haut débit

Les techniques NGS (Next Génération Sequencing) permettent de séquencer à haut débit les acides nucléiques présents dans un échantillon environnemental ou clinique. Plusieurs plateformes commerciales sont actuellement disponibles dans les laboratoires spécialisés de biologie moléculaire.

Néanmoins, la limite de la plupart de ces techniques reste actuellement leur délai de réalisation, de l’ordre de 9 à 12 heures, sans compter le temps d’analyse des résultats.

Tests antigèniques rapides

Ces tests immunologiques permettent de détecter, grâce à un ou des anticorps spécifiques, des antigènes spécifiques d’un virus. Il existe des tests antigéniques spécifiques de nombreux virus respiratoires (virus grippaux, virus respiratoire syncytial, ...).

De tels tests antigéniques ont été développés pour détecter les antigènes spécifiques de SARS-CoV-2 (1 ). Ils détectent la présence d’une des protéines du virus SARS-CoV-2, généralement mais pas uniquement, la protéine de nucléocapside NP, dans un échantillon biologique.

Les grands avantages de ces tests sont leur rapidité, leur facilité d’utilisation et d’interprétation. Ils sont majoritairement distribués sous la forme de tests unitaires rapides, également dénommés tests de diagnostic rapide (TDR).

La lecture des résultats se fait à l’œil nu (voir Figure 1 ) ou à l’aide d’un lecteur permettant une interprétation objective. Le résultat est disponible en une quinzaine de minutes. Ces tests peuvent être utilisés par des non biologistes sous forme de tests rapides d’orientation diagnostique (TROD) ou sous forme de tests de diagnostic rapide (TDR) au sein des laboratoires d’analyses médicales. Les mêmes normes de sécurité que pour des tests moléculaires (équipements de protection individuels, zone de manipulation dédiée, élimination sécurisée des déchets ...) doivent être appliquées par les manipulateurs.

Le principal écueil de ces tests antigèniques est leur manque de sensibilité par rapport aux tests moléculaires, les meilleurs d’entre eux permettant la détection du virus dans des échantillons qui, analysés en RT-PCR classique, présentent des valeurs de Ct de l’ordre de 30 ou inférieures. Cependant, ce type de test permet d’identifier rapidement des personnes présentant des charges virales élevées, par exemple dans les services d’urgence ou parmi les personnels soignants afin de prévenir les départs d’épidémie. Leur utilisation dans le cadre du dépistage de patients asymptomatiques ou pauci-symptomatiques dits « super contaminateurs », dans un objectif de santé publique (dépistage de masse et dépistage ciblé) est donc recommandé.

Echantillons biologiques utilisés pour le diagnostic d’une infection à SARS-CoV-2

Les échantillons utilisés pour le diagnostic d’infection virales, notamment par le virus SARS- CoV-2, dépendent du stade de l’infection.

Durant la phase précoce de l’infection, les prélèvements naso- ou oro-pharyngés obtenus par écouvillonnage profond du nez ou de la gorge (luette) sont les plus utilisés et les plus sensibles. Ils nécessitent une technique de prélèvement parfaitement maîtrisée. Le préleveur doit se protéger correctement (masque FFP2, lunettes ou visière de protection, double gantage, surblouse, hygiène des mains avant et après le geste) pour éviter les contaminations nosocomiales.

Le prélèvement naso-pharyngé profond peut s’avérer sinon douloureux du moins très désagréable pour le patient ; il reste néanmoins le mieux standardisé, sensible et constitue l’examen de référence, notamment chez les sujets symptomatiques suspects de maladie Covid-19.

Durant cette même phase précoce, des prélèvements alternatifs de type auto-prélèvements, faciles à répéter chez des patients pauci- ou asymptomatiques, peuvent s’envisager au prix d’une sensibilité dégradée ; c’est le cas du prélèvement de salive au niveau de la gorge recueilli après des efforts de toux, en se raclant la gorge, et sans avoir bu et mangé depuis au moins 30 minutes, voire du prélèvement de salive endo-buccale ou de l’écouvillonnage du vestibule nasal antérieur.

Ces auto-prélèvements seraient adaptés à un dépistage de masse. Ils présentent en effet l’avantage d’être non-invasifs, non douloureux, et peuvent facilement être réalisés sur des enfants.

Au stade de pneumonie virale, il faut avoir recours à des prélèvements plus profonds : crachats induits (et non salivaires) chez les patients non intubés, aspirations trachéales ou lavage broncho-alvéolaire (LBA) chez les patients en réanimation ; dans un certain nombre de cas, évalué à 30 % environ, l’ARN viral a été détecté dans les échantillons respiratoires profonds sans être amplifié dans les prélèvements oro- ou naso-pharyngés ; dans les formes très inflammatoires, le virus n’est même plus présent au niveau pulmonaire.

Le virus peut également être recherché dans le sang et dans les selles, notamment au cours des infections sévères. Tests diagnostiques pour détecter le SARS-CoV-2

En l'absence de couverture vaccinale dont l’efficacité a été démontrée et de traitement spécifique, l'endiguement des épidémies repose principalement sur l'identification rapide et l'isolement des patients atteints de COVID-19 afin d'éviter une nouvelle propagation du virus.

Le diagnostic précoce est important dans ce contexte, non seulement pour le diagnostic et le suivi virologique éventuel des patients hospitalisés, mais aussi pour assurer la sécurité sanitaire des soignants, des premiers intervenants et de la population en général.

Le test de référence est aujourd’hui la détection par RT-PCR du virus SARS-CoV-2 dans des échantillons de sécrétions nasopharyngées. Ce test est sensible mais requiert quelques heures pour obtenir les résultats.

Or, en fonction du contexte clinique et épidémiologique, d’autres types de stratégie diagnostique peuvent être considérées.

En effet, dans le but de limiter la transmission interhumaine d’un virus contagieux, la sensibilité des tests de diagnostic peut devenir un critère de second plan, au regard de la praticabilité et de la rapidité de rendu des résultats desdits tests. La figure 2 présente les différents types de tests existants et leurs intérêts relatifs en termes de sensibilité et de rapidité d’obtention du résultat.

