상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 HPV 타입 16 E7 단백질로부터 유래한 9개 이상의 아미노산 서열을 가진 펩타이드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 펩타이드는 9개에서 17개의 서열인 것이 바람직하고 15개인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명에 있어서, 상기 펩타이드 서열은 LCVQSTHVD(서열번호 15)의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드 서열은 CDSTLRLCVQSTHVD(서열번호 10) 또는 LCVQSTHVDIRTLED(서열번호 11)인 것이 바람직하며, LCVQSTHVDIRTLED(서열번호 12)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 서열번호 15의 펩타이드를 코딩하는 핵산을 제공한다.

또 본 발명은 상기 서열번호 10의 펩타이드 또는 서열번호 11의 펩타이드를 각각 코딩하는 핵산을 제공한다.

상기 서열번호 15의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 17의 핵산(ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac)이 바람직하고, 상기 서열 번호 10의 펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 18의 핵산(tgt gac tct acg ctt cgg ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac)이 바람직하며, 상기 서열 번호 11의 펩타이드를 코딩하는 핵산은 서열번호 19의 핵산(ttg tgc gta caa agc aca cac gta gac att cgt act ttg gaa gac)이 바람직하나 degeneracy 등을 고려하여 그 서열은 변화될 수 있다.

또한 본 발명은 (a)상기의 펩타이드 및 (b)약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학용 조성물을 제공한다.

상기의 조성물은 HPV 감염 관련 질환 예를 들어 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암의 치료 또는 예방에 유용하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 있어서, 상기의 조성물은 HLA-A*2402 타입 환자 특이적인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 펩타이드 또는 핵산은 선택적으로 미세입자, 리포좀, 또는 면역 자극 복합체(ISCOM)(활성성분으로 사포닌만을 포함할 수도 있는) 또는 본 발명의 펩타이드를 투여 대상에 공급하기에 적합한 다른 운반수단 속에 제제화될 수 있다. 미세입자를 사용하는 경우 그것은 바람직하게는 poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA)와 같은 공중합체인 중합체 매트릭스를 갖는다.

포유류에서 면역반응(예를 들어 MHC class I-매개 또는 class II-매개 면역 반응을 포함하는 세포 면역 반응)은 면역원성 펩타이드가 결합하는 MHC 분자를 가지는 포유류, 즉 인간, 유인원, 개, 고양이, 또끼, 소, 쥐에 면역원성 펩타이드를 투여하여 촉발될 수 있다. 상기 본 발명의 펩타이드는 미세입자, 리포좀, 또는 ISCOM, 또는 용액의 일부로 투여될 수 있다.

본 발명의 펩타이드를 투여하는 또 다른 방법은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현벡터를 이용하는 것이다. 그 핵산 서열은 선택적으로 상기의 본 발명의 펩타이드에 연결된 신호 서열을 코딩할 수도 있다.그 핵산이 신호 서열을 코딩할 때 바람직하게는 그것은 HLA-DR.alpha로부터 온 신호 서열 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala(서열번호 16)을 코딩한다. 그 경우에 본 발명의 서열은 예를 들어 서열번호 11 또는 12의 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는 그 핵산은 핵산 감염을 일으키는 바이러스 유전자를 포함하지 아니하고 인택트 E7 단백질을 코딩하지 아니한다.

본 발명의 핵산은 프라즈미드 내에 포함될 수 있고, 선택적으로 중합체 매트릭스를 포함하는 미세입자 내에 제공될 수 있다. 바람직한 실시예에서 중합체 매트릭스는 필수적으로 PLGA의 공중합체로 구성된다. 바람직하게 그 미세입자는 예를 들어 0.02에서 20 마이크론 또는 약 11 마이크론 이하의 직경을 가진다. 바람직하게는 복수의 미세입자들이 0.02에서 20 마이크론 또는 약 11 마이크론 이하의 직경을 가진다.

본 발명의 프라즈미드를 포함하는 세포도 본 발명의 범위 내이다. 그 세포는 예를 들어 B 세포 또는 다른 항원 제시 세포(APC)일 수 있다. 그 세포는 그것을 ㅋ코딩하는 프라즈미드로부터 펩타이드 발현을 가능하게 하는 조건에서 배양되거나 유지된다.