Dans le cas du SARS-CoV-2, différentes études (2-4) contribuent à démontrer que la transmission interhumaine n’obéit pas à des règles suivant une distribution normale, mais qu’un faible nombre d’individus infectés pendant un laps de temps très court (deux jours avant et cinq jours après le pic de charge virale au niveau oro-naso-pharyngé) est à l’origine de la majorité des évènements de contamination. On désigne parfois ces individus par le terme de « super-contaminateurs ».

En parallèle, des travaux récents de modélisation basés sur la cinétique de l’excrétion virale et la durée d’incubation de l’infection à SARS-CoV-2 ont cherché à préciser quel est l’impact de la rapidité de rendu du résultat sur la diminution de la transmission, appréciée par la réduction du taux de reproduction (RO) (5, 6). Les auteurs constatent que les exigences propres aux tests de dépistage pour la surveillance et le contrôle de l’épidémie sont différentes de celles des tests de diagnostic clinique. En effet, les tests qui ciblent les personnes symptomatiques nécessitent une sensibilité et une spécificité élevées et ne sont pas limités par le coût. Parce qu'ils sont symptomatiques, ces individus peuvent s'isoler dès l’apparition des symptômes, de telle sorte qu'un diagnostic retardé a moins de répercussion sur la transmission. En revanche, chez les personnes asymptomatiques ou pauci- symptomatiques, un retard de rendu de résultat, même très court (un jour), compromet l’efficacité du programme de dépistage, surtout si le sujet est à l’acmé de son excrétion virale. A ce stade, le délai de rendu de résultats est beaucoup plus important que la sensibilité du test car même un test peu sensible sera capable de repérer l’infection.

Il est donc essentiel de mettre en oeuvre des stratégies de dépistage qui identifient les individus les plus à risque de disséminer l’infection, dans un temps court.

Les tests destinés aux campagnes de dépistage à grande échelle, dans le cadre d’une surveillance épidémiologique, doivent répondre aux critères suivants : la facilité d’exécution, la rapidité de rendu du résultat, le caractère peu invasif du prélèvement et un coût faible. En effet, lors de ces campagnes de dépistage, l’objectif est de détecter les sujets les plus à risque de transmission, et notamment les sujets dits super-contaminateurs. Un autre objectif est de pouvoir répéter ces tests le plus souvent possible.

Afin de rendre cette stratégie acceptable pour le plus grand nombre, il faut pouvoir recourir à des auto-prélèvements d’échantillons biologiques (salive, prélèvements de la cavité nasale antérieure ...) donnant des résultats moins sensibles mais beaucoup plus adaptés à des surveillances continues.

Ainsi, dans un contexte de stratégie de dépistage à grande échelle et en continu, il est urgent de proposer des tests de diagnostic direct peu invasifs en termes d’échantillons biologiques, et permettant un rendu de résultats plus rapide que les tests par RT-PCR.

Il a été proposé d’utiliser des échantillons de salive pour détecter le SARS-CoV-2 (9, 10).

Néanmoins, ces échantillons de salive ne sont généralement pas assez concentrés en virus pour que la détection puisse être réalisée par un test immunologique, et ce alors que l’infection virale est présente et est validée par un test de RT-PCR.

La présente invention concerne un nouveau procédé de diagnostic d’une infection virale, basé sur l’utilisation d’un échantillon biologique combiné de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur, la détection du virus étant réalisée par un test immunologique, et la sensibilité du procédé de diagnostic étant satisfaisante grâce à cette combinaison de deux types d’échantillons biologiques.

RESUME DE L’INVENTION

La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d’une infection virale due à la présence d’un virus chez un individu, comprenant une étape de détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur un échantillon biologique dudit individu, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu.

Selon une mise en oeuvre particulière, le virus détecté est le coronavirus SARS-CoV-2. La présente invention concerne également une trousse de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, comprenant : i) des dispositifs médicaux pour effectuer et collecter des prélèvements salivaires et narinaires antérieurs, ii) un test immunologique comprenant au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du virus, ainsi que les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de ce test.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

Figure 1. Illustration d’un test immuno-chromatographique (COVID19Speed-Antigen Test de la Société BioSpeedia). Le prélèvement est déposé dans la cupule S située au bas de la figure. La ligne C correspond au Contrôle de bon fonctionnement du test ; son absence est synonyme d’un test invalide. La ligne T (Test) correspond à la détection de la protéine N du virus SARS- CoV-2. Le test présenté à gauche montre une réactivité négative. Le test présenté au centre montre une réactivité faiblement positive. Le test présenté à droite montre une réactivité positive.

Figure 2. Distribution des principaux tests de diagnostic direct de l’infection à SARS-CoV-2 en fonction de leur sensibilité et de leur délai de réponse. Dans le cadre d’un dépistage non ciblé, la répétition de tests faciles à mettre en oeuvre et de rendu rapide peut être plus efficace en termes de santé publique, pour détecter les sujets infectés et les isoler, que des techniques très sensibles.

Figure 3. Réalisation du prélèvement et du test selon l’invention, avec un kit comprenant un écouvillon pour prélèvement de salive. Les conclusions diagnostiques sont présentées.

3A) Page 1 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique, comprenant la liste des dispositifs : (1 ) Ecouvillons pour le prélèvement buccal (extrémité plus large), (2) Ecouvillons pour le prélèvement nasal, (3) Tubes d’extraction, (4) Capuchons compte-gouttes, (5) Cassettes et flacon de tampon d’extraction.

3B) Page 2 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique, présentant les grandes étapes du prélèvement de salive avec écouvillon (prélèvement buccal)

3C) Page 3 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique, présentant les grandes étapes du prélèvement de sécrétions du vestibule nasal antérieur avec écouvillon (prélèvement nasal)

3D) Page 4 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : lecture des résultats positif / négatif du procédé selon l’invention. Dans cet exemple, la ligne C est celle du contrôle interne qui doit être positif, la ligne T est celle du test de l’échantillon. Le cercle S représente le puits dans lequel deux gouttes d’échantillon biologique ont été déposées pour effectuer le test. Figure 4. Réalisation du prélèvement et du test selon l’invention, avec un kit comprenant un contenant pour prélèvement de salive par salivation.

4A) Page 1 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique, présentant le matériel

4B) Page 2 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique - Prélèvement de salive par salivation dans un contenant adapté, représenté en haut de la figure

4C) Page 3 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : prélèvement nasal et combinaison avec le prélèvement de salive.

Les différents schémas présentés en figure 4C sont commentés ci-dessous.

(1 ) et (2) Retirer l’écouvillon de son emballage puis (3) l’insérer dans la partie antérieure de la narine du patient (zone intermédiaire entre la partie humide et sèche). TOUTE la partie floquée doit être introduite dans le vestibule de la narine antérieure. Cette étape ne doit pas être douloureuse mais un réflexe lacrymal peut être observé.

(4) Demander au patient de se pincer la narine pour positionner l’écouvillon contre la paroi nasale tout en tournant doucement l’écouvillon 10 fois (environ 10 secondes) ; l’écouvillon doit toucher la paroi nasale pendant toute cette étape. Retirer l’écouvillon en maintenant la narine pincée.

(5) Prendre le tube dans le portoir et immerger la tête de l’écouvillon jusqu’au fond du tube.

(6) Mélanger soigneusement en tournant l’écouvillon au moins 10 fois ET en le pressant dans le tampon d’extraction en appuyant sur les parois du tube d’extraction (dripper) puis le ressortir en essorant fermement la tête de l'écouvillon le long de la paroi intérieure du tube d'extraction pour retenir autant de solution que possible dans le tube. Jeter l'écouvillon dans un conteneur pour produits présentant un risque biologique et fermer le tube d’extraction à l’aide du capuchon compte-gouttes. Attendre 2 minutes que le réactif agisse.

(7) Prenez le tube et déposez 2 gouttes de la solution d'échantillon traité dans le puits « S » (tube d’extraction à la verticale). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulle d'air. L'échantillon commencera à migrer le long de la membrane.

4D) Page 4 de la notice d’utilisation de la trousse diagnostique : lecture des résultats positif / négatif du procédé selon l’invention.

Négatif : Seule la ligne de contrôle (C) est visible. Aucun antigène du virus SARS-CoV-2 n'est détecté. Le résultat n'exclut pas une infection par le COVID-19 (voir la section limitations).

Positif : Des bandes colorées apparaissent à la ligne de contrôle (C) et à la ligne de test (T). Le test est positif pour l'antigène du virus SARS-CoV-2.

Invalide : La ligne de contrôle (C) est absente, ou seule la ligne (T) apparaît. Si cela se produit, le test doit être répété en utilisant une nouvelle cassette de test. DESCRIPTION DETAILLEE

La présente invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d’une infection virale due à la présence d’un virus chez un individu, comprenant une étape de détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur un échantillon biologique dudit individu, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu.

Ce procédé de diagnostic in vitro est particulièrement adapté pour une campagne de dépistage de grande ampleur parmi la population générale, puisqu’il présente les avantages suivants : facilité d’exécution, non-invasivité du prélèvement préalable de l’échantillon biologique, et rapidité d’obtention des résultats (moins d’une heure).

Alors que la personne de l’art considérait qu’un test antigénique ne serait pas suffisamment sensible pour être appliqué à un échantillon biologique consistant en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur, les inventeurs ont invalidé ce préjugé technique en démontrant qu’un test immunologique réalisé sur ce type d’échantillon présente les caractéristiques suivantes, par rapport aux résultats obtenus par un test RT- PCR réalisé sur un échantillon biologique constitué d’un prélèvement nasopharyngé :

• sensibilité (Se) de 0,875 ;

• spécificité (Sp) de 0,99.

Comme cela est bien connu par la personne de l’art, la sensibilité (ou sélectivité) d'un test diagnostique mesure sa capacité à donner un résultat positif lorsqu'une hypothèse est vérifiée. Elle s'oppose à la spécificité, qui mesure la capacité d'un test diagnostique à donner un résultat négatif lorsque l’hypothèse n’est pas vérifiée.

Dans le cas présent, les résultats obtenus avec le procédé diagnostique selon l’invention ont été comparés aux résultats obtenus avec un test RT-PCR sur un échantillon nasopharyngé de 193 individus, qui à l’heure actuelle est le « gold standard » du test de détection du virus SARS-CoV-2.

Echantillon biologique

L’échantillon biologique utilisé dans ce test consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur d’un même individu, désigné ci-après l’individu testé.

Les définitions des différents types d’échantillons pour la recherche du SARS-CoV-2 ont été présentées dans l’avis du Haut Conseil de la Santé Publique du 11 /08/2020 (7).

Le prélèvement naso-pharyngé et le prélèvement nasal se différencient par la taille et la longueur de l’embout de l’écouvillon introduit dans la narine : - pour réaliser un prélèvement naso-pharyngé, l’écouvillon de recueil des sécrétions est très fin et introduit dans la narine jusqu’au niveau du nasopharynx ;

- pour le prélèvement nasal antérieur, le diamètre de l’écouvillon est plus important et de ce fait, le niveau d’introduction de l’extrémité distale de ce dernier est moins profond ; certains écouvillons présentent une collerette pour aider à apprécier la profondeur de leur introduction. Un écouvillon fin peut également être mis en oeuvre pour le prélèvement nasal du vestibule antérieur.

La valeur diagnostique du prélèvement dans le vestibule nasal antérieur a fait l’objet d’une revue publiée récemment (8).

Au sens de l’invention, les termes suivants sont utilisés indifféremment : sécrétions du vestibule nasal antérieur , sécrétions narinaires antérieures , prélèvement nasal antérieur , et sécrétions nasales , et désignent tous un échantillon biologique obtenu par prélèvement des sécrétions présentes dans le vestibule nasal :

- en utilisant un écouvillon introduit dans la narine, et en recueillant les sécrétions présentes sur les parois du vestibule, et/ou

- en demandant à l’individu testé de procéder à un reniflement ou un raclement de gorge préalablement à la collecte de sa salive.

En ce qui concerne la salive, elle est prélevée soit par salivation dans un récipient, soit à l’aide d’un écouvillon introduit dans la bouche de l’individu testé.