본 발명의 핵산 및 프라즈미드는 예를 들어 "naked DNA"로 포유류에 상기 언급한 플라즈미드를 투여하여 포유류 예를 들어 인간에서 면역 반응을 유도하는 방법에 유용하다. 그 포유류는 HPV 감염, 자궁경부 이형성증, 및/또는 자궁경부암의 위험이나 또는 질환을 가질 수 있다. 본 발명의 핵산 및 플라즈미드도 미세 입자, 리포좀, ISCOMS, 또는 상기에 기재된 것과 같은 다른 적당한 운반 수단에 삽입될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에 개재된 펩타이드들과 그 펩타이드를 코딩하는 핵산은 HPV E7 단백질에 대한 면역 반응을 야기하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 세포내 기관으로 그 펩타이드를 운반하는 수송(trafficking) 서열이 연결될 수 있다. 그 수송서열은 그것이 부착된 펩타이드의 세포내 수송(소기관에서 소기관으로 또는 세포 표면으로 이동을 지시)을 조절하는 기능을 하는 아미노산 사열이다. 그러한 수송 서열들은 ER, 리소좀 또는 엔도좀으로 그 폴리펩타이드들을 수송할 수 있고 시그널 펩타이드들(번역 동안 ER에 단백질을 지시하는 N-말단 서열), 예를 들어 KDEL 과 같은 ER 체류 서열, 및 KFERQ, 또는 QREFK와 같은 와 같은 리소좀 타겟 서열을 포함할 수 있다.

짧은 아미노산 사열들은 특정세포내 기관으로 단백질을 타겟하는 시그널로 작용할 수 있다. 예를 들어 ER로 가는 단백질의 아미노 말단에서 소수성 시그널 펩타이드가 발견된다.

그러한 수송 서열은 HLA-DR.알파 리더 서열인 Met Ala Ile Ser Gly Val Pro Val Leu Gly Phe Phe Ile Ile Ala Val Leu Met Ser Ala Gln Glu Ser Trp Ala (서열번호 16)일 수 있다. 만약 그 부분이 본 발명의 폴리펩타이드를 ER로 수송하는데 충분하다면, 그 시그널 펩타이드의 상기 특정된 25개의 잔기 서열 중 일부분(예를 들어 적어도 10개의 아미노산 잔기)만을 포함할 수 있다.

일부 경우에는 시그널 펩티데이즈에 의한 가공(즉 절단)을 가능하게 하기 위하여 본 발명의 HPV E7 항원성 펩타이드를 코딩하는 서열과 수송 서열을 연결하는 부분은 변형되는 것이 바람직하다. 시그널 펩타이드들에 대한 인식 서열들은 Von Heijne, NAR 14:4683, 1986에 기재된다.

본 발명의 펩타이드를 코딩하는 DNA를 구축하는데 표준 기술이 사용될 수 있다(예를 들어 WO 94/04171에 기재된 기술을 참고). 그 구축물은 인간 세포들에서 발현을 증가시키는 부가적인 서열들 예를 들어 적당한 프로모터, 코딩 서열의 RNA 안정 5' 과 3' 서열, 인트론(코딩되는 서열 내에 5' 또는 3' 어느 쪽에도 위치될 수 있음), 및 폴리(A) 부가 자리뿐만 아니라 그 구축물이 원핵 및/또는 진핵 숙주에 대한 선택 및 복제를 가능하게 하는 복제 오리진 및 선택 마커들을 포함할 수 있다.

본 발명의 플라즈미드 내에는 가나마이신 저항 유전자(519-1313 부위), SV40 얼리 프로모터(131-484 부위) 및 thymidine kinase (TK) 폴리아데닐레이션 자리(1314-1758 부위)를 가질 수 있다. 가나마이신 저항 유전자 및 관련 조절 서열은 단지 선택의 목적을 위한 것이고 만약 선택이 필요하지 않거나 바람직하지 않으면 플라즈미드로부터 제거될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 및 핵산은 HPV에 의하여 감염된 것으로 알려졌거나, HPV에 의하여 감염된 것이 의심스럽거나, HPV에 의하여 감염될 수 있는 대상에서 예방 또는 치료적인 백신으로 사용될 수 있다. 다른 적당한 대상들은 HPV-관련 질환의 증상을 나타내거나 질환이 발생할 것 같은 사람들을 포함한다. 본 발명의 펩타이드 및 백신은 HPV 균주 16의 감염과 관련된 질환들, 예를 들어 보웬성 구진(bowenoid papulosis), 항문 이형성(anal dysplasia), 호흡기 또는 결막 유두종, 자궁 경부 이형성증, 자궁경부암, 외음암(vulval cancer), 또는 전립선암을 치료하거나 예방하는 백신으로 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염과 관련된 질환들을 치료하기 위하여 단독 또는 당업계에 공지된 다른 치료법 예를 들어 화학요법제, 방사선 및 수술과 같이 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드들 및 핵산들은 면역 반응을 증진하기 위하여 고안된 다른 치료, 예를 들어 당업계에 주지된 것과 같은 어쥬번트 또는 사이토카인(또는 사이토카인을 코딩하는 핵산)과 혼합하여 투여될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 HPV 감염 또는 HPV 감염 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명의 운반 시스템들은 HPV에 대한 면역 반응을 촉진시키려는 적당한 세포들에 펩타이드 또는 그 펩타이드를 발현하는 DNA 컨스트럭트를 운반하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 표준 방법, 예를 들어 Donnelly et al., J. Imm. Methods 176:145, 1994, 및 Vitiello et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995에 기재된 것과 같은 방법을 사용하여 투여될 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 핵산들은 대상에 당업계에 공지된 형태, 예를 들어 근육주사, 정맥주사, 동맥주사, 피내주사, 복강주사, 코의내부, 질내, 관장내, 피하내 주사될 수 있거나 그들은 예를 들어 미세입자를 포함하는 분말 또는 용액의 흡입에 의하여 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 투여는 국소적(예를 들어 자궁경부 또는 다른 감염자리) 또는 전신성일 수 있다.