Le procédé selon l’invention sera réalisé sur une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieure, qui pourra comprendre toute proportion de chaque élément, par exemple 50/50 en volume de salive et de sécrétions nasales, ou encore 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 40/60, 30/70, 20/80 ou 10/90 de salive/sécrétions nasales en volume.

Selon une mise en oeuvre du procédé de l’invention, la salive est, préalablement à son prélèvement, enrichie en sécrétions nasales et/ou nasopharyngées et/ou expectorations. Ceci pourra être réalisé par différentes actions de l’individu testé, telles que :

- une étape de reniflement, bouche fermée, destinée à faire descendre dans la bouche les sécrétions nasopharyngées, et/ou

- un raclement de gorge, bouche fermée, destiné à faire remonter dans la bouche les sécrétions accumulées dans l’arrière gorge.

Au sens de l’invention, on entend par sécrétions nasopharyngées les sécrétions prélevées au niveau du nasopharynx, et par expectorations les sécrétions issues des bronches de l’individu.

Le procédé de l’invention est caractérisé en ce qu’il est réalisé sur un échantillon biologique constitué d’une combinaison de salive et de sécrétions nasales. Ces sécrétions nasales pourront être mélangées à la salive avant son prélèvement (par l’individu testé) ou après deux prélèvements distincts, l’un de salive et l’autre de sécrétions du vestibule nasal antérieur.

Dans le cas où la salive est combinée aux sécrétions nasales avant prélèvement, cette combinaison est facile à homogénéiser dans la bouche par l’individu testé, avant le prélèvement de salive par écouvillon ou par salivation dans un récipient.

Avantageusement, cet échantillon biologique combiné est facile à obtenir, sans intervention invasive (traumatisante) pour le patient, contrairement à l’écouvillonnage nasopharyngé.

Selon une première alternative du procédé, l’échantillon biologique est obtenu par auto- prélèvement(s) de l’individu testé ; selon une seconde alternative du procédé, l’échantillon biologique est obtenu par prélèvement(s) par du personnel de santé. Selon une troisième alternative, l’échantillon biologique est une combinaison d’auto-prélèvement(s) et de prélèvements réalisés par du personnel de santé.

Infection virale

Le procédé de diagnostic selon l’invention peut être utilisé pour détecter toute infection virale, notamment toute infection virale pulmonaire, telle que notamment une infection par le virus influenza générant une grippe.

Selon une mise en oeuvre préférée de l’invention, le procédé selon l’invention est un procédé de diagnostic in vitro du coronavirus SARS-CoV-2.

Au sens de l’invention, on entend par « virus SARS-CoV-2 », « coronavirus SARS-CoV-2 » ou encore « SARS-CoV-2 »

(i) le coronavirus identifié en décembre 2019 dans la ville de Wuhan (province de Hubei, en Chine), générant la forme de pneumonie dénommée maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Sa séquence génomique a été rendue publique le 5 janvier 2020 par une équipe de l'université Fudan de Shanghai (Chine), et

(ii) tout variant de ce coronavirus SARS-CoV-2, en particulier les variants suivants : variant britannique (VOC 202012/01 ), sud-africain (501 Y. V2) et brésilien (B.1.1.28), ainsi que les variants listés dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1. Variants du SARS-CoV-2 répertoriés à ce jour

Pré-traitement de l’échantillon biologique

Selon une mise en œuvre préférée de l’invention, le procédé est caractérisé en ce que l’échantillon biologique est fluidifié avant réalisation de l’étape de détection. Cette fluidification de l’échantillon biologique est une étape optionnelle du procédé de diagnostic. Cette fluidification de l’échantillon biologique est obtenue par ajout d’un fluidifiant, choisi parmi ceux bien connus de la personne de l’art.

On peut citer notamment les fluidifiants à base de N-acétyl-cystéine ou de dithiothréitol, tels que Digest-EUR® (Eurobio) ou Sputasol (ThermoFisher).

La dose de fluidifiant utilisé est facilement déterminable par la personne de l’art.

Selon une mise en oeuvre, le procédé de diagnostic in vitro selon l’invention comprend les étapes suivantes : a) fluidification d’un échantillon biologique d’un individu susceptible d’être infecté par un virus ; b) détection d’au moins un antigène spécifique dudit virus par un test immunologique réalisé sur ledit échantillon biologique fluidifié, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique consiste en une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur dudit individu.

Test immunologique utilisé pour les étapes de détection

Le procédé de diagnostic in vitro est caractérisé en ce que l’étape de détection est réalisée grâce à un test immunologique.

Ledit test immunologique est caractérisé par (i) la nature du ou des anticorps compris dans ledit test et (ii) le type de test immunologique (réactifs, visualisation des résultats). Ces deux caractéristiques sont développées ci-dessous.

Selon une mise en oeuvre préférée, le test immunologique comprend au moins un anticorps reconnaissant de manière spécifique au moins un antigène du virus SARS-CoV-2.

La notion de « reconnaissance spécifique anticorps/antigène » signifie, au sens de l’invention, que chaque anticorps du test reconnaît et se lie à un épitope d’un antigène du virus SARS-CoV-2 de manière spécifique.

L’antigène détecté pourra être de toute nature moléculaire, permettant d’identifier spécifiquement le virus SARS-CoV-2 dans un échantillon biologique. Il s’agira en particulier d’un antigène protéique.

Par « test immunologique » on entend au sens de l’invention un test permettant de détecter au moins un antigène de virus SARS-CoV-2 grâce à au moins un anticorps reconnaissant de manière spécifique cet antigène, ledit anticorps étant couplé à un réactif pouvant être détecté, ou à une enzyme réagissant à l’ajout d’un réactif de détection. Ledit réactif de détection pourra être en particulier un réactif coloré, fluorescent, luminescent, ou tout type de réactif de détection pouvant être détecté et/ou quantifié par des techniques bien connues de l’Homme du métier.

Un test immunologique couramment utilisé est par exemple le test dit « ELISA » pour Enzyme-linked immunosorbent assay, dans lequel deux types d’anticorps sont utilisés, l’un étant spécifique de l’antigène à détecter, et l’autre réagissant aux complexes antigène- anticorps et étant couplé à une enzyme capable de générer l'émission d'un signal en présence d’un substrat chromogène ou fluorogène.

D’autres tests immunologiques classiques sont dits de type ‘immunochromatographique’. Ces tests associent une détection antigènique par anticorps, avec une migration sur membrane chromatographique du complexe antigène/anticorps.

Certains tests immunochromatographiques sont basés sur l’utilisation d’anticorps couplés à des nanoparticules, notamment des nanoparticules d’or. La migration des anticorps, éventuellement liés à au moins un antigène, s’effectue sur une membrane adaptée. La lecture des résultats est rapide, en général obtenue en 10 à 20 minutes.

Le test immunologique devra être utilisé selon les indications données par la notice du test.

Selon une mise en oeuvre préférée du procédé selon l’invention, le test immunologique utilisé pour détecter un ou plusieurs antigène(s) du virus SARS-CoV-2 est un test immunochromatographique.

En particulier, le test immunologique est un test immunochromatographique comprenant au moins un anticorps se liant spécifiquement à un antigène du virus SARS-CoV-2.

Bien que la plupart des tests immunochromatographiques spécifiques du virus SARS-CoV-2 actuellement disponibles sur le marché soient indiqués pour détecter les virus SARS-CoV-2 dans des échantillons naso-pharyngés, ces tests peuvent également être utilisés, dans le cadre du procédé selon l’invention, sur des échantillons biologiques tels que décrits dans la présente demande, à savoir une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur.

Ainsi, les tests pouvant être utilisés pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic selon l’invention sont notamment les tests cités dans la liste non-exhaustive suivante :

- Rapid SARS-CoV-2 Antigen Test Card 07AG6020B MP BIOMEDICAL MP biomédical France

- 2019-nCoV Antigen Test Kit (colloïdal gold method) TEST ANTIGENIQUE DU 2019-nCoV Guangdong Hecin Scientific EXOPHARM

- AFIAS Covid -19 Ag Boditech Med Eurobio

- AMP SARS COV 2 Ag AMEDA Labordiagnostik AB-LAB

- Antigène Coronavirus (SARS-CoV-2) -Prélèvement Nasopharyngé Tody Laboratories BeDiaGenomics - Antigène Coronavirus (SARS-CoV-2) -Prélèvement Nasopharyngé Tody Laboratories EUROCOMPUB

- BIOCREDIT COVID-19 Ag RapiGEN TANITCARE

- BIOSYNEX® COVID-19 Ag + BSS BIOSYNEX Swiss BIOSYNEX

- BIOSYNEX® COVID-19 Ag BSX BIOSYNEX Swiss BIOSYNEX

- Biosynex Covid-19 Ag BSS Biosynex Swiss BIOSYNEX

- CLINITEST® Rapid COVID-19 Antigen Test Healgen Scientific Siemens Healthcare

- COVID-19 Ag Color CERTEST BIOTEC Groupe Servibio

- COVID-19 Antigen Rapid Test HANGZHOU ALLTEST BIOTECH Eurocompub

- COVID-19 Antigen Rapid Test (Nasopharyngeal Swab) ACRO BIOTECH SERVIBIO

- COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech CHONDROFRANCE

- COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech ALTHEA

- COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech CLI NISCI ENCES

- COVID-19 Antigen rapid test Hangzhou Clongene Biotech DEA

- COVID-19 Antigen rapid test kit SAFECARE Biotech TANITCARE

- COVID-19 Cassette de Test rapide antigènique Clongene Biotech HAPPY BUSINESS ZRT

- COVID-19 Test Kit (Gold colloïdal method) Hangzhou Singclean Medical Products TANITCARE

- COVID-19 antigen rapid test Prima Lab MYLAN SAS

- COVID-19-CHECK-1 Antigen VEDALAB

- COVID-VIRO® AAZ BIOGARAN

- COVID-VIRO® Test Rapide Antigène COVID-19 AAZ

- COVIgen® Test antigènique de détection rapide du SARS-CoV-2 (COVID-19) Hangzhou Clongene Biotech PREVENTYS

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD FASUAL CARE

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Art Import

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD EUROCOMPUB

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD IMOP Santé

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Auverprime

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD VOG Import

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD BN Santé

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD CONSUL TRADE

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD WORLD FLAIR

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD WIKIMER

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Aitech

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD PROPHIL

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD C2 CORNER

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Planète Médicale

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD ADVENT GROUP

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Guanxi

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD SOMVAN EUROPE

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) (écouvillon) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Wemade

- Cassette de test rapide de l'antigène du nouveau coronavirus (SARS-Cov-2) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD VALTRADE

- CerTest SARS-CoV-2 ONE STEP SARS-CoV-2 Ag CARD TEST CERTEST BIOTEC THERADIAG

- Coronavirus Ag rapide test cassette (swab) ZHEJIANG ORIENT GENE BIOTECH BioRad

- Covid -19 antigen rapid test Spartacus biomed Spartacus biomed

- Covid Antigen Test Kit Guangdong Wesail Biotech Parnasia groupe

- Dispositif de test rapide de l 'antigène COVID-19 Rapid response BTNX clinisciences

- Antigènique non automatisé (dont TROD)

- EBS SARS-CoV-2 Ag Rapid Test EUROBIO Scientific

- Epithod® 616 Covid-19 Ag Test Kit DxGen Groupe AIT

- Epithod® SARS-CoV-2 qAg Test Kit DxGen Corp. Groupe AIT

- Flowflex Test rapide d'antigène du SARS-CoV-2 REF L031 -11813 et L031 -11825 ACON Biotech Connect2 pharma

- GLINE-2019-nCoV Ag SHENZHEN YHLO BIOTECH CO Orgentec

- GenSureTM COVID-19 Antigen Rapid Test Kit GenSure Biotech Inc AVS Innovation

- ID Rapid COVID-19 Antigen Innovative Diagnostics

- INNOVA SARS-CoV-2 Antigen Rapid Qualitative Test Xiamen Biotime biotechnology - KCB COVID-19 Antigen Rapid Test Ref IVDACOV19-1025A Kappa City Biotech

- KaiBiLiTM COVID-19 Antigen et KaiBiLiTM COVID-19 Antigen Neo Hangzhou Genesis Biodetection et Biocontrol Aredis

- Kit de test rapide antigéniques SARS-CoV-2 Triplex International Bioscience AbLab