본 발명의 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노구형입자와 같은 약학적으로 수용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 그들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련되거나 또는 네이키드될 수 있고 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축하반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 운반될 수 있다.

약 0.1에서 100 마이크로몰의 펩타이드 용량 또는 약 1에서 200 마이크로그램의 DNA의 용량이 1회 체중 kg 당 투여되는 것이 바람직하다. 물론 당업계에 주지된 바와 같이 주어진 환자에 대한 용량은 환자의 키, 체표면적, 나이, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간과 경로, 일반적 건강상태 및 동시에 투여되는 다른 약제를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 적정 투여량의 결정은 통상의 지식을 가진 약사들의 능력 범위내에서 능숙하다.

바이오리스틱(biolistic) 전달 또는 생체 외(ex vivo) 처리와 같은 다른 표준 전달 방법들이 사용될 수도 있다. 생체 외 처리에서 예를 들어 항원제시 세포들(APCs), 수지상세포들, 말초혈액 단핵구 세포들, 또는 골수세포들을 환자 또는 적당한 공여자로부터 얻어서 본 면역 조성물로 생체 외에서 활성화된 후 그 환자에게 투여될 수 있다.

미국 특허 제 5,783,567에 기재된 것을 포함하는 미세입자들이 세포 속으로DNA, 또는 펩타이드와 같은 거대분자를 운반하기 위한 운송수단으로 사용될 수 있다. 그들은 폴리머의 쉘 내에 둘러 쌓여 있거나 폴리머 매트릭스에 들어간 거대분자들을 포함한다. 미세입자들은 예를 들어 들어있는 DNA를 분해되지 않은 상태로 유지하는 것과 같은 거대분자의 특성을 유지하는 작용을 한다. 미세입자들은 또 거대분자들의 펄스된 운반 및 특정 위치에 운반 또는 특정 세포 또는 타겟 세포군으로 운반에 사용될 수 있다.

폴리머 매트릭스는 poly-lactic-co-glycolic acid, 전분, 젤라틴 또는 키틴과 같은 생분해성 공중합체일 수 있다. 미세입자들은 대상의 식세포로 DNA 분자들의 이동을 최대화하는데 특히 사용될 수 있다. 또는 그 미세입자들은 조직에 주사되거나 이식될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 당업계에 주지된 지질, 덴드리머 또는 리포좀을 통하여 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어 면역 펩타이드 또는 그 펩타이드를 코딩하는 핵산들을 운반하는 리포좀들은 인 비보에서 CTL 반응을 야기하는 것으로 알려졌다(Reddy et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Collins et al., J. Immunol. 148:3336-3341, 1992; Fries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:358, 1992; Nabel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 89:5157, 1992).

본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 사포닌 단독 또는 콜레스테롤 및 Quil A (사포닌)을 동시에 혼합하여 생성된 30-40 nm 크기의 (-) 차지된 케이지 유사 구조인 Immune Stimulating Complexes (ISCOMS)을 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 및 핵산들은 ISCOMS와 동시 또는 별도로 투여될 수 있다.

보호면역은 항원에 대한 운반 수단으로 ISCOMS을 사용한 톡소플라스마증 및 Epstein-Barr 바이러스 유도된 종양들을 포함하는 감염의 여러 실험 모델에서 생성되어 왔다(Mowat et al., Immunology Today 12:383-385, 1991). ISCOMS에서 캡슐화된 1ug의 낮은 항원 용량이 클래스 I 매개된 CTL 반응을 생성하는 것이 발견되었다(Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990).