- Kit de test rapide antigéniques SARS-CoV-2 Triplex International Bioscience Planète Médicale

- Kit de tests antigéniqueCOVID-19 (Méthode à l'or colloïdal) Hangzhou Singclean Medical Products FASUAL

- Ksmart® SARS-COV2 Antigen AVALUN

- NADAL® COVID-19 Ag Test Nal von minden GmbH

- Novel Coronavirus (COVID-19) Antigen Test Kit MEDAKIT

- Novel Coronavirus (Covid-19) Antigen Test Kit Hangzhou Laihe Biotech - LYHER MEDIMASQUE

- Novel Coronavirus (SARS COV 2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD COM'MUNICATE

- Novel Coronavirus (SARS-COV-2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Juste a temps

- Novel Coronavirus (SARS-COV-2) Antigen Rapid Test Cassette (Swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD COSMYTH

- Novel Coronavirus Antigen Test Kit Hangzhou Laihe Biotech -LYHER Pierre Yves MEDICAL

- Novel Coronavirus(SARS-CoV-2) Antigen rapid test cassette (swab) HANGZHOU REALY TECH CO., LTD Medisur

- Novel coronavirus (SARS-CoV-2) Antigen rapid Test cassette swab HANGZHOU REALY TECH CO., LTD ORLIS

- Novel coronavirus (SARS-CoV-2) Antigen rapid Test cassette swab HANGZHOU REALY TECH CO., LTD MIKATEX

- Novel coronavirus (SARS-CoV-2) Antigen rapid Test cassette swab HANGZHOU REALY TECH CO., LTD HEM

- PCL COVID19 Rapid FIA PCL BIOMEDIG

- PCL Covid -19 Ag Gold Saliva (avec pvt nasopharyngé) PCL VAROL MEDICAL

- Panbio™ COVID-19 Ag Rapid Test Device Abbott Rapid Diagnostics Jena GmbH

- QuickProfile™ COVID-19 Antigen Test LumiQuick Diagnostics VAROL MEDICAL

- RAPIDTECH Test Rapide Antigène SARS-CoV-2 Weifang Kanghua Biotech Poly-Dtech

- RAPIDTECH Test Rapide Antigènique SARS-CoV-2 Qingdao Hightop Biotech Poly D Tech

- SARS-COV-2 Nucleocapsid (N) Antigen Rapid Cassette de test (écouvillon) LiClear Biotech Visiomed

- SARS-CoV-2 Ag IFA Watmind (immunofluorescence) avec analyseur Shenzhen Watmind Medical SYSMEX

- SARS-CoV-2 Antigen Rapid Test Kit Beijing Lepu Medical Technology Eurocardio corp - SARS-CoV-2 Antigen Test Latéral Flow Method No.: W196 - test antigene 2019-ncoV Guanzhou WONDFO Biotech MEDICGOV

- SARS-CoV-2 Rapid Antigen Test SD BIOSENSOR Roche diagnostics France

- SOFIA SARS Ag FIA QUIDEL Quidel Corporation QUIDEL

- STANDARD Q COVID- 19 Ag test SD BIOSENSOR ORGENTEC

- Test antigénique SRAS-CoV-2 Guanzhou WONDFO Biotech AXAMED

- Test antigénique SRAS-CoV-2 Guanzhou WONDFO Biotech Valtrade

- Test de détection rapide antigénique Healgen Scientific EXOPHARM

- Test rapide antigène COVID-19 (Écouvillon nasopharyngé) BERIGHT HANGZHOU ALLTEST BIOTECH NEPHROTEK

- Test rapide de l'antigène COVID-19 CITEST diagnostics MEDISUR

- Test rapide d’antigène COVID-19 HANGZHOU ALLTEST BIOTECH Clinisciences

- Test rapide d’antigènes de la COVID-19 Biomaxima MP EXTRA

- UNICELL-2019-nCoV Ag SHENZHEN YHLO BIOTECH CO

- Vitassay SARS-CoV-2 VITASSAY Healthcare SLU MAST DIAGNOSTIC

- Wondfo COVID-19 Test Antigénique Guanzhou WONDFO Biotech Hans Biomed

- humasis COVID-19 Ag test Acova -7025 HUMASIS Eurobio scientific

- kit de test de diagnostic Ag SARS-CoV-2 (Or colloïdal) Shenzhen Watmind Medical SYSMEX

- kit de test rapide de détection antigénique du nouveau coronavirus (SARS-CoV-2) Beijing Jinwofu Bioengineering Technology PEARLS MELI S

- un des deux tests rapides pour la détection d'antigènes du coronavirus SARS-CoV-2 développés par Biospeedia.

De manière avantageuse, l’étape de détection du procédé selon l’invention met en oeuvre l’un des deux tests de détection du virus SARS-CoV-2 suivants:

- COVID19Speed Non-Invasive -Antigen Test BSD_0504-10 & BSD_0504-25, avec écouvillon pour prélèvement de salive dans la bouche ; et

- COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25, comprenant un contenant de recueil de salive ; commercialisés par la société BIOSPEEDIA, dont les caractéristiques et les bonnes performances sont présentées dans la partie expérimentale.

Ces deux tests sont des tests immunochromatographiques mettant en oeuvre au moins un anticorps conjugué à l’or colloïdal, pour la détermination qualitative d’un antigène spécifique du SARS-CoV-2 dans un échantillon biologique humain. Les anticorps contre le SARS-CoV-2 sont immobilisés dans la région test (T) sur une membrane de nitrocellulose. L'antigène cible dans l'échantillon, s'il est présent, réagira avec l'anticorps anti-SARS-CoV-2 conjugué à l'or et formera un complexe anticorps-antigène. Lorsque ce complexe migre le long de la membrane de nitrocellulose, il est capturé par un anticorps anti-SARS-CoV-2 adsorbé sur la membrane dans la région (T) du dispositif (anticorps anti-SARS-CoV-2 conjugué à l’or) - (antigène SARS-CoV-2) - (anticorps SARS-CoV-2), ce qui provoque l’apparition d’une ligne colorée rose pâle à rose foncé. Si l'échantillon ne contient pas l'antigène du SARS-CoV- 2, aucune ligne colorée n'apparaîtra dans la région de la ligne test (T), indiquant un résultat négatif.