면역 반응을 야기하는 본 발명의 펩타이드 및 핵산의 능력은 당업계에 주지된 면역 반응을 측정하는 방법들을 사용하여 분석할 수 있다. 예를 들어 세포 독성T 세포들의 생성은 MHC 테트라머를 사용하거나 세포내 사이토카인 발현을 측정하거나 표준 ⁵¹ Cr release 분석에서 나타낼 수 있다. ELISA 또는 ELISPOT와 같은 표준 분석도 T 세포 활성화에 기여하는 사이토카인 프로화일을 측정하는데 사용될 수 있다. T 세포 증식은 또 당업계에 공지된 다른 분석들과 ³ H-thymidine 업테이크와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다. B 세포 반응들은 ELISA와 같은 분석을 사용하여 측정될 수 있다.

디지털 이미징, 세포학적 질확대경 및 조직학적 검사와 같은 다른 방법들이 유두종 바이러스 관련 병소 또는 유두종 바이러스 레벨에 대한 본 발명의 펩타이드와 핵산의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서는 HPV type 16의 E7 단백질 중 세포면역반응을 유발하는 가장 최소단위인 HLA class I 에피토프과 반응하는 E7 peptide 백신을 개발하는 데 그 목적이 있으며 그 중에서도 HLA-A*2402형에 적합한 E7 peptide 백신을 개발하였다. 세포 독성 T 림프구를 생성을 유도하는 특정한 HPV type 16 E7 에피토프을 개발하기 위해 합성된 HPV type 16 E7 펩타이드를 이용하여 유체 세포측정법(flow cytometry)을 실행한 결과 E7 펩타이드 가운데 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 높은 세포 독성 T 세포의 분화 및 활성을 유도 하는 것을 알 수 있었다. 그리고 실제 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) peptide와 인터류킨 (Interleukin: IL) 2을 이용해 대량생산된 CTL과 자궁경부암 세포를 함께 배양하여 CTL의 암세포 살상능력을 실제 측정하는 세포 독성(cytotoxicity) 실험을 통해 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 자궁 경부암 세포의 세포 사멸을 유발하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 HLA-A*2402 형을 갖는 자궁경부암 환자의 치료 및 백신 개발에 효과적으로 적용될 수 있음을 확인하였으며, 특히 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED)의 효과가 더욱 강력함을 확인하였다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

최근 많은 연구진들에 의해 항암 면역 반응의 작동자 (effector)로 알려진 세포 독성 T 세포(CD8+ T 세포)를 이용한 암 치료와 관련하여 분자 혹은 세포 수준에서 일어나는 여러 가지 기전들이 점차 밝히기 위한 많은 연구들이 진행되고 있으며 , 또한 특정 암에 있어서 치료의 핵심이 되는, CD8+ T 세포에 의해 인식되는 표적항원을 밝혀 내기 위한 연구들도 활발히 진행되고 있다(Boon T, Coulie PG, Van Den Eynde BJ and Van Der BP. Annu Rev Immunol. 2006. 24: 175-208; Rosenberg SA. Nature. 2001. 411: 380-384).

항암 면역치료의 가장 기초적인 조건은 치료의 대상이 되는 암세포에 특이적으로 발현되는 특정 항원이 존재해야 된다는 것인데, 자궁경부암 세포에는 인체 면역세포반응을 강력하게 유발할 수 있는 표적항원의 존재가 밝혀져 있어 CTL (CD8+)을 이용한 면역세포치료의 대상 중 하나가 되고 있다. 자궁 경부암을 일으키는 주원인으로 알려진 인유두종 바이러스(HPV) 중 HPV type 16과 HPV type 18은 가장 발병 위험도가 높은 type으로 HPV가 감염되었을 때 발현되는 여러 바이러스 단백질 가운데 세포 증식을 자극하는 역할을 하는 것으로 밝혀진 E5, E6 그리고 E7은 자궁 경부암 세포에서 발견되며, 발암 과정에서의 역할이 잘 알려져 있다.