Population d’individus testés

Tout individu susceptible de présenter une infection virale pourra être testé selon le procédé de diagnostic in vitro de l’invention.

Dans la présente demande, les termes « individu », « individu testé » et « patient » sont utilisés de manière indifférente, et désignent tous l’être humain dont est issu l’échantillon biologique utilisé dans le procédé de diagnostic selon l’invention. Il s’agit en particulier d’un individu susceptible d’être infecté par un virus, ou ayant été en contact avec un autre individu dont l’infection virale a été confirmée.

Selon un aspect particulier du procédé, il s’agit d’un individu susceptible d’être infecté par un virus SARS-CoV-2, ou ayant été en contact avec un autre individu dont l’infection virale par SARS-CoV-2 a été confirmée.

Comme cela a déjà été présenté, ce procédé de diagnostic est adapté aux adultes (tout particulièrement à des personnes âgées de plus de 70 ans) et est particulièrement adapté aux enfants âgés de moins de 12 ans, et de manière préférée aux enfants âgés entre 3 et 12 ans.

Selon une mise en oeuvre du procédé, l’individu testé est âgé de plus de 70 ans.

Selon une autre mise en oeuvre, l’individu testé est âgé de plus de 3 ans.

Selon une autre mise en oeuvre, l’individu testé est âgé de 3 à 12 ans.

Selon une autre mise en oeuvre, l’individu testé est une personne devant subir des tests diagnostiques de manière régulière et répétée : cette population d’individus inclut notamment le personnel de santé dans les hôpitaux, ou le personnel travaillant dans les foyers de personnes âgées.

Le procédé de diagnostic selon l’invention est en tout état de cause adapté à la population générale, que ce soit dans le cadre d’un programme de dépistage de masse, de tests dans des entreprises, dans des collectivités de sujets jeunes comme les écoles ou les universités, ou pour un criblage des voyageurs dans les aéroports. Trousse de diagnostic

La présente invention concerne également une trousse de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, comprenant : i) des dispositifs médicaux pour effectuer et collecter des prélèvements salivaires et narinaires antérieurs, ii) un test immunologique comprenant au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du virus, ainsi que les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre de ce test.

Ces dispositifs médicaux sont notamment des écouvillons pour prélèvement nasal et/ou buccal ; et des contenants pour recueillir de la salive. Comme cela est présenté dans les exemples, les écouvillons adaptés pour le prélèvement de salive présentent une extrémité plus larges que ceux adaptés pour le prélèvement des sécrétions nasales du vestibule nasal antérieur.

Avantageusement, ladite trousse comprendra également une notice d’utilisation. Un exemple d’une telle notice est présenté en figures 3 et 4.

Avantageusement, cette trousse comprendra un agent fluidifiant destiné à fluidifier l’échantillon biologique.

Selon une mise en oeuvre particulière, la trousse de diagnostic est destinée à un procédé de diagnostic in vitro de présence d’un virus SARS-CoV-2. Dans ce cas, le test immunologique fourni dans la trousse comprend au moins un anticorps se liant à au moins un antigène spécifique du coronavirus SARS-CoV-2.

De manière avantageuse, cette trousse pourra être utilisée par des personnels de santé, mais également par des individus non spécialisés, pratiquant des auto-prélèvements et pouvant ainsi s’auto-diagnostiquer dans le cadre privé.

EXEMPLES

Exemple 1. Population testée et tests de diagnostic classique versus l’invention BioSpeedia

1.1. Population de patients

Un total de 193 prélèvements de salives combinés avec des échantillons des sécrétions nasales antérieures provenant d’adultes et d’enfants admis au Centre Hospitalier Universitaire de Saint-Etienne (France), ou lors de campagnes de prélèvements, ont été étudiés. L’étude a été prospective. Le recueil et l’analyse des données cliniques et biologiques ont été faits a posteriori. Le diagnostic de C0VID19 a été défini sur :

(i) des critères cliniques évocateurs,

(ii) un test RT-PCR positif sur prélèvement nasopharyngé avec au moins deux cibles génétiques.

1.2. Diagnostic RT-PCR

Les échantillons prélevés ont été testés au Laboratoire de Virologie du plateau de biologie du CHU de Saint Etienne ou dans des laboratoires de biologie médicale en mettant en oeuvre des méthodes RT-PCR commercialisées, notamment :

- Argène (BioMérieux) SARS-COV-2 R-GENE® [PCR1 : SARS-COV-2 N gene (FAM) / Internai control (HEX) / SARS-COV-2 RdRp gene (CY5) / (https://www.biomerieux- diagnostics.com/sars-cov-2-r-gene)]

- IDNC0V2q - SARS-CoV-2 RNA détection kit by RT-PCR (https://www.id- solutions.fr/en/detection-kits/idncov2q/) sur CFX Opus 96 Real-Time PCR Instrument #12011319 (https://www.bio-rad.com/fr-fr/sku/12011319-cfx-opus-96-real -time-pcr- instrument? )

- CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic (https://www.fda.gov/media/134922/download)

1.3. Prélèvements et tests immunochromatographiques

Prélèvements :

Les échantillons biologiques testés ont été obtenus selon le protocole décrit en figures 3A, 3B et 3C.

Tests immunochromatographiques :

Les tests ont été conduits sur tous les prélèvements obtenus selon les notices des kits « C0VID19Speed Non-Invasive -Antigen Test BSD_0504-10 & BSD_0504-25 » et

« C0VID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25 » : voir figures 3 et 4.

1.4. Résultats et performances du procédé selon l’invention par rapport aux résultats de la RT-PCR

A partir des prélèvements de salives combinés avec les sécrétions du vestibule nasal antérieur, les résultats d’une étude prospective sont les suivants : Tableau 2

Les variables descriptives, la sensibilité (Se), la spécificité (Sp) ont été rapportées avec leur intervalle de confiance (IC ou Cl) à 95 %. Des tests paramétriques et non paramétriques ainsi que les graphiques ont été effectués à l'aide du logiciel GraphPad Prism 5 (Californie, USA).

Les valeurs de P inférieures à 5% ont été considérées comme statistiquement significatives.

Les performances du procédé diagnostic selon l’invention par rapport au test RT-PCR réalisé sur des échantillons biologiques constitués de prélèvement nasopharyngés ont été les suivantes :

- sensibilité (Se) de 0,875 [Cl : 0,69 à 0,96]

- spécificité (Sp) de 0,99 [Cl : 0,97 à 0,99]

Exemple 2. Procédé de diagnostic d’une infection à virus SARS-CoV-2 à l’aide d’un test immunochromatographique « COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 Et BSD_0505-25 » selon différents modes de prélèvements

2.1. Prélèvements et procédés mis en oeuvre

Prélèvements :

Les variables explorées par rapport au procédé décrit en paragraphe 1.3 ont été :

- Echantillon biologique qui consiste une combinaison de salive et de sécrétion du vestibule nasal antérieur ;

- Fluidification de l’échantillon : échantillon fluidifié par addition d’un réactif comme Digest-EUR® (Eurobio) ou Sputasol (ThermoFisher) ou N-acétyl-cystéine.

Test immunochromatographique : Le test a été conduit selon la notice du test « COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 & BSD_0505-25 ».

2.2. Résultats obtenus avec le test « COVID19Speed Non-Invasive Saliva Antigen Test BSD_0505-10 Et BSD_0505-25 « selon différents modes de prélèvements et de traitements

Tous les patients testés ont un diagnostic de COVID19, à la fois clinique et biologique (RT- PCR positive sur écouvillon nasopharyngé).

2.2.1. Prélèvements salivaires seuls sans combinaison avec les sécrétions du vestibule nasal antérieur, et non traité par fluidifiant

Tableau 3

N : nucléocapside du SARS-CoV-2 Rdtp : polymérase du SARS-Cov-2

Conclusion : l’échantillon biologique constitué de salive uniquement ne présente pas une charge virale et/ou la concentration antigénique suffisante ; le test immunologique utilisé n’est pas suffisamment sensible pour détecter le virus SARS-CoV-2 sur ces 4 échantillons.

2.2.2. Prélèvement salivaire combiné avec un prélèvement de sécrétions du vestibule nasal antérieur, non traité par fluidifiant Tableau 4

Conclusion : la charge virale et/ou la concentration antigènique est suffisante sur une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur pour que le test immunologique détecte la présence de SARS-CoV-2.

2.2.3. Prélèvement salivaire combiné avec un prélèvement nasal antérieur, après fluidification chez des patients dont le TDR sur sécrétion nasopharyngée est négatif

Tableau 5

Conclusion : la charge virale et/ou la concentration antigènique est suffisante sur une combinaison de salive et de sécrétions du vestibule nasal antérieur, après fluidification, pour que le test immunologique détecte la présence de SARS-CoV-2.

2.2.4. Etude comparée sur différents modes de prélèvements sur un même sujet

Les différents prélèvements ont été obtenus du sujet CPCHU 168 testé RT-PCR positif sur trois cibles : gène ORF (Ct 19,8), Nucléocapside (Ct 21 ,1 ) et Spike (Ct 20,2). Tableau 6

Conclusion : la charge virale et/ou la concentration antigénique de la combinaison salive est augmentée à la fois par la présence des sécrétions narinaires antérieures, ce qui permet d’obtenir un résultat positif avec un test immunologique.

2.2.5. Etude comparée sur différents modes de prélèvements sans fluidification chez des patients PCR positifs sur prélèvements nasopharyngés

Tableau 7. Exemples comparatifs

Conclusion : la charge virale et/ou la concentration antigénique de la salive est augmentée par la présence des sécrétions narinaires antérieures, et inversement, ce qui permet d’obtenir un résultat positif avec un test immunologique alors que :

Le résultat basé sur l’analyse du prélèvement nasal antérieur était négatif (voir PA, LC) ou

Le résultat basé sur l’analyse du prélèvement salivaire était négatif (voir LK, ZM, GA et BM). LISTE DES DOCUMENTS CITES

1. Haute Autorité de Santé. Revue rapide sur les tests de détection antigénique du virus

SARS-CoV-2. 8 octobre 2020. Disponible sur : https://www.has- sante.fr/upload/docs/application/pdf/2020-10/synthese_tests_ antigeniques_vd.pdf

2. He X, Lau EHY, Wu P, et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat Med. 2020;26:672-5.

3. Wong F, Collins JJ. Evidence that coronavirus superspreading is fat-tailed. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117:29416-8.

4. Althouse BM, Wenger EA, Miller JC, et al. Superspreading events in the transmission dynamics of SARS-CoV-2: opportunities for interventions and control. PLoS Biol. 2020;18:e3000897.

5. Mina MJ, Parker R, Larremore DB. Rethinking Covid-19 test sensitivity. A strategy for containment. N Engl J Med. 2020;383:e120.

6. Larremore DB, Wilder B, Lester E, et al. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 surveillance. Sci Adv. 2021 ;7:eabd5393

7. https://www.hcsp.fr/Explore.cgi/avisrapportsdomaine?clefr=90 9.

8. Comber L, Walsh KA, Jordan K, O'Brien KK, Clyne B, Teljeur C, Drummond L, Carty PG, De Gascun CF, Smith SM, Harrington P, Ryan M, O'Neill M. Alternative clinical specimens for the détection of SARS-CoV-2: A rapid review. Rev Med Virol. 2020 Oct 22. doi: 10.1002/rmv.2185. Epub ahead of print. PMID: 33091200.

9. Kashiwagi K, Ishii Y, Aoki K, Yagi S, Maeda T, Miyazaki T, Yoshizawa S, Aoyagi K, Tateda K. Immunochromatographic test for the détection of SARS-CoV-2 in saliva. J Infect Chemother. 2021 Feb;27(2):384-386. doi: 10.1016/j.jiac.2020.11 .016. Epub 2020 Dec 23.

10. Chen JH, Yip CC, Poon RW, Chan KH, Cheng VC, Hung IF, Chan JF, Yuen KY, To KK.

Evaluating the use of posterior oropharyngeal saliva in a point-of-care assay for the détection of SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect. 2020 Dec;9(1 ):1356-1359. doi:

10.1080/22221751 .2020.1775133.