HPV type 16은 거의 모든 인종에서 발견되어 발병 위험도가 가장 높은 것으로 알려져 있고, 이런 이유에서 HPV type 16에 의해 발생되는 암의 치료를 위한 연구가 중요한 부분을 차지하고 있다(18). HPV type 16이 감염된 자궁 경부암 세포에서 발현되는 E5, E6 그리고 E7은 이러한 치료의 주요 대상이 되며, 특히 특정 항원의 인식이 필요한 adoptive CD8+ T 세포치료의 핵심적인 target이 되어 있다. HPV type 16 E7은 E6와 함께 종양형성 및 성장을 일으키는 주요 단백질로 알려져 있으며, 두 단백질간의 상호작용 또는 단독으로도 발암작용이 가능한 것으로 밝혀져 있다(Munger K, Phelps WC, Bubb V, Howley PM and Schlegel R. J. Virol. 1989. 63: 4417-4423;McDougall JK. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994. 186: 101-119; Band V, Zaychowski D, Kulesa V and Sager R. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1990. 87: 463-467;Halbert CL, Demers GW and Galloway DA. J. Virol. 1991. 65: 473-478.19-22).

그 동안 이루어진 HPV type 16 E7을 대상으로 하는 adoptive CD8+ T 세포치료에 관한 연구는 HLA-A*0201 type을 갖는 백인종(cacasian)을 위주로 진행되어 항암효과를 나타내는 몇몇의 특이적인 E7 에피토프을 밝혀 내었다. 그러나, 전세계 인구의 절반 이상을 차지하고 있는 아시아인종(asian) 중 다수를 차지하는 HLA-A*2402 type 환자의 adoptive CD8+ T 세포치료를 위해 진행되어 나타난 HPV type 16 E7 에피토프의 연구 결과물은 거의 없는 실정이다.

본 발명에서는 정상 HLA-A*2402 type 혈액 증여자에게서 PBMC를 공급받아 합성된 E7 펩타이드를 처리하여 1주 혹은 2주간 배양한 후 IFN-γ 및 CD69의 발현 정도를 측정하여 CD8+ T 세포로의 분화를 유도하는 펩타이드의 후보를 선정하고, 세포 독성 실험인 ⁵¹ Cr release assay 을 사용하여 실제적인 항암 효과를 확인해 보았다.

도 1과 2에서 알 수 있는 바와 같이, 합성된 14개의 펩타이드 중 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD), E7 67-81 (LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 다른 E7 펩타이드에 비해 높은 수치의 IFN-γ의 생성을 나타냄으로써 효과적인 면역성(immunogenic)을 가지고 있음을 예상할 수 있었다. T 세포가 활성화되면 표면에 발현되는 항원인 CD69는 T 세포의 활성과 증식을 야기시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Ziegler SF, Ramsdell F and Alderson MR. Stem Cells. 1994. 12(5): 456-65). CD69는 분화가 일어나 성숙된 T 세포에서 발견되기 때문에 CD69의 발현 정도를 통해 CD8+ T 세포로의 분화를 유발하는 E7 펩타이드의 선별에 이용될 수 있다. 유체 세포측정법을 사용하여 CD69의 발현 정도를 확인한 결과, E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD), E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 다른 E7 펩타이드에 비해 높은 수치의 CD69의 생성을 유도하는 것으로 나타나는 것을 알 수 있었다 (도 3).

이 결과는 IFN-γ의 생성 정도를 확인한 실험과 함께 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드가 매우 유력한 백신(vaccine)개발 및 adoptive CD8+ T 세포치료에 있어서 매우 유력한 E7 에피토프 후보임을 확인 할 수 있었다.

유체 세포측정법을 사용하여 선별한 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD)와 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프가 실제로 HLA-A*2402 type의 자궁 경부암 세포에 대해 항암효과를 나타내는 지를 확인하기 위해 ⁵¹ Cr release assay 기법을 이용하여 세포 사멸효과를 측정해 본 결과, E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프을 처리한 실험군에서 pp65 328-336(A24, QYDPVAALF) 펩타이드를 처리한 양성대조군보다 월등히 높은 세포 사멸효과를 나타내는 것을 알 수 있었다. 반면, 유체 세포측정법에서 IFN-γ와 CD69의 발현 정도가 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프와 유사하게 나타난 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD) 에피토프는 예상과 달리 세포 사멸 효과가 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 에피토프에 비해 낮게 나타났다(도 4 및 도 5). 이러한 결과는 두 E7 에피토프의 아미노산 서열 차이에서 기인하는 실제 자궁 경부암 세포에 대한 면역성 유발 정도가 다르기 때문에 나타난 것으로 예상된다.

따라서 유체 세포측정법과 세포 독성 실험을 통해 E7 67-81(LCVQSTHVDIRTLED) 펩타이드와 HPV type 16 E7 61-75(CDSTLRLCVQSTHVD) 펩타이드가 HLA-A*2402 type 자궁 경부암의 백신 개발과 adoptive 면역세포치료에 필요한 세포 독성 T 림프구 생성에 효과적인 에피토프임을 규명할 수 있었다